intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử xác định các kiểu gen hệ nhóm ABO cá thể

Chia sẻ: Sunshine_6 Sunshine_6 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

54
lượt xem
3
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Những nghiên cứu về các dòng cADN mã hoá kháng nguyên nhóm máu ABO [6] đã xác định đ-ợc trình tự đoạn gen ABO với kích th-ớc 1000bp. Đồng thời qua những nghiên cứu này, ng-ời ta chứng minh đ-ợc rằng gen mã hoá kháng nguyên A và B có một số gốc bazơ khác nhau ở những vị trí xác định. Điều này dẫn đến những thay đổi một số trình tự axit amin làm cho hoạt tính của A và B-transferase khác nhau. Sự khác nhau đó đã đ-ợc các tác giả tìm ra tại nucleotit 700 của...

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử xác định các kiểu gen hệ nhóm ABO cá thể

  1. TCNCYH 23 (3) 2003 Nghiªn cøu sö dông c¸c ph−¬ng ph¸p sinh häc ph©n tö x¸c ®Þnh c¸c kiÓu gen hÖ nhãm ABO c¸ thÓ Nghiªm Xu©n Dòng1, TrÇn Minh §«n1, L−¬ng ThÞ YÕn1 vµ Lª §øc §µo2 1 Côc Kü thuËt Hãa – Sinh, Tæng côc Khoa häc kü thuËt vµ C«ng nghÖ - Bé C«ng an. 2 ViÖn Sèt rÐt Ký sinh trïng vµ C«n trïng trung −¬ng Kü thuËt huyÕt häc x¸c ®Þnh ®−îc 4 nhãm m¸u lµ A, B, O, AB. Sö dông kÜ thuËt PCR vµ c¸c lo¹i enzym c¾t giíi h¹n cã thÓ x¸c ®Þnh kiÓu gen cña hÖ kh¸ng nguyªn nµy, cho phÐp x¸c ®Þnh ®−îc 6 tr¹ng th¸i gen lµ AA, BB, OO, AB, AO, BO. Ph−¬ng ph¸p míi sö dông cã ®é nh¹y rÊt cao, cã thÓ x¸c ®Þnh ®−îc c¸c mÉu ADN tõ vÕt m¸u, n−íc bät, tãc nªn ®−îc ¸p dông cã hiÖu qu¶ trong c«ng t¸c gi¸m ®Þnh h×nh sù. I. §Æt vÊn ®Ò kü thuËt PCR, nhãm t¸c gi¶ ®· nh©n ®o¹n gen ABO t¹o ra mét s¶n phÈm cã kÝch th−íc Nh÷ng nghiªn cøu vÒ c¸c dßng cADN m· 209/210bp. S¶n phÈm nµy sÏ mang vÞ trÝ ®ét ho¸ kh¸ng nguyªn nhãm m¸u ABO [6] ®· x¸c biÕn t¹i baz¬ 258 nÕu allen O cã mÆt. §«i måi ®Þnh ®−îc tr×nh tù ®o¹n gen ABO víi kÝch tiÕp theo (DHF3 vµ DHR3) sÏ nh©n ®o¹n gen th−íc 1000bp. §ång thêi qua nh÷ng nghiªn ABO t¹o ra mét s¶n phÈm cã kÝch th−íc 175bp. cøu nµy, ng−êi ta chøng minh ®−îc r»ng gen S¶n phÈm nµy mang vÞ trÝ ®ét biÕn t¹i baz¬ 700 m· ho¸ kh¸ng nguyªn A vµ B cã mét sè gèc nÕu allen B cã mÆt. Sau ®ã, c¸c t¸c gi¶ sö dông baz¬ kh¸c nhau ë nh÷ng vÞ trÝ x¸c ®Þnh. §iÒu kü thuËt c¾t s¶n phÈm PCR b»ng hai lo¹i nµy dÉn ®Õn nh÷ng thay ®æi mét sè tr×nh tù axit enzym KpnI vµ AluI. §èi víi s¶n phÈm amin lµm cho ho¹t tÝnh cña A vµ B-transferase 210/209pb, nÕu allen O cã mÆt, KpnI sÏ c¾t kh¸c nhau. Sù kh¸c nhau ®ã ®· ®−îc c¸c t¸c gi¶ thµnh c¸c ®o¹n 177bp vµ 32bp. Cßn s¶n phÈm t×m ra t¹i nucleotit 700 cña gen B. T¹i vÞ trÝ 175bp nÕu cã mÆt allen B, AluI sÏ c¾t s¶n phÈm nµy, baz¬ G ®−îc thay thÕ b»ng baz¬ A cã ë thµnh c¸c ®o¹n 94bp vµ 81bp. Cuèi cïng, dùa thÓ d¹i. VÞ trÝ ®ét biÕn nµy t¹o ra ®iÓm nhËn vµo sù thÓ hiÖn cña c¸c b¨ng ADN trªn ®iÖn di biÕt cña enzym giíi h¹n AluI. §ång thêi, ®å (gel agarose), ng−êi ta cã thÓ ph©n tÝch tÝnh nghiªn cøu trªn gen O chøng minh sù v¾ng mÆt ®a h×nh cña ®o¹n gen ABO thÓ hiÖn ë 6 kiÓu cña baz¬ G ë vÞ trÝ 258, do ®ã gen m· ho¸ tæng gen kh¸c nhau lµ: AA, BB, OO, AO, BO, AB. hîp protein kh«ng cã ho¹t tÝnh transferase. §ét biÕn nµy t¹o thªm mét vÞ trÝ nhËn biÕt n÷a ®èi Nh÷ng nghiªn cøu trªn ®· t¹o c¬ së ®Ó kh¾c víi gen O bëi enzym giíi h¹n KpnI. phôc mét lo¹t khã kh¨n gÆp ph¶i khi x¸c ®Þnh nhãm ABO b»ng kü thuËt huyÕt thanh häc, TiÕp theo nh÷ng nghiªn cøu trªn, Carll Ladd ®ång thêi víi c¸c kü thuËt hiÖn ®¹i, cã ®é nh¹y vµ céng sù 1996 [2] ®· ®−a ra mét ph−¬ng ph¸p vµ tÝnh ®Æc hiÖu cao cña sinh häc ph©n tö, viÖc nh»m x¸c ®Þnh kiÓu gen nhãm m¸u ABO. Sö x¸c ®Þnh nhãm m¸u ABO kh«ng chØ dõng l¹i ë dông ®«i måi thø nhÊt (DHF1 vµ DHR2) b»ng møc ®é x¸c ®Þnh kiÓu h×nh víi 4 nhãm nh− 74
  2. TCNCYH 23 (3) 2003 tr−íc kia mµ thay vµo ®ã cã thÓ x¸c ®Þnh ®−îc §· cã rÊt nhiÒu ph−¬ng ph¸p ®−îc nªu ra ®Ó 6 kiÓu gen kh¸c nhau, do ®ã t¨ng kh¶ n¨ng t¸ch chiÕt ADN tõ c¸c tµi liÖu ®· ®−îc c«ng bè ph©n biÖt hÖ thèng nhãm ABO. trªn thÕ giíi vµ trong n−íc. Trong nghiªn cøu nµy, chóng t«i ®· sö dông ph−¬ng ph¸p t¸ch Víi nh÷ng c¬ së lý thuyÕt vµ nghiªn cøu chiÕt ADN cña Banaschak S. vµ céng sù [1]. thùc tÕ ®· nªu, chóng t«i ®Æt vÊn ®Ò nghiªn cøu x¸c ®Þnh c¸c kiÓu gen hÖ nhãm ABO c¸ thÓ b. Kü thuËt PCR: b»ng c¸c kü thuËt hiÖn ®¹i cña sinh häc ph©n Qu¸ tr×nh PCR ®−îc tiÕn hµnh trong èng tö. KÕt qu¶ nghiªn cøu cña chóng t«i sÏ gãp nghiÖm eppendorf 0,5 ml. Thµnh phÇn ph¶n phÇn bæ sung mét ph−¬ng ph¸p míi cã ®é nh¹y øng gåm: 0,2mM dNTPs; 10mM tris HCl, rÊt cao phôc vô viÖc gi¸m ®Þnh truy nguyªn 50mM KCl, 1,5 mM MgCl2; 2 ®¬n vÞ Taq nhãm dïng cho c«ng t¸c gi¸m ®Þnh h×nh sù. polymeraza; 15 pmol mçi måi, n−íc cÊt khö Môc tiªu nghiªn cøu: ion; dÇu kho¸ng. - Nghiªn cøu c¸c ®iÒu kiÖn tèi −u ®Ó thùc Ph¶n øng ®−îc thùc hiÖn trªn m¸y PCR tiÕn hiÖn ph¶n øng nh©n béi gen m· ho¸ kh¸ng hµnh víi 950C: 5 phót; 45 chu kú ë c¸c nhiÖt nguyªn nhãm m¸u ABO. ®é: 94oC - 1 phót; 58oC - 1 phót; 72oC - 2 phót. - Nghiªn cøu lùa chän nh÷ng ph−¬ng ph¸p c. Sö dông enzym giíi h¹n ®Ó ph©n tÝch thÝch hîp ®Ó t¸ch chiÕt ADN tõ c¸c mÉu sinh ®o¹n gen m· ho¸ kh¸ng nguyªn ABO: häc (m¸u, l«ng, n−íc bät... ) cho ph¶n øng Trªn ®o¹n gen m· ho¸ tæng hîp kh¸ng PCR. nguyªn ABO, ng−êi ta t×m thÊy cã 2 vÞ trÝ cã - Ph©n tÝch tÝnh ®a h×nh cña ®o¹n gen thÓ sö dông enzym c¾t giíi h¹n ®Ó ph©n tÝch m· ho¸ tæng hîp kh¸ng nguyªn nhãm m¸u ®iÓm ®ét biÕn: VÞ trÝ baz¬ 258 ë ng−êi cã gen ABO, nghiªn cøu x©y dùng mét quy tr×nh æn m· ho¸ kh¸ng nguyªn O cã thÓ dïng enzym ®Þnh ®Ó x¸c ®Þnh dÊu vÕt thu ®−îc trong ®iÒu giíi h¹n Kpn I ®Ó c¾t. S¶n phÈm c¾t sÏ cho ra kiÖn hiÖn t¹i cña phßng thÝ nghiÖm. hai ®o¹n ADN nhá h¬n cã kÝch th−íc kh¸c nhau. T−¬ng tù, t¹i vÞ trÝ baz¬ 700 cña gen m· II. §èi t−îng vµ Ph−¬ng ph¸p ho¸ kh¸ng nguyªn B ng−êi ta sö dông enzym nghiªn cøu Alu I c¾t. KÕt qu¶ c¾t còng cho ra hai ®o¹n 1. §èi t−îng: ADN nhá h¬n cã kÝch th−íc kh¸c nhau. - M¸u t−¬i, m¸u trªn giÊy thÊm Walkman, Kü thuËt c¾t b»ng hai lo¹i enzym giíi h¹n n−íc bät trªn giÊy thÊm Walkman, n−íc bät Kpn I vµ Alu I ®−îc chóng t«i tiÕn hµnh theo thÊm vµo b«ng, ch©n tãc. ph−¬ng ph¸p cña Carll vµ céng sù, 1996 [2]. - Ho¸ chÊt: Ho¸ chÊt cho t¸ch chiÕt ADN; d. Kü thuËt ®iÖn di: ho¸ chÊt dïng cho PCR; ho¸ chÊt dïng cho C¸c s¶n phÈm PCR ®−îc kiÓm tra, ph©n tÝch enzym c¾t giíi h¹n KpnI vµ AluI; ho¸ chÊt b»ng ph−¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel agaroza dïng cho ®iÖn di vµ nhuém gel cña c¸c h·ng 2,5% trong ®Öm TBE, nhuém b»ng ethidium Sigma vµ Biorad. bromide, soi vµ chôp ¶nh trªn ®Ìn cùc tÝm. 2. Ph−¬ng ph¸p: III. KÕt qu¶ a. T¸ch ADN : 1. S¶n phÈm PCR khi dïng hai cÆp måi ®Æc hiÖu (DHF1, DHR2 vµ DHF3, DHR3) 75
  3. TCNCYH 23 (3) 2003 o Tæng thÓ tÝch ph¶n øng lµ 50µl gåm: 95 C - 5 phót − dNTPs (nång ®é mçi lo¹i: 0,2mM) 58oC - 1 phót : 5µl 72oC - 2 phót 45 chu kú − 10 X PCR buffer (15mM MgCl2) : 5µl 94oC - 1 phót − Primer (DHF1x DHR2) hoÆc (DHF3 x 58oC - 1 phót DHR3) mçi lo¹i 1µl ®Õn 2µl 72oC - 10 phót − 2 unit Taq ADN polymerase: 2µl NhiÖt ®é lµ 25oC. Thêi gian ch¹y: 4 giê − ADN khu«n tõ 1 ®Õn 6µl 47phót − H2O tõ 28 µl- 33µl. -Primer DHF1 vµ DHR2 t¹o ra mét s¶n phÈm 210 / 209bp. §iÒu kiÖn ®Ó lµm ph¶n øng chuçi trïng hîp trªn m¸y Mastercycle 5330: -Primer DHF3 vµ DHR3 t¹o ra mét s¶n phÈm 175bp. Khi ph¶n øng hoµn thµnh chóng t«i kiÓm tra s¶n phÈm b»ng ph−¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gen agarose 2,5% vµ soi trªn m¸y UV (¶nh 1). 1 2 3 4 5 6 7 8 ¶nh 1. KÕt qu¶ PCR ®o¹n gen ABO víi 2 ®«i måi ®Æc hiÖu DHF1, DHR2 vµ DHF3, DHR3 1,4,6: S¶n phÈm PCR dïng cÆp måi DHF3, DHR3 2,5,7: S¶n phÈm PCR dïng cÆp måi DHF1, DHR2 3,8 : Marker Khi cã s¶n phÈm PCR, dïng enzym Kpn I vµ Alu I c¾t. C¬ chÕ ho¹t ®éng cña Kpn I vµ Alu I : 76
  4. TCNCYH 23 (3) 2003 5’ GCT GAC ACC GTG GAA GGA TGT CCT CGT GGT(G)ACC Primer DHF1 No. 258 bp (Kpn I) ... AGG CAG TGG CGA GTC GTG ACT GTG GAC ATT GAG GT Primer DHR2 (A) 5’ GTG CGT GGA CGT GGA CAT GGA GTT... CCC (G)GC TTC Primer DHF3 No. 700bp (Alu I) ... ...................C AAG GAC GAG GGC GAT TTC TAC TAC CTG Primer DHR 3 Primer DHF 1 + DHR 2 Primer DHF 3 + DHR 3 209/210 bp 175 bp KpnI Alu I 177 bp 210 bp 94bp 175bp 32 bp 81 bp “O” “B” Allen O: Lµ kÕt qu¶ cña sù biÕn mÊt cña Guanin (G) t¹i vÞ trÝ 258. §iÒu ®ã lµm mÊt ho¹t tÝnh β- trasferase vµ t¹o ra ®iÓm nhËn biÕt cña KpnI. Allen B: G thay b»ng A t¹i vÞ trÝ 700 t¹o ra vÞ trÝ nhËn biÕt cña enzym AluI. - S¶n phÈm 210/209 nÕu chøa d¹ng ®a h×nh ®Æc hiÖu cña allen O (nÕu allen O cã mÆt) Kpn I sÏ c¾t thµnh c¸c ®o¹n 177 bp vµ 32 bp. - S¶n phÈm 175 bp nÕu chøa d¹ng ®a h×nh ®Æc hiÖu cña allen B (nÕu allen B cã mÆt), Alu I sÏ c¾t s¶n phÈm thµnh ®o¹n 94 bp vµ 81bp. * TiÕn hµnh ph¶n øng c¾t b»ng enzym giíi h¹n: AluI vµ KpnI (Tæng thÓ tÝch 25µl) Enzym Alu I Enzym Kpn I - ADN : 20µl - ADN: 20µl - Buffer A: 2,5µl - Tris 10X : 2µl - Alu I : 1,5µl - BSA 10X : 0,3µl - H2O: 1µl - Kpn I : 1 µl - H2O: 1,7 µl 77
  5. TCNCYH 23 (3) 2003 o Ph¶n øng enzym ®−îc thùc hiÖn ë nhiÖt ®é 37 C trong thêi gian 1 giê. S¶n phÈm ®−îc ®iÖn di trªn gel agarose 2.5% víi ®iÖn thÕ 100V. Thêi gian ch¹y ®iÖn di lµ 2 giê 30 phót. C¸c kÕt qu¶ ®−îc kiÓm tra b»ng m¸y UV. C¸c lo¹i genotype cña gen ABO sau ®iÖn di cã thÓ ®−îc thÓ hiÖn trªn ®iÖn di ®å theo m« h×nh sau: MÉu 1 MÉu 2 MÉu 3 MÉu 4 MÉu 5 MÉu 6 bp BO BB AO AA AB OO Enzym KpnI AluI KpnI AluI KpnI AluI KpnI AluI KpnI AluI KpnI AluI c¾t Marker 210 175 94 81 32 C¨n cø vµo m« h×nh trªn, chóng t«i tiÕn hµnh ®äc kÕt qu¶ trªn b¶n ®iÖn di agarose vµ ph©n tÝch kiÓu gen cña c¸c mÉu nghiªn cøu (¶nh 2). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 • Ghi chó: 1: Marker 6,7: OO 2,3: AO 8,9: BO 4,5: AO 10,11: AB ¶nh 2: KÕt qu¶ c¾t s¶n phÈm PCR b»ng enzym KpnI vµ AluI 78
  6. TCNCYH 23 (3) 2003 2. KÕt qu¶ kh¶o s¸t gen ABO cu¶ mét sè c¸ thÓ ng−êi ViÖt Nam KÕt qu¶ kh¶o s¸t mét nhãm ng−êi ViÖt Nam: - Sè ng−êi cã nhãm AA lµ 2 ng−êi - Sè ng−êi cã nhãm AB lµ 4 ng−êi - Sè ng−êi cã nhãm OB lµ 9 ng−êi - Sè ng−êi cã nhãm OA lµ 7 ng−êi - Sè ng−êi cã nhãm BB lµ 1 ng−êi - Sè ng−êi cã nhãm OO lµ 7 ng−êi. Ngoµi ra chóng t«i tiÕn hµnh lÊy mÉu m¸u, n−íc bät, ch©n tãc cña mét ng−êi ®Ó nghiªn cøu. KÕt qu¶ cho thÊy ë cïng mét c¸ thÓ c¸c mÉu ph©n tÝch ®Òu gièng nhau (¶nh 3). 1, 2, 7, 8, 14, 15, 20, 21 : M¸u 3, 4, 9, 10, 16, 17, 22, 23 : Tãc 5, 6, 11, 12, 18, 19, 24, 25 : N−íc bät ¶nh 3: KÕt qu¶ kh¶o s¸t gen ABO cu¶ mét sè c¸ thÓ ng−êi ViÖt Nam 1-6: Ng−êi thø 1 nhãm OO 7-12 : Ng−êi thø 2 nhãm OO 14-19: Ng−êi thø 3 nhãm OA 20-25 : Ng−êi thø 4: nhãm AB 13 : Marker IV. Bµn luËn b»ng kü thuËt hiÖn ®¹i cña sinh häc ph©n tö ng−êi ta cã thÓ ph©n biÖt c¸c c¸ thÓ ra thµnh 6 §iÖn di trªn gel agarose 2,5% ®èi víi s¶n nhãm gen: AA, BB, OO, AO, BO, AB. Sö dông phÈm cña chóng t«i cho thÊy viÖc x¸c ®Þnh ph−¬ng ph¸p nµy cßn biÕt ®−îc ngay gen cña nhãm ABO tõ c¸c vÕt m¸u, tÕ bµo cñ tãc (cña con c¸i khi biÕt gen cña bè mÑ [5]. 1 sîi tãc) hay vÕt n−íc bät thÝ nghiÖm ®¹t kÕt qu¶ tèt. C¸c b¨ng m¶nh, s¾c, kh«ng cã c¸c Sö dông c¸c kü thuËt vµ trang thiÕt bÞ hiÖn v¹ch phô, ®· x¸c ®Þnh ®−îc genotype cña c¸ cã t¹i c¸c c¬ së nghiªn cøu ë ViÖt Nam, chóng thÓ. Nh− vËy, ph−¬ng ph¸p chóng t«i ®· sö t«i ®ang tõng b−íc hoµn thiÖn c¸c ph−¬ng ph¸p dông lµ æn ®Þnh vµ cã ®é nh¹y cao. Do ®ã cã nghiªn cøu c¸c ®o¹n gen ®a h×nh phôc vô cho thÓ ph©n biÖt ®−îc c¸c kiÓu gen nhãm ABO c«ng t¸c cña ngµnh C«ng an. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh víi l−îng mÉu rÊt Ýt mµ c¸c ph−¬ng ph¸p tr−íc thµnh c«ng ®o¹n gen ABO ®· gióp chóng t«i ®©y kh«ng thÓ thùc hiÖn ®−îc [2, 3]. kh¼ng ®Þnh ch¾c ch¾n r»ng c¸c ph−¬ng ph¸p sinh häc ph©n tö cã thÓ triÓn khai vµ mang l¹i NÕu nh− chØ sö dông kü thuËt huyÕt häc, chØ kÕt qu¶ thiÕt thùc. ph©n biÖt ®−îc 4 nhãm m¸u lµ A, B, O, AB th× 79
  7. TCNCYH 23 (3) 2003 V. kÕt luËn 2. Carll Ladd et. al: A PCR-based strategy for ABO genotype determination, Chóng t«i ®· lùa chän ®−îc ph−¬ng ph¸p Journal of forensic science. January 1996,Vol. thÝch hîp ®Ó t¸ch chiÕt ADN tõ c¸c mÉu sinh 41, No. 1 :134-137. häc (m¸u, l«ng, n−íc bät... ) cho ph¶n øng PCR. 3. Cecelia Cronse and Vladimit Vincek: Identification of ABO alleles on forensic type Sö dông kÜ thuËt PCR vµ enzym giíi h¹n ®· specimen using rapid - ABO genotyping. x¸c ®Þnh ®−îc sè ng−êi mang kiÓu gen ®ång Biotechniques. 1995,Vol. 18, No. 3. hîp tö (AA, OO hoÆc BB) chiÕm kho¶ng 1/3 sè l−îng ng−êi kh¶o s¸t, cßn l¹i 2/3 lµ dÞ hîp tö 4. Gobinda Sarkar et. al: Characterisation [4]. of PCR amplication of specific alleles, Analytical biochemistry. 1990, 186: 64-68. Ph−¬ng ph¸p nµy cho kh¶ n¨ng x¸c ®Þnh ®−îc c¸c dÊu vÕt nhá nh− vÕt m¸u, n−íc bät, 1 5. Fumi - Ichiro Yamato, Herrik Clansen sîi tãc... nªn cã ý nghÜa lín trong c«ng t¸c Thayer White, John Marken: Molecular genetic gi¸m ®Þnh ph¸p y. basic of the histo blood group ABO system. Nature. 17 May, 1990,Vol. 345. Tµi liÖu tham kh¶o 6. Yamamoto F., Clausen H, White T., 1. Banaschak S, Rolf B, Brinkmann B: Marken J.: Molecular genetic basic of the Influence of different staining techniques on histo-blood group ABO system, Nature, 1990, the DNA analysis of histological sections. Int. Vol. 345: 229-233. J. Legal. Med. 2000, 113: 114-116. Summary ABO genotype determination using biological molecular methods To overcome the problems, that serology technique allow to determine only ABO phenotype by four groups as A, B, O and AB, we have employed a new method to determine ABO genotyping using modern molecular biological techniques. The method was performed by Carll Ladd et al (1996) and called " PCR-RE" typing . This method is highly sensitive and specific in comparison with the immunological method. Using this method six groups of ABO genotype would be determined as AA, BB, OO, AO, BO, AB. So ABO typing at the DNA level yields genotypic rather than phenotypic information, thereby increasing the system’s discrimination potential. The method we used was successful in determination the ABO genotypes on a group of 30 Vietnamese individuals. We also get success in ABO genotype determination on different DNA samples extracted from blood stains, saliva stains and hair root cells. It showed that there’s no different of ABO genotypes between these DNA samples from an individual. 80
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
22=>1