Nghiên cứu tác dụng kháng virus herpes simplex (HSV) của cao chiết hạ khô thảo (prunella vulgaris L.)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG VIRUS HERPES SIMPLEX (HSV)<br /> CỦA CAO CHIẾT HẠ KHÔ THẢO (PRUNELLA VULGARIS L.)<br /> Đào Thị Kim Đính*, Huỳnh Thị Kim Loan**, Trần Thu Hoa***, Trần Công Luận*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Khảo sát khả năng kháng virus herpes týp 1 và týp 2 của các cao chiết từ Hạ khô thảo thu hái ở<br /> Việt Nam nhằm tìm kiếm các loại thuốc mới có nguồn gốc từ thảo dược có khả năng kháng HSV.<br /> Phương pháp: Chiết cao toàn phần, tách phân đoạn ethylacetat và phân đoạn nước của Hạ khô thảo.<br /> Nhuộm tế bào Vero với xanh methylen và đo mật độ quang ở bước sóng 620 nm, so sánh tế bào Vero tiếp<br /> xúc/không tiếp xúc với các cao chiết, tế bào Vero không nhiễm virus và tế bào Vero nhiễm virus để xác định độc<br /> tính trên tế bào của các cao chiết và khả năng kháng virus.<br /> Kết quả: Ba loại cao đạt tiêu chuẩn theo qui định về độ ẩm DĐVN III. Cao toàn phần cùng các phân<br /> đoạn ethylacetat và phân đoạn nước của Hạ khô thảo có tác dụng ức chế HSV tốt với chỉ số hệ số chọn lọc<br /> CC50/ IC50 đối với HSV-1 và HSV-2 từ 16,29 đến 28,08. Như vậy, cả ba loại cao đều có ý nghĩa trong trị<br /> liệu (có hệ số chọn lọc >10).<br /> Kết luận: Cao toàn phần Hạ khô thảo, phân đoạn ethyl acetat và phân đoạn nước đã được chứng minh có<br /> tác dụng ức chế HSV-1 và HSV-2, có thể được sử dụng để làm thuốc kháng herpes hiệu quả.<br /> Từ khóa: Hạ khô thảo, kháng herpes, HSV-1 và HSV-2.<br /> Chữ viết tắt: CC, nồng độ gây độc; CC50, liều gây chết 50% tế bào nuôi cấy; IC50, nồng độ ức chế 50% tế<br /> bào nuôi cấy; HSV, Herpes simplex virus; CPE, bệnh tích tế bào; SI, hệ số chọn lọc; TCID50, liều gây nhiễm 50%<br /> tế bào nuôi cấy.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> STUDY ON IN VITRO ANTI-HERPES SIMPLEX VIRUS ACTIVITY<br /> OF EXTRACTS FROM VIETNAMESE MEDICINAL HERB PRUNELLA VULGARIS L.<br /> Dao Thi Kim Dinh, Huynh Thi Kim Loan, Tran Thu Hoa, Tran Cong Luan<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh* Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 313 - 317<br /> Objective: To investigate the in vitro antiherpetic activity of extracts from Prunella vulgaris.<br /> Methods: Methylene blue staining method for CPE inhibition assay and for evaluation the effects of samples<br /> by comparison untreated Vero cells or Vero cells infected with HSV-1 or HSV-2. Antiviral activity was finally<br /> expressed as a selectivity index (SI), the value of CC50 divided by 50% inhibitory concentration (EC50).<br /> Results: Prepare water extract, ethyl acetate fraction and aqueous fraction from Prunella vulgaris L.. All<br /> three extracts exhibit a potent antiherpetic activity with the SI of more than 16.29 to 28.08.<br /> Conclusion: Extracts from Prunella vulgaris L. are potential antiherpetic agents as herbal products.<br /> Keywords: Prunella vulgaris L., Antiherpetic, HSV-1, HSV-2.<br /> Abbreviation: CC, cytotoxic concentration; CC50, 50% cytotoxic concentration; CPE, cytopathic effect; IC50,<br /> 50% Inhibitory concentration; HSV, Herpes simplex virus; SI, selectivity index, TCID50, 50% tissue culture<br /> infectious dose.<br /> *<br /> <br /> Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. HCM<br /> Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Công Luận<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> **<br /> <br /> ***ĐH. Y Dược Tp. HCM<br /> Viện Pasteur Tp. HCM<br /> ĐT: 0903671323<br /> Email: congluan53@gmail.com<br /> <br /> 313<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Hạ<br /> <br /> khô<br /> <br /> thảo<br /> <br /> (Prunella<br /> <br /> vulgaris<br /> <br /> L.<br /> <br /> Lamiaceae) mọc ở một số vùng núi cao từ<br /> 1000 m trở lên củaViệt Nam, như Tam Đảo<br /> (Vĩnh Phúc); Sa Pa, Mường Khương, Bát Sát,<br /> Bắc Hà (Lào Cai); Đồng Văn, Mèo Vạc, Quản<br /> Bạ (Hà Giang); Sìn Hồ, Tủa Chùa (Lai Châu);<br /> Mù Cang Chải (Yên Bái)(7). Thành phần hóa<br /> học của Hạ khô thảo gồm có các acid<br /> triterpenoic, flavonoid, các phenolic và<br /> diterpen. Các chất tan trong nước của Hạ khô<br /> thảo có tác dụng hạ huyết áp ổn định, kháng<br /> đột biến và an thần. Khả năng kháng virus<br /> herpes bởi một polysaccharid tách từ Hạ khô<br /> thảo đặc biệt được quan tâm(3). Ngoài ra, tanin<br /> (polyphenol) chiết từ Hạ khô thảo có tác dụng<br /> kháng HIV cũng đã được chứng minh(5).<br /> Virus Herpes simplex (HSV) là tác nhân<br /> gây bệnh rất thường gặp, gây các bệnh khác<br /> nhau từ nhẹ đến nặng, trong một số trường<br /> hợp chúng có thể gây tử vong. Các thuốc<br /> nucleosid dùng điều trị nhiễm HSV thường có<br /> hiệu quả trong điều trị nhiễm HSV ban đầu<br /> <br /> hoặc là tái nhiễm, tuy nhiên việc sử dụng tràn<br /> lan các thuốc này đã làm nảy sinh các chủng<br /> HSV đề kháng với các thuốc tương đồng, đặc<br /> biệt là ở các bệnh nhân tổn thương miễn dịch.<br /> Tìm thuốc mới có nguồn gốc tự nhiên có tác<br /> dụng kháng virus mà ít độc đang được quan<br /> tâm, trong đó Hạ khô thảo cũng được nghiên<br /> cứu theo hướng này(3,6,9). Báo cáo này của<br /> chúng tôi nhằm chứng minh tác dụng ức chế<br /> HSV của cao toàn phần, phân đoạn ethyl<br /> acetat và phân đoạn nước của Hạ khô thảo<br /> chưa được khảo sát ở Việt Nam.<br /> <br /> NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Nguyên vật liệu<br /> - Phần trên mặt đất của cây Hạ khô thảo<br /> (Prunella vulgaris L.) được thu hái tại Phó<br /> Bảng, Hà Giang và được định danh bởi<br /> Nguyễn Tập – Khoa Tài nguyên dược liệu,<br /> Viện Dược liệu (Hình 1). Nguyên liệu được xác<br /> định độ ẩm, độ tro toàn phần và độ tro không<br /> tan trong acid theo DĐVN III. Phân tích sơ bộ<br /> thành phần hóa thực vật bằng phương pháp<br /> của trường đại học dược Rumani có cải tiến.<br /> <br /> Hình 1. Cành mang hoa tươi và cụm quả khô Hạ khô thảo.<br /> nước được cô cách thủy đến dạng cao đặc<br /> - Chiết xuất dược liệu: 100 g bột dược liệu<br /> (10,8% độ ẩm). Dùng 10 g cao toàn phần hòa<br /> được đun hồi lưu 3 lần với nước ở 1000C trong 1<br /> trong<br /> nước cất và lắc chiết phân đoạn bằng kỹ<br /> giờ mỗi lần theo tỷ lệ 1:15 (dược liệu:nước). Dịch<br /> <br /> 314<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> thuật lỏng – lỏng với các dung môi từ ít phân<br /> cực đến phân cực thu được lần lượt các phân<br /> đoạn ethyl acetat, n-butanol và nước.<br /> - Acyclovir (Sigma).<br /> - HSV týp 1 và HSV týp 2 từ bệnh phẩm<br /> được phân lập, định danh và lưu trữ tại Viện<br /> Pasteur Tp.HCM.<br /> - Tế bào Vero CCL-81 (ATCC), được nuôi<br /> cấy trong môi trường CMRL (Gibco) có chứa 5%<br /> huyết thanh bào thai bê. Tế bào được nhân định<br /> kỳ trong 7 ngày. Tế bào dùng gây nhiễm virus<br /> được nhân theo tỷ lệ 2x105 tế bào ml-1 và tạo<br /> thành một lớp sau khi nhân được 2-3 ngày.<br /> <br /> Tạo nguồn HSV chuẩn<br /> HSV được gây nhiễm vào tế bào Vero, ủ<br /> o<br /> 37 C, quan sát tế bào mỗi ngày, khi tế bào có<br /> hiện tượng CPE hoàn toàn, đem đông tan băng 3<br /> lần, ly tâm lấy nước nổi, bổ sung 20% huyết<br /> thanh bào thai bê bất hoạt, phân chia lượng nhỏ<br /> 1ml, bảo quản -70oC cho đến khi làm phản ứng.<br /> <br /> Xác định hiệu giá TCID50 của hỗn dịch<br /> virus(8)<br /> Dựa vào hiện tượng CPE xác định TCID50<br /> theo công thức Karber Log TCID50 = L - d(S-0,5),<br /> với L: log của độ pha loãng thấp nhất dung<br /> trong thử nghiệm, d: tỷ lệ khác biệt giữa các độ<br /> pha loãng, S: tổng tỷ lệ các giếng dương tính<br /> trên các giếng gây nhiễm ở từng nồng độ virus.<br /> Kỹ thuật nhuộm tế bào bằng xanh methylen<br /> được thực hiện theo qui trình đã công bố(4).<br /> <br /> Chuẩn bị dịch thử<br /> Các cao chiết toàn phần và các phân đoạn<br /> chiết Hạ khô thảo được pha trong môi trường<br /> CMRL cho dung dịch mẹ có nồng độ 20 mg ml-1;<br /> acyclovir được pha trong môi trường CMRL cho<br /> dung dịch mẹ có nồng độ 2 mg/ml. Từ các dung<br /> dịch mẹ, pha loãng trong môi trường CMRL<br /> thành nhiều nồng độ để khảo sát.<br /> <br /> Xác định tính độc tế bào của chất thử đối<br /> với tế bào Vero(1,4)<br /> Cho vô mỗi giếng 100 µl các nồng độ của<br /> chất thử, mỗi nồng độ lặp lại ba lần trên phiến<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 96 giếng có tế bào Vero đã phủ kín thành một<br /> lớp, ủ ở 370C, 5% CO2 trong 48 giờ, đổ bỏ chất<br /> không hấp phụ, nhuộm màu bằng xanh<br /> methylen và đo mật độ quang ở 620 nm. Tính<br /> nồng độ gây độc (CC) theo công thức CC = (A –<br /> B)/A x 100. Trong đó A là giá trị OD của chứng<br /> tế bào (tế bào không tiếp xúc với chất thử), B là<br /> giá trị OD của tế bào đã được tiếp xúc với chất<br /> thử. Xác định nồng độ chất thử gây độc 50% tế<br /> bào (CC50) từ phương trình tuyến tính biểu diễn<br /> phần trăm gây độc tế bào CC theo nồng độ chất<br /> thử.<br /> <br /> Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng<br /> virus<br /> Cho chất thử tiếp xúc với virus, sau đó cho<br /> xâm nhiễm vào tế bào(2). Nồng độ virus sử dụng<br /> để<br /> khảo<br /> sát<br /> HSV-1<br /> và<br /> HSV-2 dựa vào hiệu giá TCID50. Tính phần trăm<br /> ức chế virus của dịch thử theo công thức IC = (C<br /> – D)/(A – D) x 100. Trong đó C là giá trị OD của<br /> tế bào tiếp xúc với virus và cao chiết, D là giá trị<br /> OD của tế bào chỉ tiếp xúc với virus (chứng<br /> virus), A là giá trị OD của tế bào không tiếp xúc<br /> với virus và dịch thử (chứng tế bào). Xác định<br /> nồng độ dược liệu ức chế 50% (IC50) sự xâm<br /> nhiễm của virus từ phương trình tuyến tính biểu<br /> diễn IC ở nồng độ virus đáp ứng tốt nhất với<br /> chất thử. Chỉ số chọn lọc SI (hay Hệ số trị liệu)<br /> được tính theo công thức SI = CC50/ IC50(1).<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> Đặc tính dược liệu<br /> Bột dược liệu có độ ẩm 11,47 ± 0,04, đạt tiêu<br /> chuẩn theo qui định về độ ẩm DĐVN III (không<br /> quá 13%). Độ ẩm của cao toàn phần là 10,83 ±<br /> 0,03, trong khi quy định DĐVN III áp dụng cho<br /> cao đặc là không quá 20%; độ tro toàn phần là<br /> 10,12 ± 0,05 và độ tro không tan trong acid là<br /> 1,18 ± 0,009.<br /> Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực<br /> vật bột Hạ khô thảo có tinh dầu, carotenoid,<br /> triterpenoid,<br /> anthraquinon,<br /> polyphenol,<br /> saponin, acid hữu cơ, chất khử và polyuronic,<br /> điều này cũng phù hợp với nghiên cứu trước<br /> <br /> 315<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> dây của Namba, 1994(3). Từ 100 g bột dược liệu<br /> thu được 32,43 g cao toàn phần. Cao toàn phần<br /> Hạ khô thảo có rất nhiều polyphenol,<br /> triterpenoid và chất khử, nhiều tinh dầu, acid<br /> hữu cơ và polyuronic, có carotenoid,<br /> anthraquinon và saponin. Từ 10 g cao toàn phần<br /> thu được 0,50 g cao phân đoạn ethyl acetat, 1,61<br /> g cao phân đoạn n-butanol và 7,82 g cao phân<br /> đoạn nước.<br /> <br /> Xác định hiệu giá virus theo TCID50<br /> Kết quả xác định hiệu giá TCID50 đối với<br /> HSV-1 và HSV-2 theo bảng 1. Như vậy có thể<br /> tiến hành khảo sát khả năng ức chế virus của<br /> chất thử với nồng độ virus HSV-1 từ 103,6, 104,6 và<br /> 105,6; HSV-2 từ 103,7, 104,7 và 105,7.<br /> Bảng 1. Kết quả hiệu giá của chủng virus HSV-1 và<br /> HSV-2 dùng thử nghiệm.<br /> TCID50= log [ L- d(S- 0,5)]<br /> HSV-1 (S6)<br /> HSV-2(S8)<br /> -4,8<br /> 10 /0,1ml<br /> 10-4,2/0,1ml<br /> <br /> Virus<br /> TCID50<br /> <br /> L: Log của độ pha loãng thấp nhất dùng trong thử nghiệm;<br /> d: Sự khác nhau giữa các độ pha loãng; S: [Tổng tỷ lệ các<br /> giếng hình thành đám hoại tử] x [tổng số giếng tiếp xúc]-1.<br /> <br /> Khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 trên tế<br /> bào Vero<br /> Các cao Hạ khô thảo bao gồm cao toàn phần,<br /> phân đoạn ethyl acetat và phân đoạn nước có<br /> chỉ số SI đối với HSV-1 và HSV-2 nằm trong<br /> khoảng từ 16,29 đến 28,08; riêng phân đoạn nbutanol có chỉ số SI < 10. Như vậy, cao Hạ khô<br /> thảo có khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 rất tốt,<br /> đặc biệt là phân đoạn nước tuy vẫn còn kém hơn<br /> <br /> so với acyclovir (Bảng 2). Kết quả này phù hợp<br /> với công bố của Hong-Xi và cộng sự (1999) là<br /> polysaccharid kiềm tách từ dịch chiết bằng nước<br /> nóng của Hạ khô thảo có khả năng ức chế HSV1 và HSV-2(3). Công bố của Zhang và cộng sự<br /> còn cho thấy phức hợp lignin–carbohydrat từ<br /> dịch chiết nước của cụm hoa (spike) có khả năng<br /> kháng mạnh HSV-1 và HSV-2 theo tác động ức<br /> chế quá trình bám đính và truyền vào tế bào của<br /> virus, kể cả chủng HSV-1 đề kháng acyclovir(9).<br /> Tuy nhiên phân đoạn ethyl acetat với thành<br /> phần polyphenol chiếm ứu thế cũng có chỉ số SI<br /> đối với HSV-1 và HSV-2 nằm trong khoảng từ<br /> 17,76 đến 19,46 tương đương với SI của cao toàn<br /> phần. Điều này cho thấy ngoài nhóm hợp chất<br /> polysaccharid thể hiện tác dụng ưu thế kháng<br /> HSV-1 và HSV-2 còn có nhóm hợp chất khác ở<br /> phân đoạn ethyl acetat cũng có tác dụng này.<br /> Nhóm hợp chất này có thể là nhóm polyphenol<br /> như đã phân tích và cũng được đề cập đến theo<br /> công bố của Nolkemper và cộng sự (2006)(6) với<br /> hai hợp chất chính là acid rosmarinic và acid<br /> caffeic. Nhưng nhóm chất này dường như<br /> không có sự hiệp lực với nhóm hợp chất<br /> polysaccharid và làm cho khả năng ức chế HSV1 và HSV-2 của cao toàn phần thấp hơn so với<br /> phân đoạn nước mà thành phần chủ yếu là<br /> nhóm polysaccharid. Đây là vấn đề chưa được<br /> đề cập trước đây và cần có sự nghiên cứu sâu<br /> hơn để làm sáng tỏ.<br /> <br /> Bảng 2. Kết quả khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2.<br /> Hạ khô thảo<br /> <br /> CC50 (μg/ml)<br /> <br /> Cao toàn phần<br /> Cao ethyl acetat<br /> Cao n-butanol<br /> Cao nước<br /> Acyclovir<br /> <br /> 170,48<br /> 191,31<br /> 81,08<br /> 307,03<br /> 1531,03<br /> <br /> HSV-1<br /> IC50<br /> 10,47<br /> 10,77<br /> 29,06<br /> 11,31<br /> 6,82<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Cao toàn phần Hạ khô thảo, phân đoạn<br /> ethyl acetat và phân đoạn nước đã được chứng<br /> <br /> 316<br /> <br /> HSV-2<br /> SI<br /> 16,29<br /> 17,76<br /> 2,79<br /> 27,15<br /> 224,51<br /> <br /> IC50<br /> 8,22<br /> 9,83<br /> 30,74<br /> 10,49<br /> 5,49<br /> <br /> SI<br /> 20,74<br /> 19,46<br /> 2,64<br /> 28,08<br /> 279,07<br /> <br /> minh có tác dụng ức chế HSV-1 và HSV-2 và<br /> có thể được lựa chọn hợp lý trong việc làm<br /> thuốc kháng herpes.<br /> Cảm ơn: Đề tài được thực hiện với kinh phí do Bộ Y tế hỗ trợ.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1.<br /> <br /> 2.<br /> 3.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> Dargan D.J. (1998), Investigation of the anti-HSV activity of<br /> candidate antiviral agents, Methods in Molecular Medrone,<br /> Vol 10 Herpes simplex virus Protocols, 387-405.<br /> Freshney R. I. (2005), Culture of animal cells: A manual of<br /> basic technique, Fith Edition, John Wiley & Sons, Inc, 199-216.<br /> Hong-Xi X., Spencer H.S. L., Song F. L., Robert L. W.,<br /> Jonathan B. (1999). Isolation and characterization of an antiHSV polysaccharide from Prunella vulgaris. Antiviral Res., 44,<br /> 43-54.<br /> Hứa Thị Như Cẩm, Trần Công Luận, Huỳnh Thị Kim Loan,<br /> Trần Thu Hoa (2010). Nghiên cứu tác dụng kháng virus<br /> herpes simplex (HSV) của các diterpen lacton từ Xuyên tâm<br /> liên. Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí Minh, 14, 142-146.<br /> Liu S., Jiang S., Wu Z., Lin L., Zhang J., Zhu Z., Wu S. (2002).<br /> Identification of inhibitors of the HIV-1 gp41 six-helix bundle<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> 6.<br /> <br /> 7.<br /> 8.<br /> 9.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> formation from extracts of Chinese medicinal herbs Prunella<br /> vulgaris and Rhizoma cibotte. Life Sciences, 71, 1779–1791.<br /> Nolkemper S., Reichling J., Stintzing F.C., Carle R., Schnitzler<br /> P. (2006). Antiviral effect of aquueous extracts from species of<br /> the Lamiaceae family against Herpes simplex type 1 and type 2<br /> in vitro. Planta med., 72, 1378-1382.<br /> Võ Văn Chi (1999). Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất<br /> bản Y Học, Hà Nội.<br /> World Health Organization (2004). Polio laboratory manual,<br /> immunization, vaccines and biologicals, 4th Edit., 76-78.<br /> Zhang Y., But P.P.H., Ooi V.E.C., Xu H.X., Delaney G.D., Lee<br /> S.S.H, Lee S.F. (2007). Chemical properties, mode of action,<br /> and in vivo anti-herpes activities of a lignin–carbohydrate<br /> complex from Prunella vulgaris. Antiviral Research 75, 242–<br /> 249.<br /> <br /> 317<br /> <br />