Tổng quan<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010<br />
<br />
NGHIÊN CỨU SỰ ĐỘT BIẾN VÙNG D-LOOP<br />
CỦA HỆ GEN TY THỂ Ở NGƯỜI TIẾP XÚC NGHỀ NGHIỆP<br />
VỚI BỨC XẠ ION HÓA LIỀU THẤP<br />
Nguyễn Hữu Nghĩa*, Đặng Trần Trung*, Phạm Xuân Mai*, Đái Duy Ban**, Lờ Thanh Hòa**,<br />
Nguyễn Thị Bích Nga**<br />
SUMMARY<br />
ANALYSIS OF MUTATIONS IN MITOCHONDRIAL D-LOOP REGION INDUCED BY RADIATION<br />
IN OCCUPATIONAL WORKERS IN VIETNAM<br />
Nguyen Huu Nghia, Dang Tran Trung, Pham Xuan Mai, Dai Duy Ban, Le Thanh Hoa,<br />
Nguyen Thi Bich Nga * Y Hoc TP. Ho Chi Minh – Vol.14 - Supplement of No 4 – 2010 : 3 - 9<br />
Genetic marker for mitochondrial D-loop region (of 369-370 bp in size) from blood isolates of 40<br />
occupational workers frequently exposed to radiation was obtained and comparatively analyzed with<br />
D-loop sequence from Chinese breast cancer patient, and normal humans including Kinh (Vietnam),<br />
Han and Chinese (China), Fillipino (Asia) and Morrocian (Africa). As results, it revealed that there<br />
are 40 nucleotide mutations among the isolates compared, of which, apart from variations resulting<br />
from polymorphism common among human clades, many are originated from mutated DNA<br />
synthesis due to affection of radiation or cancer. Majority of 40 studied humans have point-mutations<br />
dominant in 9 positions and the second human (isolate: NX2(VN)) possesses largest number of<br />
mutations compared to normal ones. Mutations at 7 positions in this NX2 human are similar to those<br />
found in a patient having breast cancer (BRC-BN10(CN)) due to the malsynthesis of DNA in<br />
mitochondrial genome. Severe mutations including point-, insertion-deletion (indel) are mostly<br />
consequence of damaging DNA syntheis, giving a rise to warn that attention to biological safety must<br />
be paid in order to protect occupational workers exposed to radiation.<br />
Key words: D-loop, mitochondrion, polymorphism, exposure to radiation, mutation,<br />
pathogenicity.<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Các tác nhân gây ung thư trong đó có<br />
bức xạ ion hóa thường gây nên nhiều dạng<br />
đột biến nghiêm trọng trong hệ gen ty thể<br />
của người và động vật (Hochhauser, 2000;<br />
Kim và CS, 2006). Trong các dạng đột biến,<br />
đột biến đứt đoạn và đột biến điểm thường<br />
gặp nhiều nhất, người ta gọi đó là “đột biến<br />
thường xuyên” (CD, common deletion<br />
(Wang và cs, 2007). Hệ gen ty thể ở người<br />
<br />
(Homo sapiens) có độ dài là 16569 cặp<br />
nucleotide, mã hóa cho 13 gen cho sản<br />
phẩm protein, 2 gen RNA ribôxôm, 22 gen<br />
của RNA vận chuyển và một phần không<br />
gen có chứa vùng Dloop điều hòa sao chép<br />
gen (Anderson và CS, 1981). Vùng D-loop<br />
trong hệ gen ty thể của người hiện đại có độ<br />
dài 1158 cặp nucleotide, giới hạn giữa RNA<br />
vận chuyển Proline (tRNAPro) và RNA vận<br />
chuyển Phenylalanine (tRNAPhe), và là vùng<br />
<br />
*<br />
<br />
Viện Y Học Phóng xạ và U Bướu Quân Đội ; ** Viện Công nghệ Sinh Học<br />
Địa chỉ liên lạc: BS. Nguyễn Hữu Nghĩa. Email: nghiaubqd@hotmail.com<br />
<br />
Chuyên ñề Ung Bướu<br />
<br />
3<br />
<br />
Tổng quan<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010<br />
<br />
điều hòasự nhân lên của ty thể trong tế bào.<br />
Vùng này có nhiều cấu trúc lặp và có điễm<br />
mầm (origin), có nhiều biến đổi đặc trưng<br />
cho loài, và nhiều đột biến diễn tiến của<br />
nhiều bệnh và hội chứng, trong đó có ung<br />
thư và chịu tác động của các tác nhân ngoại<br />
lai (Rosson và Keshgegian, 2004; Pang và<br />
CS, 2007). Hệ gen ty thể bao gồm nhiều gen<br />
mã hóa tổng hợp protein enzym cần thiết<br />
cho quá trình ô xy hóa-khử, mà vùng Dloop chịu trách nhiệm vai trò điều hòasinh<br />
tổng hợp (Irwin, 2008). Do vai trò quan<br />
trọng như vậy, hệ gen ty thể luôn luôn là<br />
đích chịu tác động của các tác nhân gây đột<br />
biến, trong đó có tác nhân sinh học và vật lý<br />
(Wallace, 1999).<br />
Trong nghiên cứu này chúng tôi giới<br />
thiệu kết quả phát hiện một số loại hình đột<br />
biến xảy ra ở vùng D-loop trên một số đối<br />
tượng trong số 40 đối tượng tiếp xúc với<br />
bức xạ ion hóa trong lao động nghề nghiệp,<br />
cảnh báo cần nâng cao an toàn lao động<br />
trong môi trường bức xạ ion hóa.<br />
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br />
Mẫu nghiên cứu<br />
<br />
Hệ gen ty thể cùng với hệ gen nhân là<br />
toàn bộ DNA có trong tế bào, gọi là DNA<br />
tổng số, được tách chiết bằng bộ hóa chất<br />
QIAamp DNA Kit (QIAGEN Inc.) theo qui<br />
trình của nhà sản xuất. Mô tả rút gọn như<br />
sau: Mẫu bệnh phẩm được ly tâm, lấy tế<br />
bào, xử lý với các dung môi của Kit, hấp<br />
phụ lên màng và ly chiết thu nhận DNA<br />
theo qui trình tách chiết. Tính toán hàm<br />
lượng DNA tổng số và sử dụng khoảng 150<br />
nanogam trong dung tích là 50 microlit mỗi<br />
phản ứng PCR.<br />
Chọn mồi, thực hiện phản ứng RT-PCR<br />
Cặp mồi (primer) sử dụng cho phản<br />
ứng PCR (polymerase chain reaction), nhân<br />
đoạn DNA vùng D-loop, bao gồm mồi xuôi<br />
DLF, định vị trên RNA vận chuyển Proline<br />
(tRNAPro)<br />
(5’CTCCACCATTAGCACCCAAAGC3’) và<br />
mồi ngược DLR, định vị trên RNA vận<br />
chuyển<br />
Phenylalanine<br />
(tRNAPhe)<br />
(5’<br />
CACGGAGGATGGTGGTCAAG 3’). Sản<br />
phẩm PCR có độ dài khoảng 440 nucleotide.<br />
DNA đích của vùng D-loop đã được nhân<br />
bản bằng PCR, với bộ hóa chất PCR Master<br />
Mix Kit (Promega). Chu trình nhiệt của PCR<br />
trên máy MJ (Mỹ) gồm các bước như sau:<br />
940C/5 phút trong 1 chu kỳ; tiếp theo là 35<br />
chu kỳ ở 940C/1 phút, 500C/1 phút và 720C/1<br />
phút; chu kỳ cuối kéo dài 10 phút ở 720C.<br />
<br />
Mẫu nghiên cứu: Máu chống đông thu<br />
nhận từ 40 đối tượng đang lao động trong<br />
môi trường bức xạ ion hóa liều thấp. Mẫu<br />
được bảo quản ở điều kiện lạnh –20°C, sử<br />
dụng để tách chiết DNA tổng số.<br />
Tách chiết DNA tổng số<br />
Bảng 1. Liệt kê các chuỗi DNA vùng D-loop phân tích so sánh với các mẫu nghiên cứu<br />
Ký hiệu chuỗi<br />
so sánh<br />
<br />
Loài<br />
<br />
Vùng<br />
gen<br />
<br />
Độ dài<br />
(bp)<br />
<br />
Nguồn<br />
gốc<br />
<br />
Số ñăng ký<br />
Ngân hàng<br />
gen<br />
<br />
NX1(VN)<br />
<br />
người (tiep xuc<br />
BX)<br />
<br />
D-loop<br />
<br />
369<br />
<br />
Việt Nam<br />
<br />
Đang ñăng ký<br />
<br />
NX2(VN)<br />
<br />
người (TXBX)<br />
<br />
D-loop<br />
<br />
370<br />
<br />
Việt Nam<br />
<br />
Đang ñăng ký<br />
<br />
Chuyên ñề Ung Bướu<br />
<br />
4<br />
<br />
Tổng quan<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010<br />
<br />
NX3(VN)<br />
<br />
người (TXBX)<br />
<br />
D-loop<br />
<br />
369<br />
<br />
Việt Nam<br />
<br />
Đang ñăng ký<br />
<br />
NX4(VN)<br />
<br />
người (TXBX)<br />
<br />
D-loop<br />
<br />
369<br />
<br />
Việt Nam<br />
<br />
Đang ñăng ký<br />
<br />
NX6(VN)<br />
<br />
người (TXBX)<br />
<br />
D-loop<br />
<br />
369<br />
<br />
Việt Nam<br />
<br />
Đang ñăng ký<br />
<br />
BRC(BN10)CN<br />
<br />
người (ung thư)<br />
<br />
D-loop<br />
<br />
369<br />
<br />
Trung<br />
Quốc<br />
<br />
EF429141<br />
<br />
BT-VN71(Vie)<br />
<br />
người (bình<br />
thường)<br />
<br />
D-loop<br />
<br />
369<br />
<br />
Việt Nam<br />
<br />
DQ834256<br />
<br />
BT-Viet0040<br />
<br />
người (bình<br />
thường)<br />
<br />
D-loop<br />
<br />
369<br />
<br />
Việt Nam<br />
<br />
DQ535941<br />
<br />
BTCN(XJ8416)<br />
<br />
người (bình<br />
thường)<br />
<br />
D-loop<br />
<br />
369<br />
<br />
Trung<br />
Quốc<br />
<br />
AY255157<br />
<br />
BT-han<br />
(SD10334)CN<br />
<br />
người (bình<br />
thường)<br />
<br />
D-loop<br />
<br />
369<br />
<br />
Trung<br />
Quốc<br />
<br />
AY255154<br />
<br />
BT-Phil<br />
<br />
người (bình<br />
thường)<br />
<br />
D-loop<br />
<br />
369<br />
<br />
Philippine<br />
<br />
AF382012<br />
<br />
BT-Mor<br />
<br />
người (bình<br />
thường)<br />
<br />
D-loop<br />
<br />
369<br />
<br />
Morroco<br />
<br />
AF381990<br />
<br />
Tách dòng sản phẩm<br />
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ<br />
hóa chất QIAquick PCR Purification Kit<br />
(QIAGEN) và được dòng hóa vào vector<br />
pCR2.1-TOPO của bộ hóa chất TA-cloning<br />
Kit (Invitrogen Inc.). Vector tái tổ hợp tiếp<br />
nhận sản phẩm PCR được chuyển nạp vào<br />
dòng tế bào DH5-T1 và chọn lọc khuẩn lạc<br />
theo phương pháp kháng sinh và chỉ thị<br />
màu (Sambrook và Russell, 2001). DNA của<br />
plasmid có chứa PCR (tái tổ hợp) được tách<br />
chiết với bộ hóa chất QIAprep Spin Plasmid<br />
Extraction Kit (QIAGEN Inc.). Chuỗi DNA<br />
được giải trình tự trên máy giải trình tự<br />
động ABI Genetic Analyzer Avant 3100 tại<br />
Viện Công nghệ sinh học, thực hiện với số<br />
lượng nhiều plasmid tái tổ hợp nhằm thu<br />
được kết quả chính xác.<br />
Xử lý số liệu, so sánh bằng ñối chiếu và phân<br />
tích phả hệ<br />
<br />
Chuyên ñề Ung Bướu<br />
<br />
Bằng phương pháp truy cập Ngân hàng<br />
gen tại (http://www.ncbi.nlm.nih.gov),<br />
chúng tôi thu nhận hệ gen ty thể của người<br />
bình thường Việt Nam (DQ834256;<br />
DQ535941), Trung Quốc, Phillipine, Marốc<br />
và người Trung Quốc bị ung thư, để phân<br />
tích so sánh (Bảng 1). Sắp xếp, đối chiếu<br />
trình tự tương ứng của các chuỗi nucleotide<br />
bằng hệ chương trình máy tính<br />
AsemblyLIGNv1.9<br />
và<br />
MacVector8.5<br />
(Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh. So<br />
sánh đối chiếu và xử lý số liệu của các chuỗi<br />
bằng chương trình GENEDOC2.5 (Nicholas<br />
và Nicholas, 1997), sau đó phân tích phả hệ<br />
chương trình MEGA4.0 (Tamura và CS,<br />
2007).<br />
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br />
Kết quả thu nhận và phân tích ñột biến các<br />
chuỗi DNA vùng D-loop của nhóm nghiên<br />
cứu<br />
<br />
5<br />
<br />
Tổng quan<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010<br />
<br />
Từ các mẫu nghiên cứu, chúng tôi sử<br />
dụng cặp mồi bám vào 2 đầu vùng D-loop<br />
(DLF-DLR), thu được sản phẩm PCR là<br />
đoạn DNA có độ dài 440 bp, điện di trên gel<br />
agarose 1% để kiểm tra. Tách dòng chọn<br />
lọc, và giải trình trình tự, từ đó, chọn chuỗi<br />
có độ dài khoảng 369-370 bp đưa vào phân<br />
tích.<br />
Trình tự và phân tích biến đổi thành<br />
phần nucleotide của phân đoạn DNA trong<br />
vùng D-loop thu nhận từ hệ gen ty thể các<br />
mẫu của người lao động nhiễm xạ, của<br />
người bị ung thư vú, của người bình<br />
thường Việt Nam và một số tộc người đại<br />
diện các châu của thế giới được trình bày ở<br />
hình 1. Có tất cả 40 vị trí có sự sai khác về<br />
nucleotide giữa các chủng, chủ yếu là các<br />
dạng đột biến điểm hoặc đột biến điểm<br />
thêm vào hay bớt đi 1 nucleotide. Những<br />
sai khác thuộc dạng đa hình giữa các<br />
chủng/tộc người thường gặp trên thế giới,<br />
ví dụ tại vị trí 88, 93, 153, 156, 261, 262, 328,<br />
366 là những dấu hiệu bình thường phân<br />
biệt các tộc người (Hình 1).<br />
Tuy nhiên, so với chuỗi DNA vùng Dloop của các tộc người bình thường trên thế<br />
giới và người Việt Nam (VN-71 và<br />
Viet0040), tất cả các mẫu của người nhiễm<br />
xạ đều có những đột biến khác biệt, trong<br />
đó mẫu số 2 (NX2 (VN)) có hiện tượng đột<br />
biến thêm nucleotide ở vị trí 320 và 323<br />
(Hình 1). Những đột biến khác còn được<br />
tìm thấy ở vị trí 104, 146, 147, 181, 187, 238,<br />
299, chỉ có ở mẫu (NX2(VN)) và mẫu bị ung<br />
thư của người Trung Quốc (mẫu BRC(BN10)CN), và có lẽ mang đặc tính đột biến<br />
do tác động của các tác nhân sinh học và vật<br />
lý ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp<br />
DNA (phần đóng khung ở Hình 1). Mẫu<br />
<br />
Chuyên ñề Ung Bướu<br />
<br />
nghiên cứu số 1 (mẫu NX1 (VN) không có<br />
nhiều đột biến do nhiễm xạ, có thể coi là<br />
còn ở mức độ bình thường; các mẫu nhiễm<br />
xạ khác (mẫu NX3(VN), NX4(VN),<br />
NX6(VN)) tuy có nhiều sai khác hơn nhưng<br />
cũng không lớn đến mức vượt xa so với<br />
bình thường. Như vậy, trong số mẫu<br />
nghiên cứu, một mẫu có thể coi là bị đột<br />
biến do nhiễm xạ nghề nghiệp được xác<br />
định bằng sinh học phân tử, và điều này<br />
cần chú ý công tác bảo hộ an toàn bức xạ,<br />
thực sự chưa đảm bảo an toàn sinh học.<br />
Kết quả phân tích tương ñồng và phả hệ dựa<br />
trên dữ liệu chuỗi nucleotide vùng D-loop<br />
Mức độ tương đồng (%) về nucleotide<br />
giữa các chuỗi so sánh được trình bày ở<br />
Bảng 2. Các chuỗi của người bình thường có<br />
mức độ tương đồng cao (98 - 99%), số sai<br />
khác phản ánh mức độ đa hình các tộc<br />
người vốn gặp.<br />
Chuỗi nucleotide của các mẫu nghiên<br />
cứu cùng với tất cả các chuỗi mẫu người ung<br />
thư và các chuỗi mà chúng tôi dùng để so<br />
sánh (gồm 12 chuỗi) được sắp xếp bằng<br />
GENEDOC2.5 (Nicholas và Nicholas, 1997)<br />
và đưa vào phân tích phả hệ bằng chương<br />
trình MEGA4.0 (Tamura và cs, 2007). Kết<br />
quả được trình bày ở Hình 2 cho thấy, các<br />
chủng phân chia thành 2 nhóm rõ rệt, trong<br />
đó, mẫu NX2 (VN) của người nhiễm xạ ở<br />
Việt Nam tập hợp cùng với mẫu ung thư của<br />
người Trung Quốc, tạo nên một nhóm riêng<br />
biệt (Hình 2). Các mẫu nhiễm xạ khác (mẫu<br />
còn lại của người nhiễm xạ), tuy có những<br />
đột biến nhất định ở vùng D-loop, nhưng<br />
mức độ đột biến không lớn và vẫn tập hợp<br />
cùng các mẫu phân tích từ người bình<br />
thường của Việt Nam, châu Á, và châu Phi<br />
(Hình 2). Kết quả phân tích quan hệ phả hệ<br />
giữa các mẫu, một lần nữa khẳng định sự<br />
6<br />
<br />
Tổng quan<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010<br />
<br />
nhóm họp cùng nhau của các mẫu có mức<br />
độ đột biến vật lý do nhiễm xạ và có đột biến<br />
do tác nhân sinh học ung thư. Những mẫu<br />
nhiễm xạ khác, tuy vẫn cùng với các mẫu<br />
bình thường nhưng mức độ phân nhánh đã<br />
xa hơn, và có thể trải qua nhiều thế hệ phân<br />
chia tế bào của những người lao động nghề<br />
nghiệp, đến lúc nào đó, trong họ có thể xuất<br />
hiện đột biến như mẫu số 2 (NX2 (VN). Sự<br />
đột biến mức độ cao, và tỷ lệ người nhiễm xạ<br />
đột biến ty thể trên mức cho phép cảnh báo<br />
thực trạng an toàn lao động và an toàn sinh<br />
học trong môi trường nghề nghiệp. Cần có<br />
những biến pháp hữu hiệu đảm bảo môi<br />
trường cho người lao động tránh bị đột biến<br />
ty thể.<br />
Bảng 2. So sánh mức độ tương đồng (%) của<br />
chuỗi nucleotide vùng D-loop giữa các mẫu<br />
nghiên cứu (Ghi chú: Các mẫu đánh số như<br />
danh sách ở bảng 1)<br />
1<br />
<br />
2<br />
<br />
3<br />
<br />
4<br />
<br />
5<br />
<br />
6<br />
<br />
7<br />
<br />
8<br />
<br />
9<br />
<br />
10<br />
<br />
1<br />
<br />
94 97 97 97 96 98 98 97 98<br />
<br />
2<br />
<br />
94 94 94 97 95 95 94 95<br />
<br />
3<br />
<br />
97 97 96 98 98 97 98<br />
<br />
4<br />
<br />
97 95 97 97 97 97<br />
<br />
5<br />
<br />
96 97 97 97 98<br />
<br />
DNA vùng D-loop, xuất hiện có một số mức<br />
độ đột biến trầm trọng, trong đó những đột<br />
biến thêm-bớt (indel mutation), một loại<br />
hình đột biến nguy hiểm đặc biệt nếu xảy ra<br />
trong D-loop ảnh hưởng đến vai trò điều<br />
hòasao chép gen ty thể, và đột biến mức độ<br />
giống nhau với mẫu người bị ung thư<br />
(Hochhauser, 2000; Rosson và Keshgegian,<br />
2004). Hệ gen ty thể có hệ số nhân lên nhiều<br />
và nhanh như sự phân chia tế bào, và hệ số<br />
đột biến cao so với hệ gen nhân do chịu áp<br />
lực tác động của tác nhân sinh học, vật lý,<br />
hóa chất, dược chất, ung thư, nhiễm xạ<br />
(Kim và CS, 2006; Wang và CS, 2007). Nếu<br />
như người lao động tiếp xúc hoặc phơi<br />
nhiễm với phóng xạ không được bảo vệ chu<br />
đáo, rất có thể dễ bị đột biến xảy ra trong hệ<br />
gen ty thể ảnh hưởng đến chức năng sinh<br />
học của cơ thể và có tính di truyền. Điều<br />
này cảnh báo cần nghiêm túc thực hiện qui<br />
định<br />
an toàn sinh học trong môi trường lao<br />
11 12<br />
động có bức xạ và các môi trường phơi<br />
98 98<br />
nhiễm với các tác nhân gây đột biến ty thể.<br />
95 quả<br />
95 nghiên cứu của chúng tôi góp phần<br />
Kết<br />
làm<br />
98 sáng<br />
98 tỏ một số vấn đề an toàn lao động<br />
và quan hệ sinh học trong môi trường làm<br />
98 97<br />
việc tại Việt Nam.<br />
98 98<br />
<br />
6<br />
<br />
97 97 96 97 97 97<br />
<br />
7<br />
<br />
99 98 98 98 98<br />
<br />
8<br />
<br />
98 98 98 98<br />
<br />
9<br />
<br />
98 98 98<br />
<br />
10<br />
<br />
98 98<br />
<br />
11<br />
<br />
98<br />
<br />
12<br />
BÀN LUẬN<br />
Xem xét trong số 40 người lao động<br />
trong môi trường bức xạ và xem xét chuỗi<br />
<br />
Chuyên ñề Ung Bướu<br />
<br />
7<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
