Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp Bacteriocin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Lê Trọng Bằng

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Lê Trọng Bằng

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Huỳnh Hoàng Như Khánh Hà Nội – 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Huỳnh Hoàng Như Khánh và tham khảo thêm các tài liệu đã được công bố trước đó có nguồn gốc rõ ràng. Kết quả nghiên cứu này được thực hiện bởi sự tài trợ kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi sinh vật biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin nhằm ứng dụng trong nuôi trồng thủy hải sản”, mã số: VAST 02.05/20-21. Các số liệu nêu trong luận văn là kết quả làm việc của tôi trong suốt quá trình thực nghiệm tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2021

Tác giả luận văn

Lê Trọng Bằng

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Huỳnh Hoàng Như Khánh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Châu Minh Khánh - Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, người đã giúp tôi hoàn thành tốt phần thực nghiệm của mình, tôi xin chân thành cám ơn TS. Huỳnh Hoàng Như Khánh – Chủ nhiệm đề tài VAST 02.05/20-21 đã cho phép tôi sử dụng nội dung công trình nghiên cứu này vào mục đích nghiên cứu, viết và bảo vệ luận văn thạc sĩ. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đào Tấn Học và ThS. Lê Thị Thu Thảo, Viện Hải dương học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã hỗ trợ định danh đối với các mẫu tôm và cá biển sử dụng làm nguồn phân lập vi sinh vật biển trong luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Phòng Đào tạo, Khoa Công nghệ Sinh học và Quý Thầy Cô giáo đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn cũng như hoàn thành mọi thủ tục cần thiết.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang cũng như các anh, chị trong phòng Công nghệ sinh học biển đã giúp đỡ và tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến lãnh đạo trường THPT Nguyễn Chí Thanh, Sở Giáo dục và Đạo tạo Khánh Hòa luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2021

Tác giả luận văn

Lê Trọng Bằng

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

AHPND

Bac+

BLIS

GDP

LPMA

NTTS

PCR

PTN rRNA TCBS TSA TSB VK VKB VSV VSVCT Thông tin đầy đủ Acute HepatoPancreatic Necrosis Disease (Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính) Vi khuẩn biển biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. Bacteriocin-like inhitory subtance (Hợp chất có đặc điểm giống bacteriocin) Gross Domestic Product (Tổng sản phẩm quốc nội) Lab-Prepared Marine Agar (Môi trường thạch biển được chuẩn bị trong phòng thí nghiệm) Nuôi trồng thủy sản Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại gen) Phòng thí nghiệm Ribosome Ribonucleic Acid Thiosulphate Citrate Bile Salts Sucrose Agar Tryptic Soy Agar Tryptic Soy Broth Vi khuẩn Vi khuẩn biển Vi sinh vật Vi sinh vật chỉ thị

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Sự khác nhau giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm ................. 10

Bảng 1.2. Một số vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản .................................. 13

Bảng 1.3. Tác động về kinh tế – xã hội và tác động khác của bệnh liên quan

đến Vibrio trong ngành nuôi trồng thủy sản ................................................... 15

Bảng 1.4. Một số bacteriocin ở vi khuẩn Gram âm ........................................ 19

Bảng 1.5. Một số bacteriocin ở vi khuẩn Gram dương ................................... 20

Bảng 1.6. Một số khác biệt giữa bacteriocin và kháng sinh ........................... 22

Bảng 1.7. Độ bền nhiệt, pH và enzyme thủy phân của một số bacteriocin sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic .................................................................... 24

Bảng 1.8. Một số bacteriocin có nguồn gốc từ biển ....................................... 25

Bảng 2.1. Danh sách chủng chỉ thị sử dụng trong thí nghiệm sàng lọc hoạt tính ........................................................................................................... 36

Bảng 3.1. Thông tin về số lượng chủng VKB được phân lập tương ứng với từng mẫu và từng môi trường .......................................................................... 46

Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc những chủng cho hoạt tính đối kháng Vibrio spp. ....................................................................................................... 47

Bảng 3.3. Tổng hợp về hình thái khuẩn lạc của 30 chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. ghi nhận trên môi trường thạch Mueller Hinton ... 51

Bảng 3.4. Kết quả xác định phổ kháng khuẩn của 30 chủng vi khuẩn biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. xác định bằng phương pháp cấy dọc...... 54

Bảng 3.5. Tổng hợp khả năng kháng khuẩn của 30 chủng vi khuẩn biển biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch ........................................................................................ 57

Bảng 3.6. Hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus của 15 chủng vi khuẩn biển sau khi ủ với proteinase E ................................................................................ 61

Bảng 3.7. Sự biến động mật độ tế bào và hoạt tính đối kháng với vi sinh vật chỉ thị của chủng Bacillus spp. 2002NTBD1 theo thời gian ................................ 68

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. So sánh sản lượng nuôi trồng thủy sản và đánh bắt cá trên toàn cầu trong giai đoạn từ 1950 – 2017 ....................................................................... 11

Hình 1.2. Số lượng các ấn phẩm khoa học trong 20 năm qua liên quan đến từ khóa “marine bacteria” và “antimicrobial activity” phân phối theo mười quốc gia hàng đầu .................................................................................................... 17

Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin ................................................... 21

Hình 2.1. Quy trình phân lập vi khuẩn biển từ ruột tôm, ruột cá, bọt biển và rong .................................................................................................................. 39

Hình 2.2. Hình ảnh một số nguồn mẫu biển thu nhận cho phân lập vi khuẩn biển ................................................................................................... 40

Hình 2.3. Sơ đồ các nội dung nghiên cứu chính ............................................. 44

Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn biển được làm thuần .................. 45

Hình 3.2 Hoạt tính đối kháng của VKB đối với 3 chủng Vibrio spp. được xác định bằng phương pháp cấy dọc ............................................................... 50

Hình 3.3. Hình thái của một số đại diện bac+ trên môi trường Mueller Hinton agar .................................................................................................................. 53

Hình 3.4. Phổ kháng khuẩn của VKB đối với 7 chủng VSVCT được xác định bằng phương pháp cấy dọc .............................................................................. 56

Hình 3.5. Khả năng sinh chất kháng khuẩn trong canh trường bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch ............................................................................... 59

Hình 3.6. Ảnh hưởng của enzyme lên hoạt tính kháng Vibrio spp. của dịch lên men chủng 2002NTBD1 ........................................................................... 62

Hình 3.7. Cây phân loại thể hiện mối liên quan giữa 4 chủng có hoạt tính mạnh và loài có trình tự gen 16S rRNA tương đồng ................................................ 63

Hình 3.8. Khảo sát độ bền nhiệt của hợp chất kháng Vibrio spp. sinh bởi 4 chủng vi khuẩn biển ..................................................................................... 67

Hình 3.9. Hoạt tính đối kháng với vi sinh vật chỉ thị của dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus spp. 2002NTBD1 các thời điểm sinh trưởng khác nhau .................. 69

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

MỤC LỤC ........................................................................................................ 1

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 8

1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN ............................................................ 8

1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn ........................................................................ 8

1.1.2. Tác động của vi khuẩn ................................................................ 10

1.1.3. Vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản .......................................... 11

1.1.4. Vi khuẩn biển – nguồn cung cấp các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học ................................................................................................... 16

1.2. TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN ................................................... 17

1.2.1. Định nghĩa về bacteriocin ........................................................... 17

1.2.2. Phân loại bacteriocin ................................................................... 18

1.2.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin ............................................... 20

1.2.4. Điểm khác biệt giữa kháng sinh và bacteriocin .......................... 22

1.2.5. Đặc tính của bacteriocin ............................................................. 23

1.2.6. Một số bacteriocin có nguồn gốc từ biển .................................... 25

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BACTERIOCIN TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN ................................................................................................. 27

1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới ....................................................... 27

1.3.2. Các nghiên cứu trong nước ......................................................... 29

1.4. TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA BACTERIOCIN .......................... 30

1.4.1. Ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm ...................... 30

1.4.2. Ứng dụng bacteriocin trong bảo vệ sức khỏe con người và động vật trên cạn ..................................................................................... 31

1.4.3. Ứng dụng bacteriocin trong nuôi trồng thủy sản ........................ 31

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 33

2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .................................... 33

2.2. NGUYÊN LIỆU .................................................................................. 33

2.2.1. Vật liệu thí nghiệm ...................................................................... 33

2.2.2. Môi trường nuôi cấy ................................................................... 33

2.2.3. Chủng vi sinh vật chỉ thị ............................................................. 36

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 37

2.3.1. Phương pháp thu mẫu và phân lập vi khuẩn biển ....................... 37

2.3.2. Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng với Vibrio spp. của các chủng vi khuẩn biển phân lập được ........................................................ 40

2.3.3. Xác định phổ kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn biển được tuyển chọn ............................................................................................... 41

2.3.4. Xác định khả năng sinh chất kháng khuẩn trong môi trường lỏng .. 41

2.3.5. Xác định bản chất hợp chất kháng khuẩn ................................... 42

2.3.6. Phân tích trình tự nucleotide của gen mã hóa 16S rRNA ........... 42

2.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn ............................................................................................ 43

2.3.8. Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của vi khuẩn biển .................................................................................... 43

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 45

3.1. PHÂN LẬP VI KHUẨN BIỂN .......................................................... 45

3.2. TUYỂN CHỌN CHỦNG BIỂU HIỆN HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI VIBRIO SPP. ....................................................................................... 47

3.3. PHỔ KHÁNG KHUẨN VI KHUẨN TRÊN MÔI TRƯỜNG THẠCH DINH DƯỠNG ........................................................................................... 53

3.4. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG KHUẨN TRONG DỊCH MÔI TRƯỜNG LỎNG .................................................................... 57

3.5. XÁC ĐỊNH BẢN CHẤT CỦA HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN ...... 60

3.6. PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA GEN MÃ HÓA 16S RRNA .......................................................................................................... 63

3.7. ĐỘ BỀN NHIỆT CỦA CÁC HỢP CHẤT KHÁNG VIBRIO SPP. ... 66

3.8. ẢNH HƯỞNG THỜI GIAN LÊN MEN ĐẾN KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN BIỂN .................................. 67

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................. 70

4.1. KẾT LUẬN ......................................................................................... 70

4.2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 71

PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Thủy sản là ngành quan trọng của Việt Nam, đóng góp vào nền kinh tế khoảng 3 – 4 % tổng GDP hằng năm, đem lại công ăn việc làm cho hàng triệu lao động và là nguồn cung cấp thực phẩm quan trọng cho tiêu dùng [1]. Tuy nhiên, ngành này đang bị đe dọa bởi tình trạng dịch bệnh ngày càng tăng, chủ yếu do các tác nhân là vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn thuộc chi Vibrio. Vi khuẩn Vibrio gây ra nhiều bệnh nghiêm trọng trên động vật thủy sản, chẳng hạn như chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh “hoại tử gan tụy cấp” (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease – AHPND) với tỷ lệ chết lên đến 100 % trên tôm hoặc chủng Vibrio harveyi, Vibrio vulnificus là tác nhân gây nhiều bệnh nghiêm trọng trên nhuyễn thể, cá, cũng như nhiều loài động vật thủy hải sản khác [2, 3]. Theo nghiên cứu của Trần Thị Hồng Tơ và cộng sự [4], vi khuẩn V. parahaemolyticus được phát hiện trong 86,2 % sản phẩm thủy hải sản và 78,1 % mẫu nước nuôi thủy sản được thu thập khắp vùng sông Mê Kông – nơi tập trung phần lớn diện tích nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam. Có thể nói, nguy cơ bùng phát trên diện rộng dịch bệnh do Vibrio có thể xảy ra bất cứ lúc nào. Do đó, việc cần thiết có một biện pháp phòng chống Vibrio hữu hiệu nên được ưu tiên, nhằm phát triển ngành nuôi trồng thủy sản bền vững ở Việt Nam.

Trước đây, kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng và điều trị các bệnh ở thủy sản, đặc biệt là bệnh gây ra bởi Vibrio spp. Tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh trong thời gian dài đã đem lại nhiều hệ lụy khó khắc phục, như: i) tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm thủy sản ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người tiêu dùng và giảm giá trị xuất khẩu; ii) phát sinh các dòng vi khuẩn Vibrio spp. kháng kháng sinh; iii) gây ô nhiễm vùng nuôi do kháng sinh tiêu diệt các hệ vi sinh vật có lợi trong ao nuôi, dẫn đến thất bại triền miên trong nuôi trồng thủy sản [5, 6]. Trên thực tế, các dòng Vibrio kháng thuốc đã được phát hiện và ảnh hưởng nghiêm trọng đến nhiều khu vực sản xuất ở Việt Nam, như Sóc Trăng, Bạc Liêu và Trà Vinh, gây tổn thất to lớn cho ngành công nghiệp nuôi tôm trong nước. Nguyễn Diễm Thư và cộng sự [7] đã công bố tỷ lệ 12,37 % mẫu tôm, nước nuôi và bùn đáy ao thu ở khu vực sông Mê Kông

mang Vibrio có gen gây bệnh “hoại tử gan tụy”, trong đó 80,85 % và 78,72 % chủng kháng lại lần lượt 2 kháng sinh là Doxycycline và Enrofloxacin. Đây là con số đáng báo động, là hệ lụy từ việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong nuôi trồng thủy hải sản ở khu vực này trong thời gian dài. Cùng với xu hướng nuôi tôm “sạch”, kháng sinh đang dần bị hạn chế sử dụng trong nuôi trồng thủy sản, thay thế bằng việc sử dụng các chế phẩm vi sinh trong xử lý môi trường nước nuôi thủy sản, một trong những chế phẩm đang được quan tâm hiện nay đó là bacteriocin – peptide có phổ kháng khuẩn hẹp, do đó tiêu diệt vi khuẩn mục tiêu một cách hiệu quả, ít ảnh hưởng đến các vi khuẩn có lợi khác và không gây độc cho động vật. Phương thức này đang gặt hái nhiều ưu điểm, tuy nhiên đa phần các chế phẩm tích hợp các vi sinh vật có nguồn gốc trên cạn. Do đó, hoạt động vẫn chưa tối ưu trong môi trường đặc trưng nuôi tôm nước mặn.

Một vài nghiên cứu trong nước cũng đã công bố tiềm năng sử dụng vi khuẩn để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra, tuy nhiên số lượng nghiên cứu còn rất hạn chế. Nhìn chung, đa số các vi khuẩn được công bố thuộc chi Bacillus và nhóm xạ khuẩn (Actinobacteria). Theo đó, 2 chủng B. subtilis HY1 và Lactococcus lactis CC4K đã được nhóm tác giả thuộc Viện Công nghệ Sinh học công bố có hoạt tính đối kháng với Vibrio trong nước nuôi tôm [8]. Tuy nhiên, hợp chất kháng khuẩn không có bản chất protein, mà là các acid hữu cơ. Các chất acid hữu cơ kháng khuẩn khó áp dụng thực tế, do tác động diệt khuẩn sẽ giảm hoặc mất đi khi pha loãng trong nước nuôi hoặc trong pH kiềm tính của nước nuôi. Nguyễn Thị Bích Đào và cộng sự [9] đã phân lập được các chủng Bacillus subtilis B1, Bacillus subtilis B2, Bacillus amyloliquefaciens B4 từ mẫu nước và bùn đáy ao nuôi ở tỉnh Thừa Thiên Huế. Nguyễn Xuân Cảnh và cộng sự [10] đã thu nhận 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng Vibrio. Một nghiên cứu khác đã công bố Vibrio trong ao nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) bị ức chế khi bổ sung vi khuẩn B. subtilis và xạ khuẩn Streptomyces parvulus vào mẫu nước nuôi [11].

Có thể thấy hầu hết các công bố chỉ dừng lại ở việc tìm kiếm và sử dụng trực tiếp các chủng vi sinh vật có khả năng kháng Vibrio nhằm kiểm soát các bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra hoặc tìm kiếm các hợp chất có khả năng

kháng Vibrio phân lập từ nguồn vi sinh vật trên cạn và ứng dụng trong lĩnh vực nuôi trồng thủy hải sản. Do đó, các chế phẩm có hiệu quả diệt khuẩn không cao, chưa được tối ưu trong môi trường nuôi nước mặn. Vì vậy “Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin” là cách tiếp cận hiệu quả, có ý nghĩa khoa học lẫn thực tiễn nhằm đánh giá tiềm năng và ứng dụng các hợp chất có hoạt tính từ vi sinh vật (VSV) biển trong môi trường nuôi trồng thủy hải sản.

2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI

Sàng lọc và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn biển (VKB) có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin đối kháng với VSV gây bệnh trên các đối tượng thủy hải sản (chủ yếu đối kháng với Vibrio).

3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu: các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp

bacteriocin.

Phạm vi nghiên cứu: khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh trên thủy,

hải sản của các chủng vi khuẩn biển thu được.

4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn từ VSV biển nhằm ứng dụng trong lĩnh vực nuôi trồng thủy hải sản là cách tiếp cận mới, có ý nghĩa khoa học.

Thành công của đề tài sẽ định hướng khả năng sử dụng VSV biển trong nghiên cứu thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học, góp phần giảm thiểu lượng thuốc kháng sinh sử dụng trong nuôi trồng thủy hải sản, nâng cao chất lượng sản phẩm.

Chế phẩm sinh học có lợi thế thân thiện môi trường, giảm thiểu ô nhiễm

môi trường và góp phần phát triển bền vững.

5. CÁC NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHÍNH

Thu nhận mẫu sinh vật biển (tôm, cá, rong biển, bọt biển …) và phân lập

vi khuẩn biển.

Khảo sát khả năng đối kháng với vi sinh vật chỉ thị của các chủng vi

khuẩn biển phân lập được.

Xác định phổ kháng khuẩn và bản chất của hợp chất kháng khuẩn.

Tuyển chọn và định danh bằng gene 16s rRNA của một số chủng vi

khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin.

Nghiên cứu độ bền nhiệt của hợp chất kháng khuẩn và khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của ít nhất 01 chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN

1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn

Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật có cấu tạo tế bào nhưng chưa có cấu trúc nhân hoàn chỉnh, vi khuẩn có các đặc điểm đặc trưng: kích thước nhỏ bé, hấp thụ nhiều và chuyển hóa nhanh, sinh trưởng nhanh và phát triển mạnh, thích ứng mạnh, dễ phát sinh biến dị, nhiều chủng loại và phân bố rộng [12]. Vi khuẩn có kích thước rất nhỏ, thay đổi tùy từng loài, đường kính từ 0,2 – 2,0 µm, chiều dài từ 2 – 10 µm, một số vi khuẩn có kích thước dài đến vài chục micromet. Vi khuẩn có hình thái riêng, đặc tính sinh vật riêng, chúng có khả năng gây bệnh cho người, động vật và thực vật, một số có khả năng tiết chất kháng khuẩn. Phương thức dinh dưỡng đa dạng, đa số vi khuẩn sống hoại sinh trong tự nhiên [13]. Mỗi loại vi khuẩn có hình dạng và kích thước nhất định. Các hình dạng và kích thước này là do vách tế bào của vi khuẩn quyết định. Hình thái là một tiêu chuẩn rất quan trọng để xác định vi khuẩn [12].

Về hình thái, có thể chia vi khuẩn thành 3 nhóm lớn sau: i) Cầu khuẩn (Cocci): Là những vi khuẩn có hình cầu, mặt cắt của chúng có thể là những hình tròn, nhưng cũng có thể là hình bầu dục hoặc ngọn nến. Đường kính trung bình khoảng 0,5 – 1 µm. Cầu khuẩn lại được chia làm nhiều loại như: đơn cầu tứ cầu khuẩn khuẩn (Micrococcus), song cầu khuẩn (Diplococcus), (Tetracoccus), tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), liên cầu khuẩn (Streptococcus). ii) Trực khuẩn (Bacilli): Là những vi khuẩn hình que, đầu tròn hay vuông, kích thước vi khuẩn gây bệnh thường gặp là 0,5 – 1 x 2 – 5 µm. Các trực khuẩn không gây bệnh thường có kích thước lớn hơn [12]. Một số loại trực khuẩn thường gặp bao gồm: Trực khuẩn Gram dương, sống hiếu khí sinh nha bào: Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, v.v...; Trực khuẩn Gram âm, sống hiếu khí, không sinh nha bào, thường có tiên mao ở xung quanh thân vi khuẩn: Salmonella, Escherichia, Shigella, Proteus, v.v... iii) Xoắn khuẩn (Spirillum, Spirochete): Là những vi khuẩn có hình sợi lượn sóng và di động. Chiều dài của các vi khuẩn loại này có thể tới 30 µm. Trong loại này có 3 giống vi khuẩn gây bệnh quan trọng là Treponema, Leptospira và Borrelia [12].

Ngoài những vi khuẩn có hình dạng điển hình như trên còn có những loại vi khuẩn có hình thái trung gian: Trung gian giữa cầu khuẩn và trực khuẩn là cầu – trực khuẩn, như vi khuẩn dịch hạch (Yersinia pestis); Trung gian giữa trực khuẩn và xoắn khuẩn là phẩy khuẩn mà điển hình là phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae) [12].

Việc nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn được thực hiện thông qua sự hỗ trợ của các thiết bị chuyên dụng như kính hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử. Mỗi loại vi khuẩn đều có cấu trúc tế bào và hình dạng khác nhau. Do đó để nhận diện được vi khuẩn phải thực hiện qua nhiều phương pháp, kỹ thuật. Một trong số đó là phương pháp nhuộm Gram [14]. Nhuộm Gram là kỹ thuật nhuộm sử dụng nhiều loại hóa chất để phân biệt 2 nhóm vi khuẩn là Gram dương (+) và Gram âm (–) dựa trên cấu tạo vách tế bào của vi khuẩn. Đây là phương pháp được phát minh bởi nhà khoa học có tên Hans Christian Gram từ năm 1884 và đến nay vẫn được ứng dụng phổ biến [15]. Đặc tính bắt màu của vi khuẩn trong phương pháp nhuộm Gram là do vách tế bào quyết định, từ đó dẫn đến sự khác nhau trong kết quả nhuộm, vi khuẩn Gram dương sẽ bắt màu từ xanh đến tím, vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu từ hồng đến đỏ [14]. Sự khác nhau giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm được tóm tắt trong Bảng 1.1.

Bảng 1.1. Sự khác nhau giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm [14]

Vi khuẩn Gram dương Vi khuẩn Gram âm

Cấu tạo bên ngoài có 2 lớp: Cấu tạo bên ngoài có 3 lớp:

- Bên trong là màng nguyên sinh. - Lớp peptidoglycan mỏng (5 – 10 %

- Bên trong là màng nguyên sinh. - Bên ngoài là lớp peptidoglycan dày (60 – 100 % peptidoglycan).

peptidoglycan). - Bên ngoài là lớp

lipopolysaccharide.

Hàm lượng lipid thấp Hàm lượng lipid cao

Không có nội độc tố Có nội độc tố

Không có khoảng chu chất (periplasmic space) Có khoảng chu chất (periplasmic space)

Không có kênh porin Có kênh porin

Dễ bị tổn thương bởi sự tấn công của lysozyme và penicillin Chống lại sự tấn công của lysozyme và penicillin

Lớp peptidoglycan có chứa acid teichoic Lớp peptidoglycan không chứa acid teichoic

1.1.2. Tác động của vi khuẩn

Vi khuẩn tham gia tích cực vào việc khép kín vòng tuần hoàn các vật chất trong tự nhiên, làm sạch môi trường. Vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong chu trình carbon, nitơ… các chu trình vật chất có ý nghĩa quyết định cho sự sống của sinh vật trên trái đất. Tham gia chuyển hóa, phân hủy các chất khó tiêu trong đất thành các chất dễ tiêu cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, một số loại vi khuẩn làm giàu dinh dưỡng bằng cách cố định nitơ cho đất.

Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm và dược phẩm: ứng dụng quá trình lên men để sản xuất thực phẩm, sản xuất men vi sinh, sản xuất vaccine, các loại thuốc, hormon, v.v... mang lại giá trị kinh tế cao. Vi khuẩn là đối tượng để

nghiên cứu về di truyền phân tử, hóa sinh học, vì chúng có số lượng gen ít, phát triển nhanh, kích thước nhỏ, nên dễ dàng cho sự nghiên cứu và thực nghiệm.

Nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cho người, động vật, thực vật... Vi khuẩn là căn nguyên của các bệnh nhiễm trùng, gây ô nhiễm môi trường, hủy hoại thức ăn và các sản phẩm sinh học cần bảo quản, là mối đe dọa tiềm tàng trong tương lai khi tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng tăng [12, 13].

1.1.3. Vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản

Dân số thế giới tính đến năm 2020 là 7,795 tỷ người [16]. Với quy mô dân số hiện tại và được dự báo có thể đạt đến 10,5 tỷ người vào năm 2050 thì an ninh lương thực, thực phẩm được xem như một vấn đề cấp bách trên toàn cầu [17]. Từ nhu cầu trên đã thúc đẩy sự phát triển của các ngành sản xuất thực phẩm. Nuôi trồng thủy sản đã có bước phát triển mạnh mẽ trong những thập kỷ qua và tiếp tục dẫn đầu trong việc sản xuất thực phẩm từ thủy sản tại châu Á và trên toàn cầu. Hơn 91 % sản lượng nuôi trồng thủy sản được sản xuất tại châu Á (102,9 triệu tấn trong năm 2017).

Hình 1.1. So sánh sản lượng nuôi trồng thủy sản và đánh bắt cá trên toàn cầu trong giai đoạn từ 1950 – 2017 [18]

Tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản toàn cầu đã vượt qua sản lượng đánh bắt cá toàn thế giới 18,32 triệu tấn (Hình 1.1), giá trị của ngành ước tính hơn 250 tỷ USD (tính đến năm 2017) [18]. Hơn 95 % sản lượng của ngành được

sản xuất tại các nước đang phát triển, tốc độ tăng trưởng sản lượng trung bình hằng năm đạt 6,13 %, giúp tạo ra hàng nghìn việc làm và góp phần tăng trưởng kinh tế ở những quốc gia này [18].

Tuy nhiên, cùng với việc tăng cường hoạt động nuôi trồng thủy sản, dịch bệnh bùng phát, đặc biệt là các bệnh nhiễm khuẩn, ngày càng trở thành một thách thức lớn đối với việc mở rộng sản xuất và ảnh hưởng đến sự phát triển kinh tế của một số quốc gia. Dịch bệnh đã làm nền kinh tế toàn cầu bị tổn thất hơn 9 tỷ USD mỗi năm (số liệu công bố năm 2010); gây thiệt hại cho Trung Quốc hơn 120 triệu USD trong giai đoạn từ 1990 – 1992 [19, 20]. Ước tính có khoảng 15 % thiệt hại do cá chết vì dịch bệnh trong các lồng lưới và ao nuôi trong tổng số 16.100 trang trại nuôi cá tại Brazil [21, 22]. Tại Việt Nam, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (hay còn gọi là Hội chứng tôm chết sớm) là bệnh nặng nhất hiện nay ảnh hưởng đến nuôi tôm nước lợ. Căn bệnh này gây ra thiệt hại lớn cho người nuôi tôm ở Đồng bằng sông Cửu Long, nơi có hơn 70 % sản lượng tôm của Việt Nam. Thiệt hại do hội chứng tôm chết sớm đã đượ c ghi nhận ở khoảng 59.000 ha trang trại ở Đồng bằng sông Cửu Long khi bệnh mới xuất hiện vào năm 2011, đến năm 2017 bệnh đã lan ra 294 xã thuộc 86 huyện của 25 tỉnh trong cả nước [23].

Dịch bệnh gia tăng là một trong những hệ quả của việc tăng cường nuôi trồng thủy sản. Các yếu tố môi trường như chất lượng nước xấu, nhiệt độ không thích hợp, mật độ nuôi dày, quản lý chăm sóc kém, thức ăn và con giống không đảm bảo chất lượng làm cho động vật thủy sản bị giảm sức đề kháng, các tác nhân gây bệnh phát triển. Đồng thời, động vật thủy sản sống trong môi trường nước với mật độ nuôi cao làm cho bệnh có điều kiện lây lan nhanh chóng và gây thiệt hại lớn [24]. Một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến cho thủy sản là vi khuẩn. Vi khuẩn gây bệnh ở động vật thủy sản đã phân lập được vài trăm loài thuộc 9 họ, vi khuẩn điển hình là nhóm vi khuẩn Aeromonas spp., Pseudomonas spp. gây bệnh ở động vật thủy sản nước ngọt và nhóm Vibrio spp. gây bệnh ở động vật thủy sản nước mặn [24]. Một số vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản được thống kê trong Bảng 1.2.

Bảng 1.2. Một số vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản [24, 25]

Tên vi khuẩn Tên bệnh Đối tượng mắc bệnh

Flexibacter columnaris Bệnh Columnaris ở cá Cá nước ngọt

Flexibacter maritimus Bệnh Columnaris ở cá Cá nước mặn

Flavobacterium branchiophila Bệnh thối mang ở cá Cá

Myxococcus piscicolas

Cytophaga spp.

Thiothrix spp. Bệnh vi khuẩn dạng sợi Giáp xác mặn hay ngọt Leucothrix mucor

Flavobacterium spp.

Hafnia alvei Bệnh hoại tử nội tạng Cá da trơn

Proteus rettgeri Bệnh xuất huyết Cá

Aeromonas spp. Cá, tôm

Bệnh xuất huyết đốm đỏ ở cá, đốm nâu ở tôm càng xanh

Edwardsiella spp. Bệnh nhiễm trùng máu Cá

Vibrio alginolyticus Cá, tôm

Bênh đỏ thân và ăn mòn vỏ kitin ở tôm, bệnh xuất huyết ở cá biển

Vibrio anguillarum Cá, tôm

Bênh đỏ thân và ăn mòn vỏ kitin ở tôm, bệnh xuất huyết ở cá

Tôm Vibrio parahaemolyticus Bệnh phát sáng, đỏ thân và ăn mòn vỏ kitin ở tôm

Vibrio harveyi Bệnh phát sáng ở tôm Tôm

Pasteurella piscinida Bệnh nhiễm khuẩn Cá biển

Pseudomonas spp. Bệnh xuất huyết Cá

Một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến, gây thiệt hại lớn cho nuôi trồng thủy sản không thể không kể đến chi Vibrio. Chi Vibrio được mô tả lần đầu tiên vào năm 1854 bởi một bác sỹ người Ý, Filippo Pacini, khi nghiên cứu các đợt bùng phát của dịch tả ở Florence [26]. Chi Vibrio bao gồm 142 loài, có nguồn gốc từ biển và việc phân loại của chi liên tục được sửa đổi do việc phát hiện và đưa vào các loài mới [27]. Đặc điểm chung của vi khuẩn thuộc chi Vibrio: vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm, không sinh nha bào, di động nhờ một lông ở một đầu, hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện, tất cả các loài đều cần NaCl để phát triển nhưng nồng độ tốt ưu cho mỗi loài không giống nhau, trong tự nhiên thường gặp ở môi trường nước biển và cửa sông [12, 24]. Vibrio lây nhiễm cho bất kỳ sinh vật nào kể cả động vật và con người. Nhiều loài trong chi là vô hại, tuy nhiên một trong số chúng gây ra nhiều bệnh nghiêm trọng cho người và thủy hải sản. Theo báo cáo của Batz và cộng sự, một số loài của chi Vibrio đã được xác định và xếp vào 14 mầm bệnh hàng đầu gây ra gần 95 % các ca bệnh do thực phẩm dẫn đến nhập viện và tử vong ở Mỹ [28]. Đối với cá, Vibrio spp. gây bệnh nhiễm khuẩn máu là chủ yếu. Đối với tôm, Vibrio spp. gây bệnh phát sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kitin [24]. Bệnh gây bởi Vibrio spp. (gọi tắt là bệnh Vibriosis) đã trở thành yếu tố chính ảnh hưởng tới sản xuất và gây tỷ lệ tử vong cao trong ngành nuôi trồng thủy sản. Theo báo cáo năm 2007, bệnh Vibrio xảy ra ở hơn 14 quốc gia, ảnh hưởng đến việc nuôi trồng của khoảng 48 loài cá biển [29]. Ở Đan Mạch, bệnh Vibrio gây thiệt hại 30 % trong các quần thể nuôi lươn [29]. Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành nuôi tôm ở châu Á và Trung Mỹ, gây thiệt hại kinh tế hơn 1 tỷ USD [30]. Những thiệt hại đáng kể về kinh tế và các tác động do Vibrio spp. đối với ngành nuôi trồng thủy sản được tóm tắt trong Bảng 1.3.

Bảng 1.3. Tác động về kinh tế – xã hội và tác động khác của bệnh liên quan đến Vibrio trong ngành nuôi trồng thủy sản

Chủng vi khuẩn gây bệnh Vật chủ và mức độ ảnh hưởng Quốc gia bị ảnh hưởng Tài liệu tham khảo

Vibrio fluvialis [19] Trung Quốc

[31] Ai Cập

V. anguillarum V. alginolyticus V. ordalii V. harveyi

Tunisia V. parahaemolyticus [32]

[33] Mexico V. parahaemolyticus

[34] [34] Thái Lan V. harveyi Ecuador V. harveyi

[35] Nhật Bản V. carchariae

Ấn Độ V. harveyi [36] Thiệt hại hơn 120 triệu USD hằng năm trong giai đoạn từ 1990 đến 1992 Đốm đỏ trên vùng bụng và vùng bên. Các tổn thương da: sưng và sẫm màu, hoại tử, xuất huyết và loét trên bề mặt da gây tỷ lệ tử vong 50 % ở cá vược và cá tráp Sạm đen cơ thể, tổn thương da có nốt trắng và chết đột ngột với các vết xuất huyết ở cơ xương của cá vược châu Âu Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm thẻ chân trắng Tử vong hàng loạt ở tôm sú Tử vong hàng loạt ở tôm sú Tử vong hàng loạt ở bào ngư Nhật Thối đuôi, ban đỏ và các mảng trắng trên cơ thể cá ngựa

[37] Ấn Độ Tăng trưởng kém, cử động lờ đờ, đổi màu đỏ và chết ở tôm sú

Ý [38]

Tử vong hàng loạt tại các trang trại nuôi động vật thân mềm hai mảnh vỏ ở Taranto

V. parahaemolyticus V. alginolyticus V. anguillarum V. vulnificus V. alginolyticus V. anguillarum V. harveyi V. ordalii V. salmonicida

1.1.4. Vi khuẩn biển – nguồn cung cấp các hợp chất tự nhiên có

hoạt tính sinh học

Sự sống – từ hơn 3,5 tỷ năm trước, đã xuất hiện trong các đại dương [39]. Quá trình tiến hóa đã cung cấp cho các sinh vật biển cơ chế thích hợp để tồn tại trong môi trường khắc nghiệt, nhiều thù địch như sự tấn công của các vi khuẩn, virus gây bệnh [40]. Các đại dương bao phủ khoảng 70 % bề mặt Trái Đất, sở hữu sự đa dạng khổng lồ về sinh thái, hóa học và sinh học [41]. Sinh quyển biển bao gồm các nhóm vi sinh vật đa dạng về đặc tính trao đổi chất, chức năng và cấu trúc độc đáo [42, 43]. Hệ vi sinh vật biển đang được nghiên cứu, mặc dù có hơn 1,2 triệu loài đã được liệt kê, nhưng ước tính có tới 91 % các loài trong đại dương chưa được biết đến [44].

Sự sản xuất các chất có hoạt tính ở những sinh vật trên cạn được biết đến từ lâu. Môi trường biển với những sinh vật thích nghi với điều kiện sống khắc nghiệt dẫn đến việc sản sinh ra nhiều phân tử có hoạt tính độc đáo hơn [45]. Trong nhiều thập kỷ qua, các nhà nghiên cứu đã chuyển mối quan tâm sang việc tìm kiếm các vi sinh vật biển mới và chất chuyển hóa của chúng. Theo hướng này, một phần của những nghiên cứu công nghệ sinh học và dược phẩm đã tập trung vào môi trường biển như một nguồn tài nguyên đầy hứa hẹn cho các hoạt chất sinh học mới [46]. Sự quan tâm của thế giới trong việc tìm kiếm các thuốc kháng sinh mới để chống lại tình trạng đa kháng thuốc đang đe dọa sức khỏe cộng đồng đã thúc đẩy việc tìm kiếm các hoạt chất mới để đối phó với các mầm bệnh này [47, 48]. Các vi sinh vật biển tiếp xúc, tồn tại trong nhiều điều kiện môi trường phức tạp, chúng đã trải qua các quá trình tiến hóa sâu rộng nhằm thích nghi với môi trường sống khắc nghiệt, vì vậy vi sinh vật biển nói chung và vi khuẩn biển nói riêng là nguồn dự trữ, nguồn cung cấp đa dạng các hoạt chất sinh học đáp ứng cho nhu cầu tìm kiếm thuốc mới, liệu pháp điều trị bệnh mới của con người [49, 50]. Vi sinh vật biển đã phát triển vô số các con đường trao đổi chất, cho ra nhiều chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính mà không thể tìm thấy ở những sinh vật trên cạn [51]. Các hoạt chất cho hoạt tính bao gồm alkaloid, steroid, terpenoid, peptide và polyketide [52]. Các nhà nghiên cứu tin rằng ít nhất 10 – 20 % vi khuẩn phân lập từ môi trường biển có các ứng dụng

trong công nghệ sinh học, dược phẩm, liệu pháp điều trị bệnh [53, 54]. Vì thế, trong những năm gần đây chứng kiến sự gia tăng mạnh mẽ số lượng các nghiên cứu khoa học liên quan đến vi khuẩn biển và vai trò của chúng.

Hình 1.2. Số lượng các ấn phẩm khoa học trong 20 năm qua liên quan đến từ khóa “marine bacteria” và “antimicrobial activity” phân phối theo mười quốc gia hàng đầu [55]

Kể từ khi bacteriocin đầu tiên được phát hiện ra bởi Gratia vào năm 1925, mang tên gọi colicin có tác dụng trên E. coli [56], cho đến nay đã có rất nhiều chủng vi khuẩn biển được xác định sinh bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn. Ngành Firmicutes, Actinobacteria và Proteobacteria là những ngành nổi trội về khả năng sinh bacteriocin. Số lượng các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn trong những ngành này chiếm hơn 90 % các báo cáo khoa học được xuất bản trong giai đoạn 1998 – 2018 và còn không ngừng tăng thêm [55].

1.2. TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN

1.2.1. Định nghĩa về bacteriocin

Bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn có bản chất peptide và có nguồn gốc từ vi khuẩn. Đây là những peptide có kích thước nhỏ (thường cấu thành từ ít hơn 100 amino acid), được sinh tổng hợp ở ribosome và thường mang phổ diệt

vi khuẩn hẹp tiêu diệt vi khuẩn gần với chủng sinh bacteriocin [57, 58]. Đối với vi khuẩn sống trong tự nhiên, bacteriocin được tiết ra để ngăn chặn sự xâm chiếm của các vi sinh vật lạ vào khu vực sống của mình, cũng như hạn chế sự sinh trưởng mạnh của các vi sinh vật khác trong cùng môi trường sống. Điều này nhằm tối ưu hóa nguồn thức ăn và không gian sống của chúng [57].

Bacteriocin đầu tiên được biết đến vào năm 1925, khi Gratia chiết xuất được một hợp chất kháng khuẩn tiêu diệt E. coli, sau đó chất này đươc đặt tên là colicin [56]. Tuy nhiên mãi đến 1953, khái niệm bacteriocin mới được khởi xướng bởi Jacob và cộng sự nhằm phân biệt hợp chất “kháng khuẩn phổ hẹp bản chất peptide này” với các hợp chất khác như kháng sinh và bacteriophage [59]. Ngày nay, nghiên cứu về bacteriocin đã triển khai rộng rãi, công bố nhiều loại bacteriocin từ nhiều loại vi khuẩn khác nhau. Trong đó, bacteriocin được thu nhận chủ yếu từ vi khuẩn Gram dương tập trung ở 2 chi Lactobacillus, Bacillus phân lập từ môi trường trên cạn, nhưng cũng đã được ghi nhận ở vi khuẩn Gram âm (E. coli, Vibrio spp., Pseudomonas spp.) [60, 61, 62]. Tuy vậy, tiềm năng bacteriocin ở vi khuẩn biển còn chưa được khai thác nhiều, mặc dù vô cùng phong phú.

1.2.2. Phân loại bacteriocin

Ngày nay, có nhiều hệ thống phân loại đã được đề xuất để phân loại bacteriocin. Tuy nhiên, hệ thống phân loại của Abriouel đối với vi khuẩn sinh acid lactic (LAB, lactic acid bacteria) là phổ biến nhất [63]. Hệ thống này chia bacteriocin thành thành 3 nhóm chính:

Nhóm 1: là những hợp chất có kích thước nhỏ hơn 5 kDa, bền nhiệt và cấu trúc được biến đổi sau quá trình dịch mã. Đây là nhóm bacteriocin được tìm thấy phổ biến nhất, bao gồm nhiều dạng cấu trúc chuỗi trình tự khác nhau như dạng thẳng, dạng vòng, dạng khối cầu…, bacteriocin nhóm 1 có loại cấu trúc gồm hai thành phần và hoạt tính diệt khuẩn chỉ thể hiện khi có sự hiện diện của cả hai tiểu phần peptide như Haloduracin (loại bacteriocin được sản xuất bởi Bacillus halodurans C-125).

Nhóm 2: là những hợp chất có kích thước nhỏ hơn 10 kDa, bền nhiệt, nhưng cấu trúc không được biến đổi sau quá trình dịch mã. Bacteriocin này được chia thành các nhóm nhỏ khác nhau, tùy thuộc vào khả năng tiêu diệt Listeria và điện tích của bacteriocin.

Nhóm 3: là những protein có khối lượng lớn (>10 kDa) và nhạy cảm với

nhiệt độ.

Bảng 1.4. Một số bacteriocin ở vi khuẩn Gram âm

Kích thước Bacteriocin Loại/Lớp Ví dụ Nguồn (kDa)

Colicin A, B [64] Tạo lỗ trên màng Colicin 20 – 80

Colicin E2, E3 [64] Nuclease

Giống colicin 20 – 80 S-pyocin, Klebicin [65]

>80 Maltocin P28 [66] Giống đuôi phage

[65] <10 Microcin C7, Microcin B17 Biến đổi sau dịch mã

Colicin V [67] <10 Microcin Không biến đổi

Microcin E492 [68] Sửa đổi sau dịch mã

Bảng 1.5. Một số bacteriocin ở vi khuẩn Gram dương

Kích thước Bacteriocin Loại/Lớp Ví dụ Nguồn

(kDa)

Nisin [69] Type A – dạng thẳng tích điện dương

<5 Nhóm I

Subtilosin A [70]

Type B – hình cầu, tích điện âm hoặc không tích điện

[71] Phạm vi hoạt động hẹp Pediocin, enterocin

[71] Hoạt động phối hợp của 2 peptide Lactacin F, Lactococcin G Nhóm II <10 Peptide tròn Carnocyclin A [72]

Mạch thẳng, peptide

[73] Epidermicin NIO1 đơn không giống pediocin

IIIa – bacteriolysin Enterolysin A [74]

Nhóm III >10 Helveticin A & J [66]

IIIb –bacteriocin không ly giải màng tế bào

1.2.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin

Bacteriocin là những hợp chất tác động màng. Với điểm đẳng điện (pI) cao, bacteriocin dễ dàng liên kết với màng tế bào vi khuẩn mục tiêu, khởi sự quá trình tiêu diệt vi khuẩn.

Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin [75]

Bacteriocin nhóm I (điển hình là nisin) liên kết với lipid II trên màng. Đây là một lipopeptide neo xuyên màng, đóng vai trò là kênh vận chuyển chính nguyên liệu tạo vách tế bào vi khuẩn Gram dương, do đó ngăn cản quá trình tổng hợp vách, từ đó gây chết vi khuẩn mục tiêu. Liên kết giữa bacteriocin nhóm I và lipid II còn tạo một cấu trúc xuyên màng gây thoát các thành phần nội màng, gây chết vi khuẩn mục tiêu [75].

Đối với các bacteriocin nhóm II (điển hình sakacin), do cấu trúc lưỡng tính và xoắn helix, các bacteriocin này gắn đầu kỵ nước với lớp phospholipid kép trên màng nguyên sinh chất, khởi sự quá trình chèn đầu ưa nước vào khu vực xoang màng để liên kết với protein thuộc hệ thống mannose phosphotransferase (PTS-Man), từ đó hình thành một phức hợp xuyên màng gây thất thoát các thành phần nội bào vi khuẩn [75].

Trong khi đó, bacteriocin nhóm III (điển hình lysostaphin) có hoạt tính thủy phân các đơn vị cấu trúc vách tế bào, gây mất tính toàn vẹn của vách tế bào [75].

1.2.4. Điểm khác biệt giữa kháng sinh và bacteriocin

So với kháng sinh, bacteriocin có nhiều ưu điểm vượt trội đáng quan tâm [76], có thể kể đến như: i) Không có thông tin nào cho thấy bacteriocin gây độc cho động vật hoặc tích tụ trong mô. Bacteriocin nhạy cảm với protease nên dễ dàng phân hủy trong cơ thể vật chủ. ii) Bacteriocin có hiệu quả chống lại các mầm bệnh kháng kháng sinh. iii) Bacteriocin thường biểu hiện phổ kháng khuẩn hẹp, do đó tiêu diệt vi khuẩn mục tiêu một cách hiệu quả, ít ảnh hưởng đến các vi khuẩn có lợi khác. iv) Bacteriocin biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn thường ở nồng độ thấp hơn (nanogram) so với các hợp chất kháng sinh (microgram).

Bảng 1.6. Một số khác biệt giữa bacteriocin và kháng sinh [69]

Đặc điểm Bacteriocin Kháng sinh

Ứng dụng Thực phẩm, y tế, triển vọng trong NTTS Y tế, nuôi trồng thủy sản

Sinh tổng hợp Trên ribosome, do gen quy định Sản phẩm trao đổi chất bậc II

Phạm vi hoạt động Phổ kháng khuẩn hẹp Phổ kháng khuẩn rộng

Có Không Khả năng gây đáp ứng miễn dịch của sinh vật chủ

Liên quan đến gen Cơ chế kháng thuốc của tế bào mục tiêu Ảnh hưởng đến thành phần cấu tạo màng tế bào

Cơ chế hoạt động Tạo lỗ màng, sinh tổng hợp thành tế bào Tác động lên màng tế bào hoặc các vị trí đích nội bào

Độc tính/Tác dụng phụ Chưa biết Có

1.2.5. Đặc tính của bacteriocin

1.2.5.1. Tính chất hóa học

Bacteriocin có bản chất là peptide trọng lượng phân tử thấp. Do đó các enzyme đặc trưng như pronase E, trypsin, proteinase K …thường được sử dụng để kiểm tra bản chất protein của bacteriocin. Phân tích hóa học cho thấy, bacteriocin là loại protein đơn giản, có trọng lượng phân tử thấp. Tuy nhiên, bacteriocin đã được tinh sạch từ một số vi khuẩn như Staphylococcus, Clostridium và Lactobacillus cho thấy chúng là những phân tử phức tạp ngoài cấu trúc protein chúng còn có thêm nhóm chức lipid hoặc carbohydrate [77, 78].

1.2.5.2. Tính chất vật lý

Độ bền nhiệt: Các loại bacteriocin của những chủng vi khuẩn khác nhau thì có khả năng chịu nhiệt cũng khác nhau. Mỗi loại bacteriocin có khả năng chịu nhiệt ở một khoảng nhất định. Hai bacteriocin ST28MS và ST26MS, được sản xuất bởi Lactobacillus plantarum được phân lập từ mật đường, ức chế sự phát triển của Lactobacillus casei, Lactobacillus sakei, Staphylococcus aureus, faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli và Enterococcus Acinetobacter baumanii. Cả hai bacteriocin này vẫn hoạt động sau 20 phút ở 121 ℃. Khả năng chịu nhiệt của bacteriocin có liên quan đến cấu trúc phân tử của bacteriocin [79].

Độ bền pH: Bacteriocin có thể hoạt động tốt trong những khoảng pH nhất định. Bacteriocin ST28MS và ST26MS, ngoài có độ bền nhiệt cao, chúng còn có thể hoạt động ổn định trong 2 giờ tại những giá trị pH từ 2 – 12. Những đặc tính này đều do bản chất thành phần cấu trúc của bacteriocin đó quy định. Độ bền nhiệt độ và pH rất quan trọng quyết định khả năng ứng dụng của bacteriocin trong bảo quản nguyên liệu thực phẩm. Tùy vào trạng thái, nhiệt độ thực phẩm mà chúng ta có thể lựa chọn loại bacteriocin bổ sung vào sao cho phù hợp với mục đích sản xuất [79].

Độ bền với các enzyme: Mỗi loại bacteriocin có thành phần cấu trúc các amino acid khác nhau nên bị phân cắt đặc hiệu bởi các enzyme khác nhau, thích hợp với nó. Khi bị phân cắt bằng các enzyme đặc hiệu, bacteriocin sẽ mất đi

hoạt tính kháng khuẩn. Đồng thời đây cũng là dấu hiệu giúp ta nhận biết được đó có phải là bacteriocin hay không [79].

Bảng 1.7. Độ bền nhiệt, pH và enzyme thủy phân của một số bacteriocin sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic [80]

Tên bacteriocin Nhiệt độ xử lý Khoảng pH bền Enzyme thủy phân

Megacin A – 216 60 °C/30 phút 2 – 7 Chymotrypsin, Pepsin, Trypsin

Trypsin, Chymotripsin,

Clostocin A 100 °C/30 phút 4 – 9

Pronase P, RNAse, DNAse

Clostocin B 80 °C/10 phút 4 – 9

Trypsin, Chymotrypsin, Pronase P, RNAse, DNAse

Clostocin C 80 °C/10 phút 4 – 9

Trypsin, Chymotrypsin, Pronase P, RNAse, DNAse

Clostocin D 100 °C/30 phút 4 – 9

Trypsin, Chymotripsin, Pronase P, RNAse, DNAse

Boticin E – S5 100 °C/10 phút 1,1 – 9,5

Trypsin, Chymotrypsin, Pronase P, RNAse, DNAse

Boticin P 60 °C/30 phút 6,5 – 7,5

Trypsin, RNAse, DNAse, Alkaline phosphotase, Phospholipase C, D

Butyricin 7423 100 °C/10 phút 2 – 12 Trypsin

2 – 12 Trypsin 100 °C/30 phút Perfreingocin 11105

1.2.6. Một số bacteriocin có nguồn gốc từ biển

Bảng 1.8. Một số bacteriocin có nguồn gốc từ biển

VSV bị ức chế Bacteriocin Chủng sản xuất

Khối lượng phân tử Mẫu phân lập Nguồn tham khảo

BLIS Cá hồi [81] – Lactobacillus pentosus 39

Carnocin UI49 Cá [82] Carnobacterium spp. 4,5 – 5 kDa

Aeromonas hydrophila, Listeria monocytogenes Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Carnobacterium

[83] Divergicin M35 Carnobacterium divergens M35 ~4,5 kDa Carnobacterium, Listeria Trai xông khói

Divercin V41 4,5 kDa [84] Carnobacterium divergens V41 Nội tạng cá Carnobacterium, Listeria, Enterococcus

Listeria [85] Carnobacterio- cin B2 Carnobacterium piscicola A9b ~4,5 kDa Cá hồi xông khói

[86, 87] Piscicocin CS526 Carnobacterium piscicola CS526 ~4,4 kDa Surimi đông lạnh

Cá [88] 4,4 kDa Carnobacterium pisciocola V1 Piscicocin V1a và V1b

Tetragenococcus, Leuconostoc, Listeria, Enterococcus, Pediococcus Lactobacillus, Listeria, Enterococcus, Pediococcus, Carnobacterium

BLIS Enterococcus Ngao [89] – Enterococcus faecium CHG 2–1

BLIS Listeria [89] –

Enterococcus faecium C-K, C-S, M 2-1, PEF 2-2 Cá cơm, phi lê cá mập, cá kiếm

Bacteriocin Chủng sản xuất VSV bị ức chế

Khối lượng phân tử Mẫu phân lập Nguồn tham khảo

[90] Enterocin B like BLIS Enterococcus faecium ALP7 <6,5 kDa Động vật thân mềm

[91] BLIS 94 kDa Lactobacillus lactis Mẫu trầm tích

<3 kDa [92] Bacteriocin BL8 Bacillus licheniformis Trầm tích

BLIS Vibrio sp. <5 kDa Cá liệt [93]

Listeria, Staphylococcus, Bacillus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc Bacillus, Staphylococcus, Enterococcus, E. coli, Pseudomonas, Shigella Staphylococcus aureus, Bacillus spp. Bacillus spp., Vibrio spp., Pseudomonas spp.

BLIS Vibrio spp. [94]

Bacteriocin <5 kDa Fish pathogens [95] Ấu trùng cá bơn Đại Tây Dương Cá ven biển

~3 kDa [96, 97] Bacteriocin BaCf3 Cá mập biển sâu Bacillus spp., Staphylococcus aureus

BLIS Vibrio Cá chim [98] –

BLIS Vibrio Cá chim [98] – Bacillus spp. NM12 Bacillus amyloliquefaciens BTSS3 Proteus mirabilis D10 Proteus mirabilis D15

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BACTERIOCIN TỪ CÁC CHỦNG

VI KHUẨN

1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới

Budu-Amoako cùng cộng sự [99] đã nghiên cứu hiệu quả tiêu diệt Listeria monocytogenes trong các thùng chứa bảo quản tôm hùm khi kết hợp nisin và nhiệt độ. Hamza và cộng sự [100] đã nghiên cứu khả năng đối kháng của B. licheniformis với Vibrio alginolyticus và Pseudomonas gessardii bằng mô hình in vivo trên ấu trùng Artemia salina. Kết quả cho thấy dịch môi trường nuôi cấy của B. licheniformis có hoạt tính đối kháng mạnh với hai chủng vi khuẩn gây bệnh trên, có khả năng bảo vệ, tăng khả năng sống sót của ấu trùng Artemia salina. Hiệu quả kháng khuẩn có được nhờ sự hiện diện của một protein kháng khuẩn mang tên BLDZ1 [101].

Đã có vài nghiên cứu về bacteriocin trên các nguồn mẫu thủy hải sản tươi, đông lạnh khác nhau: đã sàng lọc vi khuẩn Carnobacterium divergens M35, được phân lập từ một mẫu trai hun khói đông lạnh, tạo ra một bacteriocin mới, divergicin M35, thuộc nhóm IIa. Divergicin M35 nhạy cảm với proteinase-E, α-chymotrypsin và proteinase K, nhưng không nhạy cảm với trypsin và chịu được xử lý nhiệt lên đến 121 ℃ trong 30 phút. Divergicin M35 có hoạt tính kháng Listeria mạnh, đặc biệt là trên chủng Listeria monocytogenes và cũng có hoạt tính kháng vi khuẩn carnobacteria [83]; từ mẫu tôm thẻ chân trắng Ấn Độ đã tách chiết một loại bacteriocin, phocaecin PI80, sinh tổng hợp từ chủng Streptococcus phocae PI80. Chất kháng khuẩn này nhạy cảm với trypsin, proteinase, pepsin, chymotrypsin và ức chế một số tác nhân gây bệnh quan trọng như: Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, V. fischeri [102]; đã phân lập được ba chủng vi khuẩn thuộc chi Vibrio trên hải sản tươi và đông lạnh có hoạt tính đối kháng với các tác nhân gây bệnh V. parahaemolyticus và V. mediterranei trên đĩa thạch. Bản chất protein của chúng được thể hiện qua sự bất hoạt bởi enzyme proteinase K [60].

Một số nghiên cứu đã tuyển chọn được nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin từ nhiều vùng sống khác nhau: đã xây dựng một bộ sưu tập gồm 57 chủng enterococcal phân lập từ các nguồn khác nhau (bao gồm nước sông, nước thải, đất, động vật và các loại rau) được sử dụng để sản xuất bacteriocin [103]. McCall và Sizemore [104] đã tuyển chọn được 795 chủng Vibrio spp. tại đảo Galveston, Texas, nhằm nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Theo nghiên cứu này khoảng 5 % chủng Vibrio spp. được phát hiện có khả năng sinh bacteriocin. Các bacteriocin này có trọng lượng phân tử cao, chỉ có khả năng kháng khuẩn đối với các chủng thuộc loài V. harveyi. Do đó, các loại bacteriocin này được gọi là harveyicin. Shehane và Sizemore [105] đã phân lập được ba chủng vi khuẩn sinh bacteriocin từ các cửa sông gần Wilmington (North Carolina, Mỹ), các chủng vi khuẩn này tổng hợp bacteriocin (IW1, BC1, BC2). IW1 ức chế một vài chủng của V. vulnificus; BC1 ức chế một vài chủng của V. vulnificus, V. cholerae và V. parahaemolyticus; BC2 ức chế tất cả các chủng Vibrio spp. Bacteriocin IW1 dễ biến tính bởi nhiệt, trong khi đó BC1 bền nhiệt ở mức độ trung bình. BC2 rất bền nhiệt và duy trì hoạt tính của chúng khi đông lạnh, hấp khử trùng hoặc khi xử lý ở các mức pH thấp hoặc cao.

Các nghiên cứu đã công bố hoạt tính kháng khuẩn trên các mẫu cá biển có bản chất là peptide: Sugita và cộng sự [93] đã nghiên cứu ở Vibrio spp. chủng NM 10 có hoạt tính ức chế đối với Pasteurella piscicida K-III được phân lập từ ruột của cá liệt (Leiognathus nuchalis). Vi khuẩn này tạo ra một chất kháng khuẩn một cách hiệu quả sau khi tăng trưởng ở 20 ℃ trong 24 giờ trên 1/5 PYBG agar được chuẩn bị với 50 % nước biển ở độ pH từ 7,5 đến 9,0. Các chất kháng khuẩn không bền nhiệt và có bản chất là protein, có khối lượng phân tử nhỏ hơn 5 kDa, có thể là một bacteriocin hoặc một chất giống như bacteriocin. Immacolata Anacarso và cộng sự [81] đã nghiên cứu ở Lactobacillus pentosus 39 trong cá hồi tạo ra hợp chất BLIS có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và hoạt phổ rộng trên nhiều chủng VSV được dùng làm chỉ thị. Bindiya và cộng sự [96] đã nghiên cứu trên các dòng vi khuẩn phân lập từ ruột Centroscyllium fabricii (cá mập biển sâu), nhóm tác giả đã sàng lọc được một số chủng vi khuẩn sản sinh hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh bao gồm Salmonella typhimurium, Proteus vulgaris,

Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus macerans và Bacillus pumilus. Phân tích trình tự gen 16S rDNA so sánh chỉ ra rằng chủng này thuộc giống Bacillus, có độ tương đồng cao (98 %) với trình tự 16S rDNA của Bacillus amyloliquefaciens. Nghiên cứu đã phân lập được 137 chất, một vài trong số chúng có khả năng kháng khuẩn. Nhóm nghiên cứu đã tách phần dịch nổi không có các tế bào đem thử nghiệm với dung dịch amoni sulfate và các enzyme phân giải protein. Kết quả thu được: các chất kháng khuẩn bị kết tủa bởi dung dịch amoni sulfate nồng độ từ 0 – 30 %, bị mất hoạt tính bởi các enzyme phân giải protein. Từ những kết quả trên cho thấy chất kháng khuẩn phân lập được từ vi khuẩn trong ruột cá có bản chất peptide, chính là các bacteriocin.

Wilson và cộng sự [106] đã phân lập được 9 chủng vi khuẩn biển sinh chất kháng khuẩn từ một vài loài động vật không xương sống ở biển (hàu, bọt biển, nhím biển, v.v...). Khi xử lý các chất kháng khuẩn này với proteinase K, các chất kháng khuẩn bị bất hoạt hoàn toàn, chứng tỏ các chất này có thể có bản chất là peptide.

1.3.2. Các nghiên cứu trong nước

Một vài nghiên cứu trong nước cũng đã công bố tiềm năng sử dụng vi khuẩn để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra, tuy số lượng nghiên cứu còn rất hạn chế. Nhìn chung, đa số các vi khuẩn được công bố thuộc chi Bacillus và xạ khuẩn. Theo đó, 2 chủng B. subtilis HY1 và L. lactis CC4K đã được nhóm tác giả Viện Công nghệ Sinh học công bố tính đối kháng với Vibrio trong nước nuôi tôm [8]. Tuy nhiên, hợp chất kháng khuẩn không có bản chất protein, mà là các acid hữu cơ. Các chất acid hữu cơ kháng khuẩn khó áp dụng thực tế, do tác động diệt khuẩn sẽ giảm hoặc mất đi khi pha loãng trong nước nuôi hoặc trong pH kiềm tính của nước nuôi. Nguyễn Thị Bích Đào và cộng sự [9] đã phân lập được các chủng Bacillus subtilis B1, Bacillus subtilis B2, Bacillus amyloliquefaciens B4 từ Thừa Thiên Huế. Nguyễn Xuân Cảnh và cộng sự [10] thu nhận 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng Vibrio. Một nghiên cứu khác đã công bố hiệu quả ức chế Vibrio khi bổ sung vi khuẩn B. subtilis và

xạ khuẩn Streptomyces parvulus vào ao nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) [11].

Theo nghiên cứu của Lê Mỹ Tiểu Ngọc và cộng sự [107] đã phân lập và định danh được 4 chủng Lactococcus garvieae từ hệ tiêu hóa tôm khỏe mạnh có hoạt tính đối kháng nhóm vi khuẩn Vibrio spp., trong đó chủng L. garvieae HN09 đối kháng mạnh với nhiều loài Vibrio spp.. Ngoài ra, Nguyễn Văn Duy và cộng sự [107] đã nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn biển sinh bacteriocin dùng làm thuốc đa năng trong nuôi trồng thủy sản. Kết quả thu được của nghiên cứu này là tuyển chọn được 24 chủng có hoạt tính kháng khuẩn thuộc về nhiều chi khác nhau như Proteus, Providencia, Klebsiella, Alcaligenes, Bacillus và Enterococcus; trong số đó, bảy chủng vi khuẩn cho phổ kháng khuẩn rộng chống lại mầm bệnh từ thực phẩm và động vật, mở đường cho việc khai thác tiềm năng của chúng chế tạo thuốc mới, chế phẩm sinh học ứng dụng trong thực phẩm, chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản.

Như vậy rõ ràng việc nghiên cứu tìm kiếm và thu nhận bacteriocin từ vi khuẩn biển ứng dụng trong nuôi trồng thủy hải sản tại một đất nước có vùng biển rộng lớn, đa dạng sinh học đồng thời có ngành nuôi trồng thủy hải sản phát triển như nước ta hiện nay là hướng nghiên cứu cần tập trung và đẩy mạnh.

1.4. TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA BACTERIOCIN

1.4.1. Ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm

Bacteriocin được sử dụng rộng rãi như một chất bảo quản thực phẩm và hợp chất kháng sinh trong điều trị nhiễm khuẩn cho động vật và người. Một ví dụ tiêu biểu là chất bảo quản thực phẩm nisin. Nisin có 3 dạng trong tự nhiên là nisin A, Z và Q [108, 109, 110]. Nisin được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm qua nhằm bảo vệ thực phẩm khỏi các vi khuẩn gây hư hỏng và ngộ độc [111]. Lactococcus lactis subsp. lactis KT2W2L và Lactobacillus spp. AMET1506 là hai chủng sinh nisin được sử dụng để bảo quản các sản phẩm tôm trong quá trình bảo quản lạnh ở 8 ℃ hoặc nisin được tẩm vào màng thực phẩm sử dụng để kiểm soát các vi khuẩn yếm khí gây hư hỏng thực phẩm [112, 113, 114]. Lactococcus lactis subsp. lactis strain CWBI B1410 sinh ra nisin A

được sử dụng để bảo quản cá lên men truyền thống tại Senegal [115]. Ngoài ra, một bacteriocin khác từ Lactobacillus pentosus 39 cũng đã được thử nghiệm để tiêu diệt Aeromonas hydrophila ATCC 14715 và Listeria monocytogenes trong quá trình bảo quản thực phẩm [81].

1.4.2. Ứng dụng bacteriocin trong bảo vệ sức khỏe con người và

động vật trên cạn

Nghiên cứu của Claesson và cộng sự [116] đã chứng minh bacteriocin Abp 118 từ chủng Lactobacillus salivarius UCC 118 kháng lại tác nhân gây bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm (Listeria monocytogenes).

Bacteriocin được sinh ra từ vi khuẩn Gram âm có khả năng ức chế các loại vi khuẩn gây bệnh đường ruột thông thường như Enterobacter, Klebsiella hoặc Salmonella. Như chủng E. coli H22 có thể ức chế sinh trưởng của 7 chi trong họ Enterobacteriaceae (đó là Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Salmonella, Shigella và Yersinia). Khả năng ức chế này được cho là do sự sản sinh ra microcin C7 và colicin [117].

Nghiên cứu của Carina Audisio và cộng sự [118] khi bổ sung bacteriocin sản xuất từ Enterococcus faecium J96 có khả năng kháng tác nhân gây bệnh Salmonella pullorum và nâng cao tỷ lệ sống của gà con. Một công trình nghiên cứu khác khi bổ sung colicin từ các chủng E. coli vào dạ cỏ của bò đã làm giảm số lượng tác nhân gây bệnh một cách rõ rệt như colicin E7 [119]. Microcin B17 của chủng E. coli cũng có khả năng hạn chế vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ở bê con [120].

1.4.3. Ứng dụng bacteriocin trong nuôi trồng thủy sản

Việc ứng dụng bacteriocin như một thuốc đa năng trong nuôi trồng thủy sản đã được thử nghiệm, tuy nhiên số lượng còn rất hạn chế. Chẳng hạn, một số vi khuẩn như Vibrio spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đã được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản (động vật thân mềm, giáp xác, cá), bao gồm bổ sung trong nước nuôi và bổ sung vào thức ăn thủy sản [121, 122, 123]. Tuy nhiên, hầu hết các bacteriocin này được thu nhận từ các loài vi khuẩn trên cạn và hiệu quả diệt khuẩn không cao, chưa được tối ưu trong

môi trường nuôi trồng động vật nước mặn. Hiện nay, ngày càng nhiều các vi khuẩn biển có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản đã được phát hiện làm gia tăng tiềm năng ứng dụng của nhóm vi khuẩn biển một cách hiệu quả. Có thể kể đến như sử dụng Aeromonas media A199 gia tăng hiệu quả tiêu diệt Vibrio tubiashii gây bệnh trên hàu Crassostrea gigas hoặc sử dụng Alteromonas macleodii 0444 làm tăng tỷ lệ sống của hàu thông qua khả năng tiêu diệt các nhóm vi khuẩn gây bệnh Vibrio coralliilyticus, Vibrio pectenicida trên đối tượng nuôi trồng này [121, 124, 125]. Vì vậy, tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn biển sinh bacteriocin là rất lớn, kỳ vọng giúp ngành nuôi trồng và chế biến thủy sản phát triển bền vững.

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Thời gian thực nghiệm: Từ tháng 02/2020 đến 02/2021.

Địa điểm thực nghiệm: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ

Nha Trang.

2.2. NGUYÊN LIỆU

2.2.1. Vật liệu thí nghiệm

Các mẫu bọt biển thu tại vùng biển Phú Quý (Bình Thuận) ở độ sâu từ 3 – 5 m; các mẫu tôm, cá biển và mẫu rong được thu tại cảng Nha Trang (Khánh Hòa) (bản đồ vị trí thu mẫu tại Phụ lục 1) vào tháng 02/2020. Các mẫu được bảo quản lạnh (15 ℃ đến 20 ℃), vận chuyển về phòng thí nghiệm (PTN) và tiến hành phân lập vi khuẩn. Tất cả các mẫu được rửa sạch 03 lần bằng nước biển vô trùng và được sử dụng làm nguồn phân lập vi khuẩn biển; riêng đối với các mẫu tôm và cá: dùng dao mổ vô trùng rạch phần bụng cá hoặc phần sóng lưng của tôm để thu nhận ruột cho vào ống nghiệm sạch và được sử dụng làm nguồn phân lập vi khuẩn biển.

2.2.2. Môi trường nuôi cấy

Tryptic soy agar (TSA): Các thành phần trên một lít nước bao gồm:

Trypticase pepton: 17 g Phytone pepton :3 g

NaCl: 5 g K2HPO4: 2,5 g

Glucose: 2,5 g Nước cất: 1 L

Agar: 15 g pH 7,3 ± 0,2, 25 °C

Hòa tan 45 g tổng hợp trong 1000 ml nước cất, chuẩn pH, sau đó đổ môi trường vào các bình tam giác, làm nút bông và bọc giấy bạc, hấp khử trùng ở 121 °C trong vòng 15 phút.

Môi trường Tryptic Soy Broth (TSB)

Trypticase pepton: 17 g Phytone pepton: 3 g

NaCl: 5 g K2HPO4: 2,5 g

Glucose: 2,5 g Nước cất: 1 L

pH 7,3 ± 0,2, 25 °C

Hòa tan 30 g tổng hợp trong 1000 ml nước cất, chuẩn pH, sau đó đổ môi trường vào các bình tam giác, làm nút bông và bọc giấy bạc, hấp khử trùng ở 121 °C trong vòng 15 phút.

Môi trường thạch nuôi cấy TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Salts

Sucrose Agar).

Peptone special : 10 g/l Yeast extrat: 5 g/l

Sodium thiosulphate: 10 g/l Sodium citrate: 10 g/l

Sodium cholate: 3 g/l Oxbile (Oxgall): 5 g/l

Sucrose: 20 g/l Sodium chloride 10 g/l

Feric citrate: 1 g/l Brom thymol blue: 0,04 g/l

Thymol blue: 0,04 g/l Agar:15 g/l

pH 8,6 ± 0,2, 25 °C

TCBS agar được sử dụng cho phân lập chọn lọc Vibrio. Thiosulfate và sodium citrate, cũng như tính kiềm của môi trường, ức chế đáng kể sự phát triển của Enterobacteria. Mật bò và sodium cholate làm chậm sự sinh trưởng của enterococci và ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương. Sự acid hóa của môi trường từ sự lên men của sucrose bởi Vibrio khiến cho Brom thymol blue chuyển thành màu vàng. Brom thymol blue và thymol blue là chất chỉ thị pH. Sử dụng thiosulfate như là một nguồn lưu huỳnh, việc sản xuất hydrogen sulfide được phát hiện trong sự có mặt của ferric citrate. Dịch chiết nấm và peptone cung cấp nitrogen, vitamin và các amino acid trong TCBS agar. Sodium chloride cung cấp sự phát triển tối ưu và hoạt động trao đổi chất của các loài Vibrio sống trong môi trường mặn. Agar là tác nhân làm cứng môi trường.

Hòa tan 88,1 gam của môi trường đã khử nước vào trong 1 lít nước cất hoặc nước khử ion; Đun sôi chậm, khuấy đều liên tục cho tới khi tan hoàn toàn; Không hấp tiệt trùng; Làm nguội tới 50 ℃ và đổ vào đĩa petri vô trùng.

Môi trường lỏng LPMB [126]:

Dịch chiết nấm men: 1,0 g/L Peptone: 5,0 g/L

Dextrose: 1,0 g/L KH2PO4: 0,1 g/L

Nước biển tự nhiên: 500 ml/L MgSO4: 0,1 g/L

Nước cất: 500 ml/L pH 7,0 – 7,2

Môi trường LPMA [126]:

Dịch chiết nấm men: 1,0 g/L Peptone: 5,0 g/L

Dextrose: 1,0 g/L KH2PO4: 0,1 g/L

Nước biển tự nhiên: 500 ml/L MgSO4: 0,1 g/L

Nước cất: 500 ml/L Agar: 17 g/L

pH 7,0 – 7,2

Môi trường Mueller Hinton agar:

Chiết thịt bò: 2,0 g/L Sản phẩn phân giải Casein bởi acid: 17,5 g/L

Tinh bột: 1,5 g/L Agar: 17,0 g/L

Nước cất: 1000 ml/L pH = 7,2 – 7,6

Môi trường Mueller Hinton chứa dịch chiết thịt bò, sản phẩm phân giải Casein, Tinh bột và thạch. Chiết thịt bò và sản phẩm phân giải casein cung cấp nitơ, vitamin, carbon, amino acid, lưu huỳnh và các chất dinh dưỡng cần thiết khác. Tinh bột được bổ sung để hấp thụ bất cứ chất chuyển hóa độc nào được tạo ra. Thủy phân tinh bột tạo ra dextrose, nó sẽ cung cấp như một nguồn năng lượng. Thạch là nhân tố làm đông cứng môi trường.

2.2.3. Chủng vi sinh vật chỉ thị

Sử dụng 7 chủng vi sinh vật chỉ thị (VSVCT) gồm: 4 vi khuẩn Gram âm: Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli; 2 vi khuẩn Gram dương: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus; 1 vi nấm (Candida albicans).

Bảng 2.1. Danh sách chủng chỉ thị sử dụng trong thí nghiệm sàng lọc hoạt tính

Vi sinh vật chỉ thị Nguồn gốc Môi trường/nhiệt độ/ điều kiện tối ưu

(A) Vi khuẩn Gram dương

Bacillus cereus ATCC 10876 TSA/30 °C/hiếu khí -

TSA/37 °C/hiếu khí - Staphylococcus aureus ATCC 25923

(B) Vi khuẩn Gram âm

Escherichia coli ATCC 25922 TSA/37 °C/hiếu khí -

Vibrio parahaemolyticus TSA + 3 % NaCl/30 °C/ hiếu khí

Vibrio harveyi TSA + 3 % NaCl/30 °C/ hiếu khí

Vibrio cholerae TSA + 3 % NaCl/30 °C/ hiếu khí vi Chủng khuẩn gây bệnh thủy sản Viện do cứu Nghiên trồng nuôi thủy sản III cung cấp

Candida albicans ATCC 10231 - MHA/30 °C/hiếu khí

Ghi chú: TSA: Tryptic soy agar (Oxoid), MHA: Mueller Hinton agar.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phương pháp thu mẫu và phân lập vi khuẩn biển

Thu mẫu: Mẫu sinh vật biển được lựa chọn là mẫu còn sống hoặc tươi, đánh bắt tự nhiên tại vùng biển Nha Trang (Khánh Hòa) và biển Phú Quý (Bình Thuận), vận chuyển trong ngày về phòng thí nghiệm. Mẫu được thu trong túi zip sạch và phân lập vi khuẩn ngay trong ngày. Mẫu được rửa sạch 03 lần bằng nước biển vô trùng, dùng dao mổ vô trùng rạch phần bụng cá hoặc phần sóng lưng của tôm để thu nhận ruột cho vào ống nghiệm sạch. Đối với rong biển và bọt biển được rửa sạch nguyên mẫu bằng nước biển vô trùng và cho vào túi zip sạch, chuyển về PTN.

Phương pháp phân lập (Hình 2.1):

Vi khuẩn biển (VKB) được phân lập theo phương pháp pha loãng bậc 10. Theo đó, 5 g bọt biển hoặc rong biển cho vào cối tiệt trùng chứa 45 ml nước muối sinh lý (NaCl 0,85 %) và nghiền mẫu cho đến khi mẫu thành dịch huyền phù. Đối với mẫu ruột tôm và cá, 1 g mẫu ruột cho vào 9 ml nước muối sinh lý (NaCl 0,85 %), lắc ở 150 vòng/phút trong 15 phút. Đặt mẫu yên tĩnh trong cối hoặc ống nghiệm trong 10 phút, hút 1 ml dịch huyền phù cho vào 9 ml nước muối sinh lý, trộn đều mẫu và tiếp tục thực hiện pha loãng đến 10-4.

Hút 100 µL dịch ở các nồng độ pha loãng cho vào 2 môi trường Tryptic soya agar (TSA) và Thiosulphate Citrate Bile Sucrose agar (TCBS) trước đó đã bổ sung 50 % nước biển tự nhiên, ủ ở nhiệt độ 30 ℃ trong ba ngày. Khuẩn lạc được quan sát và thu nhận mỗi ngày, làm thuần và giữ ở –80 ℃.

Từ các đĩa phân lập, các khuẩn lạc đơn của vi khuẩn lần lượt được kiểm tra độ thuần khiết bằng phương pháp cấy ria ba chiều. Theo đó, dùng que cấy vòng tiệt trùng chấm lên bề mặt khuẩn lạc, ria qua lại trên khoảng ¼ diện tích đĩa thạch. Đốt que cấy, xoay đĩa 90° ria để tạo vùng ria thứ 2 khoảng ¼ diện tích đĩa thạch. Đường ria đầu tiên cắt vào một đầu của đường ria cuối của vùng ria thứ nhất. Đốt que cấy để tiệt trùng, xoay đĩa 90° ria tương tự để tạo vùng thứ 3 và thứ 4. Sau mỗi lần cấy ria, vi sinh vật sẽ bị tách dần ra khỏi hỗn hợp và phát triển thành một khuẩn lạc riêng rẽ. Sau khi cấy, lật ngược đĩa thạch lại,

bao gói bằng giấy báo và nuôi trong tủ ấm ở 37 ℃ trong vòng 24 giờ. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy. Vi khuẩn được gọi là thuần khiết khi các khuẩn lạc trên đĩa tương đồng về hình thái, kích thước, màu sắc. Đặc điểm khuẩn lạc rời trên đĩa được mô tả dựa trên màu sắc, kích thước, hình thái, đặc điểm bề mặt và rìa của khuẩn lạc.

Các chủng vi khuẩn sau khi thuần khiết được lưu giữ và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Cách bảo quản như sau: nuôi cấy một khuẩn lạc thuần của vi khuẩn trong ống nghiệm chứa 10 ml môi trường TSB đến khi mật độ quang OD600 đo được nằm trong khoảng 0,8 – 1 thì đem lưu giữ. Các chủng vi khuẩn

được giữ trong các ống eppendorf 1,5 ml có bổ sung thêm 30 % glycerol. Lắc nhẹ cho đều hỗn hợp sau đó bảo quản ở –80 ℃.

Cá, tôm Bọt biển, rong

Rửa sạch bằng nước biển vô trùng Rửa sạch bằng nước biển vô trùng

5 g mẫu + 45 ml nước muối sinh lý (0,85 %) 1 g ruột + 9 ml nước muối sinh lý (0,85 %)

Nghiền mẫu thành dịch huyền phù

Lắc 150 vòng/phút trong 15 phút

Để lắng trong 10 phút

Pha loãng 10-2, 10-3, 10-4

Hút 100 µL dịch ở các nồng độ pha loãng vào môi trường TSA và TCBS

Ủ ở 30 ℃ trong 48 – 72 giờ

Kiểm tra, quan sát, thu nhận khuẩn lạc

Làm thuần, giữ mẫu ở –80 ℃

Hình 2.1. Sơ đồ quá trình phân lập vi khuẩn biển từ ruột tôm, ruột cá, bọt biển và rong

Hình 2.2. Hình ảnh một số nguồn mẫu biển thu nhận cho phân lập vi khuẩn biển

Các nguồn mẫu biển thu nhận để phân lập vi khuẩn biển bao gồm: 02 mẫu tôm biển và 04 mẫu cá; (A) Tôm Tít Harpiosquilla spp., (B) Tôm He Penaeus latisulcatus, (C) Cá Bò da Aluterus spp., (D) Cá Trác Priacanthus spp., (E) Cá Lượng Nhật Bản Nemipterus japonicus, (F) Cá Lạc Congresox spp. và (J) Rong nâu Sargassum spp. thu nhận tại vùng biển Nha Trang (Khánh Hòa). (G, H, I) là hình ảnh đại diện của 03 mẫu bọt biển (trong tổng số 12 mẫu bọt biển) thu nhận tại vùng biển Phú Quý (Bình Thuận). Các mẫu bọt biển đang trong quá trình định danh đến loài.

2.3.2. Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng với Vibrio spp. của

các chủng vi khuẩn biển phân lập được

Tìm kiếm các chủng VKB biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. được thực hiện bằng phương pháp cấy dọc [127]. Theo đó, sinh khối VKB được

cấy 1 đường dọc trên đĩa thạch LPMA, ủ ở 30 ℃ qua đêm để vi khuẩn biển hình thành sinh khối. Ba vi khuẩn chỉ thị Vibrio spp. (bao gồm Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae) được cấy ngang từ mép đĩa chạm vào sinh khối vi khuẩn biển. Đĩa được ủ ở 37 ℃ qua đêm cho 3 chủng chỉ thị hình thành sinh khối. Vi khuẩn được cho là có khả năng ức chế Vibrio spp. sẽ hình thành 1 đoạn vô khuẩn giữa sinh khối vi khuẩn biển và vi khuẩn chỉ thị.

2.3.3. Xác định phổ kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn biển được

tuyển chọn

Các vi khuẩn biểu hiện đối kháng với Vibrio spp. được tuyển chọn để tiếp tục nghiên cứu xác định phổ kháng khuẩn bằng phương pháp cấy dọc đối kháng với 07 chủng vi sinh vật chỉ thị [127]. Theo đó, sinh khối VKB được cấy 1 đường dọc trên đĩa thạch LPMA, ủ ở 30 ℃ qua đêm để vi khuẩn biển hình thành sinh khối. 7 VSVCT gồm 4 chủng vi khuẩn Gram âm (Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli), 2 chủng Gram dương (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus) và 1 chủng vi nấm (Candida albicans) được cấy ngang từ mép đĩa chạm vào sinh khối vi khuẩn biển. Đĩa được ủ ở 37 ℃ qua đêm cho 7 chủng chỉ thị hình thành sinh khối. Vi khuẩn được cho là có khả năng ức chế VSV chỉ thị sẽ hình thành 1 đoạn vô khuẩn giữa sinh khối vi khuẩn biển và VSV chỉ thị. Các vi sinh vật chỉ thị được lựa chọn đại diện cho các vi khuẩn gây bệnh trên người/động vật, gây ngộ độc thực phẩm. Kết quả được sử dụng để đánh giá tiềm năng ứng dụng của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn trong các lĩnh vực khác nhau như y dược, thực phẩm và nông nghiệp.

2.3.4. Xác định khả năng sinh chất kháng khuẩn trong môi trường lỏng

Khả năng sinh chất kháng khuẩn của vi khuẩn trong canh trường được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch [128]. Theo đó, 01 khuẩn lạc đơn của vi khuẩn được cấy vào 5 ml môi trường lỏng LPMB, lắc ở tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 30 ℃ trong vòng 24 giờ. Dịch môi trường được ly tâm loại bỏ sinh khối vi khuẩn, lọc qua màng polyether sulfone (PES) 0,45 µm để thu nhận phần dịch trong không chứa tế bào vi khuẩn. Phần dịch trong được thu nhận để xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.

Theo đó, đĩa môi trường Mueller Hinton được quét với 0,5 McFarland dịch huyền phù sinh khối vi khuẩn chỉ thị (0,85 % NaCl), đĩa được đục lỗ thành các giếng có kích thước 6 mm. Khoảng 80 µL dịch trong được cho vào các giếng đục sẵn trên đĩa thạch Mueller Hinton. Sử dụng 4 trong 7 chủng vi khuẩn chỉ thị như trên, bao gồm Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus và Candida albicans. Vi khuẩn được cho là có khả năng sinh chất kháng khuẩn vào môi trường dịch lỏng khi vòng vô khuẩn xuất hiện quanh giếng tương ứng với dịch trong của vi khuẩn đó.

2.3.5. Xác định bản chất hợp chất kháng khuẩn

Phần dịch chiết biểu hiện hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus được sử dụng để xác định bản chất của chất kháng khuẩn hiện diện. Khoảng 200 µL dịch được ủ lần lượt với pronase E, proteinase K, trypsin và lysozyme ở nồng độ cuối cùng là 1 mg/ml ở 37 ℃ trong 60 phút. Khảo sát khả năng kháng Vibrio bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (D = 6 mm) của các hỗn hợp gồm 80 µL dịch đã ủ với enzyme hoặc dịch không ủ với enzyme (đối chứng). Chất kháng khuẩn trong phần dịch trong được xem có bản chất protein hoặc là bacteriocin khi hoạt tính tiêu diệt Vibrio bị mất sau quá trình xử lý enzyme.

2.3.6. Phân tích trình tự nucleotide của gen mã hóa 16S rRNA

số, từ DNA

DNA tổng số của vi khuẩn biển được tách chiết theo phương pháp bead beating [129]. Đoạn gen 16S rRNA được khuếch đại bằng máy luân nhiệt (Polymerase Chain Reaction – PCR) (Máy Techne Prime Thermal Cyclers, hãng Techne, Anh) sử dụng với cặp mồi tổng 27F: AGAGTTTGATCCTGGCTAG và 1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT [130]. Thành phần hỗn hợp cho PCR bao gồm 25 µL đệm mastermix PCR, 2 µL mồi xuôi, 2 µL mồi ngược, 1 – 2 µL DNA khuôn và bổ sung H2O đến thể tích tổng là 50 µL. Chu kì nhiệt của phản ứng bao gồm biến tính ban đầu ở 94 ℃ trong 5 phút; 35 chu kì của 94 ℃ trong 1 phút, 62 ℃ trong 1 phút và 72 ℃ trong 1 phút 30’; và cuối cùng kết thúc ở 72 ℃ trong 7 phút. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1 %, tinh sạch, giải trình tự bằng phương pháp Sanger. Sản phẩm đoạn gen 16S rRNA được so sánh với các trình tự trên Ngân hàng Gen quốc tế bằng công cụ trực tuyến Basic Local

Alignment Search Tool (BLAST) tích hợp trên trang web The National Center for Biotechnology Information (NCBI) [131]. Cây phân loại được xây dựng sử dụng phần mềm MEGA X phiên bản 10.1.8 với phương pháp Neighbor joining sử dụng bootstrap 1000 [132].

2.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của hợp chất

kháng khuẩn

Dựa vào phổ kháng khuẩn được xác định ở bước trên, 4 chủng vi khuẩn tiềm năng được lựa chọn để xác định độ bền nhiệt của hợp chất kháng khuẩn. Độ bền nhiệt là một đặc tính quan trọng nhằm đánh giá khả năng ứng dụng của hợp chất kháng khuẩn trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản. Theo đó, dịch nuôi cấy sau 24 giờ được ly tâm, phần dịch trong được ủ ở 60 ℃ và 80 ℃ trong vòng 60 phút, sau đó được làm lạnh nhanh. Dịch trước (đối chứng) và sau xử lý nhiệt được sử dụng để xác định hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus còn lại bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.

2.3.8. Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng sinh chất kháng

khuẩn của vi khuẩn biển

Thí nghiệm được thiết kế nhằm lựa chọn thời gian lên men tối ưu mà

tại đó vi khuẩn sinh chất kháng khuẩn ở nồng độ cao nhất cho việc thu nhận và

tinh sạch chất sau này. Theo đó, vi khuẩn được cấy ria từ môi trường bảo quản

(–80 ℃) sang đĩa thạch LPMA, ủ ở nhiệt độ 30 ℃ qua đêm. Khuẩn lạc đơn

được tăng sinh giống trong 10 ml canh trường LPMB, lắc ở nhiệt độ 30 ℃

qua đêm với tốc độ lắc 150 rpm. Khoảng 1 ml dịch nuôi cấy qua đêm được

cấy chuyển vào bình tam giác thể tích 250 ml chứa 100 ml môi trường LPMB

(tỷ lệ cấy giống 1 %), lắc ở nhiệt độ 30 ℃ với tốc độ lắc 120 vòng/phút trong

vòng 48 giờ. Định kỳ, 5 ml dịch môi trường được thu nhận mỗi 3 giờ, ở các

thời gian tương ứng là 3, 6, 9, 12, 24, 27 30, 33 và 48 giờ. Mật độ tế bào trong

dịch môi trường được xác định thông qua giá trị OD 600 nm. Môi trường

nuôi cấy được ly tâm ở 4.500 vòng/phút trong 20 phút, lọc qua màng PES

0,45 µm thu lấy dịch môi trường vô khuẩn, dịch được cất giữ ở –20 ℃.

Hoạt tính tiêu diệt V. parahaemolyticus và L. monocytogenes của môi trường

nuôi cấy được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Sơ đồ các nội

dung nghiên cứu chính được thể hiện ở Hình 2.3.

Vật liệu thí nghiệm

Phân lập vi khuẩn

Tuyển chọn chủng vi khuẩn đối kháng VSV chỉ thị

Xác định bản chất của chất kháng khuẩn Xác định phổ kháng khuẩn

Tuyển chọn chủng VKB sinh bacteriocin

Định danh vi khuẩn bằng sinh học phân tử, nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài

Khảo sát thời gian lên men đến khả năng sinh bacteriocin

Kết luận

Hình 2.3. Sơ đồ các nội dung nghiên cứu chính

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. PHÂN LẬP VI KHUẨN BIỂN

19 nguồn mẫu biển đã được thu thập phục vụ cho phân lập VKB bao gồm 02 mẫu ruột tôm, 04 mẫu ruột cá, 01 mẫu rong biển và 12 mẫu bọt biển. Hình ảnh và tên một số mẫu đã được mô tả chi tiết ở Hình 2.2. Dựa trên màu sắc, kích thước và hình thái bề mặt khuẩn lạc VKB, thí nghiệm phân lập thu nhận được 152 chủng VKB bao gồm 128 chủng trên môi trường TSA và 24 chủng trên môi trường TCBS. Hình thái khuẩn lạc của một số đại diện vi khuẩn biển được trình bày ở Hình 3.1 với sự đa dạng về màu sắc, kích thước. VKB trên môi trường TCBS chỉ thu được ở ruột cá, tôm biển ở mẫu gốc hoặc pha loãng 10 lần. VKB thu nhận trên TSA thường được phân lập ở độ pha loãng 100 lần hoặc 1000 lần.

Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn biển

Trong đó: (A) Hình thái khuẩn lạc trên môi trường TCBS; (B) Hình thái khuẩn lạc trên môi trường TSA.

Kết quả cho thấy các vi khuẩn biển có khuẩn lạc đa dạng về hình thái,

kích thước, màu sắc khuẩn lạc.

Bảng 3.1. Thông tin về số lượng chủng VKB được phân lập tương ứng với từng mẫu và từng môi trường

Rong Các nội dung thông tin Bọt biển Ruột tôm Ruột cá

Địa điểm thu mẫu Biển Nha Trang Biển Phú Quý

12 2 4 1 Số lượng mẫu thu nhận cho phân lập VKB

65 18 35 10 Số chủng VKB thu nhận được trên môi trường TSA

0 7 17 0 Số chủng VKB thu nhận được trên môi trường TCBS

65 25 52 10 Tổng số chủng VKB thu nhận được trên cả 2 môi trường (TSA và TCBS)

Kết quả phân lập cho thấy số chủng VKB thu nhận được trên môi trường TSA và TCBS có sự khác nhau giữa các mẫu nghiên cứu. Theo đó, ở môi trường TSA cả 4 loại mẫu đều thu được chủng vi khuẩn, nhiều nhất là ở bọt biển (65 chủng), sau đó ở ruột cá (35 chủng), ruột tôm (18 chủng) và rong biển (10 chủng). Tỷ lệ phân lập vi khuẩn cao nhất ở mẫu bọt biển có thể giải thích do: Bọt biển có cấu trúc đặc trưng gồm nhiều lỗ nhỏ, tạo điểm bám cho vi khuẩn, hỗ trợ cho sự phát triển của nhiều loài nên mật độ của vi khuẩn cao. Trong khi đó, ở môi trường TCBS chỉ 2 mẫu ruột tôm (7 chủng), ruột cá (17 chủng) thu được vi khuẩn không ghi nhận từ mẫu bọt biển. Trong nghiên cứu này, môi trường TCBS được lựa chọn để phân lập các chủng Vibrio spp. từ mẫu nghiên cứu, kết quả cho thấy Vibrio spp. khu trú trong mẫu ruột tôm, cá nhưng không hiện diện trong các mẫu bọt biển. Chủng Vibrio spp. môi trường thường là chủng sinh các bacteriocin có hoạt tính đối kháng mạnh với Vibrio spp., do bacteriocin là hoạt chất thường biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn tương đồng về loài với vi khuẩn sinh bacteriocin.

Số lượng chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường TSA cao hơn môi trường TCBS, do TCBS là môi trường chọn lọc hạn chế sinh trưởng của phần lớn các vi khuẩn khác ngoại trừ Vibrio spp. Trong khi đó, môi trường TSA hỗ trợ sinh trưởng của đa số vi khuẩn từ mẫu.

3.2. TUYỂN CHỌN CHỦNG BIỂU HIỆN HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI

VIBRIO SPP.

Từ các chủng vi khuẩn biển thu nhận được, các VKB biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. (gọi tắt là bac+) được xác định bằng phương pháp cấy dọc sử dụng 03 vi khuẩn chỉ thị là 03 chủng Vibrio spp. khác nhau. Quá trình sàng lọc thu nhận được 30 chủng bac+ từ tổng 152 chủng VKB phân lập trên cả hai môi trường, chiếm tỷ lệ 19,7 %. Số lượng chủng VKB và số lượng chủng bac+ tương ứng với từng nguồn mẫu được đề cập chi tiết trong Bảng 3.2. So sánh với nghiên cứu khác trong cùng khu vực, tỷ lệ phân lập bac+ tương đương với nghiên cứu của Hồ Thị Hồng Nhi (20,3 %), nhưng thấp hơn tỷ lệ phân lập từ nghiên cứu của Nguyễn Văn Duy và cộng sự (29,0 %) [133, 134].

Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc những chủng cho hoạt tính đối kháng Vibrio spp.

Rong Các nội dung thông tin Bọt biển Ruột tôm Ruột cá

9 7 10 1 Số bac+ phân lập được trên môi trường TSA

0 0 3 0 Số bac+ phân lập được trên môi trường TCBS

9 7 13 1 Tổng số bac+ phân lập được trên trên 2 môi trường

65 25 52 10 Tổng số chủng VKB thu nhận được trên hai môi trường

13,8 % 28,0 % 25,0 % 10,0 % Tỷ lệ số bac+ so với tổng VKB phân lập được

Trong đó: bac+ là chủng VKB biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp.

Trong tổng số 128 VKB phân lập trên môi trường TSA có 27 chủng được xác định biểu hiện hoạt tính đối kháng với ít nhất 1 vi khuẩn Vibrio spp., chiếm tỷ lệ 21,09 %. Trong tổng số 24 VKB phân lập trên môi trường TCBS có 03 chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp., chiếm tỷ lệ 12,5 %. Xét trên tổng VKB thu nhận từ hai môi trường, tỷ lệ phân lập chủng bac+ được phát hiện theo thứ tự như sau: ruột tôm (28,0 %) > ruột cá (25,0 %) > bọt biển (13,8 %) > rong (10,0 %) (Bảng 3.2).

Kết quả chỉ ra rằng ruột tôm và cá biển là hai nguồn phân lập quan trọng để thu nhận chủng VKB biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. Kết quả khá tương đồng với một số nghiên cứu tương tự trên thế giới. Sugita và cộng sự [95] đã phân lập được nhiều VKB đối kháng với Vibrio spp. từ 7 loài cá sống ở vùng biển Nhật Bản. Nhóm tác giả này cũng đã ghi nhận hoạt tính đối kháng Vibrio spp. ở VKB phân lập từ ruột cá liệt [95]. Qua so sánh với một số nghiên cứu khác, đa phần nguồn mẫu ban đầu dùng phân lập vi khuẩn cho hoạt tính kháng khuẩn đều dùng ruột tôm, ruột cá, các động vật thân mềm hai mảnh vỏ [96, 102, 133, 135]. Kết quả này góp phần gợi ý cho việc lựa chọn nguồn mẫu thích hợp ở những nghiên cứu tương tự về sau. Ruột các loài thủy, hải sản cung cấp môi trường sống lý tưởng cho sự phát triển và đa dạng các vi sinh vật bởi nguồn dinh dưỡng dồi dào, sự ổn định các thông số về nhiệt độ, pH, v.v... Ngoài ra, sự hiện diện của Vibrio spp. trong ruột thủy, hải sản là tác nhân thúc đẩy sự phát triển những cơ chế đối kháng tự nhiên của hệ vi khuẩn đường ruột đối với Vibrio spp. so với mẫu bọt biển hoặc rong biển [136, 137]. Việc phân lập, nghiên cứu những chủng vi khuẩn cho hoạt tính từ ruột cá, tôm mang tính ứng dụng cao vào thực tiễn nhờ vào khả năng thích nghi tốt với môi trường ruột trong tự nhiên giúp tạo ra các chế phẩm sinh học probiotic tương thích cao với thủy, hải sản, khả năng sản xuất bacteriocin và chất kháng khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh nhưng an toàn với vật chủ ứng dụng tạo ra thuốc điều trị nhiễm khuẩn dùng trong NTTS.

Ngoài nguồn ruột cá, tôm, vi khuẩn bac+ còn được phân lập ở bọt biển, trầm tích và mẫu đất thu ở rừng ngập mặn [138, 139]. Bọt biển là một trong những nhóm sinh vật phong phú và đa dạng nhất trong hệ sinh thái biển [140].

Trong hệ sinh thái biển, bọt biển là một trong những môi trường sống phong phú nhất của các cộng đồng vi sinh vật bao gồm tảo đơn bào, virus, nấm và vi khuẩn, cho thấy sự đa dạng VSV đáng kể [141, 142]. Nhờ sự đa dạng này, bọt biển trở thành nguồn tiềm năng cho việc phân lập các chủng vi khuẩn cho hoạt tính kháng khuẩn. Nghiên cứu của Prem và cộng sự đã phân lập được 75 chủng vi khuẩn từ 4 loài bọt biển tại vịnh Mannar, 24,0 % trong tổng số chủng phân lập được cho hoạt tính kháng khuẩn [143]. Nghiên cứu của Phan Thị Hoài Trinh và cộng sự, 42,0 % (21/50 chủng) trong tổng số chủng VKB phân lập từ 23 loài bọt biển từ vùng đảo Phú Quốc có khả năng ức chế hiệu quả đối với ít nhất 2 trong 10 chủng vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm [126]. Chứng tỏ bọt biển hứa hẹn là nguồn mẫu cung cấp đa dạng các loài vi khuẩn cho hoạt tính kháng khuẩn nói riêng, hoạt tính sinh học nói chung, có tiềm năng mở rộng nghiên cứu nhằm tìm kiếm các liệu pháp điều trị mới.

Ngoài bọt biển, rong biển cũng là một nguồn hứa hẹn cung cấp các vi khuẩn cho hoạt tính. Kết quả nghiên cứu ghi nhận 10,0 % trong tổng số chủng phân lập từ rong biển cho hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả này tương đồng với kết quả của một số nghiên cứu khác trên thế giới. Penesyan và cộng sự đã phân lập được 325 chủng vi khuẩn từ bề mặt hai loài rong biển Delisea pulchra và Ulva australis, trong đó 39 chủng (chiếm 12,0 %) cho hoạt tính kháng khuẩn [144]. Thilakan và cộng sự đã phân lập được 234 chủng từ 7 loài rong biển tại vịnh Mannar, đông nam Ấn Độ, thu được 9,8 % trong tổng số chủng cho hoạt tính kháng khuẩn [145]. Ngoài số lượng các chủng vi khuẩn cho hoạt tính tăng dần trong các nghiên cứu, số lượng các chất có hoạt tính sinh học chiết xuất từ các vi khuẩn trên các loài rong biển trong giai đoạn 2000 – 2010 đã tăng gần 600 % so với thế kỷ trước [146]. Từ những dẫn chứng trên chứng tỏ rong biển là một trong những nguồn mẫu nhiều tiềm năng cần tập trung phát triển các nghiên cứu tương tự.

Nhận thấy tiềm năng đa dạng của các nguồn mẫu khác nhau, chính vì thế trong bước lựa chọn nguồn mẫu phân lập vi khuẩn, chúng tôi đã lựa chọn đa dạng các mẫu từ nhiều nguồn sinh vật biển khác nhau với mục đích nhằm đa dạng hóa kết quả, tăng khả năng phân lập được những chủng cho hoạt tính cao.

Hình 3.2 Hoạt tính đối kháng của VKB đối với 3 chủng Vibrio spp. được xác định bằng phương pháp cấy dọc

Trong đó: (1) V. harveyi, (2) V. parahaemolyticus, (3) V. cholerae.

Hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn biển biểu hiện hoạt tính

đối kháng với Vibrio spp.

Các kết quả nghiên cứu cho thấy hình thái khuẩn lạc của các chủng VKB được biểu hiện rõ ràng hơn trên môi trường thạch Mueller Hinton (MHA) so với môi trường LPMA. Do đó, trong nghiên cứu này môi trường MHA được sử dụng để xác định hình thái khuẩn lạc của 30 chủng bac+. Trên môi trường MHA, sau 24 giờ ủ ở 37 ℃ trong điều kiện hiếu khí, trong tổng số 30 chủng vi khuẩn đã phân lập, khuẩn lạc của 15 chủng có màu trắng đục (chiếm 50,0 %), 07 chủng trắng ngà (23,3 %) và 5 chủng có khuẩn lạc trong (chiếm 16,7 %), 3 chủng khuẩn lạc xanh thu nhận được trên TCBS (10,0 %) (Hình 3.3 và Phụ lục 2). Khuẩn lạc của 20 chủng có dạng tròn (chiếm 66,7 %), 9 chủng có dạng răng cưa (chiếm 30,0 %), 1 chủng có dạng rìa không đều (chiếm 3,3%). Khuẩn lạc của 12 chủng có dạng nhầy (chiếm 40,0 %), 13 chủng có bề mặt nhăn (chiếm 43,3 %), 8 chủng bề mặt nhẵn (chiếm 26,7 %).

Có thể thấy rằng khuẩn lạc các chủng thu nhận từ bọt biển tương đối đa dạng về hình thái so với các chủng vi khuẩn thu nhận từ mẫu ruột tôm, cá. Theo đó, chủng vi khuẩn thu nhận từ nguồn ruột tôm, ruột cá đa số có khuẩn

lạc trắng đục, rìa tròn, nhầy, bề mặt nhăn hoặc có khuẩn lạc trắng trong, lớn, rìa răng cưa, khô, bề mặt nhẵn.

Bảng 3.3. Tổng hợp về hình thái khuẩn lạc của 30 chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. ghi nhận trên môi trường thạch Mueller Hinton

STT Hình thái khuẩn lạc Mã vi khuẩn biển

A. Chủng phân lập trên môi trường TSA

Chủng phân lập từ bọt biển

1 2002STB2.1 Khuẩn lạc trắng đục, rìa răng cưa, bề mặt nhăn

2 2002STB5.3 Khuẩn lạc nhỏ, trắng đục, rìa tròn, bề mặt lồi

3 2002STB19.3 Khuẩn lạc lớn, trắng trong, nhầy, rìa tròn

4 2002STB21.6 Khuẩn lạc vừa, trắng ngà, khô, rìa tròn, bề mặt nhăn

5 2002STB23.1 Khuẩn lạc lớn, trắng trong, nhầy, rìa tròn

6 2002STB23.2 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, nhầy, bề mặt nhăn, rìa tròn,

7 2002STB23.3 Khuẩn lạc vừa, trắng ngà, khô, rìa tròn, bề mặt nhăn

8 2002STB29.1 Khuẩn lạc nhỏ, rìa tròn, trắng ngà, khô, bề mặt nhăn

9 2002STB41.1 Khuẩn lạc lớn, trắng ngà, khô, rìa răng cưa, bề mặt nhẵn

Chủng phân lập từ ruột cá, ruột tôm và rong biển

10 2002NTCL2 Khuẩn lạc vừa, trong, rìa tròn, bề mặt lồi

11 2002NTCL3 Khuẩn lạc vừa, trắng đục, rìa răng cưa, bề mặt nhăn

12 2002NTCL8 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, rìa tròn, nhầy, bề mặt nhăn

13 2002NTBD1 Khuẩn lạc vừa, trắng đục, rìa răng cưa, khô, bề mặt nhẵn

14 2002NTBD4 Khuẩn lạc vừa, trắng ngà, rìa răng cưa, khô, bề mặt nhẵn

STT Hình thái khuẩn lạc Mã vi khuẩn biển

15 2002NTBD6 Khuẩn lạc nhỏ, trắng đục, rìa tròn, lồi

16 2002NTST1 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, lớn, rìa răng cưa, khô, bề mặt nhẵn

2002NTST2 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, rìa tròn, nhầy, bề mặt nhăn 17

2002NTST5 Khuẩn lạc lớn, trong, nhầy, bề mặt nhăn, rìa tròn 18

19 2002NTCD2 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, rìa không đều, khô, bề mặt nhẵn

20 2002NTTB1 Khuẩn lạc lớn, trong, nhầy, bề mặt nhăn, rìa tròn

21 2002NTTB2 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, rìa răng cưa, khô, bề mặt nhẵn

22 2002NTTT1 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, rìa răng cưa, khô, bề mặt nhẵn

23 2002NTTT3 Khuẩn lạc vừa, trắng đục, rìa răng cưa, khô, bề mặt nhẵn

2002NTTT4 Khuẩn lạc vừa, trắng ngà, nhầy, bề mặt nhăn, rìa tròn 24

2002NTTT6 Khuẩn lạc lớn, trắng đục, nhầy, bề mặt nhăn, rìa tròn 25

2002NTTT7 Khuẩn lạc nhỏ, trắng đục, rìa tròn, lồi 26

2002NTR06 Khuẩn lạc vừa, trắng ngà, khô, rìa tròn, tâm nhăn 27

B. Chủng thu nhận trên môi trường TCBS

28 2002NTBD8 Khuẩn lạc vừa, xanh, rìa tròn, nhầy, bề mặt lồi

29 2002NTBD9 Khuẩn lạc vừa, xanh, rìa tròn, nhầy, bề mặt lồi, tâm đen

30 2002NTCD10 Khuẩn lạc vừa, xanh, rìa tròn, nhầy, bề mặt lồi

Trong đó: Khuẩn lạc nhỏ: đường kính 1 – 2 mm; Khuẩn lạc vừa: đường kính 2 – 3 mm; Khuẩn lạc lớn: đường kính > 3 mm.

Hình 3.3. Hình thái của một số đại diện bac+ trên môi trường Mueller Hinton agar

3.3. PHỔ KHÁNG KHUẨN VI KHUẨN TRÊN MÔI TRƯỜNG THẠCH

DINH DƯỠNG

Ba mươi chủng bac+ thu nhận ở thí nghiệm trên được sử dụng để xác định phổ kháng khuẩn bằng phương pháp cấy dọc. Phổ kháng khuẩn được xác định dựa trên khả năng tiêu diệt 7 chủng VSVCT bao gồm 4 vi khuẩn Gram âm (3 Vibrio spp., 1 E. coli), 2 vi khuẩn Gram dương (S. aureus, B. cereus) và 1 vi nấm (C. albicans). Kết quả phổ kháng khuẩn của các chủng bac+ được thống kê trong Bảng 3.4.

Bảng 3.4. Kết quả xác định phổ kháng khuẩn của 30 chủng vi khuẩn biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. xác định bằng phương pháp cấy dọc

Vi khuẩn chỉ thị

TT Mã vi khuẩn biển E. coli Vibrio harveyi Vibrio cholerae B. cereus S. aureus C. albicans Vibrio parahae- molyticus

Vi khuẩn phân lập trên môi trường TSA

– 1 2002STB2.1 ++ ++ – + – –

2 2002STB5.3 +++ +++ ++ – + – –

+ 3 2002STB19.3 + – – + + –

+ 4 2002STB21.6 – ++ +++ + – –

++ 5 2002STB23.1 ++ + – + – –

++ 6 2002STB23.2 ++ ++ – + + –

7 2002STB23.3 +++ ++ ++ – + – –

8 2002STB29.1 +++ ++ ++ – + + –

9 2002STB41.1 +++ +++ +++ + + – –

10 2002NTCL2 +++ +++ ++ ++ ++ ++ +

+ 11 2002NTCL3 + + – – – –

++ 12 2002NTCL8 ++ – – + + +

++ 13 2002NTBD1 ++ + – + + +

14 2002NTBD4 +++ +++ ++ – + + +

– 15 2002NTBD6 ++ – – + – –

+++ – 16 2002NTST1 +++ +++ ++ ++ ++

– 17 2002NTST2 + + – – – –

18 2002NTST5 +++ ++ +++ – + + +

19 2002NTCD2 ++ ++ ++ + + + +

20 2002NTTB1 +++ ++ ++ + + – +

21 2002NTTB2 ++ ++ ++ – + + –

22 2002NTTT3 +++ ++ ++ + + + +

23 2002NTTT4 +++ +++ ++ + + + –

24 2002NTTT6 +++ ++ ++ + + + ++

25 2002NTTT7 +++ +++ ++ – + + +

26 2002NTTT1 +++ ++ ++ – + – ++

27 2002NTR06 +++ +++ ++ + + + ++

Vi khuẩn phân lập trên môi trường TCBS

28 2002NTBD8 + + – – – – –

29 2002NTBD9 + + + – – – –

30 2002NTCD10 + + + – – – –

Trong đó: Khoảng cách vô khuẩn giữa sinh khối vi khuẩn biển và sinh khối vi khuẩn chỉ thị (D) là: (–): không hoạt tính

(+): hoạt tính yếu, D <3 mm

(++): hoạt tính trung bình, 3 mm ≤ D ≤5 mm

(+++): hoạt tính mạnh, D > 5 mm

Kết quả cho thấy, các bac+ thu nhận trên môi trường TSA sở hữu phổ kháng khuẩn rộng và mạnh hơn bac+ phân lập trên môi trường TCBS. Trong tổng 27 chủng bac+ thu nhận trên môi trường TSA, tỷ lệ chủng có biểu hiện đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là cao nhất (chiếm 96,29 %, 26/27 chủng), theo sau là B. cereus (chiếm tỷ lệ 92,6 %, 25/27 chủng), Vibrio harveyi (chiếm tỷ lệ 88,89 %, 24/27 chủng) và Vibrio cholerae (chiếm tỷ lệ 88,89 %, 24/27 chủng). Trong khi đó, tỷ lệ chủng ức chế S. aureus, C. albicans và E. coli ít hơn, chiếm tỷ lệ lần lượt 62,9 % (17/27 chủng), 44,44 % (12/27 chủng) và 33,3 % (9/27 chủng). Ngược lại 3 chủng bac+ thu nhận trên môi trường TCBS không có biểu hiện hoạt tính đối kháng với các VSVCT khác ngoài Vibrio spp. Số chủng cho hoạt tính đối kháng với cả 3 chủng Vibrio là 23 trên tổng số 30 chủng thử nghiệm (chiếm 76,7 %).

Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn biển thu được trên môi trường TSA đa số có phổ kháng rộng. Trong đó, 8,5 % (5/27) chủng tiêu diệt tất cả 7 vi sinh vật chỉ thị (VSVCT), 29,6 % (8/27) vi khuẩn biểu hiện hoạt tính đối kháng với 6 VSVCT, 18,5 % (5/27) chủng tiêu diệt 5 VSVCT và 14,8 % (4/27) chủng tiêu diệt 4 VSVCT.

Hình 3.4. Phổ kháng khuẩn của VKB đối với 7 chủng VSVCT được xác định bằng phương pháp cấy dọc

Trong đó: Hình (A), (B), (C) chỉ ra chủng có biểu hiện tiêu diệt các VSVCT. (D) là chủng không có hoạt tính tiêu diệt VSVCT. 7 chủng VSVCT bao gồm (1) S. aureus, (2) B. cereus, (3) C. albicans, (4) sinh khối VKB làm chứng âm, (5) V. harveyi, (6) V. parahaemolyticus, (7) V. cholerae và (8) E. coli.

Từ những kết quả trên cho thấy các chủng VKB được phân lập trong nghiên cứu không chỉ có khả năng đối kháng tốt với Vibrio spp. mà còn có khả năng ức chế nhiều vi khuẩn chỉ thị khác. Những vi khuẩn được chọn làm VSVCT trong nghiên cứu đều là những vi khuẩn gây bệnh phổ biến cho người và động vật và vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm (Bảng 2.1). Với phổ kháng khuẩn rộng, các chủng VSV được tuyển chọn hứa hẹn khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau (y dược, nuôi trồng thủy hải sản, bảo quản thực phẩm…).

3.4. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG KHUẨN TRONG

DỊCH MÔI TRƯỜNG LỎNG

Thử nghiệm khả năng sinh chất kháng khuẩn của các chủng VKB có hoạt tính trong canh trường bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch để sử dụng trong quá trình tối ưu hóa các điều kiện lên men sinh chất trong môi trường lỏng, là tiền đề cho việc tinh sạch hoặc mục đích xác định bản chất của hợp chất kháng khuẩn. Sử dụng 4 VSVCT bao gồm V. harveyi, V. parahaemolyticus, B. cereus, C. albicans. Khả năng kháng khuẩn của 30 chủng VKB được thể hiện trong Bảng 3.5.

Bảng 3.5. Tổng hợp khả năng kháng khuẩn của 30 chủng vi khuẩn biển biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch

STT Mã chủng V. harveyi V. parahaemolyticus B. cereus C. albicans

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2002STB2.1 2002STB5.3 2002STB19.3 2002STB21.6 2002STB23.1 2002STB23.2 2002STB23.3 2002STB29.1 2002STB41.1 2002NTCL2 2002NTCL3 2002NTCL8 2002NTBD1 2002NTBD4 2002NTBD6 2002NTST1 2002NTST2 – +++ +++ ++ – – +++ +++ +++ +++ – +++ +++ ++ – ++ – ++ ++ ++ – – – ++ – ++ ++ – ++ ++ +++ – ++ – + + – – + + + + + ++ – + + + – ++ – – – – – – – – – – – – – – – – – –

STT Mã chủng V. harveyi V. parahaemolyticus B. cereus C. albicans

2002NTST5 18 2002NTCD2 19 2003NTTB1 20 2002NTTB2 21 2002NTTT3 22 2002NTTT4 23 2002NTTT6 24 2002NTTT7 25 2002NTCT1 26 2002NTR06 27 2002NTBD8 28 2002NTBD9 29 30 2003NTCD10 ++ +++ ++ – – ++ + + – +++ – – – – ++ ++ – – ++ ++ – – ++ – – – + – – + – + + – – + – – – – – – – – – – – – – – – –

Trong đó: Đường kính vòng kháng khuẩn (bao gồm đường kính giếng d = 6 mm): (–) không hoạt tính; (+) 6 – 10 mm; (++) >10 mm; (+++) >20 mm.

Trong số 27 chủng phân lập được trên môi trường TSA, 18 chủng (chiếm 66,6 %) có khả năng ức chế V. harveyi, 17 chủng (chiếm 62,9 %) có khả năng ức chế B. cereus, 15 chủng (chiếm 55,5 %) có khả năng ức chế V. parahaemolyticus và không ghi nhận dịch nuôi cấy có khả năng ức chế C. albicans (Hình 3.5).

Kết quả cho thấy rằng số lượng chủng có biểu hiện hoạt tính đối kháng được phát hiện bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch thấp hơn so với phương pháp cấy dọc (Bảng 3.4). Điều này có thể do nồng độ của chất kháng khuẩn sinh ra trong dịch nuôi thấp hơn (do pha loãng) so với nồng độ chất được vi khuẩn tiết ra trên môi trường thạch, do đó giảm khả năng tiêu diệt vi khuẩn mục tiêu. Thêm vào đó, nhiều nghiên cứu cũng khẳng định quá trình sinh chất kháng khuẩn của vi khuẩn trong canh trường phụ thuộc nhiều yếu tố như thời gian tăng trưởng, tốc độ lắc, mật độ vi khuẩn, thành phần môi trường, yếu tố cảm ứng quá trình sinh chất. Kết quả này cho thấy việc cần thiết kết hợp hai phương pháp

thử nghiệm giúp tăng độ chính xác của quá trình sàng lọc những chủng có hoạt tính kháng khuẩn, tạo thuận lợi cho những thử nghiệm tiếp theo. Trong đó, phương pháp cấy dọc được sử dụng ở bước sàng lọc sơ bộ nhằm tuyển chọn chủng vi khuẩn biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn mong muốn, giúp tránh bỏ qua những vi khuẩn tiềm năng. Phương pháp khuếch tán đĩa thạch được sử dụng trong quá trình tối ưu hóa các điều kiện lên men sinh chất trong môi trường lỏng cho việc tinh sạch hoặc mục đích xác định bản chất của hợp chất kháng khuẩn.

Hình 3.5. Khả năng sinh chất kháng khuẩn trong canh trường bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch

Trong đó: VSVCT bao gồm (A): V. harveyi, (B): V. parahaemolyticus, (C): B. cereus, (D): C. albicans.

Dựa vào kết quả trong Bảng 3.5, các VKB có hoạt tính ức chế mạnh đối với hai chủng V. harveyi và V. parahaemolyticus bao gồm 2002STB5.3, 2002STB23.3, 2002STB41.1, 2002NTCL2, 2002NTCL8, 2002NTBD1, 2002NTBD4, 2002NTR06. Các chủng có thể được sử dụng như những chủng

probiotic trong nuôi trồng thủy sản nhằm kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh trong nước ao nuôi hoặc nguồn thu nhận các chất kháng khuẩn tinh sạch Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi là bước đầu trong quá trình sàng lọc, chưa đánh giá toàn diện các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy. Do đó, trong nghiên cứu thu nhận bacteriocin nói riêng, nghiên cứu chiết xuất chất kháng khuẩn từ dịch môi trường nuôi cấy nói chung, cần thiết có những thí nghiệm nhằm tối ưu hóa các điều kiện tăng trưởng của vi khuẩn.

Từ kết quả nghiên cứu nhận thấy hoạt tính của các chủng thử nghiệm ức chế tốt đối với Vibrio spp. so với 2 VSVCT còn lại. Đồng thời trong chủng Vibrio kể trên, V. parahaemolyticus được đặc biệt quan tâm. Vì thế chúng tôi chọn ra 15 chủng biểu hiện hoạt tính ức chế mạnh trên V. parahaemolyticus để tiến hành những nghiên cứu tiếp theo.

3.5. XÁC ĐỊNH BẢN CHẤT CỦA HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN

V. parahaemolyticus là nguyên nhân gây ra bệnh “hoại tử gan tụy cấp” với tỷ lệ chết 100 % trên tôm, gây thiệt hại rất lớn cho ngành nuôi tôm trên toàn thế giới [2, 3]. Nên việc sàng lọc được các chủng khuẩn cho hoạt tính cao đối với V. parahaemolyticus cho ý nghĩa ứng dụng rất lớn. Do đó, 15 dịch môi trường nuôi cấy của 15 chủng biểu hiện hoạt tính ức chế V. parahaemolyticus được sử dụng để xác định bản chất chất kháng khuẩn hiện hiện. (Bảng 3.6)

Kết quả cho thấy rằng, 9 trong số 15 dịch kháng khuẩn bị giảm hoặc bị mất hoạt tính sau ủ với enzyme proteinase E; trong đó có 6 dịch bị mất hoạt tính hoàn toàn là 2002STB5.3, 2002STB23.3, 2002STB41.1, 2002NTBD1, 2002NTCD2, 2002NTR06. Điều này chứng tỏ đây là nhóm các chất kháng khuẩn có bản chất là protein. Kết quả tương tự với những nghiên cứu gần đây liên quan đến phân lập vi khuẩn biển như Vibrio mediterranei, Lactobacillus từ ruột động vật thủy sản [60, 135]. Các nghiên cứu này xác định chất kháng khuẩn nhạy với enzyme proteinase thường được xác định là bacteriocin [135].

Bảng 3.6. Hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus của 15 chủng vi khuẩn biển sau khi ủ với proteinase E

STT Mã chủng

Hoạt tính kháng V. parahaemolyticus sau khi ủ với proteinase E

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 2002STB2.1 2002STB5.3 2002STB19.3 2002STB23.3 2002STB41.1 2002NTCL2 2002NTCL8 2002NTBD1 2002NTBD4 2002NTST1 2002NTCD2 2003NTTB1 2002NTTT4 2002NTTT6 2002NTR06 Hoạt tính kháng V. parahaemolyticus trước khi ủ với proteinase E ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + – + – – + ++ – ++ ++ – ++ ++ ++ –

Trong đó: Đường kính vòng kháng khuẩn (bao gồm đường kính giếng d = 6 mm): (–) không hoạt tính; (+) 6 – 10 mm; (++) >10 mm; (+++) >20 mm

Bên cạnh đó, 6 trong 15 dịch môi trường vẫn giữ hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus sau khi ủ enzyme. Lý giải cho kết quả này do nhiều nguyên nhân, bao gồm: i) Do cấu trúc đa dạng, một số bacteriocin có cấu trúc bậc 4, ẩn những amino acid là điểm cắt chuyên biệt của proteinase E gây hiện tượng âm tính giả; do đó, việc xác định bản chất của bacteriocin cần phải sử dụng kết hợp nhiều loại enzyme phân cắt protein khác nhau như proteinase K, trypsin. ii) Nhiều vi khuẩn đặc biệt là Bacillus sinh cả bacteriocin, lipopeptide và một số acid hữu cơ có hoạt tính ức chế Vibrio spp. Vì vậy có thể dịch nuôi cấy vẫn biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn nhưng không phải là hoạt tính do bacteriocin.

Các vi khuẩn này được xem như nguồn thu nhận dồi dào các hợp chất kháng khuẩn, ứng dụng không chỉ trong NTTS mà còn dùng trong nông nghiệp, kiểm soát nấm gây bệnh và như một nguồn kháng sinh hữu hiệu trong y dược.

Chủng 2002NTBD1 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nên dịch lên men của chủng này tiếp tục được thử nghiệm với nhiều loại enzyme khác nhau để xác định hoạt chất kháng khuẩn có phải là bacteriocin hay không, xác định bằng cách ủ dịch chiết của chủng 2002NTBD1 với các enzyme như trypsin, proteinase K, pronase E, lysozyme (1,0 mg/mL) ở 37 °C trong 1 giờ (Hình 3.6)

Hình 3.6. Ảnh hưởng của enzyme lên hoạt tính kháng Vibrio spp. của dịch lên men chủng 2002NTBD1

Trong đó: (S): Dịch chiết lên men thu ở 24 giờ; (K): dịch chiết ủ với enzyme proteinase K, (L) dịch chiết ủ với enzyme lysozyme, (E) dịch chiết ủ với pronase E, (T) dịch chiết ủ với trypsin; T (-), E (-), L (-), K (-): đối chứng âm của các enzyme tương ứng.

Kết quả cho thấy hợp chất kháng khuẩn trong dịch chiết mất hoạt tính khi được xử lý với các enzyme trypsin, pronase E, proteinase K, nhưng duy trì

hoạt tính sau khi ủ lysozyme. Hoạt chất kháng Vibrio spp. từ dịch lên men kháng với lysozyme, do đó chất kháng khuẩn không phải là H2O2. Trong khi đó, hoạt chất kháng khuẩn mất hoạt tính khi được xử lý với các enzyme thuộc nhóm phân giải protein/peptide như trypsin, pronase E, proteinase K. Kết quả chỉ ra rằng hợp chất kháng khuẩn hiện diện trong dịch lên men chủng 2002NTBD1 là bacteriocin.

3.6. PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA GEN MÃ HÓA

16S rRNA

Bốn trong số các vi khuẩn tiềm năng (2002STB23.3, 2002STB41.1, 2002NTCL2, 2002NTBD1), có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và có sự đa dạng về chủng loại thể hiện qua hình thái khuẩn lạc được tuyển chọn để định danh vi khuẩn bằng phương pháp phân tích trình tự 16S rRNA. Theo đó, bộ gen của 4 các VKB này được tách chiết và dùng làm khuôn để khuếch đại gen 16S rRNA. Kết quả PCR cho thấy sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, kích thước của 03 chủng 2002STB23.3, 2002STB41.1, 2002NTCL2 hơn 1000 bp.

Trình tự đoạn gen 16S rRNA của VKB 2002STB23.3, 2002STB41.1,

2002NTCL2, 2002NTBD1 được trình bày ở phần Phụ lục 3.

Hình 3.7. Cây phân loại thể hiện mối liên quan giữa 4 chủng có hoạt tính mạnh và loài có trình tự gen 16S rRNA tương đồng

Cây được vẽ theo phương pháp Neighbor Joining, với bootstrap đối với 1000 phép so sánh. Kết quả cho thấy mối quan hệ giữa các chủng nghiên cứu với các thành viên đại diện trong chi Bacillus: B. altitudinis, B. licheniformis và B. amyloliquefaciens.

Dựa trên kết quả so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen và cây phát sinh loài (Hình 3.7), chủng 2002STB23.3 phân lập từ bọt biển có độ tương đồng 98,0 % với Bacillus licheniformis MPF22 (MT487672.1). Một chủng khác được phân lập từ bọt biển là 2002STB41.1 có độ tương đồng trình tự 16S rRNA là 98,3 % với vi khuẩn Bacillus altitudinis strain NPB34b (MT598007.1). Hai chủng 2002NTBD1 và 2002NTCL2 được phân lập từ ruột hai loài cá khác nhau đều được xác định là vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens, do trình tự 16S rRNA tương đồng lần lượt là 97,6 % và 99,0 % với trình tự của chủng Bacillus amyloliquefaciens strain MPA (NR117946.1). Kết quả này chứng tỏ sự đa dạng về loài của vi khuẩn biển sinh bacteriocin được phân lập ở vùng biển Khánh Hòa và Bình Thuận.

Các chủng thể hiện khả năng kháng tốt đối với V. parahaemolyticus được định danh đều thuộc chi Bacillus. Các loài thuộc chi Bacillus là những trực khuẩn Gram dương, hiếu khí, hình que, có khả năng tạo nội bào tử [147]. Nhờ khả năng hình thành nội bào tử, sự đa dạng về đặc tính sinh lý và khả năng tạo nhiều hợp chất kháng khuẩn giúp chúng phân bố khắp nơi trong môi trường đất, nước, thức ăn và hệ VSV đường ruột của nhiều loài động vật [148]. Bốn loài ban đầu của chi (Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. pumilus và B. amyloliquefaciens) được phát hiện từ hơn 40 năm trước [149, 150]. Cho đến nay, chi Bacillus được ghi nhận có 93 loài [151]. Với sự gia tăng nhanh chóng các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh thúc đẩy việc tìm kiếm các hợp chất mới nhằm giải quyết vấn đề sức khỏe cấp bách này. Trong số đó, các peptide kháng khuẩn được xem như một giải pháp đầy hứa hẹn cho vấn đề kháng kháng sinh [152]. Nhờ vào khả năng tạo ra một lượng lớn các peptide kháng khuẩn đa dạng về cấu trúc bao gồm bacteriocin, glycopeptide, lipopeptide và các peptide vòng, chi Bacillus được xem là một trong những nguồn quan trọng cung cấp các chất cho hoạt tính kháng khuẩn [153]. Chính vì thế, việc định danh tên khoa học các

chủng có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin, cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh trong nghiên cứu tiếp tục khẳng định vai trò của chi Bacillus trong việc tìm kiếm các thế hệ kháng sinh mới hiệu quả hơn.

Trong 4 chủng được định danh trong nghiên cứu, hai chủng Bacillus licheniformis và B. amyloliquefaciens đã được nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi. Điểm qua kết quả của một số nghiên cứu tiến hành trên loài Bacillus licheniformis như sau: Nghiên cứu của Võ Hồng Phượng và cộng sự [154] tiến hành trên chủng Bacillus licheniformis phân lập từ ruột cá Đối (Mugil cephalus) trong tự nhiên cho hoạt tính đối kháng tốt với Vibrio parahaemolyticus với vòng vô khuẩn 15 mm trong thời gian 24 giờ. Theo nghiên cứu của Vinoj và cộng sự [155], chủng B. licheniformis phân lập từ tôm he Ấn Độ (Fenneropenaeus indicus) cho hoạt tính đối kháng với V. parahaemolyticus với vòng kháng khuẩn 14 – 15 mm trong 24 giờ. Nghiên cứu của Mengfan và cộng sự [156], chủng B. licheniformis được phân lập từ các ao nuôi tôm tại Chiết Giang cho hoạt tính đối kháng với 3 chủng Vibrio, trong đó hiệu lực trên chủng V. parahaemolyticus K cho vòng vô khuẩn 18 mm. Nghiên cứu của Girija và cộng sự [157], dịch nuôi cấy B. licheniformis theo từng nồng độ cho ức chế V. parahaemolyticus với vòng vô khuẩn từ 6 – 14 mm. Qua so sánh nhận thấy sự tương đồng trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi với những nghiên cứu trước đó được thực hiện trên loài B. licheniformis. Hơn nữa trong những nghiên cứu của các tác giả khác, B. licheniformis cho hiệu lực đối kháng tốt với đa dạng các chủng vi khuẩn gây bệnh như Vibrio alginolyticus, Pseudomonas gessardii, Vibrio fluvialis FX-2, Streptococcus spp., Listeria monocytogenes, Bacillus cereus [100, 156, 158, 159]. Nghiên cứu của chúng tôi cũng chỉ ra hiệu lực đối kháng của B. licheniformis trên hai chủng V. harveyi và V. cholerae. Vậy nên kết quả nghiên cứu góp phần cung cấp dữ liệu về hoạt tính đối kháng của loài B. licheniformis được phân lập từ mẫu bọt biển, thu thập tại vùng biển Bình Thuận.

Điểm qua kết quả của các nghiên cứu tiến hành trên loài Bacillus amyloliquefaciens như sau: Nghiên cứu của Chen và cộng sự [160], phân lập B. amyloliquefaciens từ ruột cá Paralichthys lethostigma đối kháng

trong đó hiệu lực

V. parahaemolyticus với vòng vô khuẩn 15,33 mm. Nghiên cứu của nhóm tác giả từ Đại học Cần Thơ, phân lập B. amyloliquefaciens từ các mẫu nước ao nuôi tôm tại huyện Duyên Hải (Trà Vinh) cho hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus với vòng kháng khuẩn 13,67 mm [161]. Nghiên cứu của Hong-Mei Xu và cộng sự [162] tiến hành trên chủng B. amyloliquefaciens M1 cho hoạt tính đối kháng với nhiều chủng Vibrio spp. kháng thuốc phân lập được trên chủng từ những động vật biển bị bệnh, V. parahaemolyticus cho vòng vô khuẩn với đường kính là 17 mm. Qua so sánh nhận thấy sự tương đồng trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi với những nghiên cứu trước đó được thực hiện trên loài B. amyloliquefaciens.

Loài Bacillus altitudinis chưa được nghiên cứu sâu tại Việt Nam, số lượng nghiên cứu trong nước về hoạt tính sinh học của loài còn hạn chế. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi lần đầu tiên ghi nhận hoạt tính kháng khuẩn của chủng trên, khi phân lập tại vùng biển Khánh Hòa và Bình Thuận. Nghiên cứu của Phạm Việt Cường và cộng sự [163] phân lập B. altitudinis từ hải miên ở bán đảo Sơn Chà, cho hoạt tính đối kháng với V. parahaemolyticus với đường kính vòng vô khuẩn 10,7 mm. Galaviz-Silva và cộng sự [164] phân lập B. altitudinis từ cua ẩn sĩ (Clibanarius panamensis), chủng này cho hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus với đường kính vòng vô khuẩn là 14,7 mm. Với những kết quả trên, cho thấy loài B. altitudinis có hoạt tính kháng khuẩn tốt, đặc biệt trên vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Vì vậy cần thiết có những nghiên cứu sâu hơn nhằm đánh giá toàn diện hoạt tính sinh học của loài này, góp phần ứng dụng trong điều trị bệnh trên thủy hải sản.

3.7. ĐỘ BỀN NHIỆT CỦA CÁC HỢP CHẤT KHÁNG VIBRIO SPP.

Độ bền nhiệt của hợp chất kháng khuẩn sinh bởi 4 vi khuẩn 2002STB23.3, 2002STB41.1, 2002NTBD1, 2002NTCL2 lần lượt được khảo sát. Theo đó, dịch trong của môi trường lên men 24 giờ của 4 vi khuẩn lần lượt được ủ ở nhiệt độ 60 ℃ và 80 ℃ trong 1 giờ, kết quả thí nghiệm được ghi nhận trong Hình 3.8.

Hình 3.8. Khảo sát độ bền nhiệt của hợp chất kháng Vibrio spp. sinh bởi 4 chủng vi khuẩn biển

Trong đó: (-) là dịch trong của môi trường sau ly tâm làm đối chứng (chưa xử lý nhiệt); 60°: Dịch trong được xử lý nhiệt ở 60 ℃ trong 60 phút; 80°: Dịch trong được xử lý nhiệt ở 80 ℃ trong 60 phút.

Kết quả cho thấy chất kháng khuẩn trong dịch trong 2 vi khuẩn đường ruột (2002NTBD1 và 2002NTCL2) khá bền nhiệt so với dịch trong 2 chủng phân lập tính kháng Vibrio từ bọt biển (2002STB23.3, 2002STB41.1). Hoạt parahaemolyticus của dịch trong chủng 2002NTBD1 và 2002NTCL2 vẫn giữ nguyên sau 60 phút ở 60 ℃, chỉ mất hoạt tính ở nhiệt độ 80 ℃ sau 60 phút. Trong khi đó, dịch trong từ chủng 2002STB41.1 và 23.3 mất hoàn toàn hoạt tính sau ủ ở 60 ℃ trong 60 phút. Kết quả cho thấy tiềm năng ứng dụng cao của các hợp chất kháng khuẩn thu nhận từ chủng 2002NTCL2 và 2002NTBD1 trong ngành thủy sản.

3.8. ẢNH HƯỞNG THỜI GIAN LÊN MEN ĐẾN KHẢ NĂNG SINH CHẤT

KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN BIỂN

Chủng 2002NTBD1 được lựa chọn tiếp theo để khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men lên khả năng sinh chất của vi khuẩn. Thí nghiệm được

thiết kế nhằm xác định thời gian lên men tối ưu để thu nhận chất kháng khuẩn với nồng độ cao nhất, phục vụ cho các thí nghiệm tinh sạch chất sau này.

Bảng 3.7 thể hiện giá trị mật độ vi khuẩn và đường kính vòng vô khuẩn đối kháng với Vibrio parahaemolyticus và L. monocytogenes của dịch nuôi cấy chủng Bacillus spp. 2002NTBD1 biển ở các thời điểm nuôi khác nhau. Dựa trên giá trị OD600, có thể thấy rằng quá trình sinh trưởng của vi khuẩn bắt đầu chuyển sang pha cân bằng sau 24 giờ nuôi cấy. Trong đó, vi khuẩn bắt đầu sinh chất kháng khuẩn tiêu diệt Vibrio spp. ở thời điểm sau 12 giờ nuôi cấy, hoạt tính mạnh nhất sau 24 giờ nuôi cấy, và mất sau đó. Khác với hoạt tính đối kháng với Vibrio spp., hoạt tính tiêu diệt Listeria monocytogenes được ghi nhận ở thời điểm sau 9 giờ nuôi cấy, hoạt tính mạnh nhất ở dịch nuôi cấy 12 giờ, giảm rõ rệt ở thời điểm sau 27 giờ, và mất sau khoảng thời gian này. Tuy nhiên, vi khuẩn lại sinh chất kháng khuẩn tiêu diệt Vibrio spp. sau 48 giờ nuôi cấy (Hình 3.9).

Bảng 3.7. Sự biến động mật độ tế bào và hoạt tính đối kháng với vi sinh vật chỉ thị của chủng Bacillus spp. 2002NTBD1 theo thời gian

Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

OD600 V. parahaemolyticus L. monocytogenes Thời gian nuôi lắc

3 giờ 0,23 – –

6 giờ 1,015 – –

9 giờ 1,075 – 19

12 giờ 1,105 11 18

24 giờ 1,203 12 11

27 giờ 1,237 – 11

30 giờ 1,373 – 11

33 giờ 1,343 – –

48 giờ 1,303 21 21

Trong đó: Đường kính kháng khuẩn bao gồm đường kính giếng D = 6 mm.

Hình 3.9. Hoạt tính đối kháng với vi sinh vật chỉ thị của dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus spp. 2002NTBD1 các thời điểm sinh trưởng khác nhau

Trong đó: Dịch môi trường được thu nhận sau 3, 6, 9, 12, 24, 27, 30, 33 và 48 giờ nuôi cấy, hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch sử dụng chủng vi khuẩn chỉ thị Vibrio parahaemolyticus (Hình 3.9.A), và Listeria monocytogenes (Hình 3.9.B).

Hoạt tính kháng khuẩn của dịch nuôi cấy ở 2 thời điểm sau 24 giờ và 48 giờ đã được thử nghiệm với các loại enzyme phân giải protein/peptide như trypsin, pronase E, proteinase K. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy bị mất hoạt tính hoàn toàn chứng tỏ chất kháng khuẩn thu được ở thời điểm này là bacteriocin, ở thời điểm sau 48 giờ nuôi cấy vẫn giữ nguyên hoạt tính khi xử lý với các enzyme trên chứng tỏ chất kháng khuẩn ở thời điểm 48 giờ không phải là bacteriocin.

Kết hợp giữa giá trị OD600 và hoạt tính kháng khuẩn, có thể thấy rằng mật độ vi khuẩn Bacillus spp. cần tăng lên đến một mức đủ lớn có thể tiết hoạt chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Do đó, thời điểm 24 giờ sau nuôi cấy được lựa chọn cho lên men quy mô lớn nhằm thu nhận hợp chất kháng khuẩn từ chủng 2002NTBD1 phục vụ cho thí nghiệm tinh sạch sau này.

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

1. Đã phân lập được 152 chủng vi khuẩn biển từ 19 mẫu biển (ruột tôm, ruột cá, bọt biển và rong biển) thể hiện sự phong phú của các chủng vi khuẩn biển cư trú trong sinh vật biển.

2. Đã tuyển chọn được 30/152 chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng với vi khuẩn Vibrio spp. và đã xác định được phổ kháng khuẩn của 30 chủng vi khuẩn biển đối với 7 vi sinh vật chỉ thị.

3. Bốn chủng vi khuẩn biển tiềm năng (2002STB23.3, 2002STB41.1, 2002NTCL2, 2002NTBD1) đã được nghiên cứu tuyển chọn, định danh. Kết quả phân tích cho thấy cả 4 chủng đều thuộc chi Bacillus.

4. Hợp chất kháng khuẩn thu nhận từ 4 chủng 2002STB23.3, 2002STB41.1, 2002NTCL2, 2002NTBD1 đã được nghiên cứu độ bền nhiệt. Hai chủng 2002NTBD1 và 2002NTCL2 có hoạt tính vẫn giữ nguyên sau 60 phút ở 60 ℃.

5. Đã xác định được bản chất của hợp chất kháng khuẩn thu nhận từ chủng 2002NTBD1 là bacteriocin. Thời gian nuôi cấy tối ưu để thu nhận bacteriocin từ chủng 2002NTBD1 là 24 giờ.

4.2. KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục thử nghiệm khả năng sinh tổng hợp bacteriocin ở các chủng

vi khuẩn có hoạt tính mạnh còn lại.

2. Tiếp tục nghiên cứu tinh sạch bacteriocin, ứng dụng bacteriocin và

vi khuẩn như nguồn probiotic cho phát triển ngành thủy sản bền vững.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Hong N.T.K., Hien P.T.T., Thu T.T.N., Lebailly P., 2017, Vietnam's Fisheries and Aquaculture Development's Policy: Are Exports Performance Targets Sustainable?, Oceanography & Fisheries Open access Journal, 5(4), pp. 555667.

2. Lavilla-Pitogo C.R., Leaño E.M., Paner M.G., 1998, Mortalities of pond- cultured juvenile shrimp, Penaeus monodon, associated with dominance of luminescent vibrios in the rearing environment, Aquaculture, 164(1-4), pp. 337-349.

3. Chen F.-R., Liu P.-C., Lee K.-K., 2000, Lethal Attribute of Serine Protease Secreted by Vibrio alginolyticus Strains in Kuruma Prawn Penaeus japonicus, Zeitschrift für Naturforschung C, 55(1-2), pp. 94-99.

4. Tran T.H.T., Yanagawa H., Nguyen K.T., Hara-Kudo Y., Taniguchi T., Hayashidani H., 2018, Prevalence of Vibrio parahaemolyticus in seafood and water environment in the Mekong Delta, Vietnam, Journal of Veterinary Medical Science, 80(11), pp. 1737-1742.

5. Austin B., 1985, Antibiotic pollution from fish farms: effects on aquatic

microflora, Microbiological sciences, 2(4), pp. 113-117.

6. Watts J., Schreier H., Lanska L., Hale M., 2017, The Rising Tide of Antimicrobial Resistance in Aquaculture: Sources, Sinks and Solutions, Marine Drugs, 15(6), pp. 158.

7. Nguyễn Diễm Thư, Lê Hồng Phước, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Hồng Lộc, Mã Tú Lan, 2016, Sự hiện diện của Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính và hiện trạng sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh trên tôm nuôi tại Đồng bằng sông Cửu Long, Tạp chí nghề cá sông Cửu Long, 8.

8. Đặng Phương Nga, Nguyễn Thị Yên, Đỗ Thu Phương, Nguyễn Bá Tú, Lại Thúy Hiền, 2007, Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibrio trong nước

nuôi tôm của Bacillus subtilis HY1 và Lactococcus lactis CC4K, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5(3), tr. 383-390.

9. Nguyễn Thị Bích Đào, Trần Quang Khánh Vân, Nguyễn Văn Khanh, Nguyễn Quang Linh, 2015, Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh tôm chết sớm ở tỉnh Thừa Thiên Huế, Tạp chí Khoa học (Đại học Huế), 100(01), tr. 15-28.

10. Nguyễn Xuân Cảnh, Hồ Tú Cường, Nguyễn Thị Định, Phạm Thị Hiếu, 2016, Nghiên cứu chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm, Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 14(11), tr. 1809-1816.

11. Phạm Thị Tuyết Ngân, Hồ Diễm Thơ, Trần Sương Ngọc, 2016, So sánh khả năng cải thiện chất lượng nước và ức chế Vibrio của xạ khuẩn Streptomyces parvulus và vi khuẩn Bacillus subtilis chọn lọc trong hệ thống nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 47, tr. 87-95.

12. Lê Huy Chính, 2007, Vi sinh vật Y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

13. Hoàng Hải, Dư Ngọc Thành, 2008, Giáo trình Vi sinh vật đại cương, Nhà

xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội.

14. Gladwin M.T., Trattler W., Mahan C.S., 2016, Clinical Microbiology

Made Ridiculously Simple 6th Edition, MedMaster, Inc., Miami.

15. Gram H.C., 1884, Über die isolirte Färbung der Schizomyceten in

Schnittund Trockenpräparaten, Fortschritte der Medizin, Berlin.

16. United Nations Population Fund, 2020, State of World Population 2020,

Prographics, Inc., Annapolis.

17. UNPD, 2006, World Population Projections, the 2006 Revision, New York.

18. FAO Fisheries Department, 2019, Global aquaculture production: Quantity 1950–2017, Value 1950–2017, Global capture production, FAO, Rome.

19. Wei Q., 2002, Social and economic impacts of aquatic animal health problems in aquaculture in China, FAO Fish Technical Paper, 406, pp. 55-61.

20. Ruwandeepika H.A.D., 2010, Expression of virulence genes of Vibrios belonging to the harveyi clade in the brine shrimp Artemia, PhD thesis, Ghent University, Belgium.

21. Kubitza F., Campos J., Ono E., Istchuk P., 2013, Piscicultura no Brasil: a sanidade na piscicultura, do ponto de vista dos produtores e técnicos, Panor Aquicultura, 23, pp. 16-25.

22. Ministério da Pesca e Aquicultura, 2013, Censo aquícola nacional: ano

2008 Brasília, pp. 32.

23. Dang T.L., Pham A.T., Phan T.V., 2018, Acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in Vietnam, Asian Fisheries Science, 31S, pp. 274-282.

24. Đặng Xuân Bình, Bùi Quang Tề, Đoàn Quốc Khánh, 2012, Giáo trình

bệnh động vật thủy sản, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.

25. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004, Bệnh học Thủy sản, Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh.

26. Thompson F.L., Iida T., Swings J., 2004, Biodiversity of Vibrios, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 68(3), pp. 403-431.

27. Sawabe T., Ogura Y., Matsumura Y., Feng G., Amin A.R., Mino S., Nakagawa S., Sawabe T., Kumar R., Fukui Y., Satomi M., Matsushima R., Thompson F.L., Gomez-Gil B., Christen R., Maruyama F., Kurokawa K., Hayashi T., 2013, Updating the Vibrio clades defined by multilocus sequence phylogeny: proposal of eight new clades, and the description of Vibrio tritonius sp. nov, Frontiers in Microbiology, 4, pp. 414-424.

28. Batz M.B., Hoffmann S., Morris J.G., 2012, Ranking the Disease Burden of 14 Pathogens in Food Sources in the United States Using Attribution Data from Outbreak Investigations and Expert Elicitation†, Journal of Food Protection, 75(7), pp. 1278-1291.

29. Austin B., Austin D.A., 2007, Bacterial fish pathogens: disease of farmed

and wild fish, Springer Netherlands, Heidelberg.

30. Zorriehzahra J., Banaederakhshan R., 2015, Early Mortality Syndrome (EMS) as new Emerging Threat in Shrimp Industry, Advances in Animal and Veterinary Sciences, 3, pp. 64-72.

31. Saad T.T., Atallah S.T., 2014, Studies on bacterial infection in marine fish,

Journal of Arabian Aquaculture Society, 9(1), pp. 1-20.

32. Khouadja S., Lamari F., Bakhrouf A., 2013, Characterization of Vibrio parahaemolyticus isolated from farmed sea bass (Dicentrarchus labrax) during disease outbreaks, International Aquatic Research, 5(13), pp. 1-11.

33. Soto-Rodriguez S.A., Gomez-Gil B., Lozano-Olvera R., Betancourt- Lozano M., Morales-Covarrubias M.S., 2015, Field and Experimental Evidence of Vibrio parahaemolyticus as the Causative Agent of Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease of Cultured Shrimp (Litopenaeus vannamei) in Northwestern Mexico, Applied and Environmental Microbiology, 81(5), pp. 1689-1699.

34. Le Groumellec M., Haffner P., Martin B., Martin C., 1995, Comparative study of bacterial infections responsible for mass mortality in penaeid shrimp hatcheries of the pacific zone, In: Shariff M., Arthur J.R., Subasinghe R.P., Editors, Diseases in Asian Aquaculture II, Fish Health Section: Asian Fisheries Society, Manila, pp. 163-173.

35. Nishimori E., Hasegawa O., Numata T., Wakabayashi H., 1998, Vibrio carchariae causes mortalities in Japanese abalone Sulculus deversicolor supratexta, Fish pathology, 33, pp. 495-502.

36. Raj S.T., Lipton A.P., Chauhan G.S., 2010, Characterization and infectivity evaluation of Vibrio harveyi causing white patch disease among captive reared seahorses, Hippocampus kuda, Indian Journal of Marine Sciences, 39(1), pp. 151-156.

37. Thakur A.B., Vaidya R.B., Suryawanshi S.A., 2003, Pathogenicity and antibiotic susceptibility of Vibrio species isolated from moribund shrimps, Indian Journal of Marine Sciences, 32(1), pp. 71-75.

38. Cavallo R., Acquaviva M., Alabiso G., Milillo M., Narracci M., Stabili L., 2012, Study of aquaculture pathogenic vibrios in the Mar Piccolo of Taranto (Ionian Sea, Italy), Biologia Marina Mediterranea, 19(1), pp. 154-155.

39. Macdougall J.D., 1996, A short history of planet earth, Wiley, New York.

40. Jimeno J., Faircloth G., Sousa-Faro J.M.F., Scheuer P., Rinehart K., 2004, New Marine Derived Anticancer Therapeutics ─ A Journey from the Sea

to Clinical Trials, Marine Drugs, 2(1), pp. 14-29.

41. Margulis L., Schwartz K.V., 1998, Five Kingdoms: an illustrated guide to the Phyla of Life on Earth, Freeman WH and Company, New York.

42. Proksch P., Edrada-Ebel R., Ebel R., 2003, Drugs from the Sea -

Opportunities and Obstacles, Marine Drugs, 1(4), pp. 5-17.

43. Kowalewski M., Finnegan S., 2010, Theoretical diversity of the marine

biosphere, Paleobiology, 36(1), pp. 1-15.

44. Mora C., Tittensor D.P., Adl S., Simpson A.G.B., Worm B., 2011, How Many Species Are There on Earth and in the Ocean?, PLoS Biology, 9(8), pp. e1001127.

45. Panno L., Bruno M., Voyron S., Anastasi A., Gnavi G., Miserere L., Varese G.C., 2013, Diversity, ecological role and potential biotechnological applications of marine fungi associated to the seagrass Posidonia oceanica, New Biotechnology, 30(6), pp. 685-694.

46. Imhoff J.F., Labes A., Wiese J., 2011, Bio-mining the microbial treasures of the ocean: New natural products, Biotechnology Advances, 29(5), pp. 468-482.

47. Xiong Z.-Q., Zhang Z.-P., Li J.-H., Wei S.-J., Tu G.-Q., 2012, Characterization of Streptomyces padanus JAU4234, a Producer of

Actinomycin X2, Fungichromin, and a New Polyene Macrolide Antibiotic, Applied and Environmental Microbiology, 78(2), pp. 589-592.

48. Jeyanthi V., Velusamy P., 2016, Anti-methicillin Resistant Staphylococcus aureus Compound Isolation from Halophilic Bacillus amyloliquefaciens MHB1 and Determination of Its Mode of Action Using Electron Microscope and Flow Cytometry Analysis, Indian J Microbiol, 56(2), pp. 148-57.

49. Gerwick W.H., Fenner A.M., 2013, Drug discovery from marine

microbes, Microbial Ecology, 65(4), pp. 800-806.

50. Anas A., Nilayangod C., Jasmin C., Vinothkumar S., Parameswaran P.S., Nair S., 2016, Diversity and bioactive potentials of culturable heterotrophic bacteria from the surficial sediments of the Arabian Sea, 3 Biotech, 6(2).

51. Biswas K., Paul D., Sinha S.N., 2016, Marine bacteria: a potential tool for

antibacterial activity, J Appl Environ Microbiol, 4(1), pp. 25-29.

52. Simmons T.L., Andrianasolo E., McPhail K., Flatt P., Gerwick W.H., 2005, Marine natural products as anticancer drugs, Mol Cancer Ther, 4(2), pp. 333-42.

53. Armstrong E., Yan L., Boyd K.G., Wright P.C., Burgess J.G., 2001, The symbiotic role of marine microbes on living surfaces, Hydrobiologia, 461(1), pp. 37-40.

54. Zheng L., Han X., Chen H.M., Lin W., 2005, Marine bacteria associated with marine macroorganism: the potential antimicrobial resources, Annals of Microbiology, 55, pp. 119-124.

55. Stincone P., Brandelli A., 2020, Marine bacteria as source of antimicrobial

compounds, Crit Rev Biotechnol, 40(3), pp. 306-319.

56. Gratia A., 1925, Sur un remarquable exemple d’antagonisme entre deux

souches de colibacille, C R Soc Biol, 93, pp. 1040–1041.

57. Desriac F., Defer D., Bourgougnon N., Brillet B., Le Chevalier P., Fleury Y., 2010, Bacteriocin as Weapons in the Marine Animal-Associated Bacteria Warfare: Inventory and Potential Applications as an Aquaculture Probiotic, Marine Drugs, 8(4), pp. 1153-1177.

58. Bindiya E.S., Sarita G.B., 2016, Marine bacteriocins: A review, Journal

of Bacteriology & Mycology, 2(5), pp. 140-147.

59. Jacob F., Lwoff A., Siminovitch A., Wollman E., 1953, Definition of some terms relative to lysogeny, Ann Inst Pasteur (Paris), 84(1), pp. 222-224.

60. Carraturo A., Raieta K., Ottaviani D., Russo G.L., 2006, Inhibition of Vibrio parahaemolyticus by a bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS) produced by Vibrio mediterranei 1, Journal of Applied Microbiology, 101(1), pp. 234-241.

61. Ahmad A., Hamid R., Dada A.C., Usup G., 2013, Pseudomonas putida Strain FStm2 Isolated from Shark Skin: A Potential Source of Bacteriocin, Probiotics Antimicrob Proteins, 5(3), pp. 165-175.

62. Ghequire M.G.K., Öztürk B., 2018, A Colicin M-Type Bacteriocin from Pseudomonas aeruginosa Targeting the HxuC Heme Receptor Requires a Novel Immunity Partner, Applied and Environmental Microbiology, 84(18).

63. Abriouel H., Franz C.M.A.P., Omar N.B., Gálvez A., 2011, Diversity and applications of Bacillus bacteriocins, FEMS Microbiology Reviews, 35(1), pp. 201-232.

64. Cascales E., Buchanan S.K., Duché D., Kleanthous C., LloubèS R., Postle K., Riley M., Slatin S., Cavard D.L., 2007, Colicin Biology, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 71(1), pp. 158-229.

65. Michel-Briand Y., Baysse C., 2002, The pyocins of Pseudomonas

aeruginosa, Biochimie, 84(5-6), pp. 499-510.

66. Joerger M.C., Klaenhammer T.R., 1986, Characterization and purification of helveticin J and evidence for a chromosomally determined bacteriocin

produced by Lactobacillus helveticus 481, Journal of Bacteriology, 167(2), pp. 439-446.

67. Gillor O., Kirkup B.C., Riley M.A., 2004, Colicins and microcins: the next

generation antimicrobials, Adv Appl Microbiol, 54, pp. 129-146.

68. De Lorenzo V., Pugsley A.P., 1985, Microcin E492, a low-molecular- weight peptide antibiotic which causes depolarization of the Escherichia coli cytoplasmic membrane, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 27(4), pp. 666-669.

69. Cleveland J., Montville T.J., Nes I.F., Chikindas M.L., 2001, Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation, International Journal of Food Microbiology, 71(1), pp. 1-20.

70. Kawulka K.E., Sprules T., Diaper C.M., Whittal R.M., McKay R.T., Mercier P., Zuber P., Vederas J.C., 2004, Structure of subtilosin A, a cyclic antimicrobial peptide from Bacillus subtilis with unusual sulfur to alpha-carbon cross-links: formation and reduction of alpha-thio-alpha- amino acid derivatives, Biochemistry, 43(12), pp. 3385-3395.

lactococcal bacteriocin whose activity depends on

71. Nissen-Meyer J., Holo H., Håvarstein L.S., Sletten K., Nes I.F., 1992, A the novel complementary action of two peptides, Journal of Bacteriology, 174(17), pp. 5686-5692.

72. Gong X., Martin-Visscher L.A., Nahirney D., Vederas J.C., Duszyk M., 2009, The circular bacteriocin, carnocyclin A, forms anion-selective channels in lipid bilayers, Biochimica et Biophysica Acta, 1788(9), pp. 1797-1803.

73. Sandiford S., Upton M., 2012, Identification, Characterization, and Recombinant Expression of Epidermicin NI01, a Novel Unmodified Bacteriocin Produced by Staphylococcus epidermidis That Displays Potent Activity against Staphylococci, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 56(3), pp. 1539-1547.

74. Nilsen T., Nes I.F., Holo H., 2003, Enterolysin A, a Cell Wall-Degrading Bacteriocin from Enterococcus faecalis LMG 2333, Applied and Environmental Microbiology, 69(5), pp. 2975-2984.

75. Cotter P.D., Hill C., Ross R.P., 2005, Bacteriocins: developing innate

immunity for food, Nat Rev Microbiol, 3(10), pp. 777-788.

76. Svetoch E.A., Eruslanov B.V., Levchuk V.P., Perelygin V.V., Mitsevich E.V., Mitsevich I.P., Stepanshin J., Dyatlov I., Seal B.S., Stern N.J., 2011, Isolation of Lactobacillus salivarius 1077 (NRRL B-50053) and Characterization of Its Bacteriocin, Including the Antimicrobial Activity Spectrum, Applied and Environmental Microbiology, 77(8), pp. 2749- 2754.

77. Schlegel R., Slade H.D., 1972, Bacteriocin Production by Transformable Group H Streptococci1, Journal of Bacteriology, 112(2), pp. 824-829.

78. Crupper S.S., Iandolo J.J., 1996, Purification and partial characterization of a novel antibacterial agent (Bac1829) Produced by Staphylococcus aureus KSI1829, Applied and environmental microbiology, 62(9), pp. 3171-3175.

79. Todorov S.D., Dicks L.M.T., 2005, Lactobacillus plantarum isolated from molasses produces bacteriocins active against Gram-negative bacteria, Enzyme and Microbial Technology, 36(2), pp. 318-326.

80. Todorov S.D., Dicks L.M., 2005, Characterization of bacteriocins produced by lactic acid bacteria isolated from spoiled black olives, Journal of Basic Microbiology, 45(4), pp. 312-322.

81. Anacarso I., Messi P., Condò C., Iseppi R., Bondi M., Sabia C., de Niederhäusern S., 2014, A bacteriocin-like substance produced from Lactobacillus pentosus 39 is a natural antagonist for the control of Aeromonas hydrophila and Listeria monocytogenes in fresh salmon fillets, LWT - Food Science and Technology, 55(2), pp. 604-611.

82. Stoffels G., Nes I.F., Guthmundsdóttir A., 1992, Isolation and properties of a bacteriocin-producing Carnobacterium piscicola isolated from fish, J Appl Bacteriol, 73(4), pp. 309-316.

83. Tahiri I., Desbiens M., Benech R., Kheadr E., Lacroix C., Thibault S., Ouellet D., Fliss I., 2004, Purification, characterization and amino acid sequencing of divergicin M35: a novel class IIa bacteriocin produced by Carnobacterium divergens M35, Int J Food Microbiol, 97(2), pp. 123- 136.

84. Metivier A., Pilet M.F., Dousset X., Sorokine O., Anglade P., Zagorec M., Piard J.C., Marlon D., Cenatiempo Y., Fremaux C., 1998, Divercin V41, two disulphide bonds produced by a new bacteriocin with Carnobacterium divergens V41: primary structure and genomic organization, Microbiology, 144(10), pp. 2837-2844.

85. Nilsson L., Ng Y.Y., Christiansen J.N., Jorgensen B.L., Grotinum D., Gram L., 2004, The contribution of bacteriocin to inhibition of Listeria monocytogenes by Carnobacterium piscicola strains in cold-smoked salmon systems, Journal of Applied Microbiology, 96(1), pp. 133-143.

86. Suzuki M., Yamamoto T., Kawai Y., Inoue N., Yamazaki K., 2005, Mode of action of piscicocin CS526 produced by Carnobacterium piscicola CS526, Journal of Applied Microbiology, 98(5), pp. 1146-1151.

87. Yamazaki K., Suzuki M., Kawai Y., Inoue N., Montville T.J., 2005, Purification and Characterization of a Novel Class IIa Bacteriocin, Piscicocin CS526, from Surimi-Associated Carnobacterium piscicola CS526, Applied and Environmental Microbiology, 71(1), pp. 554-557.

88. Bhugaloo-Vial P., Dousset X., Metivier A., Sorokine O., Anglade P., Boyaval P., Marion D., 1996, Purification and amino acid sequences of piscicocins V1a and V1b, two class IIa bacteriocins secreted by Carnobacterium piscicola V1 that display significantly different levels of specific inhibitory activity, Applied and environmental microbiology, 62(12), pp. 4410-4416.

89. Valenzuela A.S., Benomar N., Abriouel H., Cañamero M.M., Gálvez A., 2010, Isolation and identification of Enterococcus faecium from seafoods: antimicrobial resistance and production of bacteriocin-like substances, Food Microbiol, 27(7), pp. 955-961.

90. Pinto A., Fernandes M., Pinto C., Albano H., Castilho F., Teixeira P., Gibbs P., 2009, Characterization of anti-Listeria bacteriocins isolated from shellfish: Potential antimicrobials to control non-fermented seafood, International Journal of Food Microbiology, 129(1), pp. 50-58.

91. Rajaram G., Manivasagan P., Thilagavathi B., Saravanakumar A., 2010, Purification and characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus lactis isolated from marine environment, Advance Journal of Food Science and Technology, 2(2), pp. 138-144.

92. Smitha S., Bhat S.G., 2012, Thermostable Bacteriocin BL8 from Bacillus licheniformis isolated from marine sediment, Journal of Applied Microbiology, 114(3), pp. 688-694.

93. Sugita H., Matsuo N., Hirose Y., Iwato M., Deguchi Y., 1997, Vibrio sp. strain NM 10, isolated from the intestine of a Japanese coastal fish, has an inhibitory effect against Pasteurella piscicida, Applied and environmental microbiology, 63(12), pp. 4986-4989.

94. Bergh Ø., 1995, Bacteria associated with early life stages of halibut, Hippoglossus hippoglossus L., inhibit growth of a pathogenic Vibrio sp., Journal of Fish Diseases, 18(1), pp. 31-40.

95. Sugita H., Hirose Y., Matsuo N., Deguchi Y., 1998, Production of the antibacterial substance by Bacillus sp. strain NM 12, an intestinal bacterium of Japanese coastal fish, Aquaculture, 165(3), pp. 269-280.

96. Bindiya E.S., Tina K.J., Raghul S.S., Bhat S.G., 2015, Characterization of Deep Sea Fish Gut Bacteria with Antagonistic Potential, from Centroscyllium fabricii (Deep Sea Shark), Probiotics Antimicrob Proteins, 7(2), pp. 157-163.

97. Bindiya E.S., Tina K.J., Sasidharan R.S., Bhat S.G., 2019, BaCf3: highly thermostable bacteriocin from Bacillus amyloliquefaciens BTSS3 antagonistic on food-borne pathogens, 3 Biotech, 9(4), pp. 136.

98. Nguyen V.D., Pham T.T., Nguyen T.H., Nguyen T.T., Hoj L., 2014, Screening of marine bacteria with bacteriocin-like activities and probiotic potential for ornate spiny lobster (Panulirus ornatus) juveniles, Fish Shellfish Immunol, 40(1), pp. 49-60.

99. Budu-Amoako E., Ablett R.F., Harris J., Delves-Broughton J., 1999, Combined Effect of Nisin and Moderate Heat on Destruction of Listeria monocytogenes in Cold-Pack Lobster Meat, Journal of Food Protection, 62(1), pp. 46-50.

100. Hamza F., Kumar A.R., Zinjarde S., 2018, Efficacy of cell free supernatant from Bacillus licheniformis in protecting Artemia salina against Vibrio alginolyticus and Pseudomonas gessardii, Microbial Pathogenesis, 116, pp. 335-344.

101. Dusane D.H., Damare S.R., Nancharaiah Y.V., Ramaiah N., Venugopalan V.P., Kumar A.R., Zinjarde S.S., 2013, Disruption of Microbial Biofilms by an Extracellular Protein Isolated from Epibiotic Tropical Marine Strain of Bacillus licheniformis, PLoS ONE, 8(5), pp. e64501.

102. Kumar R.S., Arul V., 2009, Purification and characterization of phocaecin PI80: an anti-listerial bacteriocin produced by Streptococcus phocae PI80 Isolated from the gut of Peneaus indicus (Indian white shrimp), J Microbiol Biotechnol, 19(11), pp. 1393-400.

103. Özdemir G.B., Oryaşın E., Bıyık H.H., Ozteber M., Bozdoğan B., 2011, Phenotypic and genotypic characterization of bacteriocins in enterococcal isolates of different sources, Indian journal of microbiology, 51(2), pp. 182-187.

104. McCall J.O., Sizemore R.K., 1979, Description of a bacteriocinogenic plasmid in Beneckea harveyi, Applied and environmental microbiology, 38(5), pp. 974-979.

105. Shehane S.D., Sizemore R.K., 2002, Isolation and preliminary characterization of bacteriocins produced by Vibrio vulnificus, Journal of Applied Microbiology, 92(2), pp. 322-328.

106. Wilson G.S., Raftos D.A., Corrigan S.L., Nair S.V., 2010, Diversity and antimicrobial activities of surface-attached marine bacteria from Sydney Harbour, Australia, Microbiological Research, 165(4), pp. 300-311.

107. Lê Mỹ Tiểu Ngọc, Đặng Quang Nguyên, Đỗ Trần Hương Duyên, Trần Thúy Lan, Nguyễn Quang Đức Tiến, Nguyễn Duy Quỳnh Trâm, Nguyễn Đức Huy, 2019, Phân lập và kiểm tra khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của Lactococcus garvieae từ hệ tiêu hóa tôm, Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên, 128(1E), tr. 77-86.

108. Gross E., Morell J.L., 1971, Structure of nisin, Journal of the American

Chemical Society, 93(18), pp. 4634-4635.

109. Mulders J.W.M., Boerrigter I.J., Rollema H.S., Siezen R.J., Vos W.M., 1991, Identification and characterization of the lantibiotic nisin Z, a natural nisin variant, European Journal of Biochemistry, 201(3), pp. 581- 584.

110. Zendo T., Fukao M., Ueda K., Higuchi T., Nakayama J., Sonomoto K., 2003, Identification of the Lantibiotic Nisin Q, a New Natural Nisin Variant Produced by Lactococcus lactis 61-14 Isolated from a River in Japan, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 67(7), pp. 1616- 1619.

111. De Vuyst L., Vandamme E.J., 1994, Antimicrobial Potential of Lactic Acid Bacteria, In: De Vuyst L., Vandamme E.J., Editors, Bacteriocins of lactic acid bacteria: microbiology, genetics and applications, Blackie Academic and Professional, London, pp. 91-142.

112. Neetoo H., Ye M., Chen H., Joerger R.D., Hicks D.T., Hoover D.G., 2008, Use of nisin-coated plastic films to control Listeria monocytogenes on vacuum-packaged cold-smoked salmon, Int J Food Microbiol, 122(1-2), pp. 8-15.

113. Karthik R., Gobalakrishnan S., Hussain A.J., Muthezhilan R., 2013, Efficacy of Bacteriocin from Lactobacillus Sp. (AMET 1506) as a Biopreservative for Seafood’s Under Different Storage Temperature Conditions, Journal of Modern Biotechnology, 2, pp. 59-65.

114. Hwanhlem N., Jaffrès E., Dousset X., Pillot G., Choiset Y., Haertlé T., H- Kittikun A., Chobert J.-M., 2015, Application of a nisin Z-producing Lactococcus lactis subsp. lactis KT2W2L isolated from brackish water for biopreservation in cooked, peeled and ionized tropical shrimps during storage at 8 °C under modified atmosphere packaging, European Food Research and Technology, 240(6), pp. 1259-1269.

115. Diop M.B., Dubois-Dauphin R., Destain J., Tine E., Thonart P., 2009, Use of a nisin-producing starter culture of Lactococcus lactis subsp. lactis to improve traditional fish fermentation in Senegal, Journal of Food Protection, 72(9), pp. 1930-1934.

116. Claesson M.J., Li Y., Leahy S., Canchaya C., Van Pijkeren J.P., Cerdeno- Tarraga A.M., Parkhill J., Flynn S., O'Sullivan G.C., Collins J.K., Higgins D., Shanahan F., Fitzgerald G.F., Van Sinderen D., O'Toole P.W., 2006, salivarius, Multireplicon genome architecture of Lactobacillus Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(17), pp. 6718- 6723.

117. Cursino L., Smajs D., Smarda J., Nardi R.M.D., Nicoli J.R., Chartone- Souza E., Nascimento A.M.A., 2006, Exoproducts of the Escherichia coli strain H22 inhibiting some enteric pathogens both in vitro and in vivo, Journal of Applied Microbiology, 100(4), pp. 821-829.

118. Audisio M.C., Oliver G., Apella M.C., 2000, Protective Effect of Enterococcus faecium J96, a Potential Probiotic Strain, on Chicks Infected with Salmonella pullorum, Journal of Food Protection, 63(10), pp. 1333- 1337.

119. Schamberger G.P., Diez-Gonzalez F., 2004, Characterization of Colicinogenic Escherichia coli Strains Inhibitory to Enterohemorrhagic Escherichia coli, Journal of Food Protection, 67(3), pp. 486-492.

120. Von Buenau R., Jaekel L., Schubotz E., Schwarz S., Stroff T., Krueger M., 2005, Escherichia coli Strain Nissle 1917: Significant Reduction of Neonatal Calf Diarrhea, Journal of Dairy Science, 88(1), pp. 317-323.

121. Gibson L.F., Woodworth J., George A.M., 1998, Probiotic activity of Aeromonas media on the Pacific oyster, Crassostrea gigas, when challenged with Vibrio tubiashii, Aquaculture, 169(1), pp. 111-120.

122. Dobson A., Cotter P.D., Ross R.P., Hill C., 2012, Bacteriocin Production: a

Probiotic Trait?, Applied and Environmental Microbiology, 78(1), pp. 1-6.

123. Chamilani Nikapitiya, 2013, Marine Bacteria as Probiotics and Their in Aquaculture, In: Se-Kwon Kim, Editor, Marine Applications Microbiology: Bioactive Compounds and Biotechnological Applications, Wiley-VCH, Weinheim, pp. 126.

124. Gibson L.F., 1998, Bacteriocin activity and probiotic activity of Aeromonas media, Journal of Applied Microbiology, 85(S1), pp. 243S- 248S.

125. Kesarcodi-Watson A., Kaspar H., Lategan M.J., Gibson L., 2010, Alteromonas macleodii 0444 and Neptunomonas sp. 0536, two novel probiotics for hatchery-reared Greenshell™ mussel larvae, Perna canaliculus, Aquaculture, 309(1), pp. 49-55.

126. Phan Thị Hoài Trinh, Ngô Thị Duy Ngọc, Bùi Minh Lý, Lê Đình Hùng, Cao Thị Thuý Hằng, Võ Thị Diệu Trang, Huỳnh Hoàng Như Khánh, 2016, Hoạt tính kháng khuẩn của một số chủng vi khuẩn phân lập từ bọt biển ở vùng đảo Phú Quốc, Việt Nam, Tạp chí Sinh học, 38(1), tr. 109-114.

127. Lertcanawanichakul M., Sawangnop S., 2008, A Comparison of Two Methods Used for Measuring the Antagonistic Activity of Bacillus Species, Walailak Journal of Science and Technology, 5, pp. 161-171.

128. Valgas C., Souza S.M.d., Smânia E.F., Smânia Jr A., 2007, Screening methods to determine antibacterial activity of natural products, Brazilian journal of microbiology, 38(2), pp. 369-380.

129. Fujimoto S., Nakagami Y., Kojima F., 2004, Optimal bacterial DNA isolation method using bead-beating technique, Memoirs of Kyushu University School of Health Sciences, 3, pp. 33-38.

130. Lane D.J., 1991, 16S/23S rRNA Sequencing, In: Stackebrandt E., Goodfellow M., Editors, Nucleic acid techniques in bacterial systematics, John Wiley & Sons, New York, pp. 115-175.

131. Johnson M., Zaretskaya I., Raytselis Y., Merezhuk Y., McGinnis S., Madden T.L., 2008, NCBI BLAST: a better web interface, Nucleic Acids Research, 36(suppl_2), pp. W5-W9.

132. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K., 2018, MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across Computing Platforms, Mol Biol Evol, 35(6), pp. 1547-1549.

133. Hồ Thị Hồng Nhi, 2013, Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh bacteriocin từ động vật thân mềm hai vỏ sống ở biển, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Nha Trang, Nha Trang.

134. Nguyễn Văn Duy, Nguyễn Thị Hải Thanh, Lê Phương Chung, Phạm Thu Thủy, 2013, Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn biển sinh bacteriocin nhằm định hướng ứng dụng dược phẩm trong nuôi trồng thủy sản, Kỷ yếu Hội nghị Quốc tế "Biển Đông 2012", tr. 492- 503.

135. Ghosh S., Ringo E., Gnana Selvam A.D., Mujeeb Rahiman K.M., Sathyan N., John N., Hatha A.A.M., 2014, Gut Associated Lactic Acid Bacteria Isolated from the Estuarine Fish Mugil cephalus: Molecular Diversity and Antibacterial Activities against Pathogens, International Journal of Aquaculture, 1, pp. 1-11.

136. Egerton S., Culloty S., Whooley J., Stanton C., Ross R.P., 2018, The Gut

Microbiota of Marine Fish, Frontiers in Microbiology, 9(873).

137. Talwar C., Nagar S., Lal R., Negi R.K., 2018, Fish Gut Microbiome: Current Approaches and Future Perspectives, Indian Journal of Microbiology, 58(4), pp. 397-414.

138. Balakrishnan B., Ranishree J.K., Thadikamala S., Panchatcharam P., 2014, Purification, characterization and production optimization of a vibriocin produced by mangrove associated Vibrio parahaemolyticus, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 4(4), pp. 253-261.

139. Chopra L., Singh G., Choudhary V., Sahoo D.K., 2014, Sonorensin: an Antimicrobial Peptide, Belonging to the Heterocycloanthracin Subfamily of Bacteriocins, from a New Marine Isolate, Bacillus sonorensis MT93, Applied and Environmental Microbiology, 80(10), pp. 2981-2990.

140. Przeslawski R., Alvarez B., Kool J., Bridge T., Caley M.J., Nichol S., 2015, Implications of Sponge Biodiversity Patterns for the Management of a Marine Reserve in Northern Australia, PLOS ONE, 10(11), pp. e0141813.

141. Taylor M.W., Radax R., Steger D., Wagner M., 2007, Sponge-Associated Microorganisms: Evolution, Ecology, and Biotechnological Potential, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 71(2), pp. 295-347.

142. Abdelmohsen U.R., Bayer K., Hentschel U., 2014, Diversity, abundance and natural products of marine sponge-associated actinomycetes, Nat Prod Rep, 31(3), pp. 381-99.

143. Anand T.P., Bhat A.W., Shouche Y.S., Roy U., Siddharth J., Sarma S.P., 2006, Antimicrobial activity of marine bacteria associated with sponges from the waters off the coast of South East India, Microbiological Research, 161(3), pp. 252-262.

144. Penesyan A., Marshall-Jones Z., Holmstrom C., Kjelleberg S., Egan S., 2009, Antimicrobial activity observed among cultured marine epiphytic bacteria reflects their potential as a source of new drugs, FEMS Microbiology Ecology, 69(1), pp. 113-124.

145. Thilakan B., Chakraborty K., Chakraborty R.D., 2016, Antimicrobial properties of cultivable bacteria associated with seaweeds in the Gulf of Mannar on the southeast coast of India, Canadian Journal of Microbiology, 62(8), pp. 668-681.

146. Waters A.L., Hill R.T., Place A.R., Hamann M.T., 2010, The expanding role of marine microbes in pharmaceutical development, Current Opinion in Biotechnology, 21(6), pp. 780-786.

147. Peter C., Turnbull B., 1996, Bacillus, In: Baron S., Editor, Medical

Microbiology, University of Texas Medical Branch, Galveston.

148. Nicholson W.L., 2002, Roles of Bacillus endospores in the environment, Cellular and Molecular Life Sciences (CMLS), 59(3), pp. 410-416.

149. Gordon R., Haynes W., Pang C., Smith N., 1973, The Genus Bacillus,

United States Department of Agriculture, Washington DC.

150. Priest F.G., Goodfellow M., Shute L.A., Berkeley R.C.W., 1987, Bacillus amyloliquefaciens sp. nov., nom. rev, International Journal of Systematic Bacteriology, 37(1), pp. 69-71.

151. LPSN, Bacillus, Genus from:

Available https://lpsn.dsmz.de/genus/bacillus, accessed 24/03/2021.

152. Cotter P.D., Ross R.P., Hill C., 2013, Bacteriocins - a viable alternative to

antibiotics?, Nat Rev Microbiol, 11(2), pp. 95-105.

153. Baindara P., Mandal S.M., Chawla N., Singh P.K., Pinnaka A.K., Korpole S., 2013, Characterization of two antimicrobial peptides produced by a halotolerant Bacillus subtilis strain SK.DU.4 isolated from a rhizosphere soil sample, AMB Express, 3(1), pp. 2.

154. Võ Hồng Phượng, Võ Thị Hậu, Nguyễn Thái Hồng Ngọc, Lê Hồng Phước, Nguyễn Hoàng Tuấn, Nguyễn Hồng Lộc, Thủy L.T.B., 2018, Khảo sát đặc tính đối kháng của Bacillus licheniformis (B1) đối với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh teo gan tụy cấp tính trên tôm (AHPND) trong

điều kiện thí nghiệm, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 54(2), tr. 91-100.

155. Vinoj G., Vaseeharan B., DavidJayaseelan B., Rajakumaran P., Ravi C., licheniformis (DAB1) and 2013, Inhibitory effects of Bacillus Pseudomonas aeruginosa (DAP1) against Vibrio parahaemolyticus isolated from Fenneropenaeus indicus, Aquaculture International, 21(5), pp. 1121-1135.

156. Peng M., Zhang Y., Song Z., 2019, Isolation and Characterization of a Bacillus spp. Against Vibrio Parahaemolyticus from Shrimp Culture Ponds, International Journal of Microbiology and Biotechnology, 4(2), pp. 29-37.

157. Girija V., Malaikozhundan B., Vaseeharan B., Vijayakumar S., Gobi N., Del Valle Herrera M., Chen J.-C., Santhanam P., 2018, In vitro antagonistic activity and the protective effect of probiotic Bacillus licheniformis Dahb1 in zebrafish challenged with GFP tagged Vibrio parahaemolyticus Dahv2, Microbial Pathogenesis, 114, pp. 274-280.

158. Cladera-Olivera F., Caron G.R., Brandelli A., 2004, Bacteriocin-like substance production by Bacillus licheniformis strain P40, Letters in Applied Microbiology, 38(4), pp. 251-256.

159. Ranjit Kumar N., Raman R.P., Jadhao S.B., Brahmchari R.K., Kumar K., Dash G., 2013, Effect of dietary supplementation of Bacillus licheniformis on gut microbiota, growth and immune response in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man, 1879), Aquaculture International, 21(2), pp. 387-403.

160. Chen Y., Li J., Xiao P., Zhu W., Mo Z., 2016, The ability of marine Bacillus spp. isolated from fish gastrointestinal tract and culture pond sediment to inhibit growth of aquatic pathogenic bacteria, Iranian Journal of Fisheries Sciences, 15(2), pp. 701-714.

161. Tran Vu Phuong, Dang Thi Ngoc Thanh, Cao Ngoc Diep, 2020, Isolation shrimp pathogenic Vibrio selection of bacteria against and

parahaemolyticus from shrimp pond water on Duyen Hai district, Tra Vinh province, Ho Chi Minh City Open University Journal of Science, 10(1), pp. 43-52.

the

162. Xu H.-M., Rong Y.-J., Zhao M.-X., Song B., Chi Z.-M., 2014, Antibacterial activity of lipopetides produced by Bacillus amyloliquefaciens M1 against multidrug-resistant Vibrio spp. isolated from diseased marine animals, Applied Microbiology and Biotechnology, 98(1), pp. 127-136.

163. Phạm Việt Cường, Nguyễn Mai Anh, Vũ Thị Quyên, Nguyễn Thị Kim Cúc, 2014, Phân lập, tuyển chọn và định danh một số chủng vi khuẩn liên kết sáu loài hải miên vùng biển Sơn Chà, Tạp chí Sinh học, 36(3), tr. 345- 350.

164. Galaviz-Silva L., Iracheta-Villarreal J.M., Molina-Garza Z.J., 2018, Bacillus and Virgibacillus strains isolated from three Mexican coasts antagonize Staphylococcus aureus and Vibrio parahaemolyticus, FEMS Microbiology Letters, 365(19).

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Bản đồ Việt Nam và vị trí thu mẫu tôm biển, cá biển, rong biển tại Nha Trang và bọt biển tại Phú Quý.

Phụ lục 2: Hình thái của một số đại diện bac+ trên môi trường MHA

Phụ lục 3: Trình tự đoạn gen 16S rRNA của VKB:

5’-ACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGC

GGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTC

CGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGA

CATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTA

GCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCT

GAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACG

+ 2002NTCL2:

GGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCA

ACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGG

GAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCA

GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGC

AAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTA

AGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTG

GGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAA

ATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCT

GTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATAC

CCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCC

GCCTCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACG

GTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG

GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGA

CATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGA

CAGGTGGTGCTGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTAAGATGTTGGTTTAAGT

CCCGNAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGCAN

TCTAAGGGNACTGCCGGTTAACAAAACGGAAGGAAGGGGGGGATTACGTC

AAATTATCATGGCCCCTTTATGACCGGGGCTACCCACGGTTCTACAATGG

GGAGAAACCAAGGGCNGCCAAAACCCGGGAAGTTAACGCCATCCCCCAAA

ATCTGGTCC-3’

5’-TTGCTCCCTTAGGTCAGCGGCGGACGGATGAGTAACACGTGGGTAACCTG

CCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGCGGCTAATACCGGATGCTT

GATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTG

CAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGCTACGCCTCACCAA

GGCGACGATCCGTCCCCGACTTGACACGGTGATCGGCCTCACTGGGACTG

AGACACGGCCCAGACTCCTACGGAAGGCAGCAGTATGGAACTTCCCGCAA

TGGNCGAAAGCCTGACGGAGCAAGCCCGCCTGAGTGATGAAGGCTTTCGG

+ 2002STB23.3

ATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGAAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCG

GTACCTTGACGGTACCTAACCAGAANGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCA

GCCGCGGTAATAGGTAGGTGGCANGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAA

GGCGCGCGCGGCCGTTTTCTTTNGGTCTGATGGGAAAGCCCCCGGCCAAT

CCGGGGNAGGTTCATTGCAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGGG

TGGAATTCCTGGTGTAGCGGAAGAAATGCGTAAGAGATTTTGAAGAAACA

CCAGTGGCGAAGCCGATTCTTCTGGTTTGTAAATTGACGCTGGGGCGCAA

AAACGCTGCGGGAANCGAATAGGATTAAGNTTCCTTGGNAAGCCAACGCC

GTTAACNAATGAGTGTTAAGGGGTAAGGGGNTTCCCNCCCTTTTAGGTTG

CTGAAGCAAAATCAATTAAGCCCNCCNCNTGGGGAAGTACGGTCGCATGA

TTGAAACTCAAGGGAATNGCCGGGNCCCCTCACAAGCGGGGCTAGNTTNT

GGTTTAATNCGAGCCNNCNAAGAANNCTTACGAGGNNTTGAATTCTTCTG

ACCAACCNTAGAGGAGGGCCTCCCCCTNCGGGGNCAANCNTNCAGGTGNG

GCATGGTTCCCNNACGCTCNNNGTCGGAGAAATGTTTGGGTTAANCCCNG

AAACANGCCCAACCCTTGATCTTAGNTGGCCGTCATTTNGGTGGGCCNAT

TTTAAGTGACTGTCCGATAAACAACCGGNGGGAAGGGTGGGGANACCTCC

AAATCCGCCNTCCCCTTATGGACCTGGGCTANACACTGTCTTAGAATGGG

ACNAGAAAAAAGGCCAACCAAAGCCGCTNGGTTAAGCCAATCCCCTAA-3’

5’-ACATGCAAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGC

GGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTC

CGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAG

GATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTA

GCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCT

GAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACG

GGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCA

ACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGG

GAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAG

+ 2002STB41.1

AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCA

AGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAA

GTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGG

GAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAA

TGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTG

TAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACG

CTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGAGGTTTCCG

CCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGG

TCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGCGGCTCGCACAAGCGGTGG

AGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGAC

ATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGAC

AGGTGGTGCATGNTTGTCGTCAGCTCGGGTCGTGAGATGTTGGATTAAGT

CCCGCAACGAGCGCACCCTTGATCTTAGTTGCAAGNTTTCAGTTGGGCAT

CTTAAGGTGATTGGCGGTTGAAAAACAGGAGGAAGGGGGGGATGACANCC

A-3’

5’-TCATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGC

GGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTC

CGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGA

CATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTA

GCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCT

GAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACG

GGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCA

ACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGG

GAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCA

GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGC

AAGCGTTGTCCGGAATTATTGNGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTA

AGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGAAAACTG

GTGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAA

+ 2002NTBD1

ATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGNTCT

GTAACTGACGCTGACNAGCTAAAGCTGGTGGACGAACAGGATTGGATACN

CTGTTAGTCCACGCCGTACAGCATGAGTGCTGCGTGTTATGGG-3’

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

Châu Minh Khánh, Phan Thị Hoài Trinh, Ngô Thị Duy Ngọc, Đinh Thành Trung, Lê Thị Hoa, Lê Trọng Bằng, Huỳnh Hoàng Như Khánh, 2020, Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn biển sinh bacteriocin có hoạt tính đối kháng với Vibrio sp., Tạp chí Khoa học và Công nghệ Biển, 20(4B), tr. 333–344.

vietnam academy of science and technology

issn 1859-3097

T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ

biÓn

vietnam journal of marine science and technology

Số đặc biệt trình bày các báo cáo khoa học tại Hội nghị khoa học nhân dịp 45 năm thành lập Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Tiểu ban Khoa học và Công nghệ biển

th

Special issue introducing scientific papers of the scientific conference for 45 anniversary establishment of VAST, Subcommittee of Marine Science and Technology

(T.20)

4B

2020

hµ néi

Vietnam Journal of Marine Science and Technology; Vol. 20, No. 4B; 2020: 333–344 DOI: https://doi.org/10.15625/1859-3097/15957 http://www.vjs.ac.vn/index.php/jmst

Isolation and screening of the marine-associated bacteria possessing the capacity to produce bacteriocins that exhibit antimicrobial efficacy toward Vibrio sp.

Chau Minh Khanh1, Phan Thi Hoai Trinh1, Ngo Thi Duy Ngoc1, Dinh Thanh Trung1, Le Thi Hoa1, Le Trong Bang2, Huynh Hoang Nhu Khanh1,* 1

Nha Trang Institute of Technology Research and Application, VAST, Vietnam 2

Graduate University of Science and Technology, VAST, Vietnam

*

E-mail: hhnkhanh@gmail.com

Received: 3 September 2020; Accepted: 26 November 2020

Abstract Bacteriocins - a group of ribosomally-synthesized antimicrobial peptides have been well studied for broad application in the food industry and pharmaceuticals. However, little is known about the marine-derived bacteriocins, particularly the bacteriocins with inhibitory capacity against the Vibrio sp. (called vibriocins). The study’s overall aims were to evaluate the proportion of active marine bacteria against Vibrio sp. in the Vietnam sea and select promising strains for further application. In this study, marine bacteria were isolated from different marine samples on tryptic soya agar (TSA) and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar (TCBS). Screening of bacteria that exhibit the antimicrobial activity against different Vibrio sp. was conducted using cross streak method and well diffusion assay. Bacterial identification was also carried out based on the 16S rRNA sequences. The result showed that a total of 152 bacteria were isolated from 19 marine samples, including 04 fish guts, 02 shrimp guts, 01 seaweed samples, and 12 different marine sponges. Among the isolates, thirty bacteria (19.7%) exhibited the antimicrobial activity against Vibrio sp., with a high proportion in gut samples. The majority of antimicrobials produced by the marine strains were sensitive to proteolytic digestion, possibly indicating bacteriocin production. Analysis of the 16S rRNA of five strong isolates (2002STB23.3, 2002STB41.1, 2002NTCL2, 2002NTBD1, 2002NTR06) revealed that they all belong to Bacillus species. Collectively, the Vietnam sea region contained a diversity of strains with the capability to depress the growth of pathogenic Vibrio sp. They are suitable for further use to promote sustainable aquaculture in Vietnam.

Keywords: Marine bacteria, bacteriocins, Vibrio sp., marine sponge, fish gut, shrimp gut.

Citation: Chau Minh Khanh, Phan Thi Hoai Trinh, Ngo Thi Duy Ngoc, Dinh Thanh Trung, Le Thi Hoa, Le Trong Bang, Huynh Hoang Nhu Khanh, 2020. Isolation and screening of the marine-associated bacteria possessing the capacity to produce bacteriocins that exhibit antimicrobial efficacy toward Vibrio sp.. Vietnam Journal of Marine Science and Technology, 20(4B), 333–344.

333

Tạp chí Khoa học và Công nghệ Biển, Tập 20, Số 4B; 2020: 333–344 DOI: https://doi.org/10.15625/1859-3097/15957 http://www.vjs.ac.vn/index.php/jmst

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn biển sinh bacteriocin có hoạt tính đối kháng với Vibrio sp.

Châu Minh Khánh1, Phan Thị Hoài Trinh1, Ngô Thị Duy Ngọc1, Đinh Thành Trung1, Lê Thị Hoa1, Lê Trọng Bằng2, Huỳnh Hoàng Như Khánh1,* 1Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện HLKH&CN Việt Nam 2Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện HLKH&CN Việt Nam *E-mail: hhnkhanh@gmail.com

Nhận bài: 3-9-2020; Chấp nhận đăng: 26-11-2020

Tóm tắt Bacteriocin- nhóm peptide biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn- đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, y dược. Tuy nhiên, nghiên cứu về bacteriocin từ vi khuẩn biển còn khá hạn chế, đặc biệt là nhóm bacteriocin ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio sp. (được gọi tắt là vibriocin). Nghiên cứu này được thực hiện nhằm phân lập, đánh giá tiềm năng và tuyển chọn các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh vibriocin. Vi khuẩn biển được phân lập từ nhiều nguồn mẫu khác nhau có nguồn gốc từ biển bao gồm 04 mẫu ruột cá, 02 mẫu tôm và 01 mẫu rong biển thu thập tại vùng biển Nha Trang (Khánh Hòa) cùng 12 mẫu bọt biển thu được tại vùng biển Phú Quý (Bình Thuận). Các chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio sp. được sàng lọc bằng phương pháp cấy dọc và khuếch tán đĩa thạch, sử dụng các vi khuẩn Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae làm vi khuẩn chỉ thị. Kết quả nghiên cứu đã phân lập và thu nhận được 152 chủng vi khuẩn biển; trong đó có 30 chủng (chiếm 19,7%) có biểu hiện hoạt tính đối kháng với ít nhất 1 trong 3 chủng vi khuẩn Vibrio sp. Các chủng có khả năng ức chế mạnh với cả 3 chủng Vibrio sp. trên cả canh trường và môi trường rắn được tuyển chọn cho các nghiên cứu tiếp theo, bao gồm các chủng 2002STB23.3, 2002STB41.1, 2002NTCL2, 2002NTBD1, 2002NTR06. Kết quả phân tích trình tự 16S rRNA cho thấy 05 chủng vi khuẩn biển nêu trên đều thuộc chi Bacillus với sự đa dạng về loài. Đây là nguồn vi khuẩn quan trọng để phát triển sản xuất các chế phẩm sinh học ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản, góp phần phát triển một ngành thủy sản bền vững ở Việt Nam.

Từ khóa: Vi khuẩn biển; Bacteriocin, Vibrio sp; Bọt biển; Ruột tôm; Ruột cá.

GIỚI THIỆU

Bacteriocin là nhóm các peptide (đa số nhỏ hơn 10 kDa) có nguồn gốc từ vi khuẩn và biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn. Phổ kháng khuẩn của bacteriocin thường hẹp, tiêu diệt các vi khuẩn có quan hệ di truyền gần với loài sinh bacteriocin [1]. Gần đây, các bacteriocin có nguồn gốc từ vi khuẩn biển được xác định sở hữu phổ kháng khuẩn rộng, tiêu diệt cả nhóm vi khuẩn gây bệnh Gram âm và Gram dương [2, 3]. Do cấu trúc phân tử thường tích điện

dương, mang cả phần kỵ nước và ưu nước, bacteriocin tiêu diệt vi khuẩn mục tiêu bằng cách bám chuyên biệt lên màng tế bào thông qua liên kết với các thụ thể điện tích âm trên màng, khởi sự quá trình biến đổi cấu trúc màng gây mất tính toàn vẹn cấu trúc màng, cuối cùng gây chết tế bào mục tiêu [4]. So với các chất kháng sinh phổ rộng hiện nay, bacteriocin có tác động chọn lọc đối với vi khuẩn mục tiêu và tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh kháng với bacteriocin là rất thấp. Do đó, liều lượng ức chế tối thiểu

334

Isolation and screening of the marine-associated

của bacteriocin đối với vi khuẩn mục tiêu thường thấp, ở mức nồng độ nanogram thay vì microgram như các loại kháng sinh thông thường. Ngoài ra, bacteriocin tiêu diệt vi khuẩn mục tiêu nhưng không gây ảnh hưởng đến hệ vi khuẩn có lợi như các kháng sinh thông thường. Phân tử bacteriocin đa dạng về cấu trúc, phổ diệt khuẩn, độ bền nhiệt và trọng lượng phân tử. Bacteriocin được sinh ra bởi cả vi khuẩn Gram âm (như E. coli, Pseudomonas sp, Vibrio sp.) [5-7] và vi khuẩn Gram dương. Tuy nhiên, bacteriocin được tìm thấy phổ biến nhất ở các nhóm như vi khuẩn sinh lactic và Bacillales (thuộc vi khuẩn Gram dương) [8, 9].

soát các vi khuẩn Vibrio tubiashii gây bệnh trên hàu hoặc chủng Alteromonas macleodii 0444 được sử dụng để kiểm soát vi khuẩn V. coralliilyticus, Vibrio pectenicida [13]. Trong khi đó, tại Việt Nam một số nghiên cứu đã công bố kết quả phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật biển và đánh giá sơ bộ hiệu quả diệt Vibrio trên ao nuôi tôm [14, 15]. Nguyễn Văn Duy và cộng sự (2013) đã nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn biển sinh bacteriocin dùng làm thuốc đa năng trong nuôi trồng thủy sản. Nhóm nghiên cứu đã tuyển chọn được bộ sưu tập 30 chủng sinh bacteriocin thuộc về nhiều chi vi khuẩn khác nhau như Bacillus, Enterococcus, Proteus, Cronobacter, Enterobacter, Klebsiella [16].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phân lập và đánh giá tỷ lệ các chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng với Vibrio sp. thu được từ các mẫu biển thuộc vùng biển Nha Trang (Khánh Hòa) và vùng biển Phú Quý (Bình Thuận). Việc nghiên cứu phân lập vi khuẩn có khả năng sinh vibriocin sử dụng làm nguyên liệu phát triển các sản phẩm probiotic ứng dụng cho ngành nuôi trồng thủy sản có ý nghĩa khoa học và mang tính ứng dụng cao, đặt cơ sở cho sự phát triển một ngành thủy sản bền vững và mang lại nhiều giá trị kinh tế.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu và phương pháp phân lập vi khuẩn biển

Nguyên liệu: Các mẫu bọt biển thu tại vùng biển Phú Quý (Bình Thuận) ở độ sâu từ 3-5m; các mẫu tôm, cá biển và mẫu rong được thu tại cảng Nha Trang (Khánh Hòa) vào tháng 02/2020. Các mẫu được bảo quản lạnh, vận chuyển về Phòng thí nghiệm và tiến hành phân lập vi khuẩn. Tất cả các mẫu được rửa sạch 03 lần bằng nước biển vô trùng và được sử dụng làm nguồn phân lập vi khuẩn biển, riêng đối với các mẫu tôm và cá: dùng dao mổ vô trùng rạch phần bụng cá hoặc phần sóng lưng của tôm để thu nhận ruột cho vào ống nghiệm sạch và được sử dụng làm nguồn phân lập vi khuẩn biển.

Bacteriocin từ lâu đã được nghiên cứu ứng dụng trong thực phẩm như một chất bảo quản thực phẩm an toàn và sử dụng như một nhóm kháng sinh phổ hẹp trong dược phẩm, đặc biệt trong điều trị nhiễm khuẩn kháng thuốc [10]. Tuy nhiên, bacteriocin vẫn chưa được ứng dụng nhiều trong nuôi trồng thủy sản. Sự hạn chế ứng dụng của bacteriocin trong nuôi trồng thủy sản có lẽ do hầu hết các bacteriocin sử dụng được thu từ vi khuẩn trên cạn, không có hoạt tính hoặc hoạt tính kháng khuẩn yếu đối với các vi khuẩn đặc trưng ở biển như V. parahaemolyticus, V. cholerae, V. vulnificus và Aeromonas sp. (đây là nhóm các vi khuẩn gây bệnh nghiêm trọng và phổ biến đối với nhuyễn thể, cá và tôm trong nuôi trồng thủy sản) [11]. Gần đây, một số công bố trên Thế giới về việc thu nhận bacteriocin, đặc biệt là vibriocin từ vi khuẩn biển đã khẳng định khả năng khai thác ứng dụng của nhóm vi sinh vật này [3, 12]. Bên cạnh đó, các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát Vibrio sp. hữu hiệu, thân thiện với môi trường là hết sức cần thiết để phát triển ngành nuôi trồng thủy hải sản bền vững. Việc sử dụng vi khuẩn biển có lợi đối kháng với vi khuẩn biển gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản có thể được xem là phương thức hiệu quả bởi vi khuẩn biển vẫn đảm bảo sinh trưởng tốt trong môi trường ao nuôi, cũng như chất kháng khuẩn tiết ra từ vi khuẩn biển sẽ ổn định trong điều kiện nuôi trồng so với chất có nguồn gốc từ vi khuẩn trên cạn. Và vì vậy, một vài vi khuẩn biển sinh vibriocin đã bắt đầu được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Gibson và cộng sự (2018) sử dụng chủng Aeromonas sp. A19 trong nuôi hàu Crassostrea gigas nhằm kiểm

Phương pháp phân lập: Vi khuẩn biển (VKB) được phân lập từ mẫu theo phương pháp pha loãng bậc 10. Cứ 5g bọt biển hoặc 5g rong cho vào cối tiệt trùng chứa 45mL nước

335

Chau Minh Khanh et al.

tiếp tục thực hiện pha loãng đến 103 lần. Hút 100 µl dịch ở các nồng độ pha loãng vào 2 môi trường Tryptic soya agar (TSA) và Thiosulfate- citrate bile-sucrose agar (TCBS) trước đó đã bổ sung 50% nước biển tự nhiên, ủ ở nhiệt độ 30oC trong ba ngày. Khuẩn lạc được quan sát và thu nhận mỗi ngày, làm thuần và giữ ở -80oC.

muối sinh lý (NaCl 0,85%) và nghiền mẫu cho đến khi mẫu trở thành dạng dịch huyền phù. Đối với mẫu ruột tôm và cá, 1g mẫu ruột được cho vào 9 mL nước muối sinh lý (NaCl 0,85%), lắc ở 150 vòng/phút trong 15 phút. Đặt mẫu yên tĩnh trong cối hoặc ống nghiệm trong 10 phút, hút 1 mL dịch huyền phù cho vào 9 mL nước muối sinh lý, vortex để trộn đều mẫu và

Hình 1. Hình ảnh một số nguồn mẫu biển thu nhận cho phân lập vi khuẩn biển. 02 mẫu tôm biển và 04 mẫu cá, bao gồm: (A) Tôm Tít Harpiosquilla sp., (B) Tôm He Penaeus latisulcatus, (C) Cá Bò da Aluterus sp., (D) Cá Trác Priacanthus sp., (E) Cá Lượng Nhật Bản Nemipterus japonicus (Bloch, 1791), (F) Cá Lạc Congresox sp. và (J) Rong nâu Sargassum sp. thu nhận tại vùng biển Nha Trang (Khánh Hòa). (G, H, I) hình ảnh đại diện của 03 mẫu bọt biển (trong tổng số 12 mẫu bọt biển) thu nhận tại vùng biển Phú Quý (Bình Thuận). Các mẫu bọt biển đang trong quá trình định danh đến loài

336

Isolation and screening of the marine-associated

Sàng lọc chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng Vibrio sp.

đục lỗ thành các giếng có kích thước 6mm. Khoảng 80µL dịch trong được cho vào các giếng đục sẵn trên đĩa thạch Muller Hilton. Sử dụng 04 trong 07 vi khuẩn chỉ thị như trên, bao gồm Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus và Candida albicans. Vi khuẩn được cho là có khả năng sinh chất kháng khuẩn trong môi trường nuôi cấy lỏng khi một vòng vô khuẩn xuất hiện quanh giếng tương ứng với dịch trong của vi khuẩn đó.

Xác định bản chất của hợp chất kháng khuẩn

Chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio sp. được phát hiện từ tổng số chủng phân lập bằng phương pháp cấy dọc [17]. Theo đó, sinh khối VKB được cấy 1 đường dọc trên đĩa thạch LPMA (2,5 g/L cao nấm men, 5,0 g/L peptone, 1,0 g/L glucose, 0,2 g/L K2HPO4, 0,05g/L MgSO4.7H2O, 500 mL/L nước biển tự nhiên, 500 mL/L nước cất, pH 7,5), ủ ở 30oC qua đêm để VKB hình thành sinh khối. Ba vi khuẩn chỉ thị Vibrio sp. (bao gồm Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae) được cấy ngang từ mép đĩa chạm vào sinh khối vi khuẩn biển. Đĩa được ủ ở 37°C qua đêm cho 3 chủng vi khuẩn chỉ thị hình thành sinh khối. Vi khuẩn biển được cho là có khả năng ức chế Vibrio sp. sẽ hình thành 1 đoạn vô khuẩn giữa sinh khối vi khuẩn biển và vi khuẩn chỉ thị.

Xác định phổ kháng khuẩn của vi khuẩn kháng Vibrio sp. trên môi trường thạch rắn

Phần dịch trong biểu hiện hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus được sử dụng đại diện xác định bản chất của chất kháng khuẩn hiện diện. Khoảng 200µL dịch được ủ với pronase E (Sigma Aldrich) ở nồng độ cuối cùng là 1 mg/ mL ở 37oC trong 60 phút. Khoảng 80 µL dịch ủ enzyme và dịch không ủ enzyme làm đối chứng được cho vào hai giếng (D=6mm) trong phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Chất kháng khuẩn trong phần dịch trong được xem có bản chất protein hoặc là bacteriocin khi hoạt tính tiêu diệt Vibrio bị mất sau quá trình xử lý enzyme. Phân tích trình tự nucleotide của gen mã hóa 16S rRNA

harveyi,

(Vibrio

âm

Các VKB biểu hiện đối kháng với Vibrio sp. xác định ở bước trên được sử dụng để xác định phổ kháng khuẩn bằng phương pháp cấy dọc [17]. Thí nghiệm này sử dụng 7 chủng vi sinh vật chỉ thị (VSVCT) bao gồm 4 vi khuẩn Vibrio Gram parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli), 2 vi khuẩn Gram dương (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus) và 1 vi nấm (Candida albicans).

Khả năng sinh chất kháng Vibrio sp. trong môi trường nuôi cấy lỏng

DNA tổng số của vi khuẩn biển được tách chiết theo phương pháp bead beating [19]. Đoạn gen 16S rRNA được khuếch đại bằng PCR từ DNA tổng số, sử dụng với cặp mồi 27F: AGAGTTTGATCCTGGCTAG và 1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT. Thành phần hỗn hợp cho PCR bao gồm 25 µl đệm mastermix PCR, 2 µl mồi xuôi, 2 µl mồi ngược, 1-2 µl DNA khuôn và bổ sung H2O đến thể tích tổng là 50 µl. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, tinh sạch, giải trình tự bằng phương pháp Sanger. Sản phẩm đoạn gen 16S rRNA được so sánh với các trình tự trên Ngân hàng Gen quốc tế bằng chương trình BLAST [20]. Cây phân loại được xây dựng sử dụng phần mềm MEGAX phiên bản 10.1.8 với phương pháp Neighbor Joining sử dụng bootstrap 1000 [21].

Phương pháp xử lý thống kê

Khả năng sinh chất kháng khuẩn của VKB trong canh trường được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch [18]. Theo đó, một khuẩn lạc đơn của vi khuẩn được cấy vào 5 mL môi trường lỏng LPMA, lắc ở tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC trong vòng 24 giờ. Dịch môi trường được ly tâm loại bỏ sinh khối vi khuẩn, lọc qua màng polyether sulfones (PES) 0,45µm để thu nhận phần dịch trong không chứa tế bào vi khuẩn. Phần dịch trong được thu nhận để xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Theo đó, đĩa môi trường Muller Hilton được quét với 0.5McFarland dịch huyền phù sinh khối vi khuẩn chỉ thị (0,85% NaCl), đĩa được

Phương pháp kiểm t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances được sử dụng để đánh giá sự sai khác có ý nghĩa giữa tỷ lệ phân

337

Chau Minh Khanh et al.

lập vi khuẩn đối kháng với Vibrio sp. từ các nguồn mẫu biển khác nhau. Dữ liệu được xử lý trên Microsoft Excel với 5% độ sai khác có ý nghĩa.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập vi khuẩn biển

Quá trình thu mẫu đã thu nhận được 19 mẫu biển phục vụ cho phân lập VKB bao gồm 02 mẫu ruột tôm, 04 mẫu ruột cá, 01 mẫu rong biển và 12 mẫu bọt biển. Hình ảnh và tên mẫu được mô tả chi tiết ở Hình 1. Dựa trên màu sắc,

kích thước và hình thái bề mặt khuẩn lạc VKB, thí nghiệm phân lập thu nhận được 152 chủng VKB bao gồm 128 chủng trên môi trường TSA và 24 chủng trên môi trường TCBS. Hình thái khuẩn lạc của một số đại diện vi khuẩn biển được hiển thị ở Hình 2 với sự đa dạng về màu sắc, kích thước. VKB mọc trên môi trường TCBS chỉ được phân lập ở mẫu ruột (cá, tôm biển) đối với nồng độ không pha loãng hoặc pha loãng 10 lần. VKB thu nhận trên TSA thường được phân lập ở độ pha loãng 100 lần hoặc 1000 lần.

Hình 2. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn biển được làm thuần. (A) đĩa môi trường TCBS phân lập cho các chủng Vibrio, (B) Đĩa môi trường TSA phân lập các vi khuẩn khác. Các hình xung quanh mô tả hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn thu nhận trên 2 môi trường. Các vi khuẩn biển có khuẩn lạc đa dạng về hình thái, kích thước, màu sắc khuẩn lạc

Bảng 1. Thông tin về số lượng chủng VKB phân lập từ mẫu biển và số lượng VKB biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio sp. tương ứng với từng mẫu và môi trường phân lập

Các nội dung thông tin

Ruột tôm

Ruột cá

Rong

Biển Nha Trang

Bọt biển Biển Phú Quý 12 65 0 65 9 0 9 13,8%

2 18 7 25 7 0 7 28,0%

4 35 17 52 10 3 13 25,0%

1 10 0 10 10 0 1 10,0%

Địa điểm thu mẫu Số lượng mẫu thu nhận cho phân lập VKB Số chủng VKB thu nhận được trên môi trường TSA Số chủng VKB thu nhận được trên môi trường TCBS Tổng số chủng VKB thu nhận được trên hai môi trường Số bac+ phân lập được trên môi trường TSA Số bac+ phân lập được trên môi trường TCBS Tổng số bac+phân lập được trên trên 2 môi trường Tỷ lệ số bac+ so với tổng VKB phân lập được Ghi chú: bac+: chủng VKB biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio sp.

338

Isolation and screening of the marine-associated

Tuyển chọn chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio sp.

khuẩn Vibrio sp., chiếm tỷ lệ 21,09 %. Trong khi đó, tổng số 24 VKB phân lập trên môi trường TCBS có 03 chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio sp., chiếm tỷ lệ 8,5%. Xét trên tổng VKB thu nhận từ hai môi trường, tỷ lệ phân lập chủng bac+ được phát hiện theo thứ tự như sau: ruột tôm (28,0%) > ruột cá (25,0%) > bọt biển (13,8%) > rong (10,0%) (bảng 1).

Kết quả phân tích thống kê cho thấy rằng sự chênh lệch về tỷ lệ phân lập bac+ giữa "mẫu ruột tôm và mẫu ruột cá” không có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên, sự sai khác giữa “mẫu ruột tôm và bọt biển”, hoặc giữa “mẫu ruột cá và bọt biển” có ý nghĩa về thống kê ở mức độ tin cậy 95%. Điều này chứng tỏ rằng ruột tôm và cá biển là hai nguồn phân lập quan trọng để thu nhận tỷ lệ cao các chủng VKB biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio sp. Kết quả khá tương đồng với một số nghiên cứu trên thế giới. Chẳng hạn như Sugita và cộng sự đã phân lập được nhiều VKB đối kháng với Vibrio sp. từ 07 loài cá sống ở vùng biển Nhật Bản [22]. Nhóm tác giả này cũng đã ghi nhận hoạt tính đối kháng Vibrio sp. ở VKB phân lập từ ruột cá bơn lưỡi ngựa [23]. Ngoài nguồn ruột cá, vi khuẩn bac+ còn được phân lập ở bọt biển, trầm tích, và mẫu đất thu ở rừng ngập mặn, tuy nhiên tỷ lệ phân lập ít hơn và không đa dạng về loài [2, 6].

Phổ kháng khuẩn vi khuẩn trên môi trường thạch dinh dưỡng

Hình 3. Phương pháp cấy dọc nhằm xác định hoạt tính đối kháng của VKB đối với vi sinh vật chỉ thị. Hình A và B: Thí nghiệm sàng lọc sơ bộ các chủng có biểu hiện đối kháng với Vibrio sp., sử dụng 3 VSVCT gồm (1) V. (2) V. parahaemolyticus, (3) V. harveyi, cholerae. Hình C và D: Thí nghiệm xác định phổ kháng khuẩn của VKB biểu hiện kháng Vibrio sp., sử dụng 7 VSVCT bao gồm (1) S. aureus, (2) B. cereus, (3) C. albicans, (4) sinh khối VKB làm chứng âm, (5) V. harveyi, (6) V. parahaemolyticus, (7)V. cholerae và (8) E. coli. Trong đó, hình C hiển thị chủng biểu hiện tính đối kháng mạnh với VSVCT; hình D biểu thị chủng không biểu hiện tính đối kháng với VSVCT

Phổ kháng khuẩn của 30 bac+ thu nhận ở thí nghiệm trên được xác định bằng phương pháp cấy dọc. Thí nghiệm sử dụng 7 chủng VSVCT bao gồm 4 vi khuẩn Gram âm (3 Vibrio sp., 1 E. coli), 2 vi khuẩn Gram dương (S. aureus, B. cereus) và 1 vi nấm (C. albicans). Kết quả cho thấy, các bac+ thu nhận trên môi trường TSA sở hữu phổ kháng khuẩn rộng và mạnh hơn bac+ phân lập trên môi trường TCBS (Hình 3). Trong tổng 27 chủng bac+ thu nhận trên môi trường TSA, tỷ lệ chủng biểu hiện tính đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là cao nhất (chiếm 96,29%, 26/27 chủng), theo sau là B. cereus (chiếm tỷ lệ 92,6%, 25/27 chủng), Vibrio harveyi (chiếm tỷ lệ 88,89%, 24/27 chủng) và Vibrio cholerae (chiếm tỷ lệ 88,89%, 24/27 chủng). Trong khi đó, tỷ lệ chủng ức chế S.

VKB biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio sp. (gọi tắt là bac+) được xác định bằng phương pháp cấy dọc sử dụng 03 vi khuẩn chỉ thị là 3 chủng Vibrio sp khác nhau. Quá trình sàng lọc thu nhận được 30 chủng bac+ từ tổng 152 chủng VKB phân lập trên cả hai môi trường, chiếm tỷ lệ 19,7%. Số lượng chủng VKB và số lượng chủng bac+ tương ứng với từng nguồn mẫu được đề cập chi tiết trong Bảng 1. Theo đó, trong tổng số 128 VKB phân lập trên môi trường TSA có 27 chủng được xác định biểu hiện hoạt tính đối kháng với ít nhất 1 vi

339

Chau Minh Khanh et al.

aureus và C. albicans ít hơn, chiếm lần lượt 62,9% (17/27 chủng), 44,44% (12/27 chủng).

Kết quả cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn biển thu trên TSA đa số có phổ kháng rộng, trong đó 8,5% (5/27) chủng tiêu diệt tất cả 7 vi sinh vật chỉ thị (VSVCT), 29,6% (8/27) vi khuẩn biểu hiện hoạt tính đối kháng với 6 VSVCT, 18,5% (5/27) chủng tiêu diệt 5

VSVCT, và 14,8% (4/27) chủng tiêu diệt 4 VSVCT. Tỷ lệ các chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng VSV cao nhất ở mẫu ruột (66,6%, 20/30) > bọt biển (30,0%, 9/30) > rong (3,3%, 1/30). Kết quả trên cho thấy tầm quan trọng của việc chọn lọc nguồn mẫu cho phân lập VKB biểu hiện hoạt tính đối kháng Vibrio sp.

Bảng 2. Kết quả xác định phổ kháng diệt khuẩn của 30 vi khuẩn biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio, xác định bằng phương pháp cấy dọc

STT Mã vi khuẩn biển

Vibrio harveyi

Vibrio parahaemolyticus

Vi khuẩn chỉ thị E. coli

Vibrio cholerae

B. cereus

S. aureus

C. albicans

Vi khuẩn phân lập trên môi trường TSA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

2002STB2.1 2002STB5.3 2002STB19.3 2002STB21.6 2002STB23.1 2002STB23.2 2002STB23.3 2002STB29.1 2002STB41.1 2002NTCL2 2002NTCL3 2002NTCL8 2002NTBD1 2002NTBD4 2002NTBD6 2002NTST1 2002NTST2 2002NTST5 2002NTCD2 2002NTTB1 2002NTTB2 2002NTTT3 2002NTTT4 2002NTTT6 2002NTTT7 2002NTTT1 2002NTR06

- +++ + + ++ ++ +++ +++ +++ +++ + ++ ++ +++ - +++ - +++ ++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

++ +++ + - ++ ++ ++ ++ +++ +++ + ++ ++ +++ ++ +++ + ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ +++ ++ +++

++ ++ - + + ++ ++ ++ +++ ++ + - + ++ - +++ + +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

- - - - - - - - + + - - - - - ++ - - + + - + + + - - +

+ + + ++ + + + + + ++ - + + + + ++ - + + + + + + + + + +

- - + +++ - + - + - ++ - + + + - ++ - + + - + + + + + - +

- - - - - - - - - ++ - + + + - - - + + + - + - ++ + ++ ++

Vi khuẩn phân lập trên TCBS

28 29 30

2002NTBD8 2002NTBD9 2002NTCD10

+ + +

- + +

- - -

- -

- - -

Ghi chú: - : không hoạt tính (HT); (+):HT yếu; tăng dần + biểu thị hoạt tính kháng khuẩn tăng dần.

Xác định khả năng sinh chất kháng khuẩn trong dịch môi trường lỏng

parahaemolyticus, B. cereus, C. albicans. Trên tổng 27 chủng phân lập trên TSA, B. cereus bị ức chế bởi dịch nuôi của 17 chủng (chiếm 62,9%), V. harveyi bị ức chế bởi 18 chủng (chiếm 66,6%), V. parahaemolyticus bị ức chế bởi 15 chủng (chiếm 55,5%), và không ghi

Khả năng sinh chất kháng khuẩn của 30 VKB trong canh trường được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch, sử dụng 4 V. gồm V. VSVCT

harveyi,

bao

340

Isolation and screening of the marine-associated

nhận dịch nuôi ức chế C. albicans (Hình 4). Hoạt tính ức chế V. parahaemolyticus của vi khuẩn biển mạnh hơn hoạt tính ức chế vi khuẩn V. harveyi, có thể thấy rõ qua đường kính vòng vô khuẩn. Thêm vào đó, số lượng vi khuẩn biển biểu hiện hoạt tính đối kháng xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch thấp hơn so với phương pháp cấy dọc.

Trong phương pháp khuếch tán đĩa thạch chất kháng khuẩn thường bị pha loãng, nồng độ chất nhỏ hơn giá trị ức chế tối thiểu cần thiết để tiêu diệt VSVCT, có thể gây âm tính giả. Nhiều nghiên cứu cũng khẳng định quá trình vi khuẩn sinh bacteriocin trong canh trường phụ thuộc nhiều yếu tố như thời gian tăng trưởng, tốc độ lắc, mật độ vi khuẩn, thành phần môi trường, yếu tố cảm ứng quá trình sinh chất. Do đó, trong nghiên cứu thu nhận bacteriocin, cần thiết có những thí nghiệm tối ưu nhằm xác định các điều kiện tăng trường của vi khuẩn. Kết quả cũng chứng mình rằng, phương pháp sàng lọc chủng sinh chất kháng khuẩn bằng phương pháp cấy dọc là nhạy hơn so với phương pháp khuếch tán đĩa thạch.

Sử dụng 15 dịch trong của 15 chủng biểu hiện hoạt tính ức chế V. parahaemolyticus làm đại diện để xác định bản chất chất kháng khuẩn hiện hiện. Kết quả cho thấy rằng, 9 trên 15 dịch môi trường mất hoạt tính sau ủ với enzyme pronase E. Điều này chứng tỏ chất kháng khuẩn có bản chất là protein. Kết quả tương tự với những nghiên cứu gần đây liên quan đến phân lập vi khuẩn biển như Vibrio mediterranei, Lactobacillus từ ruột động vật thủy sản [24, 25]. Các nghiên cứu này xác định chất kháng khuẩn nhạy với enzyme proteinase thường được xác dịnh là bacteriocin [24]. Bên cạnh đó, 6 trên 15 dịch môi trường vẫn giữ hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus sau khi ủ enzyme. Lý giải việc này có do nhiều nguyên nhân; trong đó: i) do cấu trúc đa dạng, một số bacteriocin có cấu trúc bậc 4, ẩn những amino acid là điểm cắt chuyên biệt của pronase E gây hiện tượng âm tính giả; do đó, việc xác định bản chất của bacteriocin cần sử dụng kết hợp nhiều loại enzyme phân cắt protein khác nhau như proteinase K, hoặc trypsin; (ii) nhiều vi khuẩn đặc biệt là Bacillus sinh cả bacteriocin, lipopeptide và một số acid hữu cơ có hoạt tính ức chế Vibrio sp; các vi khuẩn này được xem như nguồn thu nhận dồi dào nhiều hợp chất kháng khuẩn, ứng dụng không chỉ cho thủy sản mà còn trong nông nghiệp kiểm soát nấm gây bệnh và như một nguồn kháng sinh hữu hiệu trong y dược.

Phân tích trình tự nucleotide của gen mã hóa 16S rRNA của DNA

(2002STB23.3, 5 VKB 2002BTB41.1, 2002NTCL2. 2002NTBD1, 2002NTR06) có hoạt tính kháng Vibrio sp. mạnh được dùng làm khuôn để khuếch đại gen 16s rRNA. Kết quả PCR cho thấy sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, kích thước khoảng hơn 1000 bp.

đồng

tương

98,0%

Dựa trên kết quả so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen và cây phát sinh loài (Hình 5), chủng 2002STB23.3 phân lập từ bọt biển có độ với Bacillus licheniformis MPF22 (MT48762.1). Một chủng khác được phân lập từ bọt biển là 2002STB41.1 có độ tương đồng trình tự 16S rRNA là 98,3% với vi khuẩn Bacillus altitudinis NPB34B (MT598007.1). Hai chủng 2002NTBD1 và 2002NTCL2 được phân lập từ ruột hai loài cá

Hình 4. Khả năng sinh chất kháng khuẩn trong canh trường bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. VSVCT bao gồm (A): V. harveyi, (B) V. parahaemolyticus, (C) B. cereus, (D) C. albicans Xác định bản chất của hợp chất kháng khuẩn

341

Chau Minh Khanh et al.

Bacillus

flexus

strain

chủng

trình

tự

Sargassum sp. có độ tương đồng 96,4% với K3.2 chủng (MT299641.1). Kết quả này chứng tỏ sự đa dạng về loài của vi khuẩn biển sinh vibriocins được phân lập ở vùng biển Việt Nam.

khác nhau đều được xác định là vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens, do trình tự 16S rRNA tương đồng lần lượt là 97,6% và 99,0% với Bacillus của amyloliquefaciens FZB42 (MT598007.1). Cuối cùng, chủng 2002NTR6 được phân lập từ rong

Hình 5. Cây phân loại thể hiện mối liên quan giữa 5 chủng có hoạt tính mạnh và loài có trình tự gen 16S rRNA tương đồng. Cây được vẽ theo phương pháp Neighbor Joining, với bootstrap đối với 1000 phép so sánh. Kết quả cho thấy mối quan hệ giữa các chủng nghiên cứu với các thành viên đại diện của các chi B. flexus, B. altitudinis, B. licheniformis và B. amyloliquefaciens

KẾT LUẬN

Lời cảm ơn: Kết quả nghiên cứu này được thực hiện bởi sự tài trợ kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi sinh vật biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin nhằm ứng dụng trong nuôi trồng thủy hải sản”, mã số: VAST 02.05/20-21. Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn TS. Đào Tấn Học và ThS. Lê Thị Thu Thảo, Viện Hải dương học (Viện Hàn lâm KHCNVN) đã hỗ trợ định danh đối với các mẫu tôm và cá biển sử dụng làm nguồn phân lập vi sinh vật biển trong nghiên cứu này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Riley, M.A. and J.E. Wertz, Bacteriocins: evolution, ecology, and application. Annual Review of Microbiology, 2002. 56: p. 117-37.

Đã phân lập thành công các chủng Bacillus biểu hiệu hoạt tính kháng Vibrio sp. từ các mẫu biển thuộc vùng biển Nha Trang (Khánh Hòa) và Phú Qúy (Bình Thuận). Tỷ lệ phát hiện các chủng vi khuẩn biển sinh chất đối kháng với Vibrio sp. cao nhất ở ruột tôm, cá. Trong số các vi khuẩn biển biểu hiện hoạt tính kháng Vibrio sp., 5 chủng 2002STB23.3, 2002BTB41.1, 2002NTCL2, 2002NTBD1, 2002NTR06 có hoạt tính kháng Vibrio sp. mạnh trên cả môi trường rắn, lỏng và chất kháng khuẩn có bản chất là protein. Kết quả phân tích trình tự 16S rRNA cho thấy 05 chủng vi khuẩn biển nêu trên đều thuộc chi Bacillus và có sự đa dạng về loài. Đây là nguồn vi khuẩn quan trọng cho nghiên cứu tinh sạch vibriocins, ứng dụng vibriocins và vi khuẩn như nguồn probiotic cho phát triển ngành thủy sản bền vững.

2. Chopra, L., et al., Sonorensin: an antimicrobial peptide, belonging to the of heterocycloanthracin

subfamily

342

Isolation and screening of the marine-associated

hippoglossus L., inhibit growth of a pathogenic Vibrio sp. Journal of Fish Diseases, 1995. 18: p. 31-40.

bacteriocins, from a new marine isolate, Bacillus sonorensis MT93. Applied and environmental microbiology, 2014. 80: p. 2981-2990.

3. Ahmad, A., et al., Pseudomonas putida strain FStM2 isolated from shark skin: a potential source of bacteriocin. Probiotics and Antimicrobial Proteins, 2013. 5: p. 165-175.

13. Gibson, L.F., J. Woodworth, and A.M. George, Probiotic activity of Aeromonas media on the Pacific oyster, Crassostrea gigas, when challenged with Vibrio tubiashii. Aquaculture, 1998. 169: p. 111- 120.

subtilis

and

4. Cotter, P., C. Hill, and R. Ross, Bacteriocins: Developing Innate Immunity for food. Nature reviews. Microbiology, 2005. 3: p. 777-88. Flaherty, R.A., S.D. Freed, and S.W. Lee, The wide world of ribosomally encoded bacterial peptides. PLoS Pathog, 2014. 10: p. e1004221.

14. Ngan, P.T.T., H.D. Tho, and T.N. Suong, Comparing the ability on improving water quality and inhibiting Vibrio of selected Bacillus Streptomyces parvulus in white leg shrimp (Litopenaeus vannamei). Can Tho University Journal of Science, 2016. 47: p. 87-95 (in Vietnamese).

and

strains

associated

Agriculture

and

6. Balakrishnan, B., et al., Purification, production characterization optimization of a vibriocin produced by mangrove Vibrio parahaemolyticus. Asian Pacific journal of tropical biomedicine, 2014. 4: p. 253- 261.

15. Đào, N.T.B., et al., Isolation and selection inhibit Vibrio Bacillus parahaemolyicus which is the cause of EMS on shrimp farming in Thua Thien Hue province. Hue University Journal of Rural Science: Development, 2015. 100: p. 15-28 (in Vietnamese).

bacteriocin

partner.

Applied

16. Nguyen, V.D., et al., Screening of marine bacteria with bacteriocin-like activities and probiotic potential for ornate spiny lobster (Panulirus ornatus) juveniles. Fish Shellfish Immunol, 2014. 40: p. 49-60.

17. Lertcanawanichakul, M.

and

for measuring

7. Ghequire, M.G.K. and B. Öztürk, A colicin M-type from Pseudomonas aeruginosa targeting the HxuC Heme receptor requires a novel immunity and Environmental Microbiology, 2018. 84: p. e00716-18. and R.W. Lovitt, Zacharof, M.P. Bacteriocins produced by lactic acid bacteria- a review article. APCBEE Procedia, 2012. 2: p. 50-56.

S. sawangnop, A comparison of two methods used the antagonistic activity of Bacillus species Walailak Journal of Science and Technology, 2008. 5: p. 161-171.

9. Abriouel, H., et al., Diversity and applications of Bacillus bacteriocins. FEMS Microbiology Reviews, 2011. 35: p. 201-232.

20.

18. Valgas, C., et al., Screening methods to determine antibacterial activity of natural products. of Journal Brazilian Microbiology, 2007. 38: p. 369-380. 19. Fujimoto, S., Y. Nakagami, and F. Kojima, Optimal bacterial DNA isolation method using bead-beating technique. Memoirs of Kyushu University School of Health Sciences, 2004. 3: p. 33-38. Johnson, M., et al., NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research, 2008. 36: p. W5-W9.

10. Hansen, J.N., Nisin as a model food preservative. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1994. 34: p. 69-93. 11. Lavilla-Pitogo, C.R., E.M. Leaño, and M.G. Paner, Mortalities of pond-cultured juvenile shrimp, Penaeus monodon, associated with dominance of luminescent vibrios the rearing environment. Aquaculture, 1998. 164: p. 337-349. 12. Bergh, Ø., Bacteria associated with early life stages of halibut, Hippoglossus

21. Kumar, S., et al., MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across

343

Chau Minh Khanh et al.

24. Abdulla, M.H., Gut associated lactic acid bacteria isolated from the estuarine fish Mugil cephalus: molecular diversity and antibacterial activities against pathogens. International Journal of Aquaculture, 2014. 1: p. 1-11.

Computing Platforms. Molecular Biology and Evolution 2018. 35: p. 1547-1549. 22. Sugita, H., et al., Production of the antibacterial substance by Bacillus sp. strain NM 12, an intestinal bacterium of Japanese coastal fish. Aquaculture, 1998. 165: p. 269-280.

25. Carraturo, A., et al., Inhibition of Vibrio parahaemolyticus by a bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS) produced by Vibrio mediterranei 1. Journal of Applied Microbiology, 2006. 101: p. 234-41.

23. Sugita, H., et al., Production of the antibacterial substance by Bacillus sp. strain NM 12, an intestinal bacterium of Japanese coastal fish. Aquaculture, 1998. 165: p. 269-280.

344

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp Bacteriocin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Lê Trọng Bằng

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Lê Trọng Bằng

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Huỳnh Hoàng Như Khánh Hà Nội – 2021

viÖn hµn l©m khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam

vietnam academy of science and technology

issn 1859-3097

T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ

biÓn

vietnam journal of marine science and technology

Số đặc biệt trình bày các báo cáo khoa học tại Hội nghị khoa học nhân dịp 45 năm thành lập Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Tiểu ban Khoa học và Công nghệ biển

th

Special issue introducing scientific papers of the scientific conference for 45 anniversary establishment of VAST, Subcommittee of Marine Science and Technology

(T.20)

4B

2020

hµ néi

Isolation and screening of the marine-associated bacteria possessing the capacity to produce bacteriocins that exhibit antimicrobial efficacy toward Vibrio sp.

Chau Minh Khanh1, Phan Thi Hoai Trinh1, Ngo Thi Duy Ngoc1, Dinh Thanh Trung1, Le Thi Hoa1, Le Trong Bang2, Huynh Hoang Nhu Khanh1,* 1

*

Keywords: Marine bacteria, bacteriocins, Vibrio sp., marine sponge, fish gut, shrimp gut.

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn biển sinh bacteriocin có hoạt tính đối kháng với Vibrio sp.

Từ khóa: Vi khuẩn biển; Bacteriocin, Vibrio sp; Bọt biển; Ruột tôm; Ruột cá.

GIỚI THIỆU

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu và phương pháp phân lập vi khuẩn biển

Sàng lọc chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng Vibrio sp.

Xác định bản chất của hợp chất kháng khuẩn

Xác định phổ kháng khuẩn của vi khuẩn kháng Vibrio sp. trên môi trường thạch rắn

Khả năng sinh chất kháng Vibrio sp. trong môi trường nuôi cấy lỏng

Phương pháp xử lý thống kê

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập vi khuẩn biển

Tuyển chọn chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio sp.

Phổ kháng khuẩn vi khuẩn trên môi trường thạch dinh dưỡng

Xác định khả năng sinh chất kháng khuẩn trong dịch môi trường lỏng

Phân tích trình tự nucleotide của gen mã hóa 16S rRNA của DNA

Hình 4. Khả năng sinh chất kháng khuẩn trong canh trường bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. VSVCT bao gồm (A): V. harveyi, (B) V. parahaemolyticus, (C) B. cereus, (D) C. albicans Xác định bản chất của hợp chất kháng khuẩn

KẾT LUẬN

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Riley, M.A. and J.E. Wertz, Bacteriocins: evolution, ecology, and application. Annual Review of Microbiology, 2002. 56: p. 117-37.

4. Cotter, P., C. Hill, and R. Ross, Bacteriocins: Developing Innate Immunity for food. Nature reviews. Microbiology, 2005. 3: p. 777-88. Flaherty, R.A., S.D. Freed, and S.W. Lee, The wide world of ribosomally encoded bacterial peptides. PLoS Pathog, 2014. 10: p. e1004221.

S. sawangnop, A comparison of two methods used the antagonistic activity of Bacillus species Walailak Journal of Science and Technology, 2008. 5: p. 161-171.

Computing Platforms. Molecular Biology and Evolution 2018. 35: p. 1547-1549. 22. Sugita, H., et al., Production of the antibacterial substance by Bacillus sp. strain NM 12, an intestinal bacterium of Japanese coastal fish. Aquaculture, 1998. 165: p. 269-280.

23. Sugita, H., et al., Production of the antibacterial substance by Bacillus sp. strain NM 12, an intestinal bacterium of Japanese coastal fish. Aquaculture, 1998. 165: p. 269-280.

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Quản lý hoạt động phát triển nhận thức cho trẻ mẫu giáo ở các trường mầm non, huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về điều kiện đầu tư kinh doanh trong lĩnh vực giáo dục, đào tạo ở Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Sự nghiệp nghiên cứu phê bình văn học của Hoài Thanh

Luận văn Thạc sĩ: Tiểu thuyết của Đỗ Phấn từ góc nhìn sinh thái

Luận văn Thạc sĩ: Giải pháp ứng phó với nhập cư ở Liên minh Châu Âu

Luận văn Thạc sĩ: Diễn ngôn về giới nữ trong văn xuôi nữ Việt Nam đương đại (khảo sát sáng tác của Dạ Ngân, Y Ban, Lý Lan, Nguyễn Thị Thu Huệ)

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng mức phát thải tham chiếu rừng khu vực huyện Bảo Lâm tỉnh Lâm Đồng

Luận văn Thạc sĩ: Đặc điểm nhân vật chính trong ba tác phẩm của Franz Kafka: Lâu đài, Vụ án, Hóa thân

Kháo luận tốt nghiệp: Vận dụng lí thuyết học tập trải nghiệm vào dạy học Thống kê - Xác suất ở lớp Hai

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng hệ thống điều khiển và thu nhận dữ liệu cho Robot dịch vụ

Luận văn Thạc sĩ: Thế giới nhân vật trong truyện ngắn Lê Minh Khuê sau năm 1975

Luận văn Thạc sĩ: Tác động của cấu trúc vốn đến hiệu quả hoạt động của các ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Kiểm soát rủi ro tín dụng bán lẻ tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Đầu tư và Phát triển Việt Nam chi nhánh Thủ Thiêm

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kinh doanh của ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hành vi sử dụng dịch vụ ngân hàng điện tử tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Ngoại thương Việt Nam – Chi nhánh Thủ Đức

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố tác đồng đến nợ xấu tại Ngân hàng Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn - Chi nhánh Tiền Giang

Luận văn Thạc sĩ: Yếu tố ảnh hưởng đến quyết định sử dụng dịch vụ thanh toán không dùng tiền mặt tại Ngân hàng TMCP Công thương Việt Nam (Vietinbank)

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về du lịch biển, thực tiễn tại tỉnh Bình Định

Luận văn Thạc sĩ: Ảnh hưởng của các yếu tố thương hiệu với vai trò trung gian của Marketing truyền miệng đến quyết định chọn việc làm của nhân viên GenZ tại chuỗi nhà hàng gà rán Popeyes khu vực Thành Phố Hồ Chí Minh

Luận văn Thạc sĩ: Ảnh hưởng của Marketing mix đến ý định học cao học của sinh viên khối ngành kinh tế thuộc Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông