NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI, KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DDT VÀ SINH LACCASE CỦA CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Ô NHIỄM HỖN HỢP THUỐC TRỪ SÂU

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ----------------///----------------

Đào Thị Ngọc Ánh

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI, KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DDT

VÀ SINH LACCASE CỦA CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ ĐẤT

Ô NHIỄM HỖN HỢP THUỐC TRỪ SÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ----------------///----------------

Đào Thị Ngọc Ánh

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI, KHẢ NĂNG PHÂN HỦY

DDT VÀ SINH LACCASE CỦA CHỦNG NẤM SỢI

PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Ô NHIỄM HỖN HỢP THUỐC TRỪ SÂU

Chuyên ngành Mã số : Sinh học thực nghiệm : 60.42.30

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Thái Nguyên - 2009

Lời Cảm Ơn !

Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi gửi lời cảm ơn chân thành và

sâu sắc đến sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà,

và các anh chị trong nhóm nghiên cứu Công nghệ sinh học xử lý khử độc các

chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy, phòng Công nghệ Sinh học Môi trường,

đặc biệt là Ths. Nguyên Bá Hữu, KS. Đàm Thúy Hằng, KS.Nguyễn Nguyên

Quang, KS. Nguyễn Quang Huy.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Khoa sau đại học, Khoa Sinh-Kỹ

thuật nông nghiệp – Trường đại học Sư phạm – Đại Học Thái Nguyên và lãnh

đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận

tình dạy dỗ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và thực hiện

luận văn này.

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè

đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể

hoàn thành bản luận văn này.

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Đào Thị Ngọc Ánh

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

2,4,- dichlorophenoxyacetic acid 2,4-D

2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T

2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxin

ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)

bp Base pair

DDE Dichlorodiphenyldichloroethylene

DDD Dichlorodiphenyldichloroethane

DDT Dichloro - Trichloroethane Diphenyl

DNA Deoxyribonucleic acid

EC Enzyme Commission

EPA U.S. Environmental Protection Agency

HCH Hexacyclohexan

Lac Laccase

LB Luria - Bertani

LiP Lignin peroxidase

MnP Manganese peroxidase

PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon

PCB Polychlorinated biphenyl

PCR Polymerase Chain Reaction

POP Persistent Organic Pollutant

RBBR Remazol brilliant blue R

RNA Ribonucleic acid

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

5-bromo-4-chloro-3-indodyl- β galactosidase

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

X-gal

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

MỤC LỤC

MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA DDT

1.1 Cấu trúc của DDT 1.2 Tính chất lý hóa của DDT

1 4 6 6 6 6

CỦA DDT

2.1 Ảnh hƣởng đến môi trƣờng 2.2 Ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời 3 TÌNH TRẠNG Ô NHIỄM DDT 3.1 Nguồn gốc phát sinh 3.2 Tình trạng ô nhiễm DDT trên thế giới 3.3 Tình trạng ô nhiễm DDT ở Việt Nam

4.1 Các phƣơng pháp cơ, hóa lý

4 CÁC PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ Ô NHIỄM DDT

4.1.1 Phương pháp chôn lấp, cô lập 4.1.2 Phương pháp đốt có xúc tác 4.1.3 Phương pháp phân hủy bằng kiềm nóng

4.2 Phƣơng pháp phân hủy sinh học

5 PHÂN HỦY SINH HỌC DDT

5.1 Khả năng phân hủy DDT bởi vi sinh vật

2 ẢNH HƢỚNG ĐẾN MÔI TRƢỜNG VÀ SỨC KHỎE CON NGƢỜI

5.1.1 Loại clo bởi quá trình khử 5.1.2 Khoáng hoá DDT bởi nấm thủy phân lignin 5.1.3 Phân hủy DDT bởi vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí

7 7 9 11 11 13 14 16 16 16 17 17 18 20 20 21 22 23

5.2 Các điều kiện môi trƣờng ảnh hƣởng đến phân hủy sinh học DDT và

6 LACCASE

các dẫn xuất của DDT

6.1 Định nghĩa 6.2 Cấu trúc phân tử của laccase 6.3 Cơ chế xúc tác của laccase 6.4 Tính chất hóa sinh của laccase 6.5 Sự phân bố và một số vi sinh vật sinh laccase 6.6 Gene mã hóa laccase 6.7 Ứng dụng của laccase 6.8 Lignin peroxidase và Mangan peroxidase

6.8.1 Lignin peroxidase 6.8.2. Mangan peroxidase

7 PHÂN LOẠI VI SINH VẬT

26 27 27 28 30 32 33 34 36 37 37 38 39 39

7.1 Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống 7.2 Phân loại bằng phƣơng pháp xác định và so sánh trình tự gene mã hóa

18S Rrna

39

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

1 VẬT LIỆU

1.1 Nguyên liệu 1.2 Hóa chất 1.3 Thiết bị 1.4. Môi trƣờng nuôi cấy

7.2.1 Một số phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử 7.2.2 Phân loại dựa vào trình tự gene mã hoá 18S rRNA

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm sợi 2.2 Sàng lọc khả năng sinh Lac, LiP, MnP 2.3 Nghiên cứu khả năng phân hủy DDT của chủng FNA1 2.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme

39 40 42 42 42 42 42 43 45 45 45 45 46 46 47 47

2.4.1 Xác định hoạt tính laccase 2.4.2 Xác định hoạt tính LiP 2.4.3 Xác định hoạt tính MnP

2.5 Khảo sát các điều kiện môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng phát triển

và sinh laccase của chủng FNA1

48 49

2.6 Xác định một số tính chất hóa sinh của laccase thô 2.7 Phân loại nấm sợi dựa vào xác định và so sánh trình tự gen mã hóa

50 50 51 53 53 54 55 55 55 56

18S rRNA 2.7.1 Tách DNA tổng số từ nấm sợi 2.7.2 Nhân đoạn gen bằng kỹ thuật PCR 2.7.3 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ và biến nạp vào E.coli 2.7.4 Tách chiết DNA plasmid 2.7.5 Kiểm tra plasmit mang sản phẩm PCR mong muốn 2.7.6 Điện di kiểm tra DNA tổng số 2.6.8 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 2.6.7 Xác định trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

BÀO TỬ CỦA CÁC CHỦNG FNA1, FNA2, FNA3

56 57 59

1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI KHUẨN LẠC VÀ CUỐNG SINH 2 SÀNG LỌC KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP Lac, LiP, MnP 3 KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DDT CỦA CHỦNG FNA1 4 CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG

4.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 4.1.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 4.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl

SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP LACCASE CỦA CHỦNG FNA1 64 64 64 65 67 68 68 69

4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH môi trường nuôi cấy, nồng độ NaCl

4.2 Ảnh hưởng của nồng độ DDT và nồng độ glucose

4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ DDT 4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ glucose

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

4.3 Ảnh hưởng của các chất cảm ứng

4.3.1 Guaiacol, veratyl alcohol, CuSO4 4.3.2 Các chất ô nhiễm khác

4.5.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon 4.5.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 4.5.3 Ảnh hưởng của môi trường thay thế 5 MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA LACCASE THÔ

5.1.1 pH tối ưu 5.1.2 Độ bền pH

5.1 pH tối ưu và độ bền pH

4.4 Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt 4.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitơ và môi trường thay thế

5.2 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của laccase và độ bền nhiệt

5.2.1 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của laccase 5.2.2 Độ bền nhiệt

71 71 72 74 76 76 78 80 81 81 81 83 84 84 85

SÁNH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN MÃ HÓA 18S rRNA

6.1 Tách chiết DNA tổng số 6.2 Nhân đoạn gen 18S rRNA bằng kỹ thuật PCR 6.3 Tách dòng gen 18S rRNA trong vectơ pTZ57R/T 6.4 So sánh trình tự đoạn gen mã hóa 18S rRNA của chủng FNA1

6 PHÂN LOẠI CHỦNG NẤM SỢI FNA1 BẰNG PHƢƠNG PHÁP SO

86 86 87 88 91 94 95 96 103

KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

MỞ ĐẦU

DDT (Dichloro - Trichloroethane Diphenyl) là một trong những thuốc

trừ sâu tổng hợp đƣợc biết đến nhiều nhất. DDT đƣợc tổng hợp đầu tiên vào

năm 1874, nhƣng thuộc tính thuốc trừ sâu của DDT thì cho đến 1939 mới

đƣợc khám phá. Vào những năm đầu của Chiến tranh Thế giới thứ II, DDT

đƣợc sử dụng với lƣợng lớn để kiểm soát muỗi truyền bệnh sốt rét, bệnh sốt

phát ban, và các bệnh do côn trùng khác trong cả quân đội lẫn dân cƣ. DDT

trở thành loại thuốc trừ sâu phổ biến sử dụng trong nông nghiệp. Chúng có

mặt ở khắp mọi nơi, trong không khí, đất, nƣớc do một lƣợng lớn đã đƣợc giải

phóng ra khi phun trên các cánh đồng và rừng để diệt muỗi và côn trùng.

Ngày nay DDT đã bị cấm sử dụng do tính độc của nó nhƣ có khả năng

gây ung thƣ tiềm tàng, gây đột biến và gây ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng.

Để bảo vệ môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời, cần phải xử lý khử độc DDT

trong môi trƣờng đất cũng nhƣ trong các môi trƣờng khác. DDT ở trong đất

có thể giảm đi do sự bay hơi, sự xói mòn đất, sự hấp thu của động vật, thực

vật và sự phân hủy sinh học của các vi sinh vật có sẵn trong đất nhƣng với

thời gian tƣơng đối lâu.

Trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, đã có một số phƣơng pháp khử độc

khác nhau đƣợc nghiên cứu và áp dụng. Trong đó phƣơng pháp xử lý sinh học

nhờ các vi sinh vật và hệ enzyme do chúng tiết ra là một hƣớng đi mới có

nhiều triển vọng. Hệ enzyme sử dụng trong xử lý sinh học chủ yếu là các

enzyme ngoại bào, chúng có khả năng phá vỡ các liên kết trong các hợp chất

hữu cơ hoặc xúc tác chuyển hóa chúng thành các chất ít độc hơn và các dạng

dễ bị phân hủy hơn. Nhóm enzyme có vai trò lớn trong quá trình phân hủy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4

DDT cũng nhƣ các chất thuộc POPs khác gồm có laccase (Lac), mangan

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

peroxidase (MnP) và lignin peroxidase (LiP), trong đó laccase có vai trò quan

trọng và đang bắt đầu đƣợc quan tâm nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam.

Tại Nhóm nghiên cứu Công nghệ sinh học xử lý khử độc các chất ô

nhiễm hữu cơ khó phân hủy (Persistent Organic Pollutants – POPs), phòng

Công nghệ Sinh học Môi trƣờng, Viện CNSH, Viện Khoa học và Công nghệ

Việt Nam đã có những nghiên cứu bƣớc đầu về khả năng phân hủy DDT,

DDD, DDE và sinh enzyme ngoại bào Lac, MnP, LiP [4,5,6]. Để làm rõ bản

chất sinh học và khả năng sinh enzyme của các chủng nấm sợi phân lập từ đất

ô nhiễm DDT phục vụ cho các nghiên cứu ứng dụng enzyme ngoại bào vào

xử lý các chất ô nhiễm khó phân hủy POPs, chúng tôi đã thực hiện đề tài với

tên là: “Nghiên cứu phân loại, khả năng phân hủy DDT và sinh laccase

của chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu”.

Nội dung bao gồm:

1. Phân loại và định tên chủng nấm sợi dựa vào đặc điểm hình thái và

trình tự đoạn gene mã hoá 18S rRNA.

2. Nghiên cứu khả năng phân hủy DDT của chủng nấm sợi FNA1.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5

3. Nghiên cứu khả năng sinh laccase của chủng nấm sợi FNA1.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA DDT

1.1 Cấu trúc của DDT

DDT là một trong các thuốc diệt côn trùng, chúng là một nhóm các hợp

chất hữu cơ có hai vòng thơm và có chứa Clo, bao gồm 14 hợp chất hữu cơ, trong đó: 71% là p,p,- DDT, 14.9% là o,p,- DDT, 0.3%p,p,- DDD, 0.1% là o,p,-DDD, 4% là p,p,- DDE, 0.1% là o,p,-DDE, sản phẩm khác là 3.5% (Hình

1.1).

p-p DDT p-p DDE p-p DDD

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của một số đồng phân DDT

o-p DDT o-p DDE o-p DDD

1.2 Tính chất lý hóa của DDT

Tất cả các đồng phân của DDT đều là dạng tinh thể màu trắng, không

5 Pa (1.9 x10 -7mmHg) tại 200C. DDT tan ít trong nƣớc (1g/l) nhƣng có khả

mùi, không vị, có công thức tổng quát là C14H9Cl5, khối lƣợng phân tử là 354.5. Nhiệt độ nóng chảy khoảng 108.5 - 1090C, áp suất bay hơi là 2.53 x10-

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6

năng giữ nƣớc, tan tốt trong các hợp chất hữu cơ đặc biệt là mỡ động vật. Khả

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

năng hoà tan của DDT trong nƣớc là thấp (hệ số hấp phụ cao) nên DDT có xu

hƣớng bị hấp phụ trong cặn bùn, đất đá, trầm tích. Điều này có vai trò đặc biệt

trong phân hủy sinh học DDT. Một số đặc tính cơ bản của DDT và các đồng

phân đƣợc trình bày ở phụ lục 1 [59].

2 ẢNH HƢỚNG ĐẾN MÔI TRƢỜNG VÀ SỨC KHỎE CON NGƢỜI

CỦA DDT

2.1 Ảnh hƣởng đến môi trƣờng

DDT [ 1,1,1-trichloro-2,2-bis-(p-chlorophenyl)ethane] đã đƣợc tổng

hợp vào năm 1874, nhƣng mãi đến 1930, Bác sĩ Paul Muller (Thụy Sĩ ) mới

xác nhận DDT là một hóa chất hữu hiệu trong việc trừ sâu rầy và từ đó đƣợc

xem nhƣ là một thần dƣợc và không biết có ảnh hƣởng nguy hại đến con

ngƣời. Khám phá trên mang lại cho ông giải Nobel về y khoa năm 1948 và

DDT đã đƣợc sử dụng rộng rãi khắp thế giới cho việc khử trùng và kiểm soát

mầm mống gây bệnh sốt rét. Nhƣng chỉ hai thập niên sau đó, một số chuyên

gia thế giới đã khám phá ra tác hại của DDT trên môi trƣờng và sức khỏe

ngƣời dân. Do đó, tại Hoa Kỳ từ năm 1972 DDT đã bị cấm sử dụng hẳn. DDT

bị nhiễm vào môi trƣờng không khí, nƣớc, đất trong suốt quá trình sử dụng,

DDT có mặt ở nhiều vị trí ô nhiễm khác nhau, sau đó có thể tiếp tục bị lan

truyền và gây ô nhiễm môi trƣờng. Đặc biệt trong đất, nó giữ nƣớc thành các

phần tử rắn và trở thành dạng bền vững (EPA 1986) và đƣợc EPA Hoa Kỳ

xếp vào danh sách các loại hóa chất phải kiểm soát vì có nguy cơ tạo ra ung

thƣ cho ngƣời và động vật [59]. DDT, DDE (1,1-dichloro-2,2-bis(p-

chlrophenyl)ethylene), DDD (1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlrophenyl)ethylene)

cũng có thể đƣợc thải vào không khí khi chúng bay hơi từ đất và nƣớc nhiễm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 7

độc. Một lƣợng lớn DDT đã đƣợc thải vào môi trƣờng nhƣ đi vào không khí,

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

đất và nƣớc thông qua quá trình tƣới, phun trên các diện tích sản xuất nông

nghiệp và rừng để diệt côn trùng và muỗi [59].DDT và các đồng phân bị

ngấm vào mạch nƣớc ngầm khi nó đƣợc sử dụng để diệt côn trùng ở gần các

cửa sông .v.v. Trong đất, DDT có thể suy giảm nhờ quá trình bốc hơi, quá

trình quang phân và quá trình phân hủy sinh học (hiếu khí và kị khí) nhƣng

những quá trình này xảy ra rất chậm tạo ra sản phẩm là DDD và DDE có độ

bền tƣơng tự nhƣ DDT. DDD cũng đƣợc sử dụng nhƣ là một loại thuốc trừ

sâu, còn DDE chỉ đƣợc tìm thấy trong môi trƣờng nhiễm bẩn do sự phân hủy

sinh học của DDT.

Quá trình bốc hơi, phân hủy DDT, DDD, DDE có thể đƣợc lặp lại

nhiều lần và kết quả là DDT, DDD, DDE đƣợc tìm thấy ở cả những nơi rất xa.

Những hợp chất hóa học này có thể đƣợc phát hiện ở đầm lầy, tuyết và động

vật ở vùng Bắc Cực & Nam Cực, rất xa so với nơi chúng đƣợc sử dụng, DDT,

DDD, DDE cuối cùng ở trong đất một thời gian dài, hầu hết bị phân hủy chậm

thành DDD và DDE thƣờng là bởi hoạt động của các vi sinh vật. Chu kỳ bán

hủy của những hợp chất này trong khí quyển khi bay hơi đƣợc ƣớc tính 1,5- 3

ngày. DDT ở trong đất phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nhiệt độ, loại đất, độ ẩm

v.v. ở những vùng nhiệt đới DDT bay hơi dễ hơn và vi sinh vật cũng phân

hủy nó nhanh hơn. DDT ở đất ẩm bị phân hủy nhanh hơn ở đất khô. Chúng

làm giảm giá trị của đất và khi bị phân hủy DDT đƣợc chuyển thành DDE

trong cả điều kiện hiếu khí và kị khí. Những hợp chất này có thể bốc hơi trong

không khí hoặc lắng đọng lại ở các vị trí khác nhau và có độc tính rất cao.

Chúng ở sâu trong đất, thấm qua đất và vào các mạch nƣớc ngầm. Trên bề

mặt nƣớc, DDT sẽ liên kết các phần tử ở trong nƣớc, lắng xuống và có thể

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 8

lắng đọng trong các trầm tích.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Gần đây DDT là một trong 12 hoá chất đƣợc các nhà khoa học thế giới

xếp vào hạng chất ô nhiễm khó phân hủy (POPs). Năm 1998, đại diện của hơn

92 quốc gia trên thế giới đã tụ họp tại Montreal đã bàn thảo về các biện pháp

nhằm cấm sản xuất và sử dụng các hoá chất trên vì lý do tác hại của chúng do

sự tích luỹ lâu dài trong không khí, lòng đất và nguồn nƣớc, kết tụ vào các mô

động vật- nguồn thực phẩm chính của loài ngƣời [7]. DDT tích trữ một lƣợng

lớn ở trong cá và các động vật biển (ví dụ: hải cẩu, cá heo). Tính độc của

DDT đã đƣợc biết đến thông qua các nghiên cứu rất kỹ lƣỡng ở trên các vi

sinh vật, động vật không xƣơng sống ở dƣới nƣớc, cá, lƣỡng cƣ, động vật

không xƣơng sống ở trên cạn và các loài động vật có vú khác (chuột hang, thỏ

v.v.). Trong các động vật này, DDT đƣợc tìm thấy một lƣợng lớn trong các

mô mỡ và sẽ tiếp tục di chuyển đến những cơ quan khác. Ngƣỡng độc của

DDT và các đồng phân của nó đã xác định thông qua chỉ số LC50 (LC50 là

liều gây chết 50% mẫu sinh vật thí nghiệm) ở một số loài động vật thí nghiêm

là: LD50 ở lợn khoảng 1.000mg DDT/kg [12], LD50 ở thỏ là 300mg DDT/kg

và 4.000-5.000 mg DDD/kg [12]. DDT ở trong đất cũng có thể đƣợc hấp thụ

bởi một số thực vật hoặc trong cơ thể con ngƣời khi ăn các thực vật đó [57].

2.2 Ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời

Những nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra đƣợc tác hại của DDT và các

hợp chất có liên quan tới một số loài và việc sử dụng nó đã bị cấm hoặc giảm

trên nhiều nƣớc do những hậu quả độc hại của nó. Nhƣng các số liệu về ảnh

hƣởng trên con ngƣời vẫn chƣa đƣợc biết đến nhiều. Các nghiên cứu về sự

ảnh hƣởng trên ngƣời đƣợc nghiên cứu trên các công nhân làm việc trong các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 9

nhà máy có sản xuất DDT. Các nghiên cứu khác cũng cho những kết quả có

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

giá trị nhƣng do những hạn chế của các nghiên cứu về dịch tễ học nên chƣa

xác định đƣợc những nguyên nhân gây bệnh từ chúng.

Con ngƣời bị nhiễm DDT thông qua nhiều cách khác nhau đó là phơi

nhiễm trực tiếp và gián tiếp. Phơi nhiễm trực tiếp, có thể xảy ra qua phổi hoặc

qua da. Nhiễm gián tiếp xảy ra khi ăn các thực phẩm nhƣ ngũ cốc, rau đậu đã

bị nhiễm DDT, cũng nhƣ tôm cá sống trong vùng bị ô nhiễm, DDT sẽ đi vào

cơ thể qua đƣờng tiêu hoa và tích tụ theo thời gian trong các mô mỡ và gan

của con ngƣời.

Nguồn lây nhiễm DDT chính là ở trong thịt, cá, gia cầm và các sản

phẩm từ sữa. Nếu ngƣời ăn các loại lƣơng thực thực phẩm đƣợc phun DDT và

ăn kéo dài thì có nhiều nguy cơ dẫn tới ngộ độc mãn tính, sinh con quái thai.

Mức độ tối thiểu mà con ngƣời có thể chịu đựng và không gây hại là 285

mg/kg. DDT có tác động rõ rệt lên hệ thống thần kinh ngoại biên, gây nên sự

rối loạn hệ thống thần kinh, ức chế các enzyme chức năng đòi hỏi sự dịch

chuyển các ion dẫn đến tê liệt. Những ngƣời bị nhiễm một lƣợng lớn gây ngộ

độc cấp tính, dễ bị kích động, bị rùng mình và gây tai biến mạch máu não.

Chúng cũng gây nên sự đổ mồ hôi, đau đầu, buồn nôn, chóng mặt. Những ảnh

hƣởng nhƣ trên cũng có thể xuất hiện khi hít DDT ở trong không khí hoặc hấp

thụ một lƣợng lớn qua da [59].

Đối với những ngƣời bị nhiễm DDT ở mức độ thấp (20 mg/ngày) - ví

dụ nhƣ những ngƣời làm việc trong các nhà máy sản xuất DDT, sẽ xuất hiện

những biến đổi nồng độ enzyme có trong gan và trong máu. Nhiều nghiên cứu

đã chỉ ra rằng DDT, DDE, DDD có thể gây bệnh ung thƣ, mà trƣớc tiên là

ung thƣ gan, cũng có thể là ung thƣ vú, ung thƣ tuỷ [59]. Những nghiên cứu

của Garabrant và cộng sự 1992 ở một nhóm công nhân của các nhà máy sản

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10

xuất thuốc hóa học giữa năm 1948 đến năm 1971 đã phát hiện ra DDT có thể

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

gây ung thƣ tủy và dẫn đến tử vong vào năm 1953- 1988 [59]. Bên cạnh đó nó

cũng gây nên một số bệnh ung thƣ khác nhƣng vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu kỹ

nhƣ: ung thƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ tinh hoàn, ung thƣ máu, ung thƣ dạ con

v.v.

Trẻ con bú sữa mẹ hay sữa tƣơi bị nhiễm độc DDT trực tiếp qua sự

hiện diện của DDT trong sữa tƣơi hay gián tiếp vì thức ăn của ngƣời mẹ. Tệ

hại hơn nữa, nhiều bà mẹ đã bị sảy thai trong vùng ảnh hƣởng của DDT. Ở

nƣớc ta, đã có một số công trình nghiên cứu và rút ra nhận xét là tất cả các bà

mẹ dù có tiếp xúc hay không tiếp xúc trực tiếp với DDT đều có lƣợng DDT

trong sữa mẹ rất cao. Vì DDT xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua đƣờng tiêu

hóa, cao hơn rất nhiều lần so với liều lƣợng cho phép của OMS (0.05ppm),

của Liên Xô (0.14ppm) và của Hungari (0.13ppm) [53].

3 TÌNH TRẠNG Ô NHIỄM DDT

3.1 Nguồn gốc phát sinh

DDT (1,1,1-trichloro-2,2-bis (p-chlorophenyl) ethane) đã đƣợc tổng

hợp lần đầu tiên vào năm 1873 bởi nhà khoa học ngƣời Đức Othmar Ziedler.

Tuy nhiên, phải đến 1939 nhà hoá học Thuỵ Sỹ- Paul Hermann Muller mới

khám phá các đặc tính để diệt trừ côn trùng của DDT, chúng có thể phá huỷ

nhanh chóng hệ thần kinh của côn trùng. Năm 1948, Paul Muller đã đƣợc trao

giải thƣởng Nobel về sinh - y học về khám phá này. DDT có hiệu quả chống

lại rận, bọ chét, và muỗi mang các mầm bệnh sốt phát ban, dịch hạch, sốt rét,

và sốt vàng .v.v. DDT đã đƣợc dùng rất rộng rãi hơn 20 năm và đƣợc xem là

nhân tố chính trong việc gia tăng sản lƣợng lƣơng thực thế giới và ngăn chặn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 11

bệnh tật từ côn trùng.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

DDT đƣợc tạo thành từ phản ứng của trichloroethanol với chlorobenzen

(Hình 1.2). Tên thƣơng mại hoặc các tên khác của DDT bao gồm Anofex,

Cesarex, Chlorophenothane, Dadelo, p,p-DDT,

dichlorodiphenyltrichloroethane, Dinocide, Didimac, Digmar, ENT 1506,

Genitox, Guesapon, Guesarol, Gexarex, Gyrol, Hildit, Ixodex, Kopsol,

Hình 1.2. Tổng hợp DDT từ trichloroethanol và chlorobenzen

Neocid, OMS 16, Micro DDT 75, Pentachlorin, Rukseam, R50 và Zerdane.

DDT là loại thuốc hóa học diệt côn trùng đƣợc sử dụng rộng rãi từ

chiến tranh thế giới lần thứ II trên khắp thế giới và hàng triệu tấn đƣợc sản

xuất, sử dụng trƣớc đây hiện đang còn lƣu giữ trong đất và sẽ tiếp tục phân

tán trong môi trƣờng. Một lƣợng lớn DDT đã đƣợc giải phóng vào không khí,

đất và nƣớc khi sử dụng để diệt côn trùng, muỗi ở các địa điểm nhạy cảm nhƣ

cửa sông [59].

Đầu năm 1960, nhà hoạt động ngƣời Mỹ Rachel Carson đã xuất bản

cuốn sách Silent Spring khẳng định DDT là nguyên nhân của bệnh ung thƣ và

nguy hại đến sinh sản của chim do làm mỏng lớp vỏ trứng. Cuốn sách đã gây

ra sự phản đối kịch liệt của công chúng và sự kiện này đã dẫn đến lệnh cấm

sử dụng DDT trong nông nghiệp ở Mỹ. Tiếp theo trong những năm 1970 và

1980, DDT đã bị cấm sử dụng trong nông nghiệp ở hầu hết các nƣớc phát

triển do ảnh hƣởng nguy hại của nó đối với môi trƣờng. Mặc dầu vậy, DDT

vẫn đƣợc sử dụng rộng rãi trong một số quốc gia đang phát triển. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 12

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

3.2 Tình trạng ô nhiễm DDT trên thế giới

Do tác hại của DDT trên môi trƣờng và sức khỏe ngƣời dân tại Hoa Kỳ

từ năm 1972 DDT đã bị cấm sử dụng hẳn. Tuy nhiên, đến nay hóa chất này

vẫn còn gây tác hại ở những vùng nông nghiệp đã sử dụng và những vùng

quanh nơi sản xuất ra DDT trƣớc đây. Hiện tại DDT vẫn còn ngƣng tụ nơi

thềm lục địa vùng Palos Verdas (ngoài khơi vùng biển Los Angeles) vì nhà

máy sản xuất ra DDT Montrose Chemical.co tại Torrance đã thải DDT vào hệ

thống cống rãnh thành phố vào năm 1971. Việc xử lý ô nhiễm DDT cho vùng

này ƣớc tính vào khoảng 300 triệu USD [7].

Cho đến nay ở Mỹ do lợi ích về kinh tế nên vẫn sản xuất DDT để xuất

cảng qua Phi châu và các nƣớc Á châu trong đó có Việt Nam. DDT là một

loại thuốc sát trùng công hiệu mạnh, đặc biệt quan trọng trong việc kiểm soát

bệnh sốt rét nên vẫn đƣợc sử dụng rộng rãi ở các nƣớc đang phát triển bất

chấp nguy cơ gây hại tiềm tàng và lâu dài của nó.

Sự tích tụ nhiều nhất của DDT và các hợp chất có liên quan ở biển phía

Tây của Trung Quốc. ở các bờ biển khác, lƣợng tích tụ của DDT cũng rất lớn

nhƣ: vịnh Bengal, biển Arabian, biển bắc Trung Quốc v.v.Từ năm 1980-1983,

có rất nhiều phân tích về sự tích tụ DDT ở trong các trầm tích biển ở EPA

[54]. Hàm lƣợng trung bình của DDT, DDE, DDD là: 0.1, 0.1, 0.2 g/kg

(trọng lƣợng khô). Hàm lƣợng DDT và các sản phẩm chuyển hóa của các mẫu

trầm tích đƣợc phân tích ở đáy sông ở vịnh River tại Washington: 0.1-234

g/kg. Sự tích trữ của DDT, DDE, DDD và tổng lƣợng DDT ở đáy trầm tích

từ sông San Joaquen và các nhánh sông của nó ở California-1992 lần lƣợt

là:1.4 - 115, 0.7 - 14, 0.4 - 39, 2.2 - 170 (ng/l) [45]. Trong đó Orestinba Creat

có hàm lƣợng DDT cao hơn hẳn so với các vị trí khác. Ở Canada, tổng lƣợng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 13

DDT lắng đọng trên bề mặt trầm tích ở 8 hồ khác dọc ngang lục địa vào

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

khoảng 9.7g/kg. Iwata et al (1993) đã thu thập và phân tích 68 ví dụ về hàm

lƣợng DDT ở nƣớc bề mặt từ một vài đại dƣơng (18 khu vực) đã nêu lên

những ảnh hƣởng chủ yếu do sự lắng đọng khí quyển từ tháng 4/1989-8/1990.

Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của DDT trong các mẫu

trầm tích với nồng độ cao do DDT đƣợc vận chuyển từ khu vực bị ô nhiễm

đến Bắc cực và Nam cực. Tổng lƣợng DDT ở đại dƣơng New Zealand và Ross Iland, Antarctica giữa tháng 1 và tháng 3 (1990) là: 0.40 và 0.81 pg/m3 [14, 33]. Vùng Gulf của Mexico (1977) chứa trung bình 34pg/m3 DDT với tỉ lệ 10-78pg/m3 [13]. Lƣợng DDT cao nhất đƣợc tìm thấy ở gần khu vực nơi

mà DDT vẫn đƣợc sử dụng, ví dụ ở bờ biển Arabian của ấn Độ. Các khu vực

mà lƣợng DDT trong không khí cao là eo biển Malacca, bờ biển phía nam

Trung Quốc, vịnh Mexico.

3.3 Tình trạng ô nhiễm DDT ở Việt Nam

DDT đƣợc dùng lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1949 để phòng ngừa

bệnh sốt rét. Tuy nhiên, số lƣợng thuốc DDT đƣợc dùng chỉ có 315 tấn trong

năm 1961 và giảm xuống còn 22 tấn trong năm 1974. Từ năm 1957 đến 1990,

tổng số lƣợng thuốc DDT nhập cảng chỉ có 240.422 tấn. Mặc dù việc sử dụng

thuốc DDT đã bị cộng đồng quốc tế ngăn cấm từ năm 1992, việc nhập cảng

và sử dụng DDT ở Việt Nam vẫn tiếp tục cho đến năm 1994. Trong khoảng từ

năm 1992 đến năm 1994, số lƣợng thuốc DDT nhập cảng từ Nga lên đến

423.358 tấn Tuy không có số liệu chính xác về số lƣợng DDT đang đƣợc sử

dụng ở Việt Nam, nhƣng tin tức trong nƣớc cho biết thuốc này vẫn còn đang

đƣợc sử dụng rộng rãi đặc biệt ở vùng châu thổ sông Cửu Long vì là vùng có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 14

nhiều sông rạch và nhiều muỗi mồng [8].

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Tại một kho dã chiến chứa DDT những năm 1967 – 1968 ở Hà Tĩnh

vẫn còn một lƣợng tồn dƣ lớn hóa chất này. Khối lƣợng thuốc DDT ở kho này

ƣớc tính khoảng 4- 5 tấn. Hiện nay số thuốc DDT đã nằm phơi lộ trên mặt

đất, một phần thuốc có thể bị phân hủy song phần lớn vẫn còn đó, chúng có

thể khuếch tán vào không khí gây ô nhiễm môi trƣờng và phân rã ngấm vào

đất và các mạch nƣớc ngầm gây ô nhiễm đất và nƣớc trong khu vực. Nghệ An

là một trong những tỉnh còn tồn lƣu một lƣợng tƣơng đối lớn hóa chất bảo vệ

thực vật, hiện tại tỉnh có 25 điểm tồn lƣu hóa chất chất bảo vệ thực, trong đó

mới có 5 điểm đƣợc xử lý. Phần lớn những điểm tồn lƣu hóa chất chất bảo vệ

thực đều nằm gần, hoặc nguy hiểm hơn là nằm lọt trong khu dân cƣ. Một kết

quả điều tra khác ở tỉnh Nghệ An cho thấy, DDT vẫn còn trong một nhà kho

từ năm 1965 đến năm 1985. Nồng độ của DDT thay đổi từ 3.38 đến 960.6

mg/kg trong các mẫu đất và từ 0.00012 đến 0.00168 mg/l trong các mẫu

nƣớc. Trong nhiều năm liên tiếp, mùi thuốc DDT nồng nặc bay xa đến 600

mét. Đã có 25 ngƣời chết vì ung thƣ, và 22 trƣờng hợp dị thai đƣợc ghi nhận

[8].

Do sự nguy hiểm của các chất POP nói chung và hóa chất bảo vệ thực

vật nói riêng đối với sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng, các nƣớc trên thế

giới cũng nhƣ Việt Nam đã và đang tích cực tiến tới loại trừ và cấm sử dụng

hoàn toàn các chất POP. Cụ thể là Công ƣớc Stockholm về các chất hữu cơ ô

nhiễm khó phân hủy ra đời và 172 quốc gia đã tham gia ký kết, trong đó có

Việt Nam. Ở nƣớc ta công ƣớc Stockholm chính thức có hiệu lực kể từ ngày

14/5/2004. Tham gia công ƣớc này, Việt Nam sẽ xây dựng và hoàn thiện hệ

thống pháp luật để quản lý an toàn hóa chất, giảm thiểu và tiến tới loại bỏ các

chất ô nhiễm hữu cơ khó phân huỷ. Đồng thời, phòng ngừa, kiểm soát và xử

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 15

lý an toàn đối với các chất này, tiến tới kiểm soát, xử lý và tiêu hủy hoàn toàn

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

các kho thuốc bảo vệ thực vật, những hóa chất rất độc hại đã bị loại bỏ, còn

tồn lƣu.

4 CÁC PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ Ô NHIỄM DDT

DDT là chất có tính độc hại cao, bền vững cao đối với quá trình phân

hủy tự nhiên. Một khi đã phát thải vào môi trƣờng, chất này có thể tồn tại

trong thời gian dài và có thể di chuyển đi xa khỏi nguồn phát thải ban đầu nhờ

gió, nƣớc hay nhờ vào các loài động vật di cƣ. Ngoài ra DDT có thể đƣợc hấp

thụ dễ dàng vào các mô mỡ và tích tụ trong cơ thể của các sinh vật sống, nồng

độ chất này trở nên cao hơn theo chiều tăng của chuỗi thức ăn, đặc biệt là

trong các loài sinh vật lớn và sống lâu. Chính vì những tính chất này mà việc

loại bỏ, tiêu hủy DDT cũng nhƣ các chất bảo vệ thực vật trong danh mục cấm

khác ngày càng trở nên cần thiết và cấp bách không chỉ riêng ở nƣớc ta mà

còn là vấn đề quan tâm của nhiều nƣớc trên thế giới.

Tùy điều kiện địa hình, tính chất, quy mô của vùng ô nhiễm; tùy điều

kiện kinh phí để áp dụng các quy trình xử lý khác nhau, có thể xử dụng các

phƣơng pháp nhƣ phƣơng pháp hóa lý; phƣơng pháp bao vây, cô lập nguồn ô

nhiễm; hay phƣơng pháp sinh học v.v.

4.1 Các phƣơng pháp cơ, hóa lý

Có rất nhiều phƣơng pháp hóa lý đƣợc sử dụng để loại bỏ các chất ô

nhiễm khó phân hủy. Đối với ô nhiễm DDT thì các phƣơng pháp thƣờng đƣợc

sử dụng là chôn lấp, cô lập; phân hủy bằng kiềm nóng và phƣơng pháp đốt có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 16

xúc tác.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

4.1.1 Phương pháp chôn lấp, cô lập

Với cấu trúc vòng thơm, DDT rất khó phân hủy trong tự nhiên nên biện

pháp chôn lấp chất thải nguy hại đƣợc áp dụng rộng rãi ở nhiều nƣớc trên thế

giới. Một số nƣớc sử dụng biện pháp chôn lấp cô lập và xi măng hóa chất thải

có độc tính cao ở dạng lỏng hoặc rắn. Phƣơng pháp này đòi hỏi phải chuẩn bị

hố chôn lấp đảm bảo kỹ thuật, không bị rò rỉ, bền vững trong thời gian dài,

địa điểm chôn lấp phải xa khu dân cƣ, không gần mạch nƣớc ngầm.

4.1.2 Phương pháp đốt có xúc tác

Đây là phƣơng pháp vô cơ hoá chuyển clo hữu cơ thành CO2, H2O và Cl-. Clo hữu cơ nếu tiếp xúc với kim loại đồng nung đỏ đều bị đồng lấy mất

clo (tạo thành CuCl2) và chúng bị phân huỷ tiếp theo thành CO2 và nƣớc cùng

Cu / 600-7000C

DDT CO2 + H2O + CuCl2

O2 (không khí)

Hình 1.3. Phƣơng pháp đốt có xúc tác

với các dẫn xuất khác không độc, hoặc ít độc hơn (Hình 1.3).

Công nghệ thiêu đốt cũng đã đƣợc sử dụng trên thế giới, phƣơng pháp

xử lý này tƣơng đối triệt để song giá thành lại cao và có khả năng gây ô nhiễm

thứ cấp bởi các sản phẩm phụ tạo trong quá trình vận hành.

Các phƣơng pháp vật lý khác nhƣ sử dụng tia bức xạ, tia cực tím, hay

áp suất cao cũng mang lại hiệu quả nhất định trong xử lý ô nhiêm DDT.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 17

4.1.3 Phương pháp phân hủy bằng kiềm nóng

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Khi xử lý DDT với dung dịch NaOH 20% nóng, xảy ra phản ứng

dehydroclorua hoá tạo nên một olefin. Olefin đƣợc sinh ra bị polime hoá cho

sản phẩm rắn. Sản phẩm rắn này đƣợc tách ra dễ dàng và cho vào bao nilon

rồi chôn vùi dƣới đất.

Mặc dù làm sạch DDT có thể đƣợc tiến hành bằng nhiều biện pháp nhƣ

đã nêu ở trên, nhƣng nhƣợc điểm của các công nghệ đốt và hóa học là gây ô

nhiễm thứ cấp. Chính vì vậy mà xu hƣớng sử dụng các phƣơng pháp hóa lý

ngày càng giảm.

4.2 Phƣơng pháp phân hủy sinh học

Ngày nay do có những hiểu biết sâu sắc về tác hại của DDT nên các

nhà khoa học và công nghệ Việt Nam đang nghiên cứu tìm ra các giải pháp để

có thể làm giảm lƣợng DDT còn sót lại trong đó biện pháp xử lý sinh học

đang đƣợc quan tâm nhiều bởi tính ƣu việt của nó là không tạo ra ô nhiễm thứ

cấp cho môi trƣờng. Phân hủy sinh học đã đƣợc các nhà khoa học trên thế

giới nghiên cứu và áp dụng trong những năm gần đây và cũng đạt đƣợc khá

nhiều thành tựu [63].

Quá trình làm sạch sinh học có thể thực hiện ở quy mô lớn nhỏ khác

nhau, có thể sử dụng thực vật hay vi sinh vật và ở điều kiện hiếu khí hoặc kị

khí. Việc tẩy độc bằng phân hủy sinh học có thể đƣợc tiến hành riêng rẽ hoặc

kết hợp với các phƣơng pháp khác, sau vài tháng hoặc vài năm các chất ô

nhiễm có thể đƣợc hoàn toàn loại bỏ.

Phân hủy sinh học (Bioremediation) thƣờng bao gồm các phƣơng pháp

sau: Kích thích sinh học (augmentation) và làm giàu sinh học (stimulation).

+ Kích thích sinh học (Biostimulation): là quá trình thúc đẩy sự phát

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 18

triển và hoạt động trao đổi chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

sử dụng các chất độc hại thông qua việc thay đổi các yếu tố môi trƣờng nhƣ:

pH, độ ẩm, nồng độ O2, chất dinh dƣỡng .v.v.

+ Làm giàu sinh học (Bioaugmentation): sử dụng tập đoàn các vi sinh

vật bản địa đã đƣợc làm giàu hoặc vi sinh vật sử dụng các chất độc hại từ nơi

khác, thậm chí vi sinh vật đã đƣợc cải biến về mặt di truyền đƣa vào các địa

điểm ô nhiễm.

+ Sử dụng thực vật (phytoremediation): sử dụng thực vật, hệ enzyme

của thực vật và các quá trình phức tạp khác nhằm hấp thu hoặc chuyển hóa

các chất ô nhiễm.

Kích thích sinh học hiện là khuynh hƣớng đƣợc sử dụng rộng rãi trong

xử lý ô nhiễm theo phƣơng pháp phân hủy sinh học. Đôi khi ngƣời ta cũng kết

hợp hai biện pháp để có thể tăng cƣờng sự phân hủy sinh học. Song song với

việc bổ sung các chủng vi sinh vật nuôi cấy có khả năng phân hủy chất ô

nhiễm, ngƣời ta cũng tạo điều kiện tối ƣu cho tập đoàn vi sinh vật hoạt động.

Nhƣ vậy, cùng với hoạt động của tập đoàn vi sinh vật bản địa và hoạt động

của vi sinh vật ngoại lai sẽ tăng cƣờng hiệu quả của quá trình xử lý.

Hiện nay, tại Viện Công nghệ Sinh học đã tiến hành một số nghiên cứu

về khả năng phân hủy dầu, các chất độc hại khác nhƣ dioxin, 2,4-D,

hydrocacbon thơm đa nhân (PAH) v.v. bằng công nghệ phân hủy sinh học và

đã mang lại những hiệu quả khả quan [2]. Đối với DDT, những nghiên cứu

bƣớc đầu về khả năng phân hủy bằng vi sinh vật cũng đang bắt đầu đƣợc

nghiên cứu để góp phần khử độc DDT ở một số địa phƣơng bị ô nhiễm [5].

Ngoài ra trên thế giới việc ứng dụng hệ enzyme ngoại bào của vi sinh

vật vào xử lý ô nhiêm đã có nhiều nghiên cứu, đây cũng là hƣớng có nhiều

triển vọng do rút ngắn đƣợc thời gian xử lý và hiệu quả xử lý cao hơn so với

khử độc bằng phân hủy sinh học thông thƣờng. Những nghiên cứu bƣớc đầu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 19

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

về hệ enzyme ngoại bào ứng dụng vào xử lý khử độc đã đƣợc tiến hành tạo cơ

sở cho việc thiết kế công nghệ xử lý các chất ô nhiễm hóa học trong tƣơng lai

[4,5,6]. Hệ enzyme ngoại bào đƣợc quan tâm là hệ enzyme xúc tác với các đại

diện là laccase (oxidoreductase), mangan peroxidase và lignin peroxidase

(peroxidase). Đây là những enzyme có khả năng phân hủy nhiều loại chất ô

nhiễm hữu cơ có cấu trúc đa vòng thơm khác nhau do tính đặc hiệu cơ chất

không cao. Trong đó laccase đƣợc tập trung nghiên cứu, enzyme này xúc tác

quá trình oxy hóa các hợp chất phenolic mạnh nhất trong nhóm enzyme phân

hủy lignocellucose, laccase đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghệ tẩy độc

các hợp chất phenol, các dẫn xuất clo biphenyl, các loại thuốc nhuộm và các

loại nƣớc thải v.v.

5 PHÂN HỦY SINH HỌC DDT

5.1 Khả năng phân hủy DDT bởi vi sinh vật

Các nhà khoa học cũng đã phân lập và nghiên cứu nhiều chủng vi sinh

vật có khả năng phân hủy DDT và các sản phẩm chuyển hóa của nó. Các

nghiên cứu đã chỉ ra rằng số lƣợng các vi sinh vật có khả năng phân hủy DDT

tại các vùng ô nhiễm nhiều hơn so với các vùng không ô nhiễm. Các loài vi

sinh vật trong vùng ô nhiễm có xu hƣớng thích nghi, sau đó thay đổi cấu trúc

về di truyền để hƣớng đến việc phân hủy DDT. Các vi sinh vật tiềm năng

tham gia vào quá trình phân huỷ sinh học DDT chủ yếu là vi khuẩn, vi nấm.

Các vi sinh vật này chuyển hoá DDT thông qua quá trình khử loại clo, vi nấm

thủy phân và vi khuẩn phân huỷ chlorobiphenyl thực hiện cắt vòng DDT

trong điều kiện hiếu khí. Ngoài ra vi sinh vật phân huỷ DDT có thể đƣợc thiết

kế chuyển gene dựa trên các kỹ thuật di truyền phân tử và đƣa vào vùng đất

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 20

nhiễm. Hiện nay, có tới hơn 300 loài vi sinh vật có khả năng phân hủy DDT

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

đã đƣợc nghiên cứu, danh sách dƣới đây đƣa ra một vài đại diện của vi khuẩn,

một số loài nấm và xạ khuẩn ( Phụ lục 2) [20, 29, 48].

Cơ chế của quá trình phân hủy sinh học DDT và đồng phân của nó có

thể là nhờ quá trình cắt vòng hoặc loại khử clo. Các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa DDT và các đồng phân của nó (o,p,-DDT, p,p,-DDT) thành dạng

bớt độc hơn, không độc hoặc chuyển hóa hoàn toàn thành CO2. Các cơ chế

tấn công DDT bởi vi sinh vật đã đƣợc công bố cho thấy DDT đƣợc loại clo

bởi quá trình khử dẫn đến DDD. Vi khuẩn và nấm sợi phân huỷ DDT chủ yếu

theo cơ chế này. Một con đƣờng khác phân huỷ sinh học ở điều kiện hiếu khí

đã đƣợc mô tả có sự tham gia của vi khuẩn phân huỷ chlorobiphenyl [15, 42].

5.1.1 Loại clo bởi quá trình khử

Dƣới các điều kiện khử, quá trình loại clo bởi quá trình khử là cơ chế

chủ yếu của quá trình chuyển hoá sinh học các đồng phân o,p´-DDT và p,p´-

DDT của DDT thành DDD (Fries 1969). Phản ứng diễn ra bởi sự thay thế

chlorin mạch thẳng bằng nguyên tử hydro. Một số vi sinh vật chuyển hoá

DDT thành DDD đã đƣợc công bố bao gồm Escheria coli, Enterobacter

aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas

aeruginosa, Pseudomonas putida, Bacillus sp., “Hydrogenomonas” và một

số nấm nhƣ Saccharomyces cerevisiae, Phanerochaete chrysosporium,

Trichoderma [29,48]. Rochkind-Dubinsky và cộng sự đã phát triển các điều

kiện khử loại trong các bình nuôi cấy. Các cơ chế khử loại clo với sự chuyển

tiếp các kim loại và phức kim loại đóng vai trò chất khử (Hollinger & Schraa

1994). Trong hầu hết các trƣờng hợp các quá trình có sự tham gia của vận

chuyển điện tử đơn, loại ion clo, và tạo gốc alkyl. Sự chuyển tiếp phức hệ kim

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 21

loại trong vi sinh vật có kết hợp với các trung tâm hoạt động của các phân tử

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

vận chuyển điện tử. Ở E. coli, khử loại clo của DDT cần FAD và các điều

kiện kỵ khí, trong khi đó ở E. aerogenes là cytochrom oxidaza [29].

 Con đường chuyển hoá DDT bởi vi khuẩn theo cơ chế loại khử clo

Trƣớc tiên DDT bị phân hủy tạo DDMS, quá trình phân hủy tiếp theo

sẽ là quá trình loại Cl tạo DDNU,sau đó sẽ là quá trình oxy hoá tạo DDOH,

DDOH bị oxy hoá tiếp thành DDA và loại carbon thành DDM, DDM có thể

đƣợc chuyển hoá tạo DBP hoặc tách một vòng thơm tạo p-chlorophenylaxetic

acid (PCPA). Trong điều kiện kị khí DBP không thể chuyển hóa xa hơn nữa

Hình 1.4. Con đƣờng chuyển hoá DDT bởi vi khuẩn trong điều kiện kị khí theo

cơ chế loại khử clo

(Hình 1.4) [29].

5.1.2 Khoáng hoá DDT bởi nấm thủy phân lignin

Nấm thủy phân lignin có khả năng phân huỷ nhiều loại chất hữu cơ bền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 22

vững trong môi trƣờng tự nhiên trong đó có DDT. Aust 1990 chỉ ra rằng

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

khoáng hoá DDT xảy ra đồng thời với quá trình sinh ligninaza. Khi DDT

đƣợc bổ sung vào giống nấm thủy phân lignin quá trình khoáng hoá bắt đầu

ngay lập tức nhƣng nếu thí nghiệm bắt đầu từ giống là bào tử thì sự phân huỷ

và hoạt tính thủy phân lignin xảy ra đồng thời sau 4 ngày.

 Con đường phân hủy DDT bởi loài nấm trắng Phanerochaete

chrysosporium

Sự phân hủy DDT bởi nấm đảm trắng P. chrysosporium đƣợc biết đến

trong công trình nghiên cứu của Aust và cộng sự [15]. Bumpus và Aust đã

miêu tả sự phân hủy của DDT sau 30 ngày nuôi cấy (trong điều kiện thiếu N),

có khoảng 50% DDT đã đựơc chuyển hoá, trong đó 10% đƣợc khoáng hoá,

phần còn lại đƣợc chuyển hoá thành dicofol, FW-152 và bị phân hủy tạo

DBP. Tiếp đó là phản ứng phá vòng tạo CO2. Quá trình này đƣợc điều khiển

bởi hệ enzyme ligninase. Dicofol đƣợc tạo thành sau pha lag, DDD đƣợc tạo

thành sau pha suy tàn trên đó sẽ bị phân hủy bởi hệ enzyme ligninase khác.

Trong trƣờng hợp này DDE không đƣợc phát hiện. Trong quá trình khoáng

hoá DDT thì tinh bột và cenlulose là nguồn C tốt hơn so với nguồn C khác

(muối cacbornate) kể cả đƣờng (Hình 1.5)

5.1.3 Phân hủy DDT bởi vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí

Kỹ thuật làm giàu vi sinh vật đã đƣợc sử dụng trong đó một hợp chất có

cấu trúc tƣơng tự đã đƣợc dùng thay thế DDT. Một số chủng vi khuẩn đã thể

hiện khả năng phân huỷ DDT theo các cơ chế mới. Chủng B-206 sinh ra các

chất trung gian phenol từ DDT, DDD, và DDE, tuy nhiên không có sản phẩm

cắt vòng nào đƣợc tạo ra [42]. Nadeau 1994 thông báo về chủng Alcaligenes

eutrophus A5 chuyển hoá các đồng phân o,p´-và p,p´-DDT. Aiskable 1997 đã

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 23

phân lập đƣợc vi khuẩn Gram dƣơng từ đất nhiễm DDT ở New Zealand theo

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

phƣơng pháp làm giàu trên môi trƣờng khoáng chứa biphenyl, DDT, DDD và

Hình 1.5. Con đƣờng phân hủy DDT bởi loài nấm trắng P. chrysosporium

DDE nhƣ là nguồn cacbon [42].

Một trong các con đƣờng phân hủy DDT đƣợc nghiên cứu khá kỹ trên

đối tƣợng vi khuẩn Alcaligenes eutrophus A5, dƣới đây là cơ chế phân hủy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 24

thực hiện bởi vi khuẩn này.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

 Con đường phân hủy DDT bởi vi khuẩn Alcaligenes eutrophus A5

Chủng Alcaligenes eutrophus A5 có khả năng chuyển hoá cả o,p,- và p,p,-DDT. DDT bị oxy hoá bởi enzym dioxygenase tạo ra một dẫn xuất

dihydrodiol- DDT và trải qua qúa trình phá vỡ vòng ở vị trí meta. Tiếp đó là

một loạt các phản ứng trung gian tạo sản phẩm cuối cùng là 4- chlorobenzoic

Sản phẩm cắt vòng màu vàng

Hình 1.6. Con đƣờng phân hủy DDT bởi Alcaligenes eutrophus A5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 25

acid (Hình 1.6).

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

5.2 Các điều kiện môi trƣờng ảnh hƣởng đến phân hủy sinh học DDT

và các dẫn xuất của DDT

Các yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng lớn đến sự phát triển của vi sinh vật.

Đặc biệt các yếu tố môi trƣờng tại vùng phân lập có tác động lớn đến sự phát

triển của vi sinh vật tại đó. Ở những vùng nhiệt đới, DDT bay hơi dễ hơn và

vi sinh vật cũng phân hủy các chất ô nhiễm này nhanh hơn, DDT ở đất ẩm bị

phân hủy nhanh hơn ở đất khô. Trong quá trình xử lý môi trƣờng thì vấn đề

này càng đóng vai trò quan trọng và quyết định hiệu suất xử lý. Các yếu tố

nhƣ nhiệt độ, độ pH môi trƣờng, nồng độ muối, nồng độ chất độc, các chất

hoạt động bề mặt v.v. đóng vai trò quyết định trong quá trình phân hủy,

chuyển hóa và khoáng hóa DDT.

Trong tự nhiên không chỉ tồn tại một loại chất ô nhiễm thuộc

hydrocacbon thơm đa nhân mà thƣờng chúng tồn tại dƣới dạng hỗn hợp. Do

đó việc nghiên cứu khả năng phân hủy hỗn hợp DDT là điều cần thiết để xem

ảnh hƣởng qua lại của chúng trong hỗn hợp cũng nhƣ nồng độ hỗn hợp của

các chất ô nhiễm. Sự tồn tại của DDT có thể thúc đẩy hoặc ức chế quá trình

phân hủy sinh học hoặc gây độc cho vi sinh vật.

Các yếu tố quan trọng khác là nguồn dinh dƣỡng bao gồm C, N, P có

sẵn trong môi trƣờng hay bổ sung thêm. Việc bổ sung các chất thêm nhƣ

nguồn cacbon cũng tạo điều kiện tăng khả năng phân hủy sinh học của các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 26

chủng vi sinh vật phân hủy chất độc theo cơ chế đồng trao đổi chất, một số

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

chất thƣờng đƣợc bổ sung nhằm kích thích thêm quá trình phân hủy chất độc

có thể kể đến glucose, acetate, pyruvate. Các muối N đóng một vai trò hết sức

quan trọng trong quá trình xử lý bằng phƣơng pháp phân hủy sinh học, việc

bổ sung nguồn muối này đã làm tăng tốc độ phân hủy DDT. Nguồn N có thể

thêm vào cả dạng vô cơ và hữu cơ [23]. Phốtpho cũng là một nguồn dinh

dƣỡng cần thiết để tăng cƣờng quá trình phân hủy sinh học các chất ô nhiễm. 3-. Nó đƣợc sử dụng để tăng sinh khối tế bào, thƣờng bổ sung muối gốc PO4

Nitơ và Phốtpho thƣờng bổ sung dƣới dạng muối (NH4)2HPO4. Hơn nữa,

phốtpho nhƣ là một chất đệm pH để tạo pH thích hợp cho hoạt động của vi

sinh vật nhằm tăng hoạt tính sinh học của chúng, do vậy làm tăng khả năng

sống sót của vi sinh vật trong các môi trƣờng có điều kiện khác nhau.

Ngoài ra tốc độ phân hủy các hợp chất hydrocacbon thơm đa nhân còn

bị ảnh hƣởng mạnh bởi các chất hoạt động bề mặt. Chất hoạt động là một sản

phẩm rất có giá trị đối với công nghệ sinh học và nó đã đƣợc ứng dụng rất

rộng rãi đối với nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Đối với đất bị nhiễm

độc, các chất hoạt động bề mặt có thể làm tăng khả năng phân hủy, nó phụ

thuộc vào thời gian phân hủy và số lần các chất hoạt động bề mặt bám vào bề

mặt chất độc [36].

Bên cạnh đó quá trình phân hủy sinh học của vi sinh vật còn phụ thuộc

vào bản thân các vi sinh vật, phƣơng thức mà các vi sinh vật chuyển cơ chất

qua màng tế bào. Ngoài cơ chế phân hủy DDT và dẫn xuất của DDT bởi các

enzyme nội bào tức là phải chuyển các chất độc qua màng tế bào thì cơ chế

xúc tác phân hủy DDT bằng các enzyme ngoại bào cũng đã đƣợc quan tâm.

Trong đó ba enzyme ngoại bào LiP, MnP thuộc nhóm peroxidase và Lac

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 27

thuộc nhóm oxidoreductase hiện nay đƣợc quan tấm nhiều nhất.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

6 LACCASE

6.1 Định nghĩa

Laccase (p- benzenediol:oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) thuộc

nhóm enzyme oxidase, cụ thể là polyphenol oxidase. Trong phân tử có chứa 4

nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất

nhận điện tử. Khác với phần lớn các enzyme khác, laccase có phổ cơ chất rất

đa dạng, bao gồm diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol, diamine, amine

thơm, benzenethiol, PCB, dioxin và cả các hợp chất vô cơ nhƣ iot. Các loại

enzyme laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau rất khác nhau về mức độ

glycosyl hóa, khối lƣợng phân tử và tính chất động học [35].

6.2 Cấu trúc phân tử của laccase

Một loài sinh vật có thể có nhiều dạng isozyme của laccase, các dạng

isozyme này khác nhau về trình tự acid amine và một số tính chất về động học

xúc tác. Nấm có thể tạo ra nhiều dạng isozyme laccase khác nhau cả về mức

độ glycosyl hóa và cả thành phần các gốc carbonhydrate. Trametes versicolor

có 5 dạng isozyme chỉ khác nhau về thành phần carbonhydrate, thành phần

carbonhydrate của chúng thay đổi từ 10 – 45% so với khối lƣợng của thành

phần protein. Phân tử laccase thƣờng là monomeric protein, chỉ một số là oligomeric protein, có khối lƣợng phân tử dao động trong khoảng 60 – 90 kD.

Phần lớn laccase của nấm có bản chất là glycoprotein với hàm lƣợng

carbonhydrate chiếm khoảng 10 – 25% [34].

Tuy vậy, tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác

với 4 nguyên tử đồng. Những nguyên tử đồng này đƣợc chia thành 3 nhóm:

loại 1 (T1), loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ

ánh sáng và thế điện tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp phụ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 28

điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

không tạo phổ hấp thụ điện tử, và có thể đƣợc hoạt hóa khi liên kết với anion

mạnh.

Phân tử laccase thông thƣờng bao gồm 3 tiểu phần chính (vùng) A, B,

C có khối lƣợng tƣơng đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá

trình xúc tác của laccase. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và

C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử

đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và C. Trung tâm đồng một nguyên tử

chỉ chứa 1 nguyên tử đồng T1, liên kết với một đoạn peptide có 2 gốc

histidine và 1 gốc cystein. Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S

của cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 600

nm, tạo cho laccase có màu xanh nƣớc biển đặc trƣng. Trung tâm đồng 3

nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp nguyên tử đồng T3. Nguyên tử đồng

T2 liên kết với 2 gốc histidine bảo thủ trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 29

liên kết với 6 gốc histidine bảo thủ (Hình 1.7, 1.8) [35].

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Tiểu phần A, B, C đƣợc kí hiệu đỏ, xanh lục và xanh lá cây

Hình 1.7. Hình ảnh không gian ba chiều của laccase từ M. albomyces

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 30

Hình 1.8. Trung tâm hoạt động của laccase

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

6.3 Cơ chế xúc tác của laccase

Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các

hợp chất có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử. Khác với

phần lớn các loại enzyme khác, laccase có phổ đặc hiệu cơ chất khá rộng. Sự

phù hợp của các cơ chất đối với laccase quyết định bởi hai nhân tố chính. Thứ

nhất là sự phù hợp giữa cơ chất và nguyên tử đồng T1, thứ hai là sự phụ thuộc

vào sự chênh lệch giữa thế oxy-hóa khử giữa cơ chất và enzyme. Các đại

lƣợng này phụ thuộc cấu trúc hóa học của cơ chất. Thế oxy hóa khử của

laccase dao động trong khoảng 0,4 đến 0,8 V [9]. Cơ chất khử bị mất một

điện tử nhờ xúc tác laccase thƣờng tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không

bền này tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính laccase đó hoặc tiếp tục các

phản ứng không cần xúc tác enzyme nhƣ hydrate hóa, phân ly hoặc polymer

hóa.

Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng

oxy hóa cơ chất. Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+). Một chu kỳ xúc tác liên quan

đến sự vận chuyển đồng thời 4 electron từ nguyên tử đồng T1 sang cụm

nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptide bảo thủ His-Cys-His. Phân tử oxy

sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 31

cuối cùng bị khử thành nƣớc (Hình 1.9).

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 1.9. Cơ chế xúc tác của laccase

Ngoài ra cơ chế xúc tác có thể xảy ra theo một trong các cơ chế sau. Cơ

chế đơn giản nhất có thể diễn ra khi các cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung

tâm hoạt động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm. Tuy nhiên, các phần tử cơ

chất thƣờng có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế khử quá lớn, vì vậy chúng

không thể tiếp cận đƣợc trung tâm phản ứng của phân tử laccase. Trong

trƣờng hợp này cần một hợp chất hóa học trung gian (mediator). Hợp chất hóa

học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase và bị laccase oxy

hóa thành dạ ng gố c tự do [52]. Sau đó mediator ở dạ ng oxy hoá nhậ n mộ t điệ n

tƣ̉ củ a cơ chấ t và trở thà nh khƣ̉ , tiế p tụ c tham gia và o chu kỳ xá c tá c. Ngƣợ c lạ i,

laccase sau khi cho mediator mộ t điệ n tƣ̉ thì trở thà nh dạ ng khƣ̉, và sau đó bị oxy

hoá thành dạng oxy hoá và tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác tiếp theo (Hình

1.10). Các mediator thƣờng phù hợp cho laccase là 3-Hydroxyanthranillic acid

(HAA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), N-

hydroxybenzo-trialzone (HBT), N-hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid ( VLA)

v.v [52]. Sƣ̣ tham gia củ a mediator đã làm tăng phổ cơ chất xúc tác và tí nh không

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 32

đặ c hiệ u cơ chấ t của laccase.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

A

B

Hình 1.10. Các kiểu xú c tá c củ a laccase

A. Chu kỳ xúc tác không có sự tham gia của các mediator

B. Chu kỳ xúc tác với sự tham gia của các mediator

Các chất ức chế của laccase thƣờng là các ion nhỏ nhƣ azide, cyanide,

fluoride. Các ion này sẽ liên kết vào trung tâm đồng 3 nguyên và cản trở các

dòng điện tử đi đến các nguyên tử này. Các chất ức chế laccase khác là

ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), acid béo, tropolone, acid kojic và

acid coumaric, nhƣng chúng chỉ có tác dụng ức chế ở nồng độ cao hơn. Các

hợp chất chứa sulfhydryl nhƣ L-cystein, dithiothreitol và thioglycolic acid

cũng đƣợc coi là các chất ức chế laccase.

6.4 Tính chất hóa sinh của laccase

Hoạt tính xúc tác của enzyme đƣợc đặc trƣng bởi hằng số Michaelis -

Menten (Km). Hằng số này của laccase dao động trong một giới hạn khá

rộng, trong khoảng 2 – 500µM phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme và cơ chất.

Giá trị Km thấp nhất đối với cơ chất là syringaldazine (một dạng dimer của

hai phân tử 2,6-dimethoxyphenol liên kết với nhau bằng cầu nối azide). Ái lực

đối với oxy thì ít phụ thuộc vào enzyme hơn và chỉ dao động trong khoảng 20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 33

- 50µM.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4 – 6 đối với cơ chất

phenolic. Khi tăng pH sang vùng trung tính hoặc vùng kiềm thì hoạt tính của

laccase bị giảm, nguyên nhân do anion nhỏ là ion hydroxide đã ức chế

laccase. Mặt khác, tăng pH còn làm giảm thế oxy hóa khử của các cơ chất

phenolic do đó cơ chất phenolic dễ bị oxy hóa bởi laccase hơn. Do vậy, hoạt

tính laccase ở các pH khác nhau là kết quả của hai tác dụng đối lập của pH là

sự tăng chênh lệch thế oxy hóa khử laccase – cơ chất và tác dụng ức chế trung

tâm đồng ba nguyên tử của ion hydroxide. Đối với các cơ chất không phải

phenolic nhƣ ABTS thì phản ứng oxy hóa không liên quan đến sự vận chuyển

ion và do đó pH tối thích nằm trong khoảng 2 – 3. Ngƣợc lại, tính bền của

laccase cao nhất trong khoảng pH kiềm nằm trong khoảng 8 – 9.

Nhiệt độ bền của laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc của vi sinh vật. Nhìn chung, laccase bền ở 30 – 50oC và nhanh chóng mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 60oC. Laccase bền nhiệt nhất đƣợc phân lập chủ yếu

từ các loài thuộc prokaryote ví dụ, thời gian bán hủy của laccase của Streptomyces lavendulae là 100 phút ở 70oC và của protein cotA từ loài Bacillus subtilis là 112 phút ở 80oC. Thời gian bán hủy của laccase có nguồn gốc nấm thƣờng là nhỏ hơn 1 giờ ở 70oC và dƣới 10 phút ở 80oC [9,35,43,55].

6.5 Sự phân bố và một số vi sinh vật sinh laccase

Laccase là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, chúng đƣợc tìm thấy ở

thực vật, nấm, một số vi khuẩn và côn trùng. Laccase lần đầu tiên đƣợc phát

hiện đầu tiên ở cây Rhus vernicifera. Việc nghiên cứu laccase trên đối tƣợng

thực vật và nấm đảm rất phổ biến. Laccase từ nấm đƣợc nghiên cứu và khảo

sát rất kỹ đặc biệt là laccase từ nấm đảm Basidomyces. Ngoài ra các các loài

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 34

nấm nhƣ Ascomyces, Deuteromyces, basidomyces và các loài nấm có khả

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

năng phân hủy ligincellulose nhƣ Agaricus bisporus, Botrytis cinerea,

Chaetomium themophilum, Coprius cinereus, Neurospora crassa, Phlebia

radiate, Pleurotus ostrotus ostreatus, Pycnoporus cinnabarius, Trametes

versicolor [35]. Tuy nhiên, các nghiên cứu này trên các đối tƣợng nấm sợi, xạ

khuẩn và vi khuẩn lại không nhiều. Một số vi sinh vật có khả năng sinh

laccase đƣợc miêu tả ở phụ lục 3 [21,25,38,44,56,60].

6.6 Gene mã hóa laccase

Trong vài thập kỷ gần đây, gene sinh tổng hợp laccase đã bắt đầu đƣợc

nghiên cứu. Cho đến nay đã có hơn 100 gene sinh tổng hợp laccase đƣợc đánh

giá và so sánh. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung trên đối tƣợng vi sinh vật.

Năm 1998 gene laccase đầu tiên đƣợc phân lập và giải trình tự từ nấm đảm

Neurospora crassa và nấm sợi Aspergillus nidulans. Tuy nhiên các gene

tƣơng ứng với các protein laccase hoàn chỉnh mới chỉ có khoảng 20 gene,

phần lớn trong số đó là từ nấm đảm [9,32,35,44,60] ( Phụ lục 4).

Đối với nấm đảm và thực vật bậc cao, các gene laccase thƣờng có

nhiều intron. Số lƣợng intron trong mỗi gene thƣờng từ 8 – 13 đoạn, mỗi đoạn

có kích thƣớc khoảng 50 – 90 nucleotit. Ngoài ra cũng có những gene laccase

chỉ có một intron nhƣ Neurospora crassai, ngƣợc lại Pleurotus ostreatus lại

có đến 19 đoạn intron. Các gene điển hình mã hóa protein laccase thƣờng có

kích thƣớc khoảng 500 – 600 axit amin.

Ở nhiều chủng nấm trong bộ gene chứa nhiều gene mã hóa sinh tổng

hợp laccase. Trametes villosa chứa ít nhất 5 gene mã hóa cho laccase,

Coprinus cinereus chứa ít nhất 8 gene và Rhizoctonia solani, Pleurotuss

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 35

sajor-caju chứa ít nhất là 4 gene mã hóa laccase. Tuy nhiên các gene này nằm

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

ở các allen khác nhau trên nhiễm sắc thể và các trình tự bảo thủ liên quan đến

vị trí liên kết với các nguyên tử đồng lại đồng thời cũng có mặt trong các gene

mã hóa các enzyme oxidase chứa nhiều nguyên tử đồng khác, chính những

điều này đã gây khó khăn trong việc phân lập và xác định chính xác số gene

mã hóa cho laccase.

Sự biểu hiện của gene sinh tổng hợp laccase phụ thuộc rất nhiều vào

điều kiện môi trƣờng. Với mỗi chủng khác nhau thì đòi hỏi điều kiện môi

trƣờng thích hợp cho sinh tổng hợp laccase khác nhau. Nhƣ môi trƣờng giàu

nitơ làm tăng quá trình sinh tổng hợp laccase ở chủng Pleurotus sajor-caju,

nhƣng chủng Lentinula edodes lại có khả năng sinh tổng hợp laccase t ốt hơn

trên môi trƣờ n g có hà m lƣợ ng nitơ thấ p . Đồng và các ion kim loại khác nhƣ Hg2+, Mg2+, Cd2+ và một số hợp chất vòng thơm đƣợc xem là những nhân tố

hoạt hóa mạnh quá trình sinh tổng hợp laccase. Quá trình hoạ t hóa gene sinh

tổng hợp laccase bởi các ion kim loại hoặc các hợp chất phenol chƣ́ ng minh là

đƣợc điều khiển bởi một trình tự điều hòa của vùng promoter củ a gene

[32,35].

Gene mã hóa sinh tổng hợp laccase đã đƣợc chuyển vào nhiều đối

tƣợng khác nhau nhƣ Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus

niger, A. nodulan, A. oryzae, cây thuốc lá v.v. Trong nghiên cứu mới nhất

(2009) Xiaoshu Shao và cộng sự đã chỉ ra rằng, hoạt tính của laccase từ

Shigella dysenteriae đƣợc biểu hiện trong Escherichia coli (Wlac) tăng từ

24,4 UI/mg lên 52,9 UI/mg sau khi thay thế hai axit amin Glu 106 bằng Phe

106 trong chuỗ i xoắ n anpha (WlacS). Với kỹ thuật đột biến xóa đoạn trong

chuỗi xoắ n anpha t ừ Leu 351 đến Gly 378 (WlacD), hoạt tính enzyme tăng

3,5 lần so với laccaseWlac). Đồng thời cả hai WlacS và WlacD đều bền nhiệt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 36

hơn Wlac [60].

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trình tự gene mã hóa laccase có thể chia thành 3 nhóm chính là

Ascomycete, Basidomycete và thực vật bậc cao. Tuy nhiên các nghiên cứu về

gene mã hóa laccase ở prokaryote hiện nay không nhiều.

6.7 Ứng dụng của laccase

Phƣơng pháp oxy hóa sinh học nhờ enzyme đƣợc xem là phƣơng pháp

khả quan có thể thay thế các phƣơng pháp oxy hóa hóa học do chúng rất thân

thiện với môi trƣờng và đặc biệt là do phản ứng bởi enzyme thƣờng rất đặc

hiệu và có hiệu suất cao. Laccase là một trong các loại enzyme oxy hóa đƣợc

ứng dụng khá phổ biến trong các ngành công nghiệp do chúng có phổ cơ chất

rộng và sử dụng chất nhận điện tử cuối cùng là oxy phân tử chứ không phải

cần các chất nhận điện tử đắt tiền khác nhƣ NAD(P)+. Laccase đƣợc sử dụng

trong một số ngành nhƣ công nghiệp dệt nhuộm, công nghiệp hóa mỹ phẩm,

hóa thực phẩm, dƣợc phẩm v.v. Laccase có tiềm năng cao trong công nghệ

nano sinh học để tạo các biosensor có độ nhạy cao. Ngoài ra còn đƣợc sử

dụng trong phân hủy các hợp chất lignincellulose và xử lý các chất ô nhiễm

khó phân hủy [11,17,35,52,58].

Laccase rất hữu hiệu trong việc tham gia xúc tác phân hủy các chất độc

thông qua quá trình oxy hóa đặc biệt là các chất phức tạp, không tan. Laccase

có thể tham gia phân hủy các hợp chất phenol là chất thải của các quá trình

sản xuất khác nhau nhƣ hóa dầu, sản xuất các hợp chất hữu cơ v.v. Laccase

đƣợc cố định trên các vật liệu mang và hệ thống xúc tác laccase - mediator tỏ

ra hiệu quả trong việc chuyển hóa các chất ô nhiễm chứa phenol và các hợp

chất dẫn xuất clo phenol khác nhƣ các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân

(polycyclic aromatic hydrocarbon – PAH), polychlorinated biphenyl (PCB) từ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 37

ngành công nghiệp dầu mỏ, thuốc nổ 2,4,6-trinitrotoluen (TNT) trong ngành

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

khai khoáng, quân sự, thuốc trừ sâu (Dichloro Diphenyl Trichloroethane -

DDT, Hexacyclohexan - HCH v.v.), thuốc diệt cỏ hóa học (2,4,5-

Trichlorophenoxyacetic acid - 2,4,5-T; 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid - 2,4-

D v.v.) dùng trong nông nghiệp [58].

6.8 Lignin peroxidase và Mangan peroxidase

6.8.1 Lignin peroxidase

Lignin peroxidase là một glycoprotein có chứa nhân heme, enzyme này

xúc tác quá trình oxy hóa lignin và các hợp chất có vòng giống lignin khi có

mặt H2O2 trong môi trƣờng. LiP có trọng lƣợng phân tử từ 36 – 48 kDa, pH

tối thích cho hoạt động trong khoảng 2,5 – 3, điểm đẳng điện pI là 3,2 – 4

[24].

LiP có thể xúc tác các phản ứng oxy hóa các hợp chất phenol dẫn đến

mở vòng do có thế oxy hóa khử cao. Thế oxy hóa khử cao đƣợc giải thích do

các hợp chất chất trung gian đƣợc tạo ra trong chu trình xúc tác của LiP là các

hợp chất LiPI và LiPII. Chu trình xúc tác của LiP đƣợc miêu tả ở hình 1.11.

Đầu tiên LiP bị oxy hóa thành LiPI nhờ H2O2, tiếp theo LiPI oxy hóa cơ chất

(hợp chất vòng thơm) và trở thành LiPII. LiPII tiếp tục oxy hóa một phân tử

cơ chất khác và trở về dạng ban đầu rồi tiếp tục một chu trình xúc tác khác.

Hình 1.11. Chu trình hoạt hộ ng của LiP

R – Hợp chất hƣu cơ chứa vòng thơm R+. Hợp chất hữu cơ chứa vòng thơm bị oxy hóa thành gốc cation tự do

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 38

LiP + H2 O2 H2O + LiPI LiPI + R R+. + LiPII LiPII + R + 2H+ R+. + H2O + LiP

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

6.8.2. Mangan peroxidase

Mangan peroxidase cũng giống nhƣ LiP thuộc nhóm enzyme xúc tác

phản ứng với sự có mặt của H2O2. Enzyme này hoạt động nhƣ một phenoloxydase bằng cách sử dụng Mn3+/Mn2+ làm cặp oxy hóa khử trung

gian, chúng tham gia phản ứng oxy hóa phenol và các hợp chất dẫn xuất

phenol bằng cách tấn công trực tiếp vào cấu trúc vòng thơm chuyển hóa

chúng thành những gốc có trọng lƣợng phân tử thấp theo con đƣơng oxy hóa

khử mangan gián tiếp. Cơ chế xúc tác của MnP đƣợc thể hiện trong hình 1.12

[14].

Hình 1.12. Chu trình hoạt hộ ng của MnP

R – Hợp chất hƣu cơ chứa vòng thơm R+. – Hợp chất hữu cơ chứa vòng thơm bị oxy hóa thành gốc cation tự do

MnP + H2O2 MnPI + H2O MnPI + Mn2+ MnPII + Mn3+ MnPI + R MnPII + R+. MnPII + Mn2+ MnP + Mn3+ + H2O Mn3+ + R Mn2+ + R+.

Hai enzyme LiP và MnP cũng đƣợc nghiên cứu và sử dụng nhiều trong

các ngành công nghiệp. Tuy nhiên để xử lý ô nhiễm các chất POPs trong đó

có DDT và các dẫn xuất thì Lac dễ thực hiện hơn do laccase xúc tác chỉ cần

oxy phân tử.

7 PHÂN LOẠI VI SINH VẬT

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 39

7.1 Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Phƣơng pháp phân loại cổ điển sử dụng hình thức kết hợp những đặc

điểm hình dạng bên ngoài và các đặc điểm sinh lý để phân loại. Các đặc điểm

hình thái nhƣ hình dạng, kích thƣớc tế bào, màu sắc của khuẩn lạc, kích cỡ

của tế bào vi sinh vật, khả năng bắt màu khi nhuộm Gram, các đặc điểm vi

cấu trúc, cách thức chuyển động của tế bào, hình thức sinh sản, hình dạng và

vị trí của nội bào tử trong tế bào, hình thái và vị trí bào tử trong tế bào mẹ v.v.

Các đặc điểm về sinh lý và trao đổi chất nhƣ nguồn cacbon và nitơ đƣợc sử

dụng, nguồn năng lƣợng, cơ chế chuyển hóa năng lƣợng, kiểu dinh dƣỡng,

các sản phẩm trao đổi chất, giới hạn về nhiệt độ và nhiệt độ tối thích cho sinh

trƣởng, các hợp phần cấu tạo thành tế bào, giới hạn về pH tối thích cho sinh

trƣởng, các sắc tố quang hợp, các chất dự trữ, tính mẫn cảm với chất ức chế

sinh trƣởng v.v. Ngoài ra còn rất nhiều phƣơng pháp phổ biến khác nữa nhƣ

kiểm tra phản ứng sinh hóa của vi sinh vật với các chất phản ứng khác nhau,

các phản ứng miễn dịch của các kháng nguyên là thành phần cấu tạo của tế

bào nhƣ kháng nguyên O của lipopolysaccharid hay của bao nhày thƣờng

đƣợc sử dụng để phân biệt các chủng của một loài.

7.2 Phân loại bằng phƣơng pháp xác định và so sánh trình tự gene mã

hóa 18S rRNA

7.2.1 Một số phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử

Từ cuối thế kỉ XX đặc biệt là những năm 80 trở lại đây, với sự phát

triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới

cho việc phân loại vi sinh vật đó là phân loại học phân tử. Phƣơng pháp này

có ƣu điểm là thời gian đòi hỏi ngắn và tính chính xác cao. Phƣơng pháp này

cho phép phát hiện, mô tả và giải thích đƣợc tính đa dạng sinh học ở mức

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 40

phân tử giữa các loài và trong phạm vi loài.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Phân loại học phân tử có thể dựa trên sự nghiên cứu các gene trong hệ

gene nhân, hệ gene của các bào quan (ti thể và lạp thể) hoặc các sản phẩm của

gene (protein, enzyme). Mỗi loại gene, sản phẩm của gene lại phù hợp với

từng đối tƣợng và mục đích nghiên cứu khác nhau. Do đó, việc lựa chọn gene

nào, loại protein nào có ý nghĩa lớn đối với sự thành công của mỗi hƣớng

nghiên cứu. Từ các nghiên cứu này, các nhà phân loại học có cơ sở chính xác

hơn trong việc đƣa ra các kết luận về phân loại học. Một số phƣơng pháp kĩ

thuật phân loại hiện đại đƣợc mô tả trong phụ lục 5 [1].

7.2.2 Phân loại dựa vào trình tự gene mã hoá 18S rRNA

Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA là phƣơng pháp hữu hiệu

nhất để xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA

có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có chức năng xác định và là trình tự có

tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Tuy

nhiên dựa vào sự khác nhau này, ngƣời ta có thể đánh giá đƣợc mối quan hệ

phát sinh chủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật.

Trong tế bào, riboxom có thể tồn tại trong tế bào chất, trên mạng lƣới

nội sinh chất, hay trong ty thể và lục lạp. Riboxom có cấu trúc gồm hai tiểu

đơn vị, mỗi tiểu đơn vị gồm có 2 thành phần riêng rẽ về rRNA và protein. Vi

sinh vật nhân thật có hằng số lắng 80S gồm hai tiểu đơn vị 60S và 40S, tiểu

đơn vị 60S chứa các loại 5S; 5,8S và 28S rRNA, tiểu đơn vị 40S có chứa 18S

rRNA. Trong 4 loại rRNA của sinh vật nhân thật (5S; 5,8S; 18S; 28S) thì

gene mã hóa cho 18S rRNA (kích thƣớc khoảng 1900 nucleotit) là phù hợp

nhất cho các nghiên cứu phân loại nấm. Sở dĩ nhƣ vậy là do gene mã hóa cho

5S và 5,8S rRNA có kích thƣớc khoảng 120 và 160 nucleotit dễ xác định và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 41

so sánh trình tự nhƣng lại quá ngắn để có thể phân biệt một cách chi tiết giữa

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

các chủng. Còn gene mã hóa cho 28S rRNA có kích thƣớc khoảng 4200

nucleotit, quá lớn, gây khó khăn cho tách dòng , xác định và so sánh trình tự

của cơ thể đa bào. Chỉ có gene mã hóa cho 18S rRNA với kích thƣớc khoảng

1900 nucleotit là phù hợp cho việc phân loại và không gây khó khăn trong

nghiên cứu.

Vùng đệm 18S – 5,8S có thể thay đổi đƣợc kích thƣớc và trình tự ngay

ở cả những nhóm phân loại có quan hệ họ hàng gần nhau. Phần kích thƣớc

này có thể đƣợc sử dụng để xác định tập đoàn và trình tự khác biệt rộng cho

phép khám phá ra những đơn vị giống nhƣ loài rất chính xác bằng PCR, lai

v.v. Giữa các đơn vị gene có các đoạn ITS – 2 và ITS – 2. Ở đầu 5’ của phân

tử rRNA đƣợc phiên mã có một ETS. Nói chung, các đơn vị gene bảo thủ hơn

các đoạn ITS, các ITS lại bảo thủ hơn đoạn ETS.

Gene mã hóa cho cấu trúc 18S rRNA của sinh vật nhân thật đã đƣợc

nghiên cứu kỹ cùng với nhiều cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn gene này lên

bằng kỹ thuật PCR. Nấm sợi là sinh vật nhân thật, hiện nay đã có nhiều tác

giả sử dụng phƣơng pháp phân loại dựa vào gene mã hóa 18S rRNA để phân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 42

loại nấm nói chung và nấm sợi nói riêng [30].

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 VẬT LIỆU

1.1 Nguyên liệu

Ba chủng nấm sợi đƣợc phân lập tử đất ô nhiễm hỗ n h ợp DDT, DDD,

DDE, Hexachlorocyclorohexane (HCH), Heptachlor, Aldrin, Diendrin,

Endrin ở nồng độ cao của Nam Đàn, Nghệ An. Các chủng nấm này đƣợc đặt

tên lần lƣợt là FNA1, FNA2, FNA3. Đây là 3 chủng nấm sợi trong bộ giống

của phòng Công nghệ Sinh học Môi trƣờng – Viện Công nghệ Sinh học Việt

Nam.

1.2 Hóa chất

Hóa chất sử dụng để nghiên cứu là các hóa chất tinh khiết, đảm bảo chất

lƣợng nhƣ ABTS, Guiaiacol, DDT, 2,4,5-T v.v. đƣợc nhập ngoại từ các hãng

hóa chất có uy tín Sigma, Merk v.v. Trong quá trình phân loại chủng có sử

dụng bộ kit cloning của hãng Fermentas. Cặp mồi sử dụng trong phản ứng

PCR là EF4f /Fung5R.

1.3 Thiết bị

Các thiết bị, máy móc đƣợc sử dụng của Viện công nghệ sinh học nói

chung và phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen nói riêng. Các thiết bị

bao gồm: Box cấy vô trùng, máy đo quang phổ hấp thụ, kính hiển vi, cân điện

tử, nồi khử trùng ƣớt, nồi khử trùng khô, tủ sấy, máy nuôi lắc ổn nhiệt, tủ nuôi

ổn nhiệt, máy ly tâm, máy chu trình nhiệt, máy xác định trình tự gen tự động

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 43

ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, máy điện di DNA (Bio-Rad), tủ lạnh các loại 4oC,-20oC, -80oC, và các dụng cụ thí nghiệm khác v.v.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

1.4. Môi trƣờng nuôi cấy

Các môi trƣờng cơ bản đƣợc sử dụng trong phân lập, nghiên cứu các

đặc điểm sinh lý của nấm sợi và môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn E.coli sử dụng

Bảng 2.1. Các môi trƣờng nuôi cấy cơ bản

trong phân loại đƣợc trình bày ở bảng 2.1.

Môi trường muối khoáng dịch (g/l) Môi trường muối khoáng thạch (g/l)

Thành phần các loại hoá chất

giống nhƣ môi trƣờng khoáng dịch và

có bổ sung thêm 20g agar.

KNO3 3,0 KH2PO4 0,3 MgSO4 0,4 NaH2PO4 0,4

NaCl 1,0

Nƣớc máy vừa đủ 1 lít

pH 6,5

Môi trường Czapek dịch (g/l) Môi trường Czapek thạch (g/l)

Thành phần các loại hoá chất Saccharose 30

giống nhƣ môi trƣờng czapek dịch và

có bổ sung thêm 20g agar.

NaNO3 2 KH2PO4 1 KCl 0.5

FeSO4 0.01 NaCl 1

pH 7

Môi trường LB dịch (g/l) Môi trường LB thạch (g/l)

Thành phần các hoá chất tƣơng NaCl 10

Tryptone 10 tự môi trƣờng LB dịch nhƣng có bổ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 44

Cao men 5,0 sung thêm 15g agar.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Nƣớc cất vừa đủ 1 lít

pH 7

Môi trường Czapek nghèo Nước muối sinh lý (0,85%)

Là hỗn hợp môi trƣờng muối NaCl 8,5g

Nƣớc máy vừa đủ 1 lít khoáng và Czapek theo tỷ lệ 4 : 1

về thể tích.

Môi trƣờng trƣớc khi sử dụng đƣợc khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15

phút. Môi trƣờng muối khoáng và czapek đƣợc bổ sung thêm hỗn hợp vitamin,

hỗn hợp vi lƣợng và nguồn cơ chất là DDT.

Thành phần các loại môi trƣờng sử dụng làm môi trƣờng thay thế nghiên

Bảng 2.2. Môi trƣờng thay thế

cứu khả năng sinh laccase đƣợc trình bày trong bảng 2.2.

Môi trườ ng MEG (g/l) Môi trường SG (g/l)

( Malt extract glucose) (Soy glucose)

Cao malt 6 Glucose 5

Cao men 4

KH2PO4 1 MgSO4 0,5 Fe SO4 0,01 NaCl 1

CaCO 3 0,5 KCl 0,5 Bột đậu tƣơng 10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 45

Glucose 8 0,5 MgSO4 Na2HPO4 0,6 0,5 KH2PO4 CaCO 3 0,5 Fe SO4 0,01 MnSO4 0,05 CuSO4 0,05

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Môi trườ ng YS (g/l) Môi trườ ng PG (g/l)

(Yeast extract-Soluble starch) (Potato glucose)

Cao men 2,0 Nƣớ c chiế t khoai tây 500

Cao malt 3,0 Glucose 10

Tinh bộ t tan 10 KH2PO4 0,6

NaCl 0,1

MgSO4 0,05

2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm sợi

Môi trƣờng Czapek nghèo đƣợc sử dụng để nghiên cứu hình thái của

các chủng nấm đã đƣợc làm sạch. Trong môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung 100ppm hỗn hợp DDT, DDD và DDE, nuôi cấy ở 30oC. Sau 5 ngày khi nấm

phát triển tốt, chúng đƣợc quan sát và chụp ảnh khuẩn lạc trên đĩa thạch. Hình

thái bào tử của các chủng nấm đƣợc quan sát và chụp ảnh dƣới kính hiển vi

quang học (Nikon eclipse 50i, Nhật Bản) với độ phóng đại 40 lần.

2.2 Sàng lọc khả năng sinh Lac, LiP, MnP

Guaiacol (0,01 %) và thuốc nhuộm màu RBBR (remazol brilliant blue

R, 0,04 %) là 2 chất đƣợc sử dụng làm chất chỉ thị trong các nghiên cứu sàng

lọc khả năng sinh enzyme ngoại bào Lac, LiP, MnP. Vòng màu nâu đỏ xung

quanh khuẩn lạc đƣợc tạo thành trên môi trƣờng bổ sung guaiacol và khả

năng làm mất màu RBBR là dấu hiệu vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp

các loại enzyme trên [14,52].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 46

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2.3 Nghiên cứu khả năng phân hủy DDT của chủng FNA1

Khả năng phân hủy DDT của chủng FNA1 đƣợc xác định sau 7 ngày nuôi lắc 180 vòng/phút ở 30oC trên môi trƣờng Czapek nghèo có bổ sung

nồng độ DDT thích hợp căn cứ vào kết quả thí nghiệm khả năng phát triển

trên các nồng độ DDT khác nhau. Độ tồn lƣu DDT, DDD, DDE sau 7 ngày

nuôi cấy đƣợc tách chiết và phân tích bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp

(HPLC), sử dụng máy GC/ECD 2010 của hãng Shimadzu Nhật Bản.

2.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme

2.4.1 Xác định hoạt tính laccase

Nguyên tắc: Dựa trên sự oxi hóa ABTS (2,2'-azino-bis 3-

ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) bởi laccase thành hợp chất đƣợc hấp thụ

ánh sáng mạnh tại bƣớc sóng 420 nm.

Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase là lƣợng enzyme cần thiết để tạo

thành 1 µM sản phẩm từ ABTS trong thời gian 1 phút, ở điều kiện thí nghiệm.

Thành phần phản ứng:

Thành phần Đối chứng (ml) Thí nghiệm (ml)

Đệm acetate 0,8 0,6

(20mM), pH 2

Dịch lên men 0,2 0,2

ABTS (5mM) 0 0,2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 47

Tổng thể tích 1 1

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Phản ứng xảy ra khi cho ABTS vào hỗn hợp. Giá trị OD đo sau 3 phút.

Công thức tính:

Trong đó: U: Hoạt độ enzym (U/l)

ε: Hệ số hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 420nm, ε= 36.000 (M-1cm-1)

Vpu: Tổng thể tích phản ứng (1 ml)

VE: Thể tích enzyme (0,2 ml)

ODτ: Giá trị OD đo đƣợc tại thời điểm τ

ODo: Giá trị OD đo đƣợc tại thời điểm τ = 0

Df: Độ pha loãng

t: Thời gian phản ứng

2.4.2 Xác định hoạt tính LiP

Nguyên tắc: Dựa trên sự oxy hóa 2,4-dichlorophenol (2,4-D) của

enzyme tạo thành sản phẩm có độ hấp thụ mạnh tại bƣớc sóng 510 nm.

Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ của LiP là lƣợng enzyme cần thiết để

tạo thành 1 µM sản phẩm từ 2,4-DCP trong thời gian 1 phút, ở điều kiện thí

nghiệm.

Thành phần phản ứng và công thức tính đƣợc miêu tả ở phụ lục 6.

2.4.3 Xác định hoạt tính MnP

Nguyên tắc: Dựa trên sự oxi hóa phenol đỏ của enzyme MnP tạo thành

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48

hợp chất hấp thụ mạnh ở bƣớc sóng 610 nm.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ MnP là lƣợng enzyme cần thiết để oxy

hóa phenol đỏ tạo thành 1 µM sản phẩm hấp thụ bƣớc sóng 610 nm trong thời

gian 1 phút, ở điều kiện thí nghiệm.

Thành phần phản ứng và công thức tính đƣợc miêu tả tại phụ lục 6.

2.5 Khảo sát các điều kiện môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng phát

triển và sinh laccase của chủng FNA1

Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH môi trường nuôi cấy, nồng độ NaCl

Để nghiên cứu ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ, nồng độ muối NaCl lên

khả năng sinh trƣởng và sinh laccase của nấm sợi, môi trƣờng Czapek nghèo với pH 2-9, nhiệt độ là 28, 30, 37 và 420C, nồng độ NaCl là 0; 0,1; 1; 5; 10%

đã lần lƣợt đƣợc sử dụng. Sau 5 ngày nuôi cấy đánh giá khả năng sinh trƣởng

thông qua quan sát và khối lƣợng khô sinh khối nấm. Mẫu dịch lên men đƣợc

sử dụng để đo hoạt tính enzyme.

Ảnh hưởng của nồng độ DDT và nồng độ glucose

Để nghiên cứu khả năng phát triển của nấm sợi ở các nồng độ DDT

khác nhau, môi trƣờng Czapek chứa DDT với nồng độ 50; 100; 200; 300 ppm

đã đƣợc sử dụng. Ngoài nguồn carbon là DDT còn một điều kiện nữa cũng

ảnh hƣởng rất lớn đến sự phát triển của nấm là nồng độ đƣờng. Thông qua thí

nghiệm này có thể xác định nấm sợi đƣợc chọn để nghiên cứu chuyển hóa

DDT có theo cơ chế nào, đồng trao đổi chất hay không thuộc dạng này.

Đƣờng glucose đƣợc sử dụng với các nồng độ lần lƣợt là 0; 0,1; 0,5; 1; 2; 3%,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 49

môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung 100 ppm DDT.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Ảnh hưởng của các chất cảm ứng

Các chất cảm ứng sinh laccase đƣợc sử dụng là guiaiacol, veratyl

alcohol, CuSO4. Để nghiên cứu khả năng phát triển và sinh laccase trên môi

trƣờng chứa các chất ô nhiễm khác nhau, các cảm ứng sinh enzyme là các

chất độc khác cũng đƣợc sử dụng nhƣ dịch chiết (dịch chiết từ đất ô nhiễm có

chứa 2,3,7,8 TCDD – phụ lục 7); 2,4-D; 2,4,5-T; PAH ( các đại diện là pyren,

phenanthren, anthracene) với nồng độ 100 ppm.

Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt

Chất hoạt động bề mặt đƣợc sử dụng là tween 80 với nồng độ 0,2% và

nƣớc chiết bồ kết với nồng độ 0,5% ( từ dịch chiết 20g quả bồ kết trong 100

ml nƣớc cất). Hoạt tính enzyme đƣợc xác định theo từng ngày nuôi cấy.

Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitơ và môi trường thay thế

Để nghiên cứu ảnh hƣớng của các nguồn carbon và nitơ khác nhau,

chủng nghiên cứu đƣợc nuôi trong môi trƣờng Czapek nghèo với thành phần

carbon trong môi trƣờng (saccharose) đƣợc thay thế bằng glucose, lactose,

tinh bột, cellulose và cao malt, nguồn nitơ NaNO3 và KNO3 đƣợc thay thế

bằng NH4NO3, urê, cao men, cao thịt, bột đậu tƣơng. Môi trƣờng thay thể

đƣợc khảo sát bằng các môi trƣờng MEG (cao malt), YS (cao men), SG (bột

đậu tƣơng) và PG (khoai tây).

2.6 Xác định một số tính chất hóa sinh của laccase thô

Xác định pH tối ưu và độ bền pH

pH thích hợp nhất cho laccase từ chủng tuyển chọn hoạt động đƣợc xác

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50

định theo phƣơng pháp nhƣ miêu tả tại mục 2.3.1 với pH của đệm thay đổi từ

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

pH 1 đến pH 5.

Để tìm đƣợc pH thích hợp cho việc bảo quản enzyme, dịch enzyme

đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng với các pH khác nhau. Hoạt tính enzyme còn lại

đƣợc xác định ở nhiệt độ phòng sau 3 giờ ủ.

Xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của laccase và độ bền nhiệt

Khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho laccase từ chủng FNA1 hoạt động

đƣợc xác định trong khoảng nhiệt độ từ 30 0C đế n 80 0C.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến enzyme đƣợc xác định bằng cách ủ dịch lên men tại các nhiệt độ 700C, 800C, 900C. Hoạt tính còn lại đƣợc xác định tại nhiệt

độ phòng sau các khoảng thời gian ủ nhất định.

2.7 Phân loại nấm sợi dựa vào xác định và so sánh trình tự gen mã hóa

18S rRNA

2.7.1 Tách DNA tổng số từ nấm sợi

Màng tế bào đƣợc phá bằng lysozym và SDS, DNA tổng số đƣợc giải

phóng ra. Việc loại bỏ protein khỏi DNA đƣợc thực hiện bởi enzym

proteinaza K. Qui trình các bƣớc thực hiện nhƣ sau:

Bƣớc 1: Nuôi cấy thu sinh khối nấm Bƣớc 2: Thu sinh khối bằng cách ly tâm 6000 vòng/10 phút ở 4oC. Lặp lại vài

lần để thu đủ mẫu.

Bƣớc 3: Bổ sung môi trƣờng nuôi cấy để rửa sinh khối, ly tâm 2 lần với 6000

vòng/10 phút ở 4oC.

Bƣớc 4: Dùng panh để lấy sinh khối cho vào cối sứ đã khử trùng và nghiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 51

trong nitơ lỏng thành bột mịn.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Bƣớc 5: Dùng thìa xúc mẫu cho vào các ependoff, bổ sung 600µl đệm

lyzozym và lắc nhẹ.

Bƣớc 6: Bổ sung tiếp 65µl lysozym, ủ 37oC trong 30-45 phút. Bƣớc 7: Cho 50µl protenaza K ủ ở 56oC trong 2 giờ.

Bƣớc 8: Bổ sung tiếp chloroform : isoamyalcolhol (tỷ lệ 24 : 1)với tỷ lệ 1 : 1 về

thể tích, trộn đều sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC.

Bƣớc 9: Thu phần dịch nổi bên trên cho vào ống Eppendorf mới. Bƣớc 10: Bổ sung isopropanol với tỷ lệ 1 : 1 về thể tích, ủ ở 4oC qua đêm. Bƣớc 11: Ly tâm ở vận tốc 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa.

Bƣớc 12: Hòa tan kết tủa trong 500 µl TE. Bƣớc 13: Loại RNA bằng cách thêm RNAse, ủ ở 37oC qua đêm.

Bƣớc 14: Bổ sung chloroform : isomyalcolhol (tỷ lệ 24 : 1) với tỷ lệ 1 : 1 về

thể tích sau đó đảo nhẹ và ly tâm ở vận tốc 12000 vòng/phút, 15 phút ở 4oC.

Bƣớc 15: Thu phần dịch nổi phía trên.

Bƣớc 16: Bổ sung ethanol 100% (giữ lạnh) tỷ lệ 1 : 1 về thể tích. Bƣớc 17: Ly tâm ở vận tốc 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu kết tủa

sau đó rửa sạch bằng ethanol 80%. Làm khô DNA.

Bƣớc 18: Hòa trong 100µl TE và bảo quản ở 4oC.

2.7.2 Nhân đoạn gen bằng kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR do Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Từ đó đến

nay kỹ thuật này đƣợc sử dụng rất phổ biến trong công nghệ sinh học và đóng

góp to lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử. Cặp mồi đƣợc sử dụng

trong nghiên cứu này là EF4f/Fung5R đƣợc thiết kế dựa vào trình tự có tính

bảo thủ cao của gen 18S ở sinh vật eukaryot. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 52

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Mồi xuôi EF4f: 5’ – GGAAGGG(G/A)TGTATTTATTAG – 3’

Mồi ngƣợc Fung5R: 5’ – GTAAAGTCCTGGTTCCC – 3’

Thành phần phản ứng (l):

2 Đệm PCR

3

2.5 MgCl2 (25mM) dNTP

1 EF4f (20pmol)

1 Fung5r (20pmol)

Taq-polymeraza (5 unit/l) 0.5

12.5

2 H2O DNA

Tổng thể tích 25

Chu trình nhiệt:

Bƣớc 1: 95oC (5 phút)

Bƣớc 2: 94oC (1 phút)

Bƣớc 3: 48oC (1 phút)

Bƣớc 4: 72oC (3 phút)

Bƣớc 5: Lặp lại 35 lần từ bƣớc 2 đến bƣớc 4

Bƣớc 6: 72oC (10 phút)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 53

Bƣớc 7: Bảo quản ở 4oC

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2.7.3 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ và biến nạp vào E.coli

Thứ tự các bƣớc đƣợc tiến hành theo Kit InsTAcloneTMPCR cloning

(mã số #K1214 của hãng Fermentas. Sau khi biến nạp cấy chuyển các khuẩn

lạc ra môi trƣờng LB thạch có bổ sung các chất chỉ thị (kháng sinh, X-gal) để

chọn lọc các dòng tế bào mang vector tái tổ hợp mong muốn. Các dòng tế bào

chọn lọc đƣợc nuôi trên LB dịch để tách DNA plasmit.

Thành phần phản ứng tạo vector tái tổ hợp:

Vector pTZ57R/T 3l

Buffer 5X ligation 6l

Sản phẩm PCR 3l

1l T4 DNA ligaza

Nƣớc cất 17l

Tổng thể tích 30l

Ủ hỗn hợp ở 22oC trong thời gian 1giờ.

Quy trình biến nạp vào E.coli:

Quy trình biến nạp đƣợc thực hiện theo quy trình và hóa chất đƣợc

miêu tả tại phụ lục 8.

2.7.4 Tách chiết DNA plasmid

Tách chiết DNA plasmit theo phƣơng pháp cuả Sam Brook và Russell [51].

Bƣớc 1: Thu sinh khối tế bào bằng cách ly tâm 6000 vòng/phút, 10 phút ở

4oC.

Bƣớc 2: Bổ sung 500l STE, lắc nhẹ và nhanh. Sau đó ly tâm 6000 vòng/phút

(ở 4oC) để thu cặn tế bào.

Bƣớc 3: Bổ sung 200l Sol I và lắc kỹ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 54

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Bƣớc 4: Bổ sung 400l Sol II, lắc đảo ngƣợc 5 lần rồi ủ trong đá 5 phút.

Bƣớc 5: Bổ sung 300l Sol III, để lạnh, lắc mạnh rồi ủ trong đá 20 phút.

Bƣớc 6: Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC, hút 600l pha trên.

Bƣớc 7: Bổ sung 600l chloroform : isoamyalcolhol (tỷ lệ 24 : 1), lắc kỹ, ly tâm 12000 vòng/ phút trong 6 phút ở 4oC để thu lấy pha trên.

Bƣớc 8: Bổ sung 560l isopropanol, giữ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Bƣớc 9: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, thu tủa, rửa tủa bằng

ethanol 70% rồi thu tủa lại bằng cách ly tâm 6000 vòng/phút trong 7 phút ở 4oC.

Bƣớc 10: Làm khô tủa bằng máy hút chân không, hoà tan trong nƣớc cất 2 lần

khử ion rồi giữ ở -20oC để dùng cho các thí nghiệm sau.

2.7.5 Kiểm tra plasmit mang sản phẩm PCR mong muốn

Để kiểm tra plasmit có mang sản phẩm PCR đúng kích thƣớc hay

không, có thể tiến hành cắt bằng enzym giới hạn BamHI và EcoRI hoặc tiến

hành PCR kiểm tra với cặp mồi đã nêu. Ở đây tiến hành chạy PCR để kiểm

tra với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt nhƣ đƣợc trình bày ở trên. Sau

khi PCR, điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, nếu thu đựợc băng có kích

thƣớc khoảng 550bp thì có thể kết luận plasmit tách đƣợc có thể mang sản

phẩm PCR mong muốn. Sau các bƣớc kiểm tra, DNA plasmit đƣợc tách sạch

dùng để xác định trình tự.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 55

2.7.6 Điện di kiểm tra DNA tổng số

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Điện di kiểm tra sử dụng gel agarose có nồng độ 1%, nhuộm bằng

Ethidium bromide và sau đó soi DNA dƣới ánh sáng tử ngoại.

2.6.7 Xác định trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA

Xác định trình tự gene mã hóa 16S rRNA của vi khuẩn, theo phƣơng

pháp của Sanger, sử dụng máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant

Data Collection v1.0 và Sequencing Analysis.

2.6.8 Xây dựng cây phát sinh chủng loại

Sau khi đã có kết quả xác định trình tự đoạn gen 18S rRNA, tiến hành

so sánh trình tự với các trình tự tƣơng ứng đã có trên GenBank. Tiếp đó dùng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 56

phần mềm tin sinh học Clustalx để xây dựng cây phát sinh chủng loại.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

2 Một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của

các chủng FNA1, FNA2, FNA3

Ba chủng nấm sợi FNA1, FNA2 và FNA3 phân lập từ đất ô nhiễm hỗn

hợp thuốc trừ sâu đã đƣợc tuyển chọn. Sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng

Czapek nghèo có bổ sung DDT hình thái khuẩn lạc của 3 chủng nấm đƣợc

quan sát và mô tả ở hình 1. Chủng FNA1 có khuẩn lạc mọc lan rộng, đƣờng

kính 2 cm, khuẩn ty khí sinh màu xanh lá mạ viền ngoài màu xanh trắng,

bông xốp. Khuẩn lạc chủng FNA 2 tròn, đƣờng kính 1,2 cm, bề mặt khuẩn ty

khí sinh chắc, có múi, màu xanh rêu đậm, viền ngoài trắng, tâm có giọt tiết

màu đen. Chủng FNA3 có khuẩn lạc tròn, rộng 1,5 cm, viền ngoài khẩn ty khí

sinh có màu trắng hơi khứa, trong màu nâu, sinh giọt tiết màu nâu đậm.

Khuẩn ty cơ chất của cả 3 chủng trên đều màu trắng.

Cuống sinh bào tử và bào tử của 3 chủng FNA 1, FNA2, FNA3 có dạng

gầ n giố ng nhau . Cuố ng sinh bà o tƣ̉ trầ n , không phân nhá nh . Đầu sinh bào tử

trầ n dạ ng tia . Bào tử xếp thành chuỗi đính với thể bình . Chủng FNA 1 và

FNA2 có hai tầng thể bình , FNA3 có một tầng thể bình . Bào tử có hình tròn

đến elip, bào tử non nhẵn , bào tử già gai ráp (Hình 3.1). Với các đặc điểm về

hình thái khuẩn lạc và bào tử nhƣ trên có thể xếp 3 chủng nấm sợi này vào chi

Aspergillus. Do chủng FNA1 phát triển nhanh nhất, tạo sinh khối lớn nên đã

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 57

đƣợc chọn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Tên

FNA1

FNA2

FNA3

chủng

Hình thái khuẩn lạc

Hình thái cuống sinh bào tử

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử chủng FNA1, FNA2, FNA3

2 SÀNG LỌC KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP Lac, LiP, MnP

Guaiacol (0,01 %) và thuốc nhuộm màu RBBR (0,04 %) là 2 chất đƣợc

sử dụng làm chất chỉ thị sàng lọc. Kết quả đƣợc thể hiện tại hình 3.2 cho thấy

chủng FNA1 có khả năng sinh enzyme mạnh nhất, chủng FNA2 sinh enzyme

yếu nhất trong 3 chủng nghiên cứu. Để khẳng định điều này dịch nuôi cấy của

3 chủng này sau 6 ngày đã đƣợc sử dụng để xác định hoạt tính enzyme.

Chủng FNA1 không phát hiện thấy LiP nhƣng có khả năng sinh Lac và MnP

cao nhất, lần lƣợt là 5,41 và 26,9 (U/l). Hai chủng FNA2 và FNA3 phát hiện

thấy sự có mặt của cả ba loại enzyme trên nhƣng hoạt tính yếu hơn FNA1

(Bảng 3.1). Kết hợp khả năng phát triển và sinh enzyme chủng FNA1 đƣợc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 58

lựa chọn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

FNA1

FNA2

FNA3

Tên chủng

Guaiacol

RBBR

+++ + ++

Ghi chú

Hình 3.2 Khả năng sinh enzyme từ 3 chủng chọn lọc

+++ : Tốt;

++: Trung bình;

+: Yếu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 59

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Bảng 3.1 Hoạt tính Lac, LiP, MnP của 3 chủng FNA1, FNA2, FNA3

Tên chủng

Chỉ thị

Lac (U/l)

LiP (U/l)

MnP (U/l)

RBBR

5,41

-

26,9

FNA1

Guaiacol

3,74

-

-

RBBR

2,3

4,15

6,05

FNA2

Guaiacol

2,9

-

-

RBBR

3,3

2,07

-

FNA3

Guaiacol

2,9

-

13,4

3 KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DDT CỦA CHỦNG FNA1

Sau khi xác định đƣợc ở nồng độ DDT là 200 ppm chủng FNA1 phát

triển tốt nhất thông qua nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ DDT đến khả

năng sinh trƣởng của FNA1 (trình bày tại mục 4.2.1). Đánh giá khả năng phân

hủy DDT đã đƣợc tiến hành bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp để xác

định độ tồn lƣu của DDT và các đồng phân của nó. Sau 7 ngày nuôi cấy, mẫu

không có vi sinh vật và có FNA1 đã đƣợc so sánh, kết quả phân tích đƣợc thể

hiện trên sắc ký đồ ở hình 3.3 (A, B). Khả năng phân hủy DDE, DDD và

DDT của chủng FNA1 đạt rất cao, các chất trên đƣợc loại bỏ lần lƣợt là 92,69

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 60

%, 97,19 % và 97,23 % (Bảng 3.2).

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 3.3 Phổ sắc ký đồ

A: Mẫu nuôi cấy không có vi sinh vật

B: Mẫu nuôi cấy có vi sinh vật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 61

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Bảng 3.2 Khả năng phân hủy DDT, DDE, DDD bởi chủng FNA1

Lƣợng thu hồi

Lƣợng bị loại bỏ

Chất ô

Không có

FNA1

nhiễm

(ppm)

(%)

VSV (ppm)

(ppm)

4,271 0,312 3,959

DDE

92,69

10,238 0,287 9,951 97,19

DDD

162,8 4,5 158,3 97.23

DDT

Đã có nhiều công bố về khả năng phân hủy sinh học DDT của vi sinh

vật. Các nhóm vi sinh vật tiềm năng cho quá trình phân hủy DDT phục vụ cho

xây dựng qui trình công nghệ khử độc đất nhiễm hỗn hợp DDT, HCH và các

chất ô nhiễm hữu cơ chứa clo khác đƣợc quan tâm là nấm, xạ khuẩn và vi

khuẩn. Theo các nghiên cứu thì có tới hơn 300 chủng vi sinh vật có khả năng

phân hủy DDT và các dẫn suất, một số vi sinh vật chuyển hoá DDT đã đƣợc

công bố bao gồm Escheria coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter

cloacae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas

putida, Bacillus sp. v.v. và một số nấm nhƣ Saccharomyces cerevisiae,

Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma [29]. Quá trình chuyển hoá DDT

của các vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu phần lớn đều theo cơ chế đồng trao

đổi chất. Cũng có thể chủng FNA1 đƣợc phân lập từ đất ô nhiễm DDT và các

thuốc trừ sâu khác cũng phân hủy DDT theo cơ chế đồng trao đổi chất. Các

nghiên cứu trƣớc đã sử dụng môi trƣờng muối khoáng chứa DDT nhƣng

chủng FNA1 không phát triển, chủng này chỉ phát triển trên môi trƣờng có bổ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 62

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

sung saccharose. Tuy nhiên cần rất nhiều nghiên cứu tiếp theo để làm sáng tỏ

cơ chế chuyển hóa DDE, DDD, DDT của chủng nấm sợi này.

Khả năng phân hủy hỗn hợp DDT của nấm FNA1 cao hơn hằn so với

khả năng phân hủy của vi khuẩn đƣợc phân lập từ cùng mẫu nghiên cứu là

BNA71 và BNA73 [6]. Hai chủng này phân hủy lần lƣợt là 12,53 % và 19,66

% DDT tổng sau 14 ngày nuôi cấy, trong khi chủng FNA1 phân hủy đƣợc

94,41 % sau 7 ngày. Điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trong và

ngoài nƣớc cho thấy khả năng phân hủy DDT của nấm tốt hơn hẳn vi khuẩn

và xạ khuẩn. Aislabie và cộng sự đã sử dụng chủng xạ khuẩn Terrabacter sp.

DDE-1 để nghiên cứu khả năng phân huỷ sinh học của nó. Nồng độ DDE đã

giảm từ 0,1 mg/ml xuống cò n 0,062 mg/ml (48 %) sau 10 ngày nuôi cấy

Terrabacter sp. DDE-1 [10]. Johnson và Kennedy đã xác đ ịnh hiệ u quả phân

hủy DDT của Ae robacter aerogenes và Bacillus subtilis lầ n lƣợ t là 45 % và

30 % sau 24h vớ i nồ ng độ ban đầ u là 5µg/ml [31].

Bumpus và Aust đã sử dụng nấm đảm loà i P. chrysosporium nghiên

cứu xử lý DDT trong môi trƣờng thiếu nitơ, sau 30 ngày nuôi cấy, khoảng 50

% DDT đã đƣợc chuyển hoá trong đó có 10 % đã đƣợc khoáng hoá hoàn toàn

và thấy xuất hiện các sản phẩm của quá trình trao đổi chất nhƣ dicofol, FW- 152 và DBP [15]. Fernando (1989) kiểm tra khả năng phân huỷ 14C-DDT

trong hỗn hợp đất và lõi ngô bởi nấm P. chrysosporiumi cho thấy sau 60 ngày 10% 14C chuyển sang dạng 14C-CO2, 5 % sang dạng hoà tan trong nƣớc và

18% ở dạng không thể tách chiết. Con đƣờng chuyển hóa DDT của vi khuẩn

E. Aerogenes đƣợc công bố bởi Wedemeyer năm 1976 cũng tạo ra sản phẩm

trung gian là DDD và DDE [41]. Từ kết quả phân tích DDD và DDE cho

thấy hàm lƣợng DDD và DDE của mẫu có bổ sung chủng FNA1 thấp hơn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 63

nhiều của mẫu đối chứng. Số liệu này chứng tỏ chủng FNA1 có khả năng

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

phân hủy cả DDT, DDD và DDE. So sánh khả năng chuyển hóa DDT và các

dẫn xuất với con đƣờng chuyển hóa bởi hai chủng P. Chrysosporium, E.

Aerogenes, chúng tôi nhận thấy kiểu phân hủy sinh học DDT của chủng

FNA1 khá giống với các chủng nêu trên.

Nhƣ vậy chủng FNA1 có khả năng phát triển tốt và phân hủy DDT ở

nồng độ rất cao trong thời gian ngắn. Còn rất nhiều chủng vi khuẩn và nấm

khác đã đƣợc phát hiện có khả năng phân hủy DDT rất tốt với nồng độ rất

thấp từ 0,1 – 2 ppm nhƣ loài Rhodotorula gracilis, Torulopsis utilis phân hủy

lần lƣợt 97 %, 94 % DDT với nồng độ ban đầu là 2ppm, còn loài Blepharisma

intermedium phân hủy 90 % DDT với nồng độ ban đầu là 1ppm. Bidlan và

Manonmani đã chứng minh chủng Serratia marcescens DT-1P làm giảm 50%

DDT sau 48 giờ với nồng độ ban đầu là 5ppm. Kanoknit phân lập đƣợc 167

chủng từ tỉnh Songkhla, Thái Lan có khả năng phát triển trên môi trƣờng có

chứa 25ppm DDT. Chỉ có năm chủng sinh trƣởng và phát triển và tạo vòng

phân hủy ở nồng độ 100ppm DDT, sau 10 ngày nuôi cấy năm chủng này có

khả năng phân loại bỏ từ 20,3 % đến 37,4 % DDT với nồng độ ban đầu là 25

ppm. Chúng mình trên cho thấy khả năng phân hủy DDT của chủng FNA1

cao hơn hẳn nhiều chủng đã đƣợc công bố [62].

Theo các khảo sát bƣớc đầu cho thấy chủng FNA1 sinh enzyme ngoại

bào trên môi trƣờng chọn lọc đặc hiệu với chất cảm ứng là 100 ppm DDT.

Đây có thể là một trong các lý do tại sao loài nấm sợi này phân hủy chuyển

hóa DDE, DDD, DDT rất tốt so với các chủng vi sinh vật khác. Để tìm hiểu

và ứng dụng chủng FNA1 nhƣ là một ứng cử viên cho phƣơng pháp tăng

cƣờng sinh học xử lý đất nhiễm nặng hỗn hợp thuốc trừ sâu và côn trùng cần

rất nhiều nghiên cứu sâu sắc hơn. Theo các kết quả thu đƣợc từ rất nhiều

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 64

phòng thí nghiệm trên thế giới thì enzyme ngoại bào do nấm đảm và mới nhất

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

hiện nay enzyme do nấm sợi sinh tổng hợp đang mở ra triển vọng rất to lớn để

xử lý loại bỏ các chất ô nhiễm hứu cơ khó phân hủy (POPs) trong đó có DDT

và các dẫn xuất của nó [26].

4 CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG

SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP LACCASE CỦA FNA1

4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH môi trường nuôi cấy, nồng độ NaCl

4.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nấm đƣợc nuôi ở các nhiệt độ khác nhau, kết quả đƣợc đánh giá sau 5

ngày nuôi cấy. Khả năng phát triển của FNA1 đƣợc đánh giá thông qua sự

khác biệt về sinh khối và đặc biệt là màu sắc giữa các nhiệt độ nuôi. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.4, ở khoảng nhiệt độ 30 oC đến 37 oC chủng FNA1 phát triền sinh khối mạnh nhất, ở 37 oC có sự đổi màu môi trƣờng nuôi cấy sang màu vàng nhạt, chứng tỏ chủng này phát triển mạnh nhất ở khoảng 37 oC. Điều này hoàn toàn phù hợp với đặc điểm nguồn mẫu đƣợc phân lập từ

bioreactor hiếu khí.

Hình 3.4 Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sinh trƣởng của chủng FNA1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 65

28 oC 30 oC 37 oC 42oC

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 3.5 Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng sinh laccase của chủng FNA1

Dịch lên men sau 5 ngày đƣợc sử dụng để xác định hoạt tính laccase,

kết quả thể hiện trong hình 3.5. Chủng FNA1 sinh laccase cao nhất trong khoảng nhiệt độ 30-37 oC, cao nhất là 12,2 U/l. Khả năng này giảm hẳn khi nhiệt độ tăng cao hơn, ở 40oC hoạt tính enzyme chỉ còn 1,3 U/l.

4.1.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy

Sự đánh giá ảnh hƣởng của pH lên sự phát triển và sinh laccase của

chủng FNA1 ở các pH 1 – 9 đã đƣợc tiến hành. Kết quả đƣợc đánh giá sau 5

ngày nuôi cấy cho thấy FNA1 có khả năng phát triển trong dải pH rộng, từ

môi trƣờng có pH rất thấp ( pH 2), đến môi trƣờng có pH cao ( pH 9) và tốt

nhất trong khoảng pH 4 – 6 ( Hình 3.6), kết quả này phù hợp với đặc điểm

nguồn mẫu chủng đƣợc phân lập là đất ô nhiễm có pH khá thấp. Một số vi

sinh vật cũng phát triển trên môi trƣờng có các chất độc hóa học khác cũng

phát triển trong khoảng pH hơi axit nhƣ chủng Aspergillus sp.FDN20 ở pH 6,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 66

chủng Aspergillus terreus FDN41 ở pH 6,5 [3].

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

pH môi trƣờng là một trong các yếu tố quan trọng không những ảnh

hƣởng đến sự phát triển mà còn ảnh hƣởng lớn đến khả năng sinh enzyme

ngoại bào của vi sinh vật. Với chủng FNA1 pH môi trƣờng ban đầu tốt nhất

cho sinh laccase là pH 5 ( 111,11 U/l), mặc dù phát triển tốt trong khoảng pH

4-6 nhƣng tại pH 4 hoạt tính enzyme rất thấp, chỉ đạt 2,9 % so với hoạt tính

enzyme tại pH 5. Khi pH môi trƣờng tăng dần hoạt tính laccase giảm dần, tại

pH 6 giảm nhẹ còn 90%, đến pH 7 giảm mạnh xuống còn 3,1 % ( Hình 3.7).

pH 1

2

3

4

5

6

7

8

9

Hình 3.6 Ảnh hƣởng của pH lên khả năng sinh trƣởng của chủng FNA1

Hình 3.7 Ảnh hƣởng của pH lên khả năng sinh laccase của chủng FNA1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 67

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

4.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl

Chủng nấm sợi FNA1 phát triển đƣợc đƣợc ở các nồng độ NaCl từ 0

đến 10%, phát triển tốt nhất ở nồng độ 0,1 % NaCl, đây cũng là nồng độ mà

laccase đƣợc sinh tổng hợp mạnh nhất đạt 10,41 U/l sau 5 ngày nuôi cấy. Từ

5 % NaCl trở lên khả năng phát triển rất yếu và hoạt tính enzyme giảm rõ rệt,

ở nồng độ NaCl 10 % lƣợng enzyme hầu nhƣ đƣợc sinh tổng hợp ( Hình 3.8,

3.9). Chủng Aspergillus sp. FDN20 cũng có khả năng phát triển ở khoảng

nồng độ NaCl khá rộng từ 0,1 đến 10 %, chủng Aspergillus terreus FDN41 lại

phát triển trong khoảng hẹp hơn từ 0 đến 5 %. Tuy nhiên nồng độ thích hợp

nhất cho các chủng sinh trƣởng và phát triển lại rất khác nhau, chủng FNA1

khoảng 0,1 %, chủng Aspergillus sp. FDN20 cần lƣợng muối khá cao khoảng

Hình 3.8 Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl lên sự sinh trƣởng của chủng FNA1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 68

3% [3].

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 3.9 Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl lên khả năng sinh laccase của chủng FNA1

4.2 Ảnh hưởng của nồng độ DDT và nồng độ glucose

4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ DDT

Mỗi chủng vi sinh vật đều có giới hạn nhất định đối với các điều kiện

môi trƣờng, trong đó điều kiện quan trọng ảnh hƣởng đến khả năng sử dụng

chủng nghiên cứu vào thực tế xử lý khử độc ngoài hiện trƣờng là giới hạn

nồng độ các chất ô nhiễm mà tại đó vi sinh vật có thể phát triển. Để tìm hiểu

vấn đề này cũng nhƣ lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy với nồng độ DDT thích

hợp môi trƣờng Czapek nghèo vẫn tiếp tục đƣợc sử dụng và các nồng độ

DDT khác nhau đƣợc bổ sung vào bình nuôi cấy. Sinh khối nấm đƣợc sấy khô

đến khối lƣợng không đổi và cân bằng cân phân tích sau 7 ngày nuôi cấy. Kết

quả cho thấy ở các nồng độ lần lƣợt là 50, 100, 200, 300 ppm chủng FNA1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 69

đều sinh trƣởng tốt, sự chênh lệch khối lƣợng khô và hoạt tính laccase không

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

nhiều, dao động trong khoảng 6 - 7 U/l. Tuy nhiên ở nồng độ 200 ppm DDT chủng FNA1 phát triển tốt hơn ( Hình 3.10).

Hình 3.10 Ảnh hƣởng của nồng độ DDT lên khả năng sinh trƣởng của FNA1

50 ppm 100 ppm 200 ppm 300 ppm

4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ glucose

Để tìm hiểu chủng FNA1 chuyển hóa chất độc theo cơ chế nào, đồng

trao đổi chất hay sử dụng DDT làm nguồn carbon và năng lƣợng duy nhất,

glucose đã đƣợc sử dụng để thực hiện nghiên cứu này. Sau 5 ngày nuôi cấy

FNA1 trên môi trƣờng muối khoáng chứa 200 ppm DDT và glucose ở các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 70

nồng độ khác nhau kết quả đƣợc trình bày trong hình 23. Ở nồng độ glucose 0

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

% chủng FNA1 hoàn toàn không phát triển, 0,1 % phát triển yếu, nồng độ

glucose càng cao thì FNA1 phát triển càng mạnh và màu môi trƣờng thay đổi

càng rõ rệt dần chuyển sang mầu nâu đỏ (Hình 3.11). Kết quả này chứng tỏ

chủng FNA1 phân hủy DDT theo cơ chế đồng trao đổi chất, sử dụng cả 2

nguồn carbon là đƣờng và chất độc DDT, đây là cơ chế phổ biến ở các vi sinh

vật phân hủy chất độc. Trong khi đó chủng nấm Aspergillus sp.FNA33 đƣợc

phân lập từ cùng vùng ô nhiễm có thể phát triển trên môi trƣờng muối khoáng

không bổ sung glucose hay nguồn carbon khác ngoài chất độc là HCH.

Dịch nuôi cấy sau 5 ngày đƣợc sử dụng để xác định hoạt tính laccase,

kết quả trình bày tại hình 3.12. Hoạt tính đạt cao nhất là 7,47 U/l ở 0,1 %

glucose và giảm dần khi nồng độ glucose tăng. Trong dải nồng độ khảo sát thì

chủng FNA1 phát triển tốt nhất ở nồng độ 3% glucose nhƣng tại đây không

phát hiện đƣợc laccase (Hình 3.12). Để giải thích và chứng mình đặc điểm

này cần nhiều nghiên cứu khác nhƣ động thái sinh tổng hợp laccase ở các

nồng độ glucose khác nhau và cơ chế trao đổi chất .v.v nhƣng do thời gian và

điều kiện không cho phép nên thí nghiệm dừng ở bƣớc đầu khảo sát nhƣ trên.

0 0.1

0.5

1

2

3

Glucose (%)

Hình 3.11 Ảnh hƣởng của nồng độ glucose lên khả năng sinh trƣởng của FNA1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 71

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 3.12 Ảnh hƣởng của nồng độ glucose lên khả năng sinh laccase của FNA1

4.3 Ảnh hưởng của các chất cảm ứng

4.3.1 Guaiacol, veratyl alcohol, CuSO4

Khả năng sinh laccase bởi nấm sợi ngoài sự phụ thuộc vào các yếu tố

nhƣ nhiệt độ, pH, thành phân môi trƣờng, thờ i gian nuôi c ấy .v.v còn phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt và nồng độ các chất cảm ứng nhƣ Cu2+, veratryl

alcohol (VA), gallic acid, guaiacol, catechol, hydroxybenzoic acid, vanillin

.v.v [43]. Ba loại chất cảm ứng là guaiacol (0,01 %), CuSO4 (1 mM) và VA (1

%) đã đƣợc lựa chọn để khảo sát ảnh hƣởng của chúng lên khả năng sinh tổng

hợp laccase. Vẫn sử dụng môi trƣờng Czapek nghèo và dịch nuôi cấy sau 5

ngày để xác định hoạt tính enzyme. Kết quả cho thấy môi trƣờng có bổ sung

thêm chất cảm ứng hoạt tính laccase tăng không đáng kể so với môi trƣờng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 72

không bổ sung, môi trƣờng có chƣa CuSO4 đạt cao nhất là 11,04 U/l (Hình

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

3.13). Các chất cảm ứng này có thể không phải là chất cảm ứng sinh laccase

phù hợp với chủng nấm sợi FNA1, với mỗi chủng giống khác nhau thì chất

cảm ứng thích hợp và nồng độ tối ƣu của chất đó là không giống nhau, nhƣ

Trichoderma harzianum WL1 hoạt tính laccase đạt tới 4,36 U/ml sau 4 ngày

khi có bổ sung 1mM CuSO4, hoạt tính laccase của Trametes sp. AH28-2 đạt

cao nhất với cảm ứng O-toluidine 1 mM sau 72 giờ là 504 U/l trong khi với

Hình 3.13 Ảnh hƣởng của chất cảm ứng đến khả năng sinh laccase của FNA1

cảm ứng guaiacol 1 mM chỉ đạt 287 U/l [49,61].

4.3.2 Các chất ô nhiễm khác

Để tìm hiểu khả năng phát triển của chủng FNA1 trên các môi trƣờng

có mặt các chất ô nhiễm khó phân hủy khác ngoài DDT nhƣ 2,4-D, 2,4,5-T, 3

đại diện của PAH và đặc biệt là dịch chiết đất chứa 2,3,7,8-TCDD đã đƣợc sử

dụng để đánh giá. Kết quả sau 5 ngày nuôi cấy đƣợc trình bày ở hình 3.14 và

3.15. Trên tất cả các bình thí nghiệm chủng FNA1 đều sinh trƣởng phát triển

tốt, điều này chứng tỏ ngoài khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa nguồn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 73

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

carbon là DDT chủng nấm sợi này còn có thể sinh trƣởng đƣợc trong môi

trƣờng chứa các chất ô nhiễm khác. Chủng FNA1 có sử dụng các chất ô

nhiễm này làm nguồn carbon hay không cần tiếp tục nghiên cứu nhƣng bƣớc

đầu đã mở ra khả năng ứng dụng của chủng FNA1 trong xử lý các vùng ô

nhiễm khác không chỉ riêng vùng ô nhiễm DDT.

Cơ chất thƣờng đóng vai trò là chất cảm ứng cho quá trình sinh tổng

hợp một loại enzyme tƣơng ứng nào đó. Khi bổ sung cơ chất vào môi trƣờng

nuôi cấy có sự tác động đến khả năng sinh enzyme ngoại bào của FNA1,

trong môi trƣờng có chứa 2,4-D, 2,4,5-T, 3 đại diện của PAH và dịch chiết

hoàn toàn không phát hiện thấy sự có mặt của laccase, chỉ trong môi trƣờng

chứa DDT là có sự sinh tổng hợp laccase. Đây là đặc tính khá đặc hiệu, chủng

nấm sợi này chỉ tạo laccase khi có mặt của DDT và DDT chính là chất cảm

ứng để chủng nấm này sinh tổng hợp laccase.

2,4-D 2,4,5-T DDT pyren anthracene phenanthren dịch chiết

Hình 3.14 Ảnh hƣởng của các chất độc khác nhau lên sự sinh trƣởng của FNA1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 74

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 3.15 Khối lƣợng khô sinh khối trên các nguồn chất ô nhiễm khác nhau

4.4 Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt

Đối với đất bị nhiễm độc, đặc biệt là ô nhiễm DDT các chất hoạt động

bề mặt đóng vai trò quan trọng nhƣ giảm độc tố do các chất độc gây lên. Các

chất hoạt động bề mặt làm tăng khả năng sẵn sàng phân hủy sinh học của các

chất thuộc POPs, và DDT cũng là một trong 12 chất POPs. Quá trình phân

hủy sinh học DDT có thể tăng lên khi bổ sung tỷ lệ hợp lý chất hoạt động bề

mặt sinh học. Ví dụ sử dụng enzyme MnP và Lac để xử lý methoxychlor

(MC-một loại thuốc trừ sâu đƣợc sự dụng khá rộng rãi) với sự kết hợp lần

lƣợt của Tween 80 và 1-hydroxybenzotriazole (HBT) đã chuyển đổi MC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 75

thành olefin methoxychlor (MCO) và 4,4 '-dimethoxybenzophenone. Trong

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

trƣờng hợp kết hợp MnP và Tween 80 sau 24 giờ xử lý 65 % MC đã bị loại

bỏ [27].

Do vậy để khử độc môi trƣờng bị ô nhiễm với nguồn nguyên liệu rẻ

tiền nghiên cứu ảnh hƣởng của chất hoạt động bề mặt nhƣ tween 80 và nƣớc

quả bồ kết lên khả năng sinh trƣởng và sinh laccase của chủng FNA1 đã đƣợc

tiến hành. Kết quả cho thấy FNA1 đều phát triển tốt trên 2 loại chất hoạt động

bề mặt này nhƣng khả năng sinh enzyme thì hoàn toàn khác nhau (Hình 3.16).

Trên môi trƣờng có bổ sung bồ kết lƣợng laccase sinh ra không đáng kể, trong

khi bổ sung tween 80 hoạt tính laccase đo đƣợc lên đến 2608,33 U/l sau 1

ngày. Hoạt tính laccase của chủng FNA1 là khá cao so với 1 vài chủng khác

nhƣ chủng Marasmius quercophilus có hoạt tính laccase cao nhất là 0,8 U/ml

sau 5 ngày nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung 0,1 % Tween 80 và đồng

Hình 3.16 Ảnh hƣởng của chất hoạt động bề mặt lên khả năng sinh

laccase của FNA1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 76

[50].

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Kết quả trên cho thây môi trƣờng Czapek có bổ sung 0,2 % Tween 80

là môi trƣờng nấm sợi FNA1 cho hoạt tính laccase cao, và môi trƣờng này đã

đƣợc sử dụng để tiếp tục tìm hiểu động thái sinh tổng hợp laccase của chủng

FNA1. Thí nghiệm đƣợc theo dõi trong 10 ngày, kết quả trình bày trong hình

3.17. Hoạt tính laccase đạt cao nhất sau 1 ngày nuôi cấy và giảm mạnh ở các

Hình 3.17 Động thái sinh tổng hợp laccase

ngày sau đó.

4.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitơ và môi trường thay thế

4.5.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon

Việc sử dụng một số nguồn carbon thay thế saccharose trong môi

trƣờng Czapek nghèo cho thấy nguồn carbon thích hợp nhất cho sinh tổng

hợp enzyme của chủng FNA1 vẫn là saccharose, tiếp theo là glucose đạt 40 %

so với nguồn carbon là sacchrose. Trên các nguồn carbon khác chủng FNA1

vẫn có khả năng sinh laccase nhƣng hoạt tính laccase rất thấp (Hình 3.19), Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 77

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

khác với một số chủng khác đã đƣợc công bố nhƣ Trichoderma viride và

Trichoderma longibrachiatum đều có khả năng sinh tổng hợp laccase rất tốt

trên cả 3 nguồn carbon là glucose, saccharose và CM-cellulose [22].

Trong khi đó khả năng sinh trƣởng của FNA1 cũng rất khác nhau,

chủng này phát triển tạo sinh khối yếu trên các nguồn carbon nhƣ lactose,

cellulose và dịch chiết khoai tây. Nguồn carbon thich hợp nhất cho FNA1

phát triển là saccharose, glucose và cao malt (Hình 3.18).

Glucose saccharose lactose tinh bột cellulose khoai tây cao

malt

Hình 3.18 Ảnh hƣởng của nguồn carbon lên khả năng sinh trƣởng của FNA1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 78

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 3.19 Ảnh hƣởng của nguồn carbon lên khả năng sinh laccase của FNA1

4.5.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Tƣơng tự nhƣ nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn carbon lên sinh trƣởng

và sinh tổng hợp laccase của FNA1, để nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn nitơ

môi trƣờng Czapek nghèo vẫn đƣợc sử dụng và thay thế nguồn nitơ trong môi

trƣờng bằng các nguồn khác. Kết quả cho thấy trên nguồn urê chủng FNA1

phát triển yếu và phát triển tốt trên các nguồn còn lại (Hình 3.20). Lƣợng sinh

khối lớn trên các nguồn cao thịt, cao men và bột đậu tƣơng không đồng nghĩa

với khả năng sinh tổng hợp laccase tốt, trên các nguồn nitơ này hoạt tính

laccase rất thấp và giao động trong khoảng 1 U/l (Hình 3.21). Chủng FNA1

sinh trƣởng và sinh tổng hợp laccase tốt nhất trên môi trƣờng Czapek nghèo

vơi nguồn nitơ vô cơ là NaNO3 và KNO3 khác với đa số chủng nấm sinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 79

laccase thích hợp với nguồn nitơ hữu cơ nhƣ Pleurotus ostreatus 32,

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Trametes pubescens MB 89 thích hợp với peptone, Agaricus bisporus,

Trametes versicolor thích hợp với nguồn cao malt v.v. [16,18,28,46].

Urê NH4NO3 Czapek nghèo cao men cao thịt bột đậu tƣơng

Hình 3.20 Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh trƣởng của FNA1

Hình 3.21 Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh laccase của FNA1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 80

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

4.5.3 Ảnh hưởng của môi trường thay thế

Để lựa chọn môi trƣờng thích hợp cho sản xuất laccase với lƣợng lơn

chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với các môi trƣờng MEG, YS, PG và SG

(thành phân nhƣ đƣợc mô tả trong phần phƣơng pháp). Kết quả cho thấy

chủng FNA1 phát triển rất tốt trên cả 4 loại môi trƣờng này nhƣng hoạt tính

laccase đạt cao nhất trên môi trƣờng SG (21,3 U/l) (Hình 3.22). Môi trƣờng

SG là môi trƣờng có thành phân chủ yếu là bột đậu tƣơng, đây là điều thuận

lợi vì là nguồn nguyên liệu sẵn có và rẻ tiền, có thể áp dụng trên quy mô lớn

để sản xuất lƣợng lớn enzyme. Một số chủng nấm và xạ khuẩn trên thế giới

cũng sử dụng môi trƣờng có thành phần chính là đậu tƣơng để sản xuất

laccase với lƣợng lớn nhƣ Peniophora sp, Pleurotus, Trametes versicolor, Coprinopsis cinerea, Fomes sclerodermeus và Streptomyces cyaneus CECT

3335 v.v. [19,37].

Dựa trên kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất hoạt động bề mặt,

Tween 80 đƣợc bổ sung vào môi trƣờng SG. Tuy nhiên trên môi trƣờng có

bột đậu tƣơng hoạt tính laccase không tăng lên nhƣ trên môi trƣờng Czapek

nghèo. Vậy đối với chủng nấm sợi FNA1 môi trƣờng thích hợp nhất để sản

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 81

xuất laccase với lƣợng lớn là môi trƣờng Czapek nghèo có bổ sung Tween 80.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 3.22 Ảnh hƣởng của môi trƣờng thay thế đến khả năng sinh

laccase của FNA1

5 MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA LACCASE THÔ

5.1 pH tối ưu và độ bền pH

5.1.1 pH tối ưu

Đô pH môi trƣờng ảnh hƣớng rất lớn đến vận tốc phản ứng enzyme.

Bởi pH ảnh hƣởng đến trạng thái ion hóa các gốc R của các gốc axit amin

trong phân tử enzyme, ion hóa các nhóm chức trong trung tâm hoạt động và

ion hóa cơ chất. Để tìm ra khoảng pH tối ƣu cho hoạt động của laccase từ

chủng FNA1 hoạt tính enzyme đã đƣợc xác định thông qua việc sử dụng dịch

lên men chủng FNA1 trong môi trƣờng Czapek nghèo có bổ sung 0,2 %

Tween 80 và các đệm có pH khác nhau. Trên hình 3.23 thể hiện kết quả định

tính, hoạt tính laccase đƣợc thể hiện thông qua mức độ xanh đậm hay nhạt của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 82

sản phẩm tạo thành do ABTS bị oxy hóa. Enzyme do FNA1 sinh ra hoạt động

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

xúc tác phản ứng mạnh nhất trong khoảng pH rất thấp từ pH 1 – 2. Kết quả

xác định hoạt tính trong hình 3.24 thể hiện rõ hơn kết luận trên, laccase này

hoạt động ở khoảng pH 1,5 là thích hợp nhất, tại đây hoạt tính laccase đo

đƣợc lên đến 2802,8 U/l. Laccase của chủng FNA1 có thể hoạt động trong

khoảng pH thấp nhƣ trên là một đặc tính rất quý vì trong công nghệ xử lý môi

trƣờng có rất nhiều nguồn ô nhiễm có điều kiện khắc nghiệt nhƣ pH rất thấp

hoặc rất cao. pH hoạt động tối ƣu của laccase từ chủng này là thấp hơn so với

một số chủng nấm khác nhƣ Trametes trogii, Trametes versicolor,

Melacarpus albomyces, Marasmius quercophilus .v.v, pH hoạ t độ ng tố i ƣu

của laccase từ các chủng nói trên lầ n lƣợ t là pH 2; 3; 3,5 và 4,5 [39].

Hình 3.23 pH tối ƣu của laccase từ chủng FNA1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 83

pH 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 3.24 Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính của laccase từ chủng FNA1

5.1.2 Độ bền pH

Do pH môi trƣờng có ảnh hƣởng đến độ bền của protein cho nên việc

xác định độ bền pH của enzyme có ý nghĩa quan trọng trong quá trình thu

nhận, tinh sạch, nghiên cứu và bảo quản enzyme. Laccase thô của FNA1 bền

ở khoảng pH 4 – 5 (Hình 3.25), khoảng pH bền này khá thấp so với một số

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 84

chủng nấm đảm khác nhƣ nấm đảm Sclerotium rolfsii chỉ còn 50 % hoạt tính khi đƣợ c ủ ở pH 5,0 và 30 0C trong vò ng 65 phút [33].

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 3.25 Độ bền pH của laccase từ chủng FNA1

5.2 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của laccase và độ bền nhiệt

5.2.1 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của laccase

Nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của laccase đƣợc xác định qua việc đo hoạt độ enzyme ở các nhiệt độ phản ứng khác nhau từ nhiệt độ phòng (32oC) đến 90 oC. Kết quả trên hình 3.26 cho thấy khi nhiệt độ tăng dần từ 32 oC đến 50 oC hoạt tính laccase cũng tăng dần từ 53,4 % (1354,2 U/l) đến 100%, nhiệt độ thích hợp nhất cho laccase hoạt động khoảng 50 oC (2732 U/l) và giảm nhẹ khi nhiệt độ tăng lên 60 oC. Ở 90 oC enzyme vẫn còn khả năng hoạt động

nhƣng hoạt tính giảm mạnh chỉ còn 35,7 % (905,1 U/l). Nhiệt độ thích hợp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 85

cho hoạt động của laccase từ nấm sợi FNA1 thấp hơn so với 1 số chủng nấm đảm khác nhƣ Pycnoporus sanguineus là 55 oC, 3 loại laccase của C. micaceus là pool 1; pool 2; pool 3 tƣơng ứng là 65, 60, 65 oC [33].

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 3.26 Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính laccase từ chủng FNA1

5.2.2 Độ bền nhiệt

Do bản chất hóa học của enzyme là protein nên dƣới ảnh hƣởng của

nhiệt độ, enzyme đều bị biến tính ít nhiều và ảnh hƣởng tới hoạt độ, mức độ

ảnh hƣởng tùy thuộc vào nhiệt độ và thời gian ủ enzyme. Để xác định khoảng

nhiệt độ bền của laccase từ FNA1 dịch enzyme thô đƣợc ủ ở các nhiệt độ 50, 60, 80, và 90 oC, hoạt tính enzyme đƣợc xác định sau các khoảng thời gian nhất định. Laccase thô của FNA1 bền nhiệt ở khoảng nhiệt độ dƣới 50 oC. Khi xử lý enzyme ở 60 oC sau 40 phút hoạt tính laccase giảm còn một nửa so với ban đầu (Hình 3.27), thời gian này là 200 phút đối với laccase của P.

sanguineus và dƣới 5 phút đối với các laccase của C. micaceus khi xử lý ở 65 oC. Xử lý ở nhiệt độ cao 80 và 90 oC hoạt tính enzyme sau 10 phút đã giảm

mạnh xuống khoảng 50 % hoạt tính ban đầu và duy trì ổn định trong thời gian

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 86

ủ tiếp theo [33].

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 3.27 Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền laccase từ FNA1

6 PHÂN LOẠI CHỦNG NẤM SỢI FNA1 BẰNG PHƢƠNG PHÁP SO

SÁNH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN MÃ HÓA 18S rRNA

Hiện nay, phƣơng pháp sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên

cứu phân loại dựa vào trình tự đoạn gen mã hóa 18S rRNA đƣợc sử dụng rất

rộng rãi và kết quả phản ánh nhanh chóng và chính xác vị trí phân loại của

các chủng nấm sợi. Do đó chúng tôi tiến hành tách dòng gen mã hóa 18S

rRNA của chủng nấm sợi FNA1 để xác định và so sánh trình tự nucleotide

của chủng nấm này với các chủng nấm khác trên ngân hàng gen thế giới nhằm

phân loại định tên chủng này.

6.1 Tách chiết DNA tổng số

Để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo, việc thu đƣợc DNA tổng số

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 87

không bị đứt gãy, có độ tinh sạch cao là rất quan trọng. Kết quả điện di kiểm

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

tra trên gel agaroza 1% ở hình 3.28 cho thấy DNA tổng số thu đƣợc không bị

DNA tổng số

Hình 3.28 Điện di đồ sản phẩm tách DNA tổng số chủng FNA1

đứt gãy, băng gọn, sạch có thể đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

6.2 Nhân đoạn gen 18S rRNA bằng kỹ thuật PCR

Phản ứng PCR đƣợc tiến hành sử dụng DNA tổng số của chủng FNA1

làm sợi khuôn, cặp mồi đặc hiệu Fung5r và EF4f và chu trình nhiệt nhƣ đã

1 2

750bp

Khoảng 550bp

Hình 3.29 Sản phẩm PCR 18S rRNA chủng FNA1

Kênh 1: Marker 1kb, kênh 2: Sản phẩm PCR

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 88

nêu ở phần phƣơng pháp.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Sản phẩm PCR nhân đoạn gen 18S rRNA chủng FNA1 đƣợc kiểm tra

bằng điện di trên gel agaroza 1% (Hình 3.29). Kết quả này cho thấy, băng

của sản phẩm PCR là băng đơn, sắc nét và có kích thƣớc khoảng 550 bp phù

hợp với tính toán lý thuyết, chứng tỏ đoạn gen mong muốn có thể đã đƣợc

nhân lên đặc hiệu.

6.3 Tách dòng gen 18S rRNA trong vectơ pTZ57R/T

Sau khi thu đƣợc sản phẩm PCR, tiến hành gắn vào vectơ pTZ57R/T

nhờ enzym T4 ligase, và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli. Sau khi nuôi tĩnh qua đêm ở 37oC, trên đĩa biến nạp xuất hiện các khuẩn lạc trắng và khuẩn

lạc xanh xen kẽ (Hình 3.30). Một số khuẩn lạc trắng đƣợc lựa chọn để tiến

hành tách DNA plasmid. Sản phẩm DNA plasmid thu đƣợc ở các dòng chọn

lựa đƣợc điện di kiểm tra trên gel agaroza 1% (Hình 3.31), mẫu DNA plasmid

ở các kênh 1, 3 nằm ở vị trí cao hơn so với mẫu đối chứng có khả năng mang

sản phẩm mong muốn.

Để kiểm tra dòng plasmid lựa chọn có mang sản phẩm mong muốn hay

không, phản ứng PCR kiểm tra có sử dụng khuôn là DNA plasmid của các

dòng 1, 3 đã đƣợc thực hiện. Tại các kênh 1, 2 hình 3.32 xuất hiện băng DNA

có kích thƣớc khoảng 550bp, vậy có thể các dòng này đã mang sản phẩm

PCR mong muốn. Hai dòng này đã đƣợc lựa chọn để tách và làm sạch DNA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 89

plasmid với số lƣợng lớn phục vụ cho việc xác định trình tự (Hình 3.33).

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 3.30 Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli trên môi trƣờng LB chứa X-Gal sau khi biến

nạp vector pTZ57R/T

C 1 2 3

Hình 3.31 Phổ điện di sản phẩm tách DNA

plasmit

Kênh C: Đối chứng (khuẩn lạc màu xanh)

Kênh 1, 2, 3: DNA plasmit của các dòng khuẩn lạc màu trắng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 90

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

M 1 2

Hình 3.32 Sản phẩm PCR từ DNA plasmit với cặp mồi EF4f và fung5r

Kênh M: Marker 1kb Kênh 1, 2: Sản phẩm PCR kiểm tra dòng 1 và 3

1 2 C

Hình 3.33 DNA plasmit mang gen 18S rRNA của chủng FNA1

Kênh 1, 2: DNA plasmit sau khi làm sạch

Kênh C: Đối chứng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 91

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

6.4 So sánh trình tự đoạn gen mã hóa 18S rRNA của chủng FNA1

Trình tự đoạn gen 18S rRNA (534 nucleotid) của chủng FNA1 đã đƣợc

xác định, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.34. Trình tự đoạn gen mã hoá 18S

rRNA của chủng FNA1 đƣợc đăng ký trên Genbank với mã số GQ906535.

So sánh với các trình tự gen 18S rRNA của các chủng vi nấm đã công

bố trên các ngân hàng dữ liệu Genbank, EMBL cho thấy chủng FNA1 có mức

tƣơng đồng cao với các chủng vi nấm thuộc ngành nấm nang Ascomycetes,

ngành phụ Pezizomycotina, chi Aspergillus. Dựa trên cơ sở so sánh mức độ

tƣơng đồng một phần trình tự gen mã hóa 18S rRNA chủng FNA1 với một số

chủng vi nấm đại diện, sử dụng phần mềm Clustal X để xây dựng cây phát

sinh chủng loại để thấy rõ đƣợc mối quan hệ phát sinh chủng loại của chủng

nấm sợi FNA1(Hình 3.35).

Nhƣ vậy, dựa trên các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và so sánh

một phần trình tự gen mã hóa 18S rRNA của chủng FNA1 thì ch ủng này

GGAAGGGGTGTATTTATTAGATAATCTGTGCTCCTTCTTCGAGCTCCTTGGTGATTCATAA TAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTC GATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGA GAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCC CGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTAATTGGAAT GAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGG TAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGG TCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAACCT CATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGGACTTTTACA

Hình 3.34 Trình tự đoạn gen mã hóa 18S rRNA của chủng FNA1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 92

thuộc chi Aspergillus và đƣợ c đặ t tên là Aspergillus sp. FNA1.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 3.35 Cây phát sinh chủng loại của chủng Aspergillus sp. FNA1

Aspergillus sp. FNA1

Nấm thuộc chi Aspergillus có nhiều chủng có khả năng phân hủy

DDT hay các chất có cấu trúc tƣơng tự. Aspergillus conicus làm biến đổi

55,1% bis(4-chlorophenyl)acetic acid (DDA) thành các sản phẩm hòa tan

trong nƣớc chƣa xác định và chƣa chiết tách đƣợc. Aspergillus niger và

Penicillium brefeldianum chuyển hóa lần lƣợt 12,4 và 24,6% DDT thành

các sản phẩm không xác định và hòa tan trong nƣớc. Aspergillus niger Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 93

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

phân hủ y 4, 4’-dichlorobenzophenone (DBP) thành 4-chlorobenzophenone

và methylated 4-chlorobenzophenone [47]. Các minh chứng trên cho thấy

vai trò rấ t qua n trọ ng củ a nấ m sợ i , đặ c biệ t là cá c đạ i diệ n củ a chi

Aspergillus trong phân hủ y sinh họ c DDT và cá c sả n phẩ m trong chu trì nh

khoáng hóa DDT .

Trên cây phát sinh chủng loại cho thấy chủng Aspergillus sp. FNA1

có quan hệ gần gũi với một số chủng nhƣ Aspergillus sp. FNA4,

Aspergillus sp. FNA33, Aspergillus sp. FBH11, đây đều là các chủng có

khả năng phân hủy các chất thuộc POPs. Đặc biệt 2 chủng Aspergillus sp.

FNA4, Aspergillus sp. FNA33 là 2 chủng đƣợc phân lập cùng địa điểm ô

nhiễm với chủng FNA1, các chủng này có khả năng phân hủy lần lƣợt

94,48 % hỗn hợp DDT trong 14 ngày và 88 % HCH, trong khi chủng

FNA1 phân hủy 97,23 % DDT; 97,19 DDD; và 92,69 % DDE trong 7 ngày

nuôi cấy. Cả 3 chủng FNA4, FNA33 và FBH11 đều đƣợc mô tả là có khả

năng sinh laccase, chủng FNA4 sinh laccase với hoạt tính 15,4 U/l, chủng

FNA33 là 4,3 U/l [3,4,5], chủng FBH11 có độ tƣơng đồng 98 % đƣợc phân

lập từ đất ô nhiễm thuốc diệt cỏ/dioxin sinh laccase với hoạt tính cao. Mộ t

số chủng nấ m sợ i thu ộc chi Aspergillus đƣợc công bố là có khả năng sinh

enzyme ngoạ i bà o là Aspergillus terreus LD-1 và Aspergillus nidulans.

Chủng Aspergillus tereus sinh ra hai loạ i enzyme ngo ại bào là MnP và

Laccase trong điều kiện kiềm (pH từ 11 đến 12.5), hoạt tính enzyme trung

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 94

bình của hai loại enzyme này là 0,384 U/mg [40].

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

KẾT LUẬN

1. Dựa trên các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và so sánh một phần

trình tự gen mã hóa 18S rRNA, chủng nấm sợi FNA1 đƣợc xác định thuộc

chi Aspergillus và đƣợc đặt tên là Aspergillus sp. FNA1. Trình tự đoạn gen

mã hóa 18S rRNA của chủng Aspergillus sp. FNA1 đƣợc đăng ký trên

Genbank với mã số GQ906535.

2. Cả 3 chủng FNA1, FNA2 và FNA3 đều có khả năng sinh laccase và MnP,

chủng FNA1 không sinh LiP. Trên môi trƣờng sàng lọc, hoạt tính laccase

lần lƣợt là 5,4; 2,9; 3,3 (U/l), hoạt tính MnP lần lƣợt là 26,9; 6,05; 13,4

(U/l), hoạt tính LiP của FNA2 và FNA3 là 4,15 và 2,07 (U/l).

3. Aspergillus sp. FNA1 phân hủy DDT theo cơ chế đồng trao đổi chất, sau 7

ngày nuôi cấy chủng này loại bỏ DDE, DDD và DDT lần lƣợt là 92,69 %,

97,19 % và 97,23 % so với mẫu đối chứng.

4. Aspergillus sp. FNA1 phát triển tốt nhất ở 37oC, pH 5, nồng độ NaCl 0,1

%, nồng độ DDT 200 ppm, ngoài ra còn phát triển tốt trên môi trƣờng chứa

2,4-D, 2,4,5-T, pyren, phenanthren, anthracene và dịch chiết. Chủng FNA1

không phát triển trên nguồn carbon là lactose và cellulose, phát triển yếu

trên nguồn nitơ là urê.

5. Aspergillus sp. FNA1 sinh tổng hợp laccase trong điều kiện 30oC, pH 5,

nồng độ NaCl 0,1 %, glucose 0,1 %, CuSO4 1 mM và nguồn chất ô nhiễm

là DDT, nguồn carbon là saccharose, nguồn nitơ là NaNO3 và KNO3.

6. Môi trƣờng thích hợp nhất để Aspergillus sp. FNA1 sinh tổng hợp laccase

là môi trƣờng Czapek nghèo có bổ sung Tween 80 0,2 %, hoạt tính laccase

đạt 2608,3 U/l sau 1 ngày nuôi cấy.

7. Laccase từ chủng FNA1 có pH tối ƣu 1,5, nhiệt độ tối ƣu 50oC, bền trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 95

khoảng pH 4 – 5 và nhiệt độ dƣới 50 oC.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

KIẾN NGHỊ

1. Nghiên cứu các gen chức năng tham gia quá trình phân hủy DDT và gen

mã hóa laccase.

2. Nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học các loại thuốc trừ sâu khác của

chủng FNA1, đồng thời nghiên cứu khả năng sử dụng enzyme ngoại bào

trong việc loại bỏ thuốc nhuộm màu và phân hủy các chất ô nhiễm.

3. Tối ƣu các điều kiện lên men để sản xuất laccase với lƣợng lớn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 96

4. Tiếp tục nghiên cứu các đặc tính hóa sinh của laccase từ chủng FNA1.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trƣơng Nam Hải, Lê Quang Huấn, 2003. áp dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam. Nxb KH&KT Hà Nội: 325- 329

2. Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Đƣơng Nhã, Đặng Thị Cẩm Hà, 2004. Nấm sợi phân hủy hydrocarbon thơm đa nhân phân lập từ cặn dầu thô của giếng khai thác dầu, Vũng Tàu. Tạp chí Công nghệ Sinh học, số I(tập 2): 255- 264.

3. Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Thanh Thủy, Ngô Xuân Quý, Nghiêm Xuân Trƣờng, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2004) Khả năng phân hủy 2,4-D và dibenzofuran của chủng nấm sợi FDN20. Tạp chí công nghệ sinh học 2 (4): 517-528

4. Trần Thị Nhƣ Hòa, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2008), “Phân loại hai chủng vi sinh vật từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin khử độc trong bioreactor hiếu khí”, Tạp chí công nghệ sinh học, tập(số), trang.

5. Nghiêm Ngọc Minh, Vũ Mạnh Chiến, Đặng Thị Cẩm Hà (2006), “Nghiên cứu phân loại và khả năng sử dụng DDT của chủng XKNA21 đƣợc phân lập từ đất ô nhiễm DDT”, Tạp chí công nghệ sinh học, 4(2), 257-264

6. Nguyễn Nguyên Quang, Đặng Thị Cẩm Hà (2009), “Phân lập, phân loại và khả năng phân hủy DDT, DDD, DDE của một số chủng vi sinh vật”, Tạp chí công nghệ sinh học, đang in.

7. Mai Thanh Truyết. Ô nhiễm thuốc sát trùng: DDT.

8. Mai Thanh Truyết, Nguyễn Minh Quang. Phát triển và môi trường bền

vững ở Việt Nam.

Tài liệu Tiếng Anh

9. Adinarayana Kunamneni et al (2008), “Engineering and Application of

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 97

fungal laccase for organic synthesis”, Microbial Cell Factories.

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

10. Aislabie J, Davison A D, Boul H L, Franzmann P D, Jardine D R, and Karuso P (1999), “Isolation of Terrabacter sp. Strain DDE-1, Which metabolizes 1,1-dichloro-2,2-bis (4-chlorophenyl) ethylene when induced with biphenyl”, Appl and Environ Microbiol, 65, pp. 5607-561.

11. Andrea Zille (2005), Laccase reactions for textile applications, Doctor

thesis, University of Minho, Italia

12. Ben- Dyke R., Sanderson D., Noakes D., (1970), ”Acute toxicity data for

pesticides”, World Rev Pestic Cont, 9, pp.119- 127.

13. Bidleman T., Christensen E., Billings W. et al., (1981). Atmospheric transport of organochlorines in the North Atlantic gyre, J. Mar Res 39, pp.443- 464.

14. Bononi, V. L. R., Machado, K. M. G., Matheu, D. R. (2005), “Ligninolytic enzymes production and Remazol Brilliant Blue R decolorization by tropical Brazilian Basidiomycetes fungi”, Brazilian journal of microbiology 36, pp.246-252.

15. Bumpus and Aust (1987), “Biodegradation of DDT [1,1,1- trichloro - 2,2- bis (4-chlorophenyl) ethane] by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium”, Appl Environ Microbiol, 53(9), pp.2001–2008.

16. Christiane Galhaup, Harald Wagner Barbara, Hinterstoisser and Dietmar Haltrich (2002), “Increased production of laccase by the wood-degrading basidiomycete Trametes pubescens”, Enzyme and Microbial Technology, 30(4), pp.529-536.

17. Crawford, D.L. and Crawford, R.L. (1978), “Microbial degradation of lignocellulose the lignin component”, Appl. Env. Microbiol, 31(5), pp.714-717.

18. D. A. Wood (1980), “Production, Purification and Properties of Extracellular Laccase of Agaricus bisporus”, Journal of General Microbiology 117, pp.327-338.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 98

19. Gerd J. Mander, Huaming Wang, Elizabeth Bodie, Jens Wagner, Kay Vienken, Claudia Vinuesa, Caroline Foster, Abigail C. Leeder, Gethin Allen, Valerie Hamill, Giselle G. Janssen, Nigel Dunn-Coleman, Marvin Karos, Hans Georg Lemaire, Thomas Subkowski, Claus Bollschweiler,

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Geoffrey Turner, Bernhard Nüsslein, and Reinhard Fischer (2006), “Use of Laccase as a Novel, Versatile Reporter System in Filamentous Fungi”, Applied and Environmental Microbiology, 72(7), pp.5020-5026.

20. Giraud, Guiraud P., Kadri M., Blake G., Steiman S.,

(2001), “Biodegradation of phenanthrene and fluoranthene by fungi isolated from an experimental constructed wetland for wastewater treatment”, Wat. Res., 35(17), pp.4126-4136.

21. Gladys Alexandr, Igor B. Zhulin (2000), “Laccases are widespread in

bacteria”, Trend in Biotechnology, 18(2), pp.41-42.

22. Gochev, V. K., A. I. Krastanov (2007), “Isolation of Laccase Producing

Trichoderma Spp”, Bulg. J. Agric. Sci., 13, pp.171-176

23. Guarro Josep, Josepa Gene, và Alberto M. Stchigel. Developments in

Fungal Taxonomy. Unitat de Microbiologia Spain.

24. Hans E. Schoemaker, Klaus Piontek (1996), “On the interaction of lignin peroxidase with lignin”, Pure & Appl. Chem, 68(11), pp.2089-2096.

25. Harald Claus (2003), “Laccase and their occurrence in prokaryotes”,

Arch Microbiol, 179, pp.145-150.

26. Hestbjerg Helle, Willumsen Pia Arentsen, Christensen Mette, Andersen Ole and Jacobsen Carsten Suhr (2003), “Bioaugmentation of tar- contaminated soils under field conditions using Pleurotus ostreatus refuse from commercial mushroom production”. Environmental Toxicology and Chemistry 22(4), pp.692-98.

27. Hirofumi Hirai , Sawako Nakanishi, Tomoaki Nishida (2004), “Oxidative dechlorination of methoxychlor by ligninolytic enzymes from white-rot fungi”, Chemosphere, 55(4), pp.641-645

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 99

28. Hongman Hou, Jiti Zhou, Jing Wang, Cuihong Du, Bin Yan (2004), “Enhancement of laccase production by Pleurotus ostreatus and its use for the decolorization of anthraquinone dye”, Process Biochemistry, 39(11), pp.1415-1419

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

29. J.M. Aislabie, N.K.Richards, H.L.Boul (1997), “Microbial degradation of DDT and its residues- a review”, New Zealand Journal of Agricultural Research, pp.271- 275.

30. Jan D. V. E., Gabriela F. D., Anneke K. – W., Eric S (2000), “Analysis of the dynamics of fungal communities in soil via fungal – specific PCR of soil DNA followed by denaturing gradient gel electrophoresis”, Journal of Microbiological Methods, 43, pp.133 – 151.

31. Johnson B. Thomas and Jack O. Kennedy (1973), “Biomagnification of p, p'-DDT and Methoxychlor by Bacteria”, Appl Environ Microbiol, 26(1), pp.66-71.

32. José Renato P . Cavallazzi, Catarina M. Kasuya, Marcos A. Soares, (2005), “Screening of inducers for laccase production by Lentinula edodes in liquid medium”, Brazillan Journal of Microbiology 36, pp.383-387.

33. Kizhekkedathu Narayanan Niladevi, Parukuttyama Prema

(2005), “Mangrove Actinomyces as the source of Ligninolytic Enzymes” Actinomycestologica, 19, pp.40 –47.

34. Klaus Piontek, Matteo Antorini, Thomas Choinowski Crystal (2002), “Structure of a Laccase from the FungusTrametes versicolor at 1.90-Å Resolution Containing a Full Complement of Coppers”, The Journal of Biological Chemistry, 277,pp.37663-37669.

35. Laura-Leena Kiiskinen

(2005), “Characteration and heterologuos production of novel laccase from Melanocarpus albomyces”, Doctor Thesis, Helneski University of Technology.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

36. Lucier G.W., Trischer A. M., Van den Heuvel J.P., et al., (1992), “Organohalogen compounds: Extended abstracts of 12th Intern. Symp. On dioxins and related compounds”, Tampere: Finish Institute of occupational heath, 10, pp.3-6.

100

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

37. M. Enriqueta Arias, María Arenas, Juana Rodríguez, Juan Soliveri, Andrew S. Ball, and Manuel Hernández (2003), “Kraft Pulp Biobleaching and Mediated Oxidation of a Nonphenolic Substrate by Laccase from Streptomyces cyaneus CECT 3335”, Applied and Environmental Microbiology, 69(4), pp.1953-1958.

38. Marie-Francois Hullo, Ivan Moszer, Antoine Danchin and Isabelle Martin-verstraete (2001), “Cot A of Bacillus subtilis is a copper-depedent laccase”. Journal of Bacteriology, pp.5426-5430.

39. Marièlle Bar (2001), “Kinetics and physico-chemical properties ò white-

rot fungal laccases”, doctor thesis.

40. Mario Scherer, Reinhard Fischer (2001), “Molecular characterization of a blue-copper laccase, TILA, of Aspergillus nidulans”, FEMS Microbiology Letters, 199, pp.207-213.

41. Nadeau Lloyd J, Sayler Gary S and Spain J C (1998), “Oxidation of (DDT) by Alcaligenes

1,1,1-trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)ethane eutrophus A5”, Archives of Microbiology, 171(1), pp.44-49.

42. Nadeau, L. J.; Menn, F- M.; Breen, A.; Sayler, G.S., (1994). “Aerobic degradation of DDT by Alcaligenes eutrophus A5”, Applied and environmental microbiology 60: 51- 55.

43. O. V. Morozova, G. P. Shumakovich, M. A. Gorbacheva, S. V. Shleev, and A. I. Yaropolov (2007), ““Blue” Laccases”, Biochemistry (Moscow), 72(10), pp.1136-1150.

44. P. Sharma, R. Goel, N. Capalash (2007), “Bacterial laccase”, World J

Microbiol Biotechnol, 23, pp.823-832.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

45. Pereira W., Domagalski J., Hostettler F., et al., (1996), “Occurrence and accumulation of pesticides and organic contaminants in river sediment, water and clam tissues from the San Joaquin River and tributaries, California”, Environ Toxicol Chem, 15(2), pp.172- 180.

101

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

46. PJ Collins, MJJ Kotterman, JA Field and ADW Dobson (1996), “Oxidation of Anthracene and Benzo[a]pyrene by Laccases from Trametes versicolor”, Appl. Environ. Microbiol.,62(12), pp.4563-4567.

47. R V Subba-Rao and M Alexander (1985) “Bacterial and fungal cometabolism of 1,1,1-trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)ethane (DDT) and its breakdown products”, Applied and Environmental Microbiology 49(3), pp.509-516.

48. Rochkind- Dubinsky, M.L.; Sayler, G.S.; Blackburn, J.W., 1987. Microbiological decomposition of chlorinated aromatic compounds. Microbiology series, vol. 18, New York, Marcel Dekker: pp. 153- 162.

49. S. Sadhasivam, S. Savitha, K. Swaminathan, Feng-Huei Lin (2008), “Production, purification and characterization of mid-redox potential laccase from a newly isolated Trichoderma harzianum WL1”, Process Biochemistry 43, pp.736–742.

50. S. Tagger, C. Périssol, G. Gil, G. Vogt and J. Le Petit (1998) “Phenoloxidases of the white-rot fungus Marasmius quercophilus isolated from an evergreen oak litter (Quercus ilex L.)”, Enzyme and Microbial Technology, 23(6), pp.372-379.

51. Sambrook J., Russell D.W. (2001), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

52. Sergio Riva (2006), “Laccases: Blue enzymes for green chemistry”,

Trends in Biotechnology, 24(5), pp.219-226.

53. Shah, M. M.; Barr, D. P.; Chung, N.; Aust S.D., (1992),“ Use of white rot fungi for the degradation of environmental cheicals”, Toxicology letters, 64/65, pp.493- 501.

54. Staples C., Werner A., Hoogheem T., (1985) “Assessment of priority pollutant concentrations in the United States using STORET database”, Environ Toxicol Chem 4, pp.131- 142.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

55. Susana Rodríguez Couto and José Luis Toca-Herrera (2009), “Lacasses in the textile industry”, Biotechnology and Molecular Biology Reviews, 1(4), pp.115-120.

102

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

56. Tereza Skálová et al, (2009), “The structure of small laccase from streptomyces coelicolor reveals a link between laccase and nitrite reductases”, Journal of Molecular Biotechnology, 385, pp.1165-1178.

57. The Use and Effectiveness of Phytoremediation to Treat Persistent Organic Pollutants (2005), Kristi Russell Environmental Careers Organization.

58. Timothy P.Ruggaber, (2006),

“Enhancing Jeffrey W. Talley Bioremediation with enzymatic Processes”, Practice periodical of hazardous, toxic, and radioactive waste management.

59. Toxicology profile for DDT, DDE, DDD, pp. 1- 231.

60. Xiaohu Shao et al (2009), “Deletion and site-directed mutagnesis of laccase from Shigella dysenteriae results in enhanced enzymatic activity and thermostability”, Enzyme and Microbial Technology, 44, pp.274-280.

61. Y. Z. Xiao, Q. Chen, J. Hang, Y. Y. Shi1, Y. Z. Xiao, J. Wu, Y. Z. Hong, Y. P. Wang (2004), “Selective induction, purification and characterization of a laccase isozyme genes from Trametes sp. AH28-2 and analyses of their differential expression”, Applied Microbiology and Biotechnology 71, pp.493-501.

62. Yi Huang, Xi Zhao and Shengji Luan (2007), “Uptake and biodegradation of DDT by 4 ectomycorrhizal fungi”, Sicence of the total enviroment 358, pp.235-241.

63. Zaidi R., Baquar. And Imam H. S., (1999), “Factors affecting microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocacbon phenanthrene in the Caribbean coastal water”, Marine Pollution Bulletin, 38, pp.737- 742.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 103

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Đặc tính lý - hóa một số đồng phân của DDT

Đặc tính

p,p,-DDT

p,p,-DDE

p,p,-DDD

o,p,- DDT

o,p,-DDE

o,p-DDD

Khối

lƣợng

354.5

318.03

320.05

354.49

318.03

320.05

phân tử

Màu

ND

ND

Tinh thể bé,bột trắng

Tinh thể bé, bột trắng

Tinh thể bé, bột trắng

Tinh thể bé, bột trắng

Trạng

Rắn

Rắn

Rắn

Rắn

Rắn

ND

thái vật lý

Nhiệt độ

Phân hủy

336 0C

3500C

ND

ND

ND

sôi

Khối lƣợng

0.98-0.99

ND

1.385

0.98-0.99

ND

ND

riêng d(g/cm3)

Mùi

Nhẹ

ND

ND

ND

ND

ND

Độ tan

ND

ND

0.025mg/l (250C)

0.085mg/l (250C)

0.14mg/l (250C)

0.1mg/l (25 0C)

trong nƣớc

Độ tan

trong dung

ND

ND

ND

môi hữu cơ

Ít tan trong etanol, tan tốt trong etylete và acetone

Tan trong etanol, iso octan, cacbon- tetraclorit

Tan tốt trong chất béo và các dung môi hữu cơ khác

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

104

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Áp suất

1.6x10-7 200C,torr

6x10-6 250C,torr

1.35x106 25 0C,torr

1.1x10-7 20 0C,torr

6.2x10-6 250C,torr

1.94x106 30 0C,torr

bay hơi

Phụ lục 2. Các vi sinh vật sử dụng DDT

Vi khuẩn

Nấm

Xạ khuẩn

Nocardia .sp

Streptomyces aureofaciens

Alcaligenes eutrophus A5

Phanerochaete

Streptomyces

Arthrobacter. Sp

chrysosporium

viridochromogenes

Bacillus. Sp

Trichoderma viridae

Streptomyces annamoneus

Cylindrotheca closterium

Sacharomyces cerevisiae

Streptomyces chromofuscus

Enterobacter aerogenes

Fusarium solami

Enterobacter cloacae

Aspergillus conicus

Eschrichia coli

Aspergillus niger

Klebsiella pneumoneae

Leccinum scabrum

Klebsiella pneumoniae

Gloeophyllum trabeum

Pseudomonas putida

Penicillium brefeldianum

Phụ lục 3. Vi sinh vật sinh laccase

Nấm đảm

Nấm sợi

Xạ khuẩn

Vi khuẩn

Phanerochaete

Melanocarpus

Streptomyces

Bacillus

chrysosporium

albomyces

lavendulae

licheniformis

Pycnoporus

Fusarium

Streptomyces

Bacillus

cinnabarinus

oxysporum

psammoticus

halodurans

Rhizotonia solani

Aspergillus nidulans Streptomyces

Thermus

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

105

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

viridosporus

thermophilus

Trametes villosa

Trichoderma

Streptomyces

Escherichia coli

harzianum

coelicolor

Trametes versicolor Aspergillus niger

Bacillus subtilis

Pleurotus ostreatus

Aspergillus terreus

Lentinula edodes

Pholiota spp.

Agaricus bisporus

Peniophora spp.

Botrytis cinerea

Mauginiella sp.

Phụ lục 4. Gene mã hóa laccase

Tên gene

Tên chủng

Tên chủng

Tên gene laccase

laccase

Bacillus subtilis

cotA

Basidiomycete PM1

lac1

Ceriporiopsis

Ics-1

Podospora anserina

lac2

subvermispora

Coprinus cinereus

lcc1

Populus euramericana

lac90

Cryptococcus

CNLAC1

Rhizoctonia solani

lcc4

neoformans

Gaeumannomyces

LAC2

Trametes pubescens

lap2

graminis var. tritici

Marasmius

lac1

Trametes trogii

lcc1

quercophilus

Myceliophthora

lcc1

Trametes versicolor

lccI

thermophila

lcc2

Neurospora crassa

SalI

Trametes versicolor

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

106

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Phlebia radiata

lac1

Trametes villosa

lcc1

Pleurotus ostreatus

poxa1b

Trametes villosa

lcc2

Pleurotus ostreatus

Poxc

Poxb

Streptomyces lavendulae

Phụ lục 5. Một số kỹ thuật phân loại hiện đại

Thành phần tế bào

Phƣơng pháp phân tích

Thành phần Bazơ (%G+C)

Phạm vi phân loại Chi

Biến tính DNA : DNA

Loài

DNA nhiễm sắc thể

Các phần DNA đƣợc cắt bằng enzym giới hạn

Loài và dƣới loài

Đa hình chiều dài các đoạn giới hạn của RNA riboxom

Trình tự nucleotit

RNA riboxom

Loài, chi và trên chi

Lai DNA : rRNA

Trình tự axit amin

Loài, chi và trên chi

Loài và chi

Protein

So sánh bằng phản ứng huyết thanh Các kiểu điện di

Điện di enzym đa vị trí

Các dòng trong loài

Thành tế bào

Loài và chi

Cấu trúc peptidoglucan Polysaccharid Axít teichoic Axít béo Lipid phân cực

Màng

Axít mycolic

Loài và chi

Isoprenoid quinones

Axít béo

Loài và chi

Các sản phẩm trao đổi chất

Loài và dƣới loài

Toàn bộ tế bào

Sắc kí lỏng pyrolysis Pyrolsis khối phổ

Phụ lục 6. Xác định hoạt tính LiP, MnP Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

107

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Xác định hoạt tính enzyme LiP

Thành phần phản ứng:

Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm

500 µl

500 µl

50 µl 200 µl 200µl 50 µl 0 µl

Thành phần phản ứng Đệm kali phosphate PPB (50 mM, pH = 7) 4-aminoantipyrine, 0,164 mM 2,4-DCP 3 mM Dịch enzyme H2O2 4 mM Nƣớc khử ion

50 µl 200 µl 200 µl 0 µl 50 µl

Phản ứng diễn ra khi cho H2O2 vào hỗn hợp, giá trị OD đo sau 1 phút.

Công thức tính:

Trong đó:

ε: hệ số hấp thụ, ε510 = 21647 M-1cm-1

U: Hoạt độ enzym (U/l) Vpu: Tổng thể tích phản ứng (1 ml) VE: Thể tích enzyme (0,2 ml) ODM: Giá trị OD đo đƣợc của mẫu thí nghiệm ODC: Giá trị OD đo đƣợc của mẫu đối chứng Df: Độ pha loãng

Thành phần phản ứng:

Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm

3 ml

3 ml

Thành phần phản ứng Đệm kali phosphate PPB (100 mM, pH = 7) MnSO4 0,1 mM Phenol đỏ 0,1 mM Dịch enzyme H2O2 50 mM Nƣớc khử ion

200 µl 300 µl 1 ml 0 µl 500 µl

200 µl 300 µl 1 ml 500 µl 0 µl

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Xác định hoạt tính MnP

108

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Phản ứng diễn ra khi cho H2O2 vào hỗn hợp, sau 1 phút 30 giây dừng phản ứng bằng cách cho 40 µl NaOH 5M vào 1 ml mẫu, xác định giá trị OD ở bƣớc sóng 610 nm.

Công thức tính:

Trong đó: U: Hoạt độ enzyme (U/l)

ε: hệ số hấp thụ, ε610 = 4460 M-1cm-1 Vpu: Tổng thể tích phản ứng (5 ml) VE: Thể tích enzyme (1 ml) ODM: Giá trị OD đo đƣợc của mẫu thí nghiệm ODC: Giá trị OD đo đƣợc của mẫu đối chứng Df: Độ pha loãng

Phụ lục 7. Phƣơng pháp chiết dịch chiết từ đất ô nhiễm

Cân khoảng 10g đất nhiễm chất độc hóa học (1,5DN5) thu nhận từ sân bay Đà Nẵng đã đƣợc làm khô vào bình tam giác, bổ sung 15g Na2SO4 để tiếp tục làm khô mẫu. Sau khi mẫu khô hoàn toàn bổ sung 45ml dung môi Methanol : Toluen = 1 : 4 để chất độc khuếch tán ra ngoài, siêu âm mẫu đất 30 phút, đậy nắp và lắc 2 giờ hoặc hơn, sau đó để lắng, ly tâm tách dịch, bổ sung H2SO4 với tỉ lệ 1 : 1 về thể tích so với tổng thể tích dung dịch trên để oxy hóa. Khi dung dịch tách làm hai pha thì dùng phễu chiết để lấy pha trên và bảo quản trong lọ tối màu.

Phụ lục 8. Quy trình biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào E. coli

Các bƣớc thực hiện theo quy trình và hóa chất của “PCR cloning kit” hãng

Fermentas.

Chuẩn bị tế bào khả biến và môi trường nuôi cấy:

Ngày trước biến nạp: Nuôi 1 khuẩn lạc vi khuẩn E.coli (bất kì chủng nào)

trong môi trƣờng C, lắc 37oC qua đêm.

Ngày biến nạp: Làm ấm môi trƣờng C trong tube ở 37oC ít nhất 20 phút và làm ấm đĩa thạch LB có bổ sung kháng sinh ampicilin (100 µl/ml) ở 37oC ít nhất 20 phút trƣớc khi gạt.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

109

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Quy trình biến nạp:

Bƣớc 1: Bổ sung 150 µl dịch nuôi qua đêm vào 1,5 ml môi trƣờng C đã làm

ấm. Lắc ở 37 oC trong 20 phút.

Bƣớc 2: Ly tâm 6000 vòng trong 4 phút ở 4 oC, loại dịch nổi

Bƣớc 3: Trộn đều tế bào trong 300 µl dung dịch T. Ủ 5 phút trong đá.

Bƣớc 4: Ly tâm 6000 vòng trong 4 phút ở 4 oC, loại dịch nổi

Bƣớc 5: Trộn đều tế bào trong 120 µl dung dịch T. Ủ 5 phút trong đá.

Bƣớc 6: Lấy 2,5 µl sản phẩm ligation vào ống mới làm lạnh trong đá 2 phút.

Bƣớc 7: Bổ sung 50 µl tế bào đã chuẩn bị vào ống chứa sản phẩm ligation trên,

ủ trong đá 5 phút

Bƣớc 8: Gạt ngay ra đĩa LB-ampicillin, có bổ sung thêm X-gal và IPTG. Ủ 37

oC qua đêm.

Phụ lục 9. Hoạt tính laccase

Ảnh hƣởng của nhiệt độ

28

30

37

42

Nhiệt độ (oC)

7

12.2

10.7

1.3

Hoạt tính (U/l)

Ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy

2

3

4

5

6

7

8

9

pH

0

2.6

3.2

111.1

100

3.4

1.4

3.5

Hoạt tính (U/l)

Ảnh hƣởngnồng độ NaCl

0

0.1

1

5

10

NaCl %

5.8

10.4

2.6

1.4

0.04

Hoạt tính

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

110

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

(U/l)

Ảnh hƣởng của nồng độ DDT

50 7

100 6,6

200 7,1

300 6,8

DDT ppm Hoạt tính (U/l)

Ảnh hƣởng của nồng độ glucose

2

3

Glucose %

0

7,5

6,5

6

0,2

0

0 0,1 0,5 1

Hoạt tính (U/l)

Ảnh hƣởng của các chất cảm ứng

Chất cảm ứng Hoạt tính (U/l)

guiaiacol 7,6 veratyl alcohol 2,9 CuSO4 11

Ảnh hƣởng của chất hoạt động bề mặt

Chất hoạt động bề mặt

Hoạt tính (U/l)

1 ngày 2 ngày 4 ngày 6 ngày

Tween 80 2608,3 0,4 6,5 4,8

Nƣớc bồ kết 0,4 0,5 3,8 3,1

Động thái sinh tổng hợp laccase

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Ngày

0 2608,3 0,4 2,5

6,5 194,4 4,8

2,6

7,5

6,3 2,25

Hoạt tính (U/l)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

111

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Ảnh hƣởng của nguồn carbon

Glucose

Saccharose

lactose

Tinh bột

Khoai tây

Cao malt

Cellulose

Carbon

8,6

22,2

1,8

4,3

3,7

1,1

3,3

Hoạt tính (U/l)

Ảnh hƣởng của nguồn nitơ

NH₄NO₃

NaNO₃+KNO₃

Cao men

Cao thịt

Đậu tƣơng

Urê

22,2

1,5

1,1

1,7

0,6

0,9

Nitơ Hoạt tính (U/l)

Môi trƣờng thay thế

MEG

YS

SG

PG

Môi trƣờng

Hoạt tính (U/l)

11,3

6,2

21,3

5,8

pH tối ƣu

5

4,5

4

3,5

3

2,5

2

1,5

1

pH

0,02

3,2

7,5

28,2

503,1 1552,8 2355,6 2802,8 1969,4

Hoạt tính (U/l)

Nhiệt độ tối ƣu

32

40

50

60

70

80

90

Nhiệt độ (oC)

1354,2 1877,3 2532,4

2307,9

1289,3

914,4

905,1

Hoạt tính (U/l)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

112

Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Độ bền pH

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

pH

650 1075 1472 2100 1825 1416,7 1386 1425 1472 1425

Hoạt tính (U/l)

Độ bền nhiệt

60

80

90

50

Nhiệt độ (oC)

10 phút

2508

2370.37

1333.333

1370.37

20 phút

2394

1958.333

1120.37

1212.963

Hoạt tính (U/l)

40 phút

2453

1287.037

1263.889

1018.519

1259.259

1185.185

1074.074

60 phút

2409

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

113