Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli có khả năng sản xuất vanillin từ axit ferulic

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC MA THỊ TRANG NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI

CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULIC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC MA THỊ TRANG NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI

CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULIC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Dương Văn Cường

Thái Nguyên - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự

hướng dẫn của TS. Dương Văn Cường tại bộ môn Sinh học phân tử và công

nghệ gen, Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên. Các số liệu, kết quả

trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào.

Mọi thông tin trích dẫn trong luận văn này được ghi rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, ngày 14 tháng 5 năm 2016

Tác giả luận văn

Ma Thị Trang

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Dương

Văn Cường đã hướng dẫn và chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu,

thực hiện và hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ.

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học sự sống, các

thầy cô tại bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ gen đã tạo điều kiện giúp

đỡ tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn.

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo khoa Khoa học sự sống, trường Đại học

Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi

trong thời gian tôi học tập và hoàn thành khóa học này.

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng

nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ khó khan cùng tôi trong

suốt quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thiện luận văn này.

Thái nguyên, ngày 14 tháng 10 năm 2016

Tác giả luận văn

Ma Thị Trang

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ................................................ vi DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. vii DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................. viii

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ....................................................... 3 4.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................ 3 4.2. Ý nghĩa thực tiễn ......................................................................................... 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4 1.1. Giới thiệu về vanillin ................................................................................... 4 1.1.1. Nguồn gốc ........................................................................................ 4 1.1.2. Cấu trúc, đặc điểm lí hóa .................................................................. 5 1.1.3. Đặc tính sinh học .............................................................................. 6 1.1.4. Vai trò vanillin trong công nghiệp và đời sống .............................. 8 1.2. Các con đường sinh tổng hợp vanillin ...................................................... 10 1.2.1. Con đường sinh tổng hợp vanillin trong thực vật .......................... 10 1.2.2. Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic trong vi sinh vật .... 10 1.3. Các phương pháp sản xuất vanillin ........................................................... 15 1.3.1. Phương pháp tách chiết vanillin từ thực vật .................................. 15 1.3.2. Sản xuất vanillin bằng tổng hợp hoá học ....................................... 16 1.3.3. Sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ sinh học ................... 18

1.4. Tiềm năng ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp trong sản xuất

vanillin ............................................................................................ 21

1.4.1. Các gene mã hóa các enzyme sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic .................................................................................................................. 21

1.4.2.Vi khuẩn E. coli và khả năng sử dụng làm vật chủ sản xuất vanillin. .................................................................................................................. 23

1.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất vanillin bằng ứng dụng công

nghệ ADN tái tổ hợp trong nước và ngoài nước ........................... 26 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................. 26 1.5.2. Các nghiên cứu trong nước ............................................................ 29

Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 30 2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 30 2.1.1 . Các chủng vi sinh vật .................................................................... 30 2.1.2. Các vector tách dòng và biểu hiện nền tảng ................................... 30 2.1.3. Mồi khuếch đại các gene gltA, fcs và ech. ............................... 35 2.1.4. Hóa chất .......................................................................................... 36 2.1.5. Thiết bị ........................................................................................... 37 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................. 37 2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 38 2.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 38 2.4.1. Quy trình tách dòng gene và thiết kế vector biểu hiện .................. 38 2.4.2. Nhân gene đích bằng PCR ............................................................. 41 2.4.3. Điện di trên gel agarose .................................................................. 42 2.4.4. Tách chiết ADN plasmid ................................................................ 43 2.4.5. Lập bản đồ giới hạn ........................................................................ 44 2.4.6. Thu nhận ADN từ gel agarose ....................................................... 45 2.4.7. Nối ADN bằng ADN ligase ........................................................... 46 2.4.8. Chuẩn bị tế bào khả biến ................................................................ 46 2.4.9. Biến nạp ADN vào E. coli khả biến ............................................... 47 2.4.10. Xác định trình tự nucleotide ......................................................... 47 2.4.11. Phân tích trình tự gene đã tách dòng ............................................ 48 2.4.12. Nuôi E. coli sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic ....................... 48 2.4.13. Lên men sinh tổng hợp vanillin từ cơ chất axit ferulic ................ 49 2.4.14.Phân tích vanillin và axit ferulic bằng HPLC ............................... 50

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 51 3.1. Tách dòng và giải trình tự các gene mã hóa các enzyme xúc tác

con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic ............................ 51

3.1.1. Tách dòng và giải trình tự gene gltA từ E. coli DH5α ................... 51 3.1.2. Tách dòng và giải trình tự gene ech từ Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668 ............................................................................................ 55 3.1.3. Tách dòng và giải trình tự gene fcs từ từ Amycolatopsis sp. HR104 . 60

3.2. Thiết kế vector biểu hiện chứa 3 gene gltA, ech, fcs trên nền

tảng vector pET22b+ ...................................................................... 65 3.2.1. Chuyển gene gltA từ pTZ-gltA sang pET22b+ tạo vector tái tổ hợp pET22-G ................................................................................................... 65 3.2.2. Chuyển gene ech từ pTZ-ech sang pET22-G tạo vector tái tổ hợp pET22-GE ................................................................................................ 68 3.2.3. Chuyển gene fcs từ pTZ-fcs sang pET22-GE tạo vector tái tổ hợp pET22-GEF .............................................................................................. 71 3.3.1. Chuyển gene fcs từ pTZ-fcs sang vector pRSET tạo vector pRSET-F .. 72 3.3.2. Chuyển cụm hai gene gltA và ech từ pET22-GE sang pRSET-F tạo vector tái tổ hợp pRSET-GEF .................................................................. 73

3.4. Sinh tổng hợp vanillin từ axit fefulic sử dụng E. coli tái tổ hợp làm tế bào

chủ ................................................................................................... 75 3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ axit ferulic đến sinh trưởng của E. coli .. 75 3.4.2. Xác định axit ferulic tồn dư và vanillin được tổng hợp bởi hệ thống pET22 ........................................................................................................ 76

3.5. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên năng suất sinh tổng

hợp vanillin .................................................................................... 77 3.5.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ................................................. 77 3.5.2. So sánh các môi trường LB, M9 và 2YT ....................................... 78 3.5.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG................................. 79

3.6. So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin giữa hai hệ vector

pET22 và pRSET ........................................................................... 80 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 82 4.1. Kết luận ..................................................................................................... 82 4.2. Kiến nghị ................................................................................................... 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 83

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

: 4-hydroxycinnamate-CoA ligase 4-CL

: Adenosine triphosphate ATP

: Base pair Bp

: Carbon tetrachloride CCl4

: Coenzyme Acetoacetyl CoA

ĐHQGHN : Đại học quốc gia Hà Nội

ADN : Deoxyribonucleic acid

ADN-PK : ADN protein kinase

: Deoxyribonucleotide triphosphate dNTP

: Escherichia coli E. coli

EDTA : Etilenduamin tetraacetic acid

: 4-hydroxycinnamate CoA-hydratase/lyase HCLC

: Isopropy Thyogalactoside IPTG

: Kilo base Kb

: Lauria Broth LB

NCBI : NationCenter for Biotechnology Information

PCR : Polymerase Chain Reaction

: Sodium doecyl sulfat SDS

: Tris acetate EDTA TAE

: Tricarboxylic acid TCA

: Vanillyl alcohol oxidase VAO

: 5-bromo-4chloro-3indoly-β-D-galactoside X-gal

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các đặc tính hóa lí của vanillin ......................................................... 5 Bảng 2.2: Mức độ sử dụng vanillin trong các hạng mục thực phẩm ................ 8 Bảng 2.3: Hàm lượng vanillin có trong các mặt hàng thực phẩm và mỹ

phẩm ................................................................................................. 9 Bảng 2.4: Các chủng vi sinh vật với khả năng sản xuất vanillin trên ............. 20 Bảng 3.1: Các thành phần của vector pTZ57R/T ............................................ 32 Bảng 3.2: Các thành phần của vector pRSET – A ........................................... 33 Bảng 3.3: Các thành phần của vector pET22b (+) ........................................... 34 Bảng 3.4: Trình tự mồi khuếch đại gene .......................................................... 35 Bảng 3.5: Danh mục các thiết bị ...................................................................... 37 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng PCR .............................................................. 41 Bảng 3.7: Thành phần phản ứng cắt enzyme ................................................... 45 Bảng 3.8: Thành phần phản ứng nối ............................................................... 46 Bảng 3.9: Chương trình chạy HPLC phân tích axit ferulic và vanillin ........... 50

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Sơ đồ phân bố vanilla trên thế giới .................................................... 4 Hình 1.2: Công thức cấu tạo của vanillin và vanillin dạng bột ......................... 5 Hình 1.3: Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA dependent).............. 11 Hình 1.4: Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent) ................. 12 Hình 1.5: Con đường Non-oxidation decarboxylataion................................... 13 Hình 1.6: Con đường CoA-Independent Deacetylation ................................... 14 Hình 1.7: Con đường Side-Chain Reductive .................................................. 15 Hình 1.8: Thứ tự các phản ứng tổng hợp vanillin từ guaiacol (Kirk

& Othmer, 1983) ............................................................................ 17

Hình 1.9: Con đường phân hủy axit ferulic trong Pseudomonas

fluorescens BF13 (Calisti et al., 2008) ........................................... 23

Hình 1.10: Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic (Yoon et al.,

2005) ............................................................................................... 24

Hình 1.11: Sơ đồ con đường tái sử dụng CoA từ acety-CoA (Lee et

al., 2009) ......................................................................................... 25 Hình 2.1: Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T .............................................. 30 Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc vector pRSET-A ...................................................... 32 Hình 2.3: Cấu trúc vector biểu hiện pET22b(+) .............................................. 33 Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tách dòng các gene gltA, ech, fcs từ E.coli

DH5 , ............................................................................................ 39 Hình 2.5: Sơ đồ quy trình thiết kế vector biểu hiện chứa các gene ................. 40 Hình 2.6: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene ech ................ 41 Hình 2.7: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene fcs ................. 42 Hình 3.1: Sản phẩm PCR gene gltA (A), sản phẩm PCR sau khi tinh

sạch (B) và ADN plasmid các dòng khuẩn lạc màu trắng ............. 51

Hình 3.2: Plasmid tái tổ hợp có khả năng mang gene gltA được cắt

bằng enzyme NcoI.......................................................................... 53 Hình 3.3: Kết quả xác định trình tự gene gltA ................................................. 54 Hình 3.4: Kết quả PCR khuếch đại gene ech ................................................... 55 Hình 3.5: Kết quả sàng lọc các dòng mang vector pTZ-ech ........................... 56 Hình 3.6: (A) Thiết kế in silico vector pTZ-ech; (B) Kết quả cắt

kiểm tra vector tái tổ hợp đồng thời bằng SacI và EcoRI .............. 57

Hình 3.7: Kết quả xác định trình tự gene ech .................................................. 59 Hình 3.8: Kết quả tách ADN tổng số từ Amycolatopsis sp. HR104

(DSM 9991) ..................................................................................... 60

Hình 3.9: Sản phẩm PCR gene fcs (A), plasmid các dòng có khả năng mang gene fcs (B), cắt plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI và BamHI (C). ..................................................................... 61 Hình 3.10: Kết quả xác định và phân tích trình tự gene fcs ............................. 64 Hình 3.11: Kết quả sàng lọc dòng mang vector pET22-G .............................. 66 Hình 3.12: Cắt plasmid dòng 1,7 bằng đồng thời 2 enzyme HindIII

và SacI ............................................................................................ 66

Hình 3.13: Minh hoạ cơ sở kiểm tra chiều gắn gene gltA trong

pET22-G ......................................................................................... 67 Hình 3.14: Kết quả cắt pET22-G dòng 1,7 bằng enzyme NcoI ....................... 68 Hình 3.15: Kết quả sàng lọc dòng mang vector pET22-GE ........................... 68 Hình 3.16: Kết quả cắt các dòng plasmid đồng thời bằng SacI và

EcoRI .............................................................................................. 69

Hình 3.17: Minh họa cơ sở kiểm tra chiều gắn gene ech trong

pET22-GE ...................................................................................... 70

Hình 3.18: Kết quả cắt các dòng plasmid đồng thời bằng EcoRI và

BamHI ............................................................................................ 71

Hình 3.19: Thiết kế vector tái tổ hợp pET22 mang 3 gene gltA, ech

và fcs .............................................................................................. 71

Hình 3.20: ADN plasmid của các khuẩn lạc trắng có khả năng mang pRSET-F (A) và cắt plasmid bằng enzyme SacI và BamHI (B) ...................................................................................... 72

Hình 3.21: Cấu trúc theo lý thuyết của vector pRSET-GEF (A), cắt plasmid bằng các tổ hợp enzyme khác nhau (B) và Marker 1kb được dùng làm thang chuẩn để xác định kích thước các băng của sản phẩm cắt (C)............................................. 74

Hình 3.22: Ảnh hưởng của nồng độ axit ferulic ban đầu với sinh

trưởng của E. coli tái tổ hợp mang vector pET22-GEF ................. 75

Hình 3.23: Phân tích HPLC động học sự chuyển hóa axit ferulic thành vanillin ở chủng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp mang vector pET22-GEF. .............................................................. 76

Hình 3.24: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp vanillin của chủng E. coli tái tổ hợp. ................................................................................................. 77

Hình 3.25: So sánh khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp vanillin của E. coli tái tổ hợp trên các môi trường LB, M9 và 2YT................................................................................................. 78

Hình 3.26: Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến sinh tổng hợp

vanillin. ........................................................................................... 79

Hình 3.27: So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin từ cơ chất axit ferulic sử dụng các chủng E. coli tái tổ hợp mang vector pET22-GEF và pRSET-GEF ............................................ 80

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) là một chất thơm quan

trọng được sử dụng phổ biến trên thế giới trong công nghiệp thực phẩm, đồ

uống, nước hoa, dược phẩm, dinh dưỡng [66]. Mức độ tiêu thụ hàng năm trên

thế giới vào khoảng hơn 12000 tấn [44]. Vanillin còn thể hiện các đặc tính

chống khuẩn và chống oxy hóa [71], đồng thời đã có nghiên cứu chứng minh

vanillin có tác dụng chống đột biến và ung thư [71].

Vanillin được sản xuất chủ yếu từ nguồn tách chiết vỏ quả của loài lan

Vanilla planifolia và tổng hợp nhân tạo từ eugeneol, lignin…Trong đó,

vanillin được tách chiết từ thực vật chỉ đáp ứng 1% nhu cầu thị trường, còn lại

là tổng hợp hóa học. Giá trị kinh tế của vanillin tự nhiên từ Vanilla

planifolia có giá lên tới 4000 đôla một kilogam, trái lại vanillin nhân tạo

chỉ vào khoảng 15 đôla trên một kilogram [84]. Tuy nhiên, vanillin nhân

tạo không được đánh giá tương đương như vanillin tự nhiên theo quy định

của Mỹ và Châu Âu do thiếu hẳn các hương vị thuần khiết của vanillin tự

nhiên và quá trình tổng hợp gây ảnh hưởng xấu tới môi trường [51].

Sự khác biệt lớn giữa giá trị của vanillin tự nhiên với vanillin tổng hợp

đã kích thích mối quan tâm của ngành công nghiệp hương liệu để sản xuất ra

vanillin tự nhiên, bảo vệ môi trường và hiệu quả kinh tế bằng các con đường

sinh tổng hợp thông qua các chuyển hóa sinh học nhờ vi sinh vật từ các nguồn

cơ chất như axit ferulic, eugeneol, isogeneol, lignin,…

Trong các nguồn cơ chất trên, axit ferulic được nghiên nhiều về các con

đường chuyển hóa để tạo ra vanillin có thể được ghi nhãn tự nhiên. Axit

ferulic có nhiều trong thành tế bào của thực vật hai lá mầm nên có thể thu từ

các phế phụ phẩm nông nghiệp. Một số vi sinh vật có khả năng phân hủy axit

ferulic để tạo ra vanillin như Amycolatopsis sp. strain HR167 [6], Delftia

acidovorans [63], Pseudomonas putida [62], Streptomyces setonii [73],

Pseudomonas fluorescens [53],…Vanillin mặc dù được tổng hợp từ các vi

sinh vật trên song nó bị phân hủy thành các hợp chất khác, do vậy làm giảm

nồng độ vanillin tạo ra. Đồng thời quá trình lên men một số xạ khuẩn thường

gặp khó khăn bởi dịch nuôi cấy có độ nhớt cao do sự sinh trưởng của hệ sợi

nấm và bào tử.

Với những khó khăn trên, hướng nghiên cứu tiếp theo là tổng hợp

vanillin trong các vi khuẩn không mang gene sinh tổng hợp cũng như không

có con đường phân hủy vanillin bằng kĩ thuật ADN tái tổ hợp. Trong số đó, E.

coli được xem là một vật chủ tiềm năng bởi các lý do sau:

- Vanillin tạo ra bằng con đường này được chấp nhận là vanillin tự nhiên.

- Axit ferulic chiếm tỉ lệ cao trong mô thực vật, do đó là nguồn cơ chất

phổ biến, rẻ tiền tận dụng từ phụ phẩm nông nghiệp.

- Ở các loại vật chủ khác, vanillin sau khi tạo thành nhanh chóng bị

chuyển hóa thành các sản phẩm khác, hoặc là bị chính vật chủ tái sử dụng như

một nguồn cacbon. E. coli là vật chủ không mang các con đường chuyển hóa

này, do đó sản xuất vanillin nhờ E. coli không bị yếu điểm này.

- E. coli là loài vi khuẩn lành tính, đặc điểm di truyền cũng như quy trình

lên men đã được nghiên cứu kĩ.

Từ các luận điểm trên, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này với

mục tiêu sử dụng kĩ thuật di truyền để tạo ra chủng vi khuẩn E. coli tái tổ hợp

chứa các gene của con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic. Chủng E.

coli này sẽ có khả năng sản xuất ra vanillin tự nhiên từ axit ferulic.

2. Mục tiêu của đề tài

Tạo được chủng Escherichia coli tái tổ hợp mang các gen mã hóa cho

enzyme sinh tổng hợp axit ferulic thành vanillin.

3. Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Tách dòng gene gltA, ech và fcs

Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện mang các gen gltA, ech, fcs

Nội dung 3: Đưa vector biểu hiện vào tế bào chủ, cảm ứng biểu hiện các

gen đích

Nội dung 4: Phân tích sản phẩm vanillin được tạo thành

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1. Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo được chủng E.coli có khả năng sản

xuất ra vanillin từ axit ferulic là nền tảng để thực hiện nhiều nghiên cứu

ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp để tạo ra sản phẩm thực tiễn. Giúp bổ

sung thêm dữ liệu cho việc nghiên cứu các đối tượng tiếp theo. Là nguồn

tài liệu tham khảo hữu ích cho các nghiên cứu tiếp theo về công nghệ ADN

tái tổ hợp.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài là tiền đề để sản xuất vanillin từ vi sinh

vật giúp cung cấp cho thị trường lượng vanillin tự nhiên với giá cả phù hợp

với túi tiền người tiêu dùng.

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về vanillin

1.1.1. Nguồn gốc

Vanillin là hỗn hợp chất thơm tự nhiên phổ biến trên thế giới được tách chiết

từ vỏ quả loài lan Vanilla planifolia. Trong số hơn 250 thành phần chất hóa học

khác nhau được tách chiết từ vỏ quả, vanillin chiếm thành phần chủ yếu.

Lịch sử về nguồn gốc vanillin bắt đầu từ sự khám phá ra loài lan Vanilla

planifolia ở Mesoamerica suốt những năm 1930. Người Aztecs (Mexico) được coi

là cái nôi đầu tiên trong việc sử dụng vanilla cho đồ uống của họ. Sau đó, người

Tây Ban Nha xâm chiếm và mang nó về Châu Âu, song mọi cố gắng để có thể

trồng được cây Vanilla planifolia đều thất bại do không có sự thụ phấn tự nhiên.

Cho đến khi nhà thực vật học Charles Morren phát hiện ra bí mật của sự miễn

cưỡng sinh sản ở những vùng đất ngoài Mexico, điều này đã dẫn tới khám phá ra

sự thụ phấn nhân tạo cho hoa cuả vanilla [71].

Ngày nay, vanilla được trồng phổ biến ở một số quốc gia như Indonesia,

Trung Quốc, Madagascar, Mexico,…

Hình 1.1: Sơ đồ phân bố vanilla trên thế giới

1.1.2. Cấu trúc, đặc điểm lí hóa

Vanillin có dạng bột kết tinh màu trắng với mùi thơm mạnh, dễ chịu. Về mặt

hóa học, vanillin là một phenolic aldehyde (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde),

có công thức phân tử là C8H8O3, bao gồm các nhóm aldehyte, ete, phenol [18].

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của vanillin và vanillin dạng bột

(Converti et al., 2010)

Các đặc tính lí hóa của vanillin được thể hiện dưới bảng sau:

Bảng 1.1: Các đặc tính hóa lí của vanillin

(Ravendra, Sharma, & Prem Shanker, 2012)

Đặc tính Dữ liệu

Trọng lượng phân tử 152.15

Nhiệt độ nóng chảy 80-810C

Nhiệt độ sôi 2850C

Độ hòa tan 1g/100ml

Tỉ trọng hơi (không khí=1) 5.2

Áp suất hơi 2.2 x 10-3 mmHg ở 250C

Hằng số phân li pKa1= 7.40, pKa2= 11.4(250C)

1.1.3. Đặc tính sinh học

Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra những đặc tính của vanillin như

chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, chống bệnh hồng cầu lưỡi

liềm,… [71].

1.1.3.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật

Vanillin và dẫn xuất thể hiện mức độ khác nhau về hoạt tính kháng

nấm bao gồm các loại nấm men, nấm mốc gây hư hại thực phẩm [23].

Vanillin còn ức chế sự sinh trưởng của nấm men và nấm mốc trong nước hoa

quả ép, thạch hoa quả [45] và trong bảo quản xoài chế biến tươi và chống lại

một số nấm men gây bệnh quan trong trong y học như Candida albicans,

Cryptococcus neoformans [16], [56].

Vanillin đóng vai trò như một tác nhân kháng khuẩn chống lại

Escherichia coli, Lactobacillusp lantarum, Listeria innocua. Schiff bases

(thuốc nhuộm fuchsin) có nguồn gốc từ vanillin được đánh giá là một chất

kháng khuẩn chống lại một số chủng Gram dương và gram âm như

Pseudomonas pseudoalcaligenes, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii,

[76]. Tuy nhiên cần có hướng nghiên cứu xác định nồng độ nhỏ nhất mà ở

Enterobacter aero-genes, Staphylococcus subfava, Bacillus megaterium

đó vanillin hoạt động như một chất kháng vi sinh vật cũng như chất bảo

quản tự nhiên.

1.1.3.2. Hoạt tính kháng oxy hóa

Vanillin đã được công nhận với khả năng chống oxy hóa cũng như

hoạt tính phân hủy các gốc tự do. Vanillin có khả năng chống lại các tổn

thương ở não dưới sự cảm ứng của carbon tetrachloride (CCl 4) tác nhân

gây oxy hóa ở chuột [47], bảo vệ lớp màng ty thể gan khỏi quá trình oxy

hóa được cảm ứng bởi sự nhạy cảm ánh sáng trên ty thể gan chuột [35]. Sự

có mặt của vanillin với lượng nhỏ trong thực phẩm cũng giúp chống lại oxy

hóa, ức chế sự tự oxy hóa ở sữa béo.

1.1.3.3. Hoạt tính chống ung thư và đột biến

Vanillin đã được nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư và đột biến.

Vanillin ức chế đột biến ở locus CD59 trên NST 11 ở người được cảm

ứng bởi hydrogene peroxide, N-methyl-N-nitrosoguanidine và mitomycin

C [27]. Vanillin ức chế con đường Non-homologous ADN end- joining

(NHEJ) gây ra sự đứt gãy trên mạch kép ADN bởi ức chế hoạt tính của

ADN-PK (ADN protein kinase), làm giảm số lượng khối u ruột cảm ứng

bởi nhiều tác nhân trong mô hình chuột [7].

1.1.3.4. Hoạt tính hạ lipid trong máu

Vanillin được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển tình trạng bệnh lí

như siêu mỡ trong máu. Hoạt tính dược lí của vanillin như một tác nhân

hạ lipid trong máu khi nồng độ vượt quá phạm vi cho phép trong điều trị

bệnh tiểu đường (type 2), rối loạn tim mạch, béo phì. Trước đó đã có

nghiên cứu vanillin làm giảm lượng triglycerin trong huyết tương,

triglycerin liên kết với lipoprotein và triglycerin trong gan trên đối tượng

chuột [72].

1.1.3.5. Hoạt tính chống tạo hồng cầu lưỡi liềm

Vanillin trong các thí nghiệm in vitro đã chứng minh khả năng

chống tạo hồng cầu lưỡi liềm bởi tác động của nhóm aldehyde với

hemoglobin trong tế bào hồng cầu [5]. Tuy nhiên vanillin được hấp thụ

theo đường uống không có tác động trị liệu bởi vì nó có sự phân hủy

nhanh chóng trong dịch tiêu hóa. Để khắc phục vấn đề này, chế phẩm

vanillin MX- 1520 đã được tổng hợp. Lợi ích sinh học của loại thuốc

này chống tạo thành hồng cầu lưỡi liềm mạnh gấp 5 lần so với vanillin

tự nhiên [89].

1.1.3.6. Các hoạt tính khác

Các loại dầu dễ bay hơi tách chiết từ nghệ, cỏ xả, húng quế kết

hợp với 5% vanillin có tác dụng hiệu quả chống lại các loài muỗi [74].

1.1.4. Vai trò vanillin trong công nghiệp và đời sống

Vanillin được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất

nước hoa, mỹ phẩm và dược phẩm [71].

Trong công nghiệp thực phẩm, vanillin là một phụ gia rất thông dụng,

đặc biệt trong sản xuất kem đá lạnh (ice cream). Ngoài sử dụng trong sản xuất

kem, vanillin còn được dùng rất nhiều để làm tăng hương vị và tạo mùi thơm

cho bánh, kẹo, cho các loại đồ uống.

Hương thơm đặc trưng của vanillin được sử dụng trong lĩnh vực mỹ

phẩm như tạo mùi cho nước hoa, kem, sữa dưỡng ẩm, nước hoa xịt phòng, xà

phòng ,….

Bảng 1.2: Mức độ sử dụng vanillin trong các hạng mục thực phẩm

Mức độ sử dụng (ppm) Sản phẩm Bình thường Tối đa

74.5 Đồ nướng 106.0

353.0 Ngũ cốc 353.0

96.0 Chất béo, tinh dầu 100.0

358.0 Nước sốt ngọt 363.0

47.7 Bánh pudding 117.0

200.0 Đồ ăn nhẹ 200.0

39.4 Đồ uống loại I 97.4

221.0 Các sản phẩm sữa 314.0

26.7 Đồ uống loại II 55.2

1.5 Bơ sữa đông lạnh 2.7

247.0 Các sản phẩm sữa 408.0

30.1 Kẹo mềm 47.1

Nguồn: CAS N°: 121-33-5

Bảng 1.3: Hàm lượng vanillin có trong các mặt hàng thực phẩm và mỹ phẩm

Sản phẩm Hàm lượng TLTK Trạng thái vật lí

(Furia & Bellanca, 1975)

Hoà tan hoặc rắc lên bề mặt

ACF ChemieFarmaNV

Đồ uống không cồn Kem Kẹo Đồ nướng Nước ngọt Chocolate Kẹo Bonbons Chocolate sữa Đường cô Mứt kẹo Đường vanillin Bột

Nước hoa

Kem, sữa dưỡng ẩm Hòa tan Opdyke, 1977

Xà bông 0.0063% 0.095% 0.02% 0.022% 0.033-2.0% 0.097% Lên tới 0.05% Lên tới 0.03% Lên tới 0.015% Lên tới 0.055% 2% Bình thường: 0.2% Tối đa: 0.8% Bìnhthường:0.005% Tối đa: 0.03% Bình thường:0.01% Tối đa: 0.1%

Nguồn: CAS N°: 121-33-5

Vanillin còn được sử dụng trong tổng hợp thuốc một số loại thuốc như:

Aldomet (thuốc chống tăng huyết áp), L-dopa (điều trị di chứng của bệnh

Parkinson) và Trimethoprim (điều trị chứng viêm đường hô hấp cấp và một số

biến dạng của bệnh hoa liễu) [18], [24].

Vanillin còn là một chất khử mùi hữu hiệu để che giấu mùi khó chịu của

nhiều loại mặt hàng như đồ may mặc, sản phẩm cao su, giấy và chất dẻo,…Thông

thường chỉ cần đến một lượng nhỏ, vì mùi của vanillin có thể cảm nhận được ngay

ở độ pha loãng khoảng 0,0000002 mg trong 1 m3 không khí [2]. Ngoài ra, vanillin

còn được sử dụng ngăn chặn tạo bọt trong sự bôi trơn nhiều loại dầu, làm sáng

trong lớp phủ kẽm bồn tắm, hỗ trợ sự oxi hóa tinh dầu hạt lanh, hấp dẫn côn trùng,

ngăn chặn xỉn màu răng gây ra bởi khói thuốc lá, hòa tan vitamin B1 và xúc tác

phản ứng trùng hợp methyl methacrylate [39].

1.2. Các con đường sinh tổng hợp vanillin

1.2.1. Con đường sinh tổng hợp vanillin trong thực vật

Quả vanilla được thu hoạch khoảng từ 6 đến 8 tháng sau quá trình

thụ phấn và ở giai đoạn này chúng chưa bộc lộ ra hương vanilla [79].

Mùi hương chỉ được giải phóng ra trong quá trình lên men, được

gọi là “curing”. Khi glucoside, glucovanillin, các ß-glucoside liên quan

bị thủy phân bởi enzyme ß-D-glucosidase sẽ giải phóng ra vanillin tự

do và các chất liên quan [57].

Mặc dù vanillin là một trong số những chất hóa học được nghiên

cứu nhiều song những con đường sinh tổng hợp chúng trong thực vật

vẫn c̣n gây nhiều tranh luận, bởi v́ chưa có nghiên cứu chính xác nào

xác định và nêu ra đặc trưng của tất cả các bước trong con đường được

đề xuất. Có một giả thiết nói rằng vanillin là sản phẩm của con đường

acid shikimic. Ở con đường này, phenylalanine hoặc tyrosine trải qua

khử amin hóa tới C6 – C3 phenylpropanoid, tiếp đó đóng vai trò như

một cơ chất cho vanillin [30].

1.2.2. Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic trong vi sinh vật

Một số vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đã được nghiên cứu để

xác định các gene mã hóa các enzyme xúc tác phản ứng tổng hợp vanillin từ các

cơ chất khác nhau như lignin, eugeneol, isoeugeneol, axit ferulic, glucose,…Trong

đó đáng chú ý nhiều là các chuyển hóa sinh học từ axit ferulic.

Axit ferulic (acid 4-hydroxy-3-methoxycinnamic) là một thành phần phổ

biến trong thực vật được tạo ra từ sự trao đổi chất phenylpropanoid, kết hợp

với acid dihydroferulic tạo nên tính vững chắc của thành tế bào bằng liên kết

chéo giữa lignin và polysacchatide [58].

Axit ferulic là thành phần phenolic chủ yếu được tìm thấy trong thành tế

bào của thực vật hai lá mầm, nên nó có thể được thu từ các nguồn phế phẩm

nông nghiệp như vỏ ngu, cám ngu, củ cải đường, thành tế bào nội nhũ gạo,

lúa mỳ, lúa mạch. Axit ferulic còn là cơ chất ít độc tính nhất với vi sinh vật

trong số các cơ chất được nghiên cứu. Vì vậy, có thể coi đây là cơ chất thích

hợp cho sản xuất vanillin sinh học [50].

Các nhà nghiên cứu đã đưa ra 5 con đường chuyển hóa axit ferulic thành

vanillin, đó là con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent), β-

oxidative deacetylation (CoA-dependent), Non-oxidative decarboxylation,

CoA-Independent Deacetylation, Side-Chain Reductive .

1.2.2.1. Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)

Các gene mã hóa enzyme cần cho con đường Non-β-oxidative deacetylation

đã được xác định và xác nhận hoạt tính của chúng [25].

Hình 1.3: Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)

(Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)

Con đường này có ba bước xúc tác với sự tham gia của hai enzyme: 4-

hydroxycinnamate-CoA ligase (4-CL) hay feruloyl-CoA synthetase, mã hóa bởi

gene fcsvà 4-hydroxycinnamate CoA-hydratase/lyase (HCHL) hay enoyl-CoA

hydratase/aldolas được mã hóa bởi gene ech. Đầu tiên, enzyme HCHL chuyển axit

ferulic thành feruloyl-ScoA, sau đó 4-CL xúc tác thủy phân feruloyl-ScoA thành

một chất trung gian tạm thời 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-b-hydroxypropionyl-

ScoA và tách chuỗi bên theo kiểu retro-aldol thành vanillin và acetyl-ScoA. Một

gene khác liên kết với gene fcs và gene ech mã hóa enzyme vanillin-xidoreductase

gây oxi hóa vanillin thành sản phẩm khác [25].

Các gene và enzyme tham gia vào các phản ứng tương ứng đã được xác

định ở các chủng Pseudomonas fluorescens AN103 [25], Pseudomonas sp.

HR199 [59], Streptomyces setonii [51], Amycolatopsis sp.HR167 [6], Delftia

acidovorans [63], and Pseudomonas putida KT2440 [62]. Sự nhận biết về đặc

trưng của các gene mã hóa cho các enzyme đưa ra cơ hội mới cho điều hướng trao

đổi chất và cấu trúc các chủng tái tổ hợp.

1.2.2.2. Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)

Con đường β-oxidation deacetylation được đề xuất cho P. Putida [88]

và Rhodotorula rubra [32].

Hình 1.4: Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)

(Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)

Bước đầu là sự hình thành feruloyl-ScoA từ axit ferulic được xúc tác

bởi enzyme 4-CL. Bước thứ hai enzyme HCHL xúc tác phản ứng cộng nước

để tạo thành 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-b-ketopropionyl-ScoA và trải qua

quá trình lưu phân (thyolytic)thành vanillyl-ScoA và acetyl-ScoA. Tiếp theo,

vanillyl-ScoA cộng nước (hydrate) và loại CoASH hình thành vanillin, bước

này được xúc tác bởi enzyme b-ketoacyl-CoA-thiolase (aat).

1.2.2.3. Con đường non-oxidative decarboxylation

Đầu tiên là sự tham gia của enzyme decarboxylase xúc tác phản ứng

đồng phân hóa axit ferulic thành một chất quinoid trung gian và sau đó loại

gốc cacboxyl tạo thành 4-vinylguaiacol [33].

Hình 1.5: Con đường Non-oxidation decarboxylataion

(Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)

Các chất trung gian của các phản ứng xuôi dòng tiếp theo giữa 4 -

vinylguanicol và vanillin chưa được xác định. Đặc trưng của mỗi loại

enzyme decarboxylase phụ thuộc vào từng vi sinh vật [13]. Trong số đó

ở nấm men Brettanomyces anomalus, enzyme được sản xuất ở mức độ

thấp và được cảm ứng nhờ sự bổ sung của cơ chất [22].

Rhodotorulaglutinis và Rhodotorularubra đã được báo cáo về cơ

chế trao đổi chất axit ferulic qua quá trình loại nhóm cacboxyl [32].

1.2.2.4. Con đường CoA-Independent Deacetylation

Trong suốt con đường này, liên kết đôi dạng trans của axit ferulic

cộng nước tạo thành một chất trung gian tạm thời là acid 4-hydroxy-3-

methoxy-b-hydroxypropionic.

Hình 1.6: Con đường CoA-Independent Deacetylation

(Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)

Tiếp theo bước này enzyme aldolase phân tách acetate giải phóng trực

tiếp vanillin. Ngoài ra, chất trung gian tạm thời còn có thể mất đi một

hydro thành acid 3(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)3-ketopropionic và sau đó

loại nhóm acetyl (deacetylation) thành vanillin. Một enzyme có khả năng

loại nhóm acetyl (fca) đã được xác nhận ở chủng Pseudomonas putida

WCS358 [78].

Sự tồn tại của chất trung gian tạm thời và cơ chế chính xác của con

đường này chưa được xác nhận nhận đầy đủ. Con đường CoA-Independent

Deacetylation được đề xuất cho các loài Delftia acidovorans, Pseudomonas

sp., Pseudomonas. Mira, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, E.

coli, Streptomyces setonii, Aspergillus niger, Fomes fomentarius, Fusarium

solani, Polysporus versicolor, và Rhodotorula rubra [29].

1.2.2.5. Con đường Side-Chain Reductive

Đồng thời với phản ứng loại nhóm cacboxyl, axit ferulic bị đồng phân

hóa thành một chất quinoid trung gian tạm thời mà chính nó bị khử thành acid

dihydroferulic (4-hydroxy-3-methoxyphenylpropionic acid) [69].

Hình 1.7: Con đường Side-Chain Reductive

(Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)

Con đường này đã được đề xuất cho sự biểu hiện của S. cerevisiae dưới

điều kiện yếm khí [33] hoặc Lactobacillus plantarum [13]. Tuy nhiên, sự khử

chuỗi bên này còn được báo cáo dưới điều kiện hiếu khí ở Phanerochaete

chrysosporium [26]. Phụ thuộc vào vi sinh vật mà acid dihydroferulic được

trao đổi chất tiếp theo thành homovanillic hoặc acid vanillic. Sau đó, acid

vanillic có thể được hoàn nguyên thành vanillin.

Axit ferulic ngoài là một cơ chất thích hợp cho sản xuất vanillin mà còn

biểu hiện nhiều chức năng sinh lí bao gồm các hoạt tính chống oxi hóa, kháng

khuẩn, chống viêm, chống nghẽn mạch, chống ung thư. Axit ferulic chống lại

các chứng động mạch vành, cholesterol thấp, tăng cường khả năng sống của

tinh trùng và còn được đánh giá là chất có khả năng chống lại các gốc tự do

làm giảm thiểu các tác động gây hại của quá trình oxi hóa [37].

1.3. Các phương pháp sản xuất vanillin

1.3.1. Phương pháp tách chiết vanillin từ thực vật

Vanillin tự nhiên được thu chủ yếu từ nguồn hạt và vỏ quả của loài

lan nhiệt đới Vanilla planifolia. Thời gian thu hoạch thông thường từ sáu

đến tám tháng sau khi thụ phấn. Quá trình chế biến vanilla để sản xuất

vanillin bắt đầu bằng việc ủ vỏ quả đã thu hoạch còn tươi, mục đích là

để làm ngừng lại các quá trình dinh dưỡng tự nhiên bên trong vỏ quả và

thúc đẩy nhanh chóng sự hình thành chất thơm.

Mỗi vùng miền có phương pháp ủ (curing) khác nhau, điều này

có thể là tác động chính đến sự khác biệt về chất lượng vanillin trong

vỏ quả.

Có một vài phương pháp chế biến vanilla song chủ yếu là chế biến

theo kiểu Mexico (Sun method) và Madagascar (Bourbon method) đều

bao gồm bốn giai đoạn chính [65]:

- Làm héo: Làm ngừng các quá trình tự nhiên trong vỏ quả sau thu

hoạch, đồng thời thúc đẩy các phản ứng enzyme xúc tác sự hình thành

hợp chất thơm. Điều này được nhận biết bởi các đốm nâu trên vỏ quả.

- Xông hơi: Ở bước này, nhiệt độ tăng lên nhằm thú đẩy các phản ứng

enzyme và làm khô nhanh chóng ban đầu tránh quá trình lên men gây hại xảy ra.

- Làm khô: Bước này thực hiện ở nhiệt độ thường cho đến khi khối

lượng vỏ quả đạt một phần ba so với ban đầu.

- Đóng gói: Vỏ quả được lưu trữ trong các hộp đóng khoảng ba tháng,

vào thời điểm này vanillin sẽ được tạo ra.

Để thu được vanillin, vỏ quả sẽ được ngâm trong hỗn hợp ethanolvà

nước bằng các phương pháp tách chiết khác nhau như ngâm chiết, xử lí

nhiệt,… sản phẩm có thể ở dạng lỏng hay bột tùy mục đích sử dụng.

Sản xuất vanillin tự nhiên từ nguồn thực vật không chỉ mất nhiều công

lao động mà còn bị giới hạn bởi sự dao động thất thường về năng suất cùng

với điều kiện nông nghiệp và các vấn đề về kinh tế và chính trị. Để tạo ra 1 kg

vanillin tách chiết phải cần tới 500 kg vỏ quả tương đương với gần 40000 hoa

được thụ phấn [65]. Do vậy, số lượng vanillin tách chiết tự nhiên chỉ đáp ứng

1% nhu cầu thị trường [87].

1.3.2. Sản xuất vanillin bằng tổng hợp hoá học

Quá trình hóa học đầu tiên để thu vanillin được thực hiện bởi Tiemann vào

năm 1876. Nguyên liệu là eugeneol có trong tinh dầu cây đinh hương và được sử

dụng thương mại cho đến những năm 1920. Sau đó vanillin được tổng hợp bằng

dịch kiềm sunphit giàu lignin là sản phẩm phụ của ngành công nghiệp giấy. Quá

trình tổng hợp vanillin bao gồm xử lí dung dịch lỏng chứa lignin bằng các chất oxi

hóa, pH kiềm, nhiệt độ và áp suất cao. Các chất oxi hóa có thể là không khí, oxi,

nitrobenzene hoặc không có sự hỗ trợ của các chất xúc tác. Lignin bị phân hủy và

oxi hóa, vanillin được tạo thành kèm theo các sản phẩm phụ khác [15].

Sự có mặt của các chất tạp nhiễm đòi hỏi phải sử dụng các quá trình tinh sạch

cao. Ngày nay sản xuất vanillin từ lignin không phổ biến nữa bởi vì tác động xấu tới

môi trường. Hơn nữa, dù là cơ chất có nguồn gốc từ tự nhiên song tổng hợp vanillin

từ lignin vẫn bị ghi nhãn là vanillin nhân tạo bởi vì có sự biến đổi hóa học để thu

được sản phẩm cuối cùng [31].

Ngày nay hầu hết vanillin tổng hợp được sản xuất từ nguyên liệu hóa dầu

guaiacol và acid glyoxylic [42]. Đây là một quá trình gồm hai bước bắt đầu với

phản ứng ngưng tụ trong môi trường kiềm giữa guanicol và acid glyoxylic tạo thành

acid vanillylmandelic và tiếp đó được chuyển thành vanillin bởi quá trình loại nhóm

CO2 oxi hóa. Thứ tự của các phản ứng được chỉ ra ở hình 2.8.

Hình 1.8: Thứ tự các phản ứng tổng hợp vanillin từ guaiacol

(Kirk & Othmer, 1983)

Vanillin thu được từ guaiacol bằng kĩ thuật này gần như không có các sản

phẩm phụ, do vậy vai trò của quy trình tinh sạch sản phẩm sẽ được đơn giản hóa.

Mặc dù quá trình này làm giảm tác động mạnh tới môi trường khi so sánh với

sản xuất từ lignin, song guaiacol là một sản phẩm hóa dầu cũng như vanillin khi

tổng hợp từ lignin đều có sự thay đổi hóa học mạnh tạo ra sản phẩm cuối cùng

nên chúng vẫn bị ghi nhãn “nhân tạo” [81].

1.3.3. Sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ sinh học

1.3.3.1. Sử dụng enzyme

Những hiểu biết về con đường sinh tổng hợp vanillin và các enzyme

tham gia tạo cơ sở cho việc thiết lập một hệ thống enzyme in vitro để sản xuất

vanillin.

Dignum và cộng sự đã mô tả việc sử dụng chế phẩm enzyme chứa ß-

glucosidase xúc tác phản ứng thủy phân vanillin từ glucovanillin để thu được

vanillin giải phóng từ vỏ quả vanilla như một sự thay thế quá trình ủ truyền

thống, rút ngắn thời gian [20].

Ngoài enzyme trên còn có một số enzyme khác được sử dụng để tạo ra

vanillin từ các nguyên liệu thực vật khác bằng các biến đổi sinh học. Năm

1989, Kamoda và cộng sự đã sử dụng enzyme lignostilbene αβ-dioxygenease

được thu nhận từ Pseudomonas sp. TMY1009 xúc tác sự oxi hóa giải phóng

vanillin từ Xtinben tìm thấy phổ biến trong vỏ gỗ [36].

Các enzyme được tạo ra bởi tách dòng gene mã hóa enzyme

lipoxygenease từ ðậu týõng ðã ðýợc biểu hiện trong một số vi sinh vật biến

ðổi gene ðể thãm dò khả năng tổng hợp vanillin từ este của coniferyl alcohol [48].

Vanillin còn được giải phóng từ creosol (một thành phần chính của

creosote được thu từ xử lí nhiệt gỗ hoặc than đá) và vanillylamine (được thu

bởi quá trình thủy phân capsaicin là phần cay chủ yếu của hồ tiêu). Năm

2001, Van den Huevel và cộng sự sử dụng enzyme vanillyl alcohol oxidase

(VAO), một flavoenzyme đặc trưng của Penicillium biến đổi cả creosol và

vanillylamine thành vanillin với hiệu suất cao. Sự chuyển đổi trung gian

VAO của creosol trải qua một quá trình gồm hai bước trong đó ban đầu là

sự hình thành vanillyl alcohol sau đó bị oxi hóa thành vanillin. Tuy nhiên

creosol không thể được xem như một cơ chất tự nhiên bởi vì có sự biến đổi

hóa học mạnh của gỗ hoặc than đá [77].

1.3.3.2. Nuôi cấy mô tế bào thực vật

Có một số nghiên cứu khám phá ra khả năng trao đổi chất ở thực vật để

sản xuất chất thơm trong đó có vanillin trong nuôi cấy mô tế bào như lá và

cuống lá cuả Vanilla planifolia. Chiến lược nuôi cấy mô tế bào bao gồm dinh

dưỡng của cơ chất, sử dụng hoormon ức chế các con đường cạnh tranh, cố

định tế bào, điều chỉnh điều kiện môi trường và sử dụng chất hấp phụ như

than hoạt tính, nhựa để thu hồi vanillin được tạo ra [79].

Năm 1991, Knuth và Sahai đã phát hiện rằng bản chất và nồng độ của các

cơ chất được thêm vào môi trường là một yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi

cấy V.fragrans. Phenyladenine và axit ferulic cho kết quả ít tăng cường tạo

vanillin, trong khi đó thêm vanillyl alcohol lại cho kết quả tăng hàm lượng

vanillin [40].

Năm 1993, Westcott và cộng sự đã cải tiến một quy trình sản xuất

vanillin tự nhiên từ các rễ khí sinh sử dụng axit ferulic như một chất xúc tác

sinh học. Than hoạt tính cũng được sử dụng đóng vai trò như một chất hấp

phụ vanillin tạo ra, do vậy có thể giảm thiểu được sự ức chế quá trình xảy ra.

Các mô rễ khí sinh có thể được dùng lại một vài lần nhưng hoạt tính sẽ giảm

qua mỗi lần sử dụng. Nồng độ của vanillin tạo ra cao hơn khoảng 35 lần so

với lượng vanillin ban đầu có trong mô rễ khí sinh và chiếm khoảng 40%

vanillin có trong quả vanilla trưởng thành. Sử dụng rễ khí sinh bổ sung axit

ferulic, vanillin tạo ra nhanh hơn tổng hợp bình thường trong quả từ 5 đến 10

lần. Mặc dù đã có nghiên cứu mô tả thành công sự tích lũy vanillin từ nuôi

cấy mô tế bào, song năng suất thực tế không đủ để sản xuất thương mại [80].

Ngoài ra, trong quá trình nuôi cấy mô tế bào còn gặp phải một số vấn

đề như tính không ổn định của tế bào, tỉ lệ sinh trưởng thấp, đòi hỏi điều kiện

vô trùng. Do vậy, đó không phải là lý tưởng cho sản xuất vanillin thương mại.

Hơn thế nữa, ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô trong tạo Vanilla còn là một vấn

đề mơ hồ bởi vì còn thiếu những hiểu biết về con đường sinh tổng hợp

vanillin và các enzyme tham gia [79].

1.3.3.3. Lên men vi sinh vật

Vi sinh vật với khả năng sinh trưởng nhanh chóng và tuân theo di truyền học phân tử

là những mục tiêu lý tưởng cho công nghệ sinh học và có thể được tuyển chọn cho sản

xuất vanillin bởi khả năng sinh trưởng trên các cơ chất như một nguồn cacbon và năng

lượng.

Trên thế giới đã có các nghiên cứu về quá trình lên men vi sinh vật sản xuất vanillin

từ các cơ chất khác nhau, dưới đây là bảng tóm tắt một số kết quả của các tác giả.

Bảng 1.4: Các chủng vi sinh vật với khả năng sản xuất vanillin trên

các cơ chất

Cơ chất

Vi sinh vật

Nguồn tham khảo

Năng suất(g/L) 0.28 0.44

Pseudomonas sp. TK2102 Pseudomonas sp.HR199

Eugeneol

0.24

Pseudomonas resinovorans SPR1

Pseudomonas aeruginosa

1.62

Bacillus subtilis B2

0.9

Bacillus subtilis HS8

8.1

Isoeugene ol

Pseudomonas putida IE27

16.1

Candida galli PG06

0.58

Psychrobacter sp. CSW4

1.28

(Washisu et al.1993) (Overhage et al., 1999) [51] (M. Ashengroph, Nahvi, Zarkesh-Esfahani, & Momenbeik, 2011b) [9] (M. Ashengroph, Nahvi, Zarkesh-Esfahani, & Momenbeik, 2011c) [10] (Shimoni, Ravid, & Shoham, 2000) [70] (Y. Zhang, Xu, Han, Yan, & Ma, 2006) [90] (Yamada, Okada, Yoshida, & Nagasawa, 2007) [82] (M. Ashengroph, Nahvi, Zarkesh- Esfahani, & Momenbeik, 2011a) [8] (Morahem Ashengroph, Nahvi, Zarkesh-Esfahani, & Momenbeik, 2012) [11]

11.5

(Rabenhorst & Hopp, 1997) [64]

13.9

Amycolatopsis .sp (DSM9991 or DSM9992) Streptomyces setonii ATCC 39116

Axit ferulic

fluorescens

Pseudomonas AN103

fluorescens

(Muheim, MÜLLER, Münch, & Wetli, 2012) [52] (Martínez-Cuesta, Payne, Hanniffy, Gasson, & Narbad, 2005) [49] (Calisti et al.2008) [18]

Pseudomonas BF13

** : tác giả không công bố

Mặc dù các vi sinh vật trên có khả năng tạo ra vanillin từ các cơ chất

khác nhau song chúng có nhược điểm là đều có con đường phân hủy vanillin

thành các sản phẩm phụ như acid vanillic, vanillyl alcohol,...Đối với một số

xạ khuẩn do sinh trưởng của hệ sợi nấm làm môi trường trở lên nhớt, khó

kiểm soát sự vỡ ra từng mảnh và phân giải của sợi nấm nên gây khó khăn cho

quá trình lên men.

Do vậy, yêu cầu đặt ra là phải tìm được vật chủ thích hợp để tạo chủng

tái tổ hợp biểu hiện các gene tổng hợp vanillin từ các cơ chất có sẵn, có quá

tŕnh lên men đơn giản, không có con đường phân hủy vanillin.

1.4. Tiềm năng ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp trong sản xuất vanillin

Công nghệ ADN tái tổ hợp là tập hợp các kĩ thuật tạo nên các ADN tái tổ

hợp để đưa các gene mong muốn vào các tế bào và cơ thể sống.

ADN tái tổ hợp là phân tử ADN được tạo thành từ hai hay nhiều trình tự

ADN của các loài sinh vật khác nhau. Trong kỹ thuật di truyền, ADN tái tổ

hợp thường được tạo thành từ việc gắn những đoạn ADN có nguồn gốc khác

nhau vào trong vector tách dòng hay vector biểu hiện. Những vector biểu hiện

mang gene có thể tạo thành các protein tái tổ hợp trong các sinh vật.

Đã có những nghiên cứu về sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp để tổng hợp

các hợp chất sinh học quan trọng phục vụ cho con người như: insulin [38],

hoocmon sinh trưởng ở người [68], vacxin viêm gan B [14], interlerkin [54],…

Như vậy để tổng hợp vanillin theo con đường tái tổ hợp cần tách dòng

các gene mã hóa enzyme có khả năng chuyển hóa các cơ chất thành vanillin

từ vi sinh vật đã biết, sau đó đưa các gene đó vào vector biểu hiện, biến nạp

vào tế bào vật chủ thích hợp cho phép sự biểu hiện.

1.4.1. Các gene mã hóa các enzyme sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic

Các gene mã hóa enzyme sinh tổng hợp vanillin được xác định là gene

fcs mã hóa enzyme feruloyl-coA synthetase và gene ech mã hóa enzyme

enoyl-CoA hydratase/aldolase. Hai gene trên có thể được tách dòng từ một số

vi sinh vật như: Pseudomonas fluorescens [53], Pseudomonas sp. Strain

HR199 [59], Amycolaptosis sp. strainHR167 [6], Delftia acidovorans [84],

Rhodococcussp. I24 [61]…

Để lựa chọn chủng vi sinh vật phù hợp cho tách dòng gene fcs và ech,

cần căn cứ vào một số cơ sở như:

- Chủng vi sinh vật đó có hiệu suất tổng hợp vanillin cao (mức độ biểu

hiện của 2 gene fcs, ech mạnh)

- Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic đã được xác định

- Hai gene fcs, ech trong các chủng đã được giải trình tự và công bố trên

Genebank, đây là cơ sở để thiết kế mồi cho tách dòng gene

- Các chủng được lưu giữ trong bảo tàng vi sinh vật, giảm bớt thời gian,

chi phí phân lập.

Trong số những chủng vi vật được đề xuất, Pseudomonas fluorescens có

thể được xem là đối tượng nghiên cứu thích hợp. Đây là một loài vi khuẩn

gram âm, hình que thuộc chi Pseudomonas, dựa vào phân tích vùng trình tự

16S rRNA nó được đặt vào nhóm Pseudomonas fluorescens của chi, mà nó

cho mượn tên. Các nghiên cứu thực hiện trên Pseudomonas fluorescens đã

cho thấy tiềm năng của loại vi khuẩn có lợi trong xử lý sinh học chống lại các

tác nhân gây bệnh của nhiều giống cây trồng.

Năm 2010, Di Gioia và cộng sự đã đề xuất sử dụng chủng của P.

fluorescensBF13 để sản xuất vanillin từ axit ferulic. Chủng này tạo ra

8.41 mM vanillin, cao nhất trong số các chủng của Pseudomonas [19].

Dữ liệu phân tử và sinh hóa chỉ ra rằng ở chủng Pseudomonas

fluorescens BF13 (một thành viên của chi Pseudomonas), axit ferulic bị

phân hủy qua con đường non-oxidative CoA-dependent dẫn đến sự hình

thành vanillin [17].

Hình 1.9: Con đường phân hủy axit ferulic trong Pseudomonas fluorescens

BF13 (Calisti et al., 2008)

Trong Pseudomonas fluorescens BF13, các gene tham gia vào sự phân

hủy axit ferulic được định vị trong operonech-vhd-fcs, dưới sự điều khiển của

gene điều hòa FerR với chức năng vừa kích hoạt vừa ức chế và được cảm ứng

bởi axit ferulic [17]. Các gene ech, fcs đã được tách dòng từ Pseudomonas

fluorescensBF13 và xác định trình tự, kết quả được công bố trên ngân hàng

GeneBank số AJ536325. Đây là cơ sở cho nghiên cứu tách dòng gene fcs và

ech ở chủng Pseudomonas fluorescens được phân lập tại Việt Nam.

1.4.2.Vi khuẩn E. coli và khả năng sử dụng làm vật chủ sản xuất vanillin.

Hiện nay, trong số các hệ biểu hiện protein ngoại lai thì vi khuẩn Gram

âm E. coli vẫn là một trong những hệ biểu hiện thu hút nhiều quan tâm nhất

vì chúng có tốc độ sinh trưởng nhanh với mật độ tế bào cao trên môi trường

cơ chất không đắt tiền cũng như các đặc điểm di truyền đã được nghiên cứu

đầy đủ. Trên thị trường hiện nay thương mại nhiều loại vector tách dòng,

vector biểu hiệu và chủng đột biến đối với hệ biểu hiện này. Đồng thời, trong

E. coli kiểu dại không có sự tổng hợp vanillin tự nhiên nhưng chúng có thể

tiếp nhận các gene ngoại lai để tạo ra vanillin mà không có con đường phân

hủy vanillin. Đây là cơ sở để lựa chọn E. coli làm đối tượng nghiên cứu.

Các tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp chứa 2 gene fcs và ech trong

điều kiện môi trường có chứa axit ferulic và các chất cần thiết cho sự sinh

trưởng của tế bào diễn ra quá trình tổng hợp vanillin theo sơ đồ ở hình 2.10.

Hình 1.10: Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic

(Yoon et al., 2005) Axit ferulic bị chuyển hóa thành feruloyl-CoA dưới sự xúc tác của enzyme feruloyl- CoA (mã hóa bởi gene fcs) sử dụng ATP và CoA, sau đó feruloyl-CoA cộng nước tạo thành 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-hydroxypropionyl-CoA và phân tách tạo ra vanillin và acetyl-CoA dưới sự xúc tác xủa enzyme enoyl-CoA hydratase/aldolase mã hóa bởi gene ech.

Sự tích lũy acety-CoA trong tế bào gây ra hai vấn đề chính: Một là làm

giảm nồng độ vanillin tạo ra; hai là gây thiếu CoA cho phản ứng chuyển hóa

axit ferulic thành feruloyl-CoA, dẫn đến dư thừa cơ chất có thể gây ức chế

phản ứng. Do vậy, cần có quá trình tái sử dụng tối đa lượng acety-CoA dư

thừa tạo thành CoA để khắc phục hai vấn đề trên cũng như giảm bới tiêu hao

năng lượng, tăng cường chuyển hóa axit ferulic thành vanillin. Quá trình đó

đã được Lee và cộng sự (2009) báo cáo liên quan tới một chuỗi các phản ứng

trong chu trình TCA và con đường vòng Glyoxylate với sự tham gia của gene

gltA (citrate synthase) [43].

Hình 1.11: Sơ đồ con đường tái sử dụng CoA từ acety-CoA

fcs: feruloyl-CoA synthetase; ech: enoyl-CoA hydratase/aldolase; gltA: citrate synthase; icdA: isocitrate dehydrogenease; iclR: transcription repressor; aceA: isocitrate lyase; aceB: malate synthase.

(Lee et al., 2009)

Gene gltA mã hóa enzyme citrate synthase xúc tác phản ứng đầu tiên của

chu trình TCA nơi có sự tiêu thụ acetyl-CoA giải phóng ra CoA. Sự khuếch đại

gene gltA làm tăng cường tiêu thụ acetyl-CoA để tạo ra nhiều CoA từ đó sẽ

chuyển hóa tối đa lượng axit ferulic. Ngoài con đường trên thì còn có một con

đường nữa để chuyển acetyl-CoA thành CoA đó là con đường vòng glycoxylate

nõi mà isocitrate chuyển thành glycoxylate và malate mà không thông qua α-

ketoglutarate. Như vậy, con đường vòng glucoxylate ngắn hơn chu trình TCA vì

thế có thể sẽ giảm bớt tiêu hao năng lượng [43].

Để thực hiện con đường này cần có sự tham gia của hai enzyme

isocitrate lyase và malate synthase mã hóa bởi gene aceA, aceB. Tuy nhiên,

sự phiên mã của operon aceAB bị ức chế bởi gene điều hòa iclR. Do vậy để

sử dụng tập trung acetyl-CoA theo con đường này cần giải ức chế hai gene

aceA và aceB bằng cách xóa bỏ gene iclR, đồng thời xóa bỏ gene icdA bởi vì

isocitrate có ái lực với enzyme isocitrate dehydrogenease (icdA) hơn enzyme

isocitrate lyase (aceA).

Gene gltA được xác định nằm trong nhiễm sắc thể của E. Coli [55] và đã

được tách dòng và giải trình tự, kết quả được công bố trên ngân hàng

GeneBank số EG10402.

Như vậy để tăng cường hiệu suất sản xuất vanillin trong E. coli cần kết

hợp ba gene fcs, ech, gltA trên cùng một hệ thống vector biểu hiện trong điều

kiện nuôi cấy được tối ưu hóa.

1.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ

ADN tái tổ hợp trong nước và ngoài nước

1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu sản xuất vanillin từ các chủng E.

coli tái tổ hợp .

Năm 2003, Converti và cộng sự đã tạo thành công chủng E. coli tái tổ

hợp JM109 mang plasmid pBB1 bao gồm các gene trao đổi chất axit ferulic

từ Pseudomonas fluorescens BF13. Plasmid tái tổ hợp pBB1 được tạo ra bằng

việc tạo dòng một đoạn 5098 bp chứa gene ech và fcs từ chủng Pseudomonas

fluorescens BF13 đột biến gene vdh dưới sự điều khiển của promoter chủ Pfer

vào vector có số bản copy thấp pJB3Tc19. Các tế bào E. coli chủng

JM109/pBB1 được sử dụng cho cho sự chuyển hóa sinh học axit ferulic tới

vanillin với năng suất 0.851 mol/l [75].

Barghini và cộng sự đã báo cáo rằng sử dụng các plasmid có số bản sao

thấp sẽ khắc phục sự giảm nhanh chóng sản phẩm cuối trong chủng E. coli tái

tổ hợp do tính không ổn định di truyền của đột biến sản xuất vanillin. Các tế

bào E. coli JM109/pBB1 với plasmid có số bản copy thấp dẫn đến nồng độ

cuối cùng của vanillin là 3.5 mM sau 6 giờ nuôi cấy với sự cảm ứng của axit

ferulic 1.1 mM. Các tác giả còn chỉ ra việc tái sử dụng thành công các tế bào

đó trong bốn chu kì chuyển hóa sinh học tiếp theo, điều đó cho phép tăng

nồng độ sản phẩm cuối cùng lên 2.52 g vanillin trên mỗi lít dịch nuôi cấy. Sự

tái sử dụng sinh khối có thể là một chiến lược thích hợp vừa để củng cố năng

suất bằng hệ thống lên men liên tục vừa làm giảm chi phí thu hồi vanillin

bằng sự cô đặc sản phẩm cuối trong môi trường [12].

Để khai thác một chủng tái tổ hợp ổn định hơn, E. coli JM109 được thiết

kế bởi sự tách dòng gene ech và fcs từ Pseudomonas fluorescens BF13 vào

một vector (pFR12) với một đơn vị sao chép cảm nhiệt, được thiết kế cho sự

hợp nhất gene vào locus lacZ trên nhiễm sắc thể của E. coli. Chủng được tạo

ra mang tên FR13, đã được xác nhận là hiệu quả và ổn định hơn trong sản

xuất vanillin so với những chủng biểu hiện cùng các gene đó từ một vector

plasmid có sổ bản copy thấp [46].

Một chủng E. coli tái tổ hợp XL1-Blue (pSKech/Hfcs) chứa một plasmid

gắn gene fcs và ech từ Pseudomonas sp.HR199 dưới sự điều khiển của

promoter lacZ có thể chuyển axit ferulic thành vanillin ở mức độ mM [60].

Tương tự như vậy, gene fcs và ech phân lập từ xạ khuẩn Amycolatopsis sp.

Strain HR167 được biểu hiện trong chủng E. coli tái tổ hợp cũng có khả năng

chuyển đổi axit ferulic thành vanillin [6].

Hai plasmid tái tổ hợp mang tên pDAHEF và pDDAEF mang gene fcs và

ech từ 2 chủng tương ứng Amycolatopsis sp. Strain HR104 và Delftia

acidovorans được biến nạp vào E. coli. Theo như báo cáo của tác giả, trong cùng

một điều điều kiện lên men thì chủng mang plasmid pDAHEF thu được 160

mg/l vanillin trong khi đó chủng còn lại chỉ thu được 10 mg/l. Sự tối ưu hoá quá

trình lên men E. coli mang pDAHEF đã được thực hiện bởi sự bổ sung arabinose

13.3 mM như một chất cảm ứng trao đổi chất và axit ferulic 0.2% trong 18 giờ

nuôi cấy, kết quả thu được là 580 mg/l vanillin được tạo ra [84].

Cũng trong một nghiên cứu song song, Yoon và cộng sự báo cáo rằng

vanillin được thu với hiệu suất cao hơn từ chủng E. coli tái tổ hợp thiết kế bởi

tách dòng gene fcs và ech từ Amycolatopsis sp. HR104 dưới sự điều khiển của

promoter trc (được cảm ứng bởi IPTG). Nồng độ vanillin thu được là 1,1 g/L

trong điều kiện 48h nuôi cấy, môi trường 2YT với axit ferulic 0.2%, không

IPTG và không bổ sung nguồn cacbon [86].

Để củng cố sự sản suất vanillin bằng cách giảm độc tính của nó đối với các

tế bào nuôi cấy, có hai chiến lược được đề xuất. Đó là tạo ra một đột biến kháng

vanillin mang tên NTG-VR1 bằng phát sinh đột biến nitrosoguanidine và loại bỏ

vanillin ra khỏi môi trường bằng nhựa hấp phụ XAD-2. Sử dụng 5 g/L axit ferulic,

vanillin thu được với đột biến NTG-VR1 tăng gấp 3 lần so với chủng hoang dại.

Kết hợp thêm 50% (w/v) nhựa XAD-2 vào môi trường nuôi cấy, từ 10g/L axit

ferulic thu được 2.9 g/L vanillin. Nồng độ sản phẩm cuối cùng cao hơn 2 lần so

với không bổ sung nhựa hấp phụ [85].

Năm 2009, Lee và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất vanillin trên chủng

E.coli DH5α (pTAHEF-gltA) với sự khuếch đại gene gltA (mã hóa enzyme

citrate synthase cần cho sự chuyển đổi của acetyl-CoA), gene ech và fcs được

tách dòng từ Amycolaptosis sp. Strain HR104. Từ 3 g/L axit ferulic tạo ra

1.98 g/L vanillin trong 48 giờ nuôi cấy. Trong cùng nghiên cứu đó, các tác giả

chỉ ra sự xóa bỏ gene icdA mã hóa enzyme isocitrate dehydrogenease của chu

trình TCA làm tăng cường chuyển hóa acetyl-coA thành CoA khi so sánh với

toàn bộ chu trình TCA. Sự sản xuất vanillin bởi chủng đột biến mới E. coli

BW25113 mang plasmid pTAHEF cùng với gene icdA bị xóa bỏ được tăng

cường 2.6 lần. Ảnh hưởng điều phối thực sự của việc khuếch đại gene gltA và

sự xóa bỏ gene icdA được quan sát với việc bổ sung nhựa XAD-2 làm giảm

tính độc của vanillin. Kết quả là 5.14 g/L vanillin được thu hồi trong 24h nuôi

cấy với hiệu suất chuyển đổi 86.6% [43].

Trong phạm vi điều hướng trao đổi chất của E. coli cho sản xuất vanillin,

các gene chịu trách nhiệm cho sự phân hủy eugeneol và isoeugeneol đã được

phân lập và tách dòng trong các vật chủ tái tổ hợp.

Năm 2003, Overhage và cộng sự đề xuất một quá trình gồm hai bước cho sự

chuyển hóa sinh học từ eugeneol thành vanillin bằng hai chủng E. coli điều hướng

trao đổi chất. Trong bước thứ nhất, eugeneol được chuyển tới 8.6 g/L axit ferulic

trong 15 giờ bởi E.coli XL1-Blue (pSKvaomPcalAmcalB). Chủng này mang một

plasmid lai (pSKvaomPcalAmcalB) được cấu trúc bởi gene vaoA được tách dòng từ

Penicillium simplicissimum CBS 170.90 dưới sự điều khiển của promoter lac cùng

với gene calA và calB từ Pseudomonas sp. Strain HR199. Trong bước thứ hai, axit

ferulic được chuyển hóa thành vanillin bởi chủng E. coli XL1-Blue (pSKechE/Hfcs).

Kết thúc quá trình này thu được 0.3 g/L vanillin, 0.1 g/L vanillyl alcohol và 4.6 g/L

axit ferulic [60].

Chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp được tạo ra bằng đưa một plasmid chứa

gene mã hóa enzyme isoeugeneol monooxygenease của Pseudomonas putida IE27

dưới sự điều khiển của promoter T7. Kết quả nuôi cấy cho thấy 28.3 g/L vanillin

được tạo ra từ isoeugeneol 230 mM với hiệu suất chuyển đổi phân tử 81% sau 6 giờ nuôi cấy ở 20oC [83].

1.5.2. Các nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, cũng đã có một số nghiên cứu về sản xuất vanillin bằng

phương pháp hóa học.

Năm 1991, tác giả Đinh Thị Ngọ, Nguyễn Bích Thủy, Đào Văn Trường đã

tổng hợp vanillin từ eugeneol bằng cách đồng phân hoá eugeneol tạo

isoeugeneol. Sau đó bằng quá trình oxy hoá tiến hành trong môi trường axít hoặc

kiềm. Để nâng cao hiệu suất vanillin các tác giả đã tiến hành khảo sát các yếu tố

ảnh hưởng đến cả hai quá trình đồng phân hoá và oxy hóa với các điều kiện tối

ưu hoá cho quá trình tạo ra vanillin [2].

Năm 1992, nhóm tác giả trên đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp vanillin

bằng cách oxy hóa lignin bằng tác nhân nitrobenzen và oxít đồng. Đây là tác

nhân oxy hoá mềm, giữ nhân thơm nên cho hiệu suất vanillin cao [3].

Năm 1995, Đinh Thị Ngọ đã tiến hành tách và tinh chế vanillin và đến

năm 1996, tác giả Đinh Thị Ngọ đã công bố tách chiết thành công vanillin từ

tinh dầu lá quế [1].

Hiện ở Việt Nam chưa có công bố nào về việc ứng dụng công nghệ ADN

tái tổ hợp vào sản xuất vanillin. Do vậy, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ

này là một chiến lược góp phần mở ra hướng sản xuất vanillin tự nhiên tại

Việt Nam.

Chương 2

VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 . Các chủng vi sinh vật

Chủng Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668 sử dụng làm khuôn

ADN nhân gene ech được cung cấp bởi phòng Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh

vật – Viện Vi sinh vật và công nghệ sinh học, ĐHQGHN.

Chủng Amycolatopsis sp. HR104 sử dụng làm khuôn ADN nhân gene

fcs được cung cấp bởi Ngân hàng giống chuẩn Đức DSMZ (mã số chủng

DSM 9991).

Chủng vi khuẩn E. coli DH5α sử dụng để làm khuôn nhân gene gltA và

làm tế bào tách dòng được cung cấp bởi hãng Thermo Scientific.

Chủng vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) sử dụng làm tế bào vật chủ sinh tổng

hợp vanillin được cung cấp bởi hãng Invitrogene.

2.1.2. Các vector tách dòng và biểu hiện nền tảng

Vector tách dòng pTZ57R/T

Đây là một vector tách dòng dùng cho mục đích tạo dòng các

gene gltA, ech, fcs

Hình 2.1: Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T

Vector pTZ57R/T là vector tách dòng TA, có kích thước 2886 bp, được

thiết kế dựa vào hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq-ADN

polymerase trong phản ứng PCR. Vector pTZ57R/T có đầu dính là một

nucleotide T (thymine), cho phép tách dòng tất cả các trình tự khuếch đại của

phản ứng PCR do enzyme Taq-ADN polymerase tổng hợp.

Trong cấu trúc của vector pTZ57R/T bao gồm hai hệ thống chọn lọc,

cho phép chọn lọc các dòng tế bào mang plasmid đã gắn xen trình tự đích

thành công.

- Hệ thống chọn lọc thứ nhất là gene kháng kháng sinh ampicilin mã hóa

cho enzyme phân giải kháng sinh ampicilin, điều này đồng nghĩa với việc các

tế bào mang vector pTZ57R/T có thể sống sót và phát triển trên môi trường có

chứa kháng sinh ampicilin.

- Hệ thống chọn lọc thứ hai là hệ thống chỉ thị màu Lac-operon, hệ

thống này bao gồm gene LacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase và

Lac-promoter cảm ứng bởi IPTG. Với các tế bào chủ mang vector

pTZ57R/T tự đóng vòng hay không có sự gắn xen xảy ra, Lac-operon

hoạt động bình thường.

Trong môi trường có IPTG, enzyme β-galactosidase được tổng hợp.

Enzyme này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa cơ chất X-gal thành chất có

màu xanh, làm cho khuẩn lạc bao gồm các tế bào này có màu xanh. Trường

hợp thứ hai là khi cấu trúc của Lac- operon bị phá vỡ do gắn xen thành công,

dẫn đến enzyme β-galactosidase không được tổng hợp, không có sự phân giải

cơ chất X-gal nên các khuẩn lạc này sẽ có màu trắng.

Các thành phần của vector pTZ57R/T được thể hiện trong bảng 3.1.

Bảng 2.1: Các thành phần của vector pTZ57R/T

Thành phần

Vai trò

Vị trí

615-695

Vị trí đa tách dòng (Multiple cloning site)

Cắt kiểm tra đoạn xen được nhân dòng, phục vụ cho công việc lập thư viện ADN

LacZα

449-739

Chọn lọc, giúp phân biệt các dòng tế bào mang vector có và không có đoạn xen

1896-2756

Chọn lọc, nhằm duy trì các dòng tế bào mang vector pTZ57R/T

Gene kháng kháng sinh ampicilin (Amp resistant gene)

1122-1736

Điểm khởi đầu sao chép rep (pMB1)

Chịu trách nhiệm cho sự tái bản của vector pTZ57R/T trong E. coli

T7 promoter

697-716

Phiên mã in vitro đoạn chèn AND với T7 RNA polymerase

Phage f1 origin

Tổng hợp 1 chuỗi AND đơn

2-457

Vector biểu hiện pRSET-A

Đây là vector biểu hiện sử dụng promoter T7 là promoter biểu hiện

mạnh. Sơ đồ vector được thể hiện trên hình 3.2. Các thành phần và vai trò của

chúng trong vector được thể hiện ở bảng 3.2.

Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc vector pRSET-A

Bảng 2.2: Các thành phần của vector pRSET – A

Thành phần Vai trò Vị trí

Vùng khởi đầu sao chép pUC ori Base 2047 – 2720

Cho phép tạo ra số lượng bản sao plasmid lớn trong E .coli

Gene kháng Ampicilin

Chọn lọc các dòng mang vector tái tổ hợp Base 1042 – 1902

T7 promoter Base 20 – 39

Kiểm soát chặt chẽ sự biểu hiện của gene

Vị trí đa tách dòng (MCS) Cho phép gắn gene quan tâm Base 202 – 248 XpressTM Epitope Base 169 – 192

Tín hiệu kết thúc của T7 Base 256 – 385

Cho phép kết thúc quá trình phiên mã

Base 295 – 314

Vị trí của mồi ngược cho T7 promoter Đảm bảo trật tự các đoạn chèn

F1 ori Cho phép tổng hợp sợi ADN Base 456 – 911

Vector biểu hiện pET22b(+)

Đây là một vector biểu hiện có các yếu tố cần thiết cho sự biểu hiện các

gene gltA, ech, fcs.

Hình 2.3: Cấu trúc vector biểu hiện pET22b(+)

Các thành phần cấu tạo trong vector pRT22b(+) được thể hiện trong bảng 3.3.

Bảng 2.3: Các thành phần của vector pET22b (+)

Thành phần

T7 promoter Vị trí 361-377

T7 transcription start 360

pelB coding sequence 224-289

Multiple cloning sites (NcoI – XhoI) 158-225

His•Tag coding sequence 140-157

T7 terminator 26-72

lacI coding sequence 764-1843

pBR322 origin 3277

bla coding sequence 4038-4895

f1 origin 5027-5482

Vector pET22b(+) được thiết kế có vùng đa tách dòng (hình 3.3) với 15 vị

trí cắt cho các enzyme giới hạn: AvaI, XhoI, NotI, EagI, HindIII, SacI, EcoRI,

BamHI, NcoI, MscI, BseRI, BspMI, NdeI, XbaI, cho phép gắn các gene quan tâm

vào vector và biểu hiện ra sản phẩm mong muốn. Tất cả đều cho một vị trí cắt duy

nhất trên vector, đảm bảo việc gắn gene một các đặc hiệu và gene được gắn không

bị mất đi ở những bước cắt, gắn nối tiếp theo. Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, tôi

quy định chiều từ BamHI đến HindIII là chiều 5’→3’.

Vector pET22b(+) mang trình tự C-terminal His*tag, thuận lợi cho việc

tinh sạch protein, vị trí khởi đầu sao chép tạo ra số bản sao thấp (low copy) trong

tế bào E. coli.

Promoter T7 cho phép tế bào kiểm soát chặc chẽ sự biểu hiện của gene

thông qua hệ thống gene điều hòa, có khả năng biểu hiện cao khi cảm ứng IPTG.

Gene kháng ampicillin giúp cho vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp có

thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứa kháng sinh, giúp chọn

lọc những dòng có mang plasmid mong muốn.

Lý do tôi sử dụng vector pET22b(+) là do pET22b(+) có chứa

thêm một trình tự chuỗi tín hiệu N-terminal pelB quy định tiết protein

vào khoang chu chất (hay gian bào), điều này có nhiều ưu điểm đó là

giảm sự phân cắt protein đích, protein không gây độc cho tế bào, hầu hết

protein khi được tiết ra khoang chu chất đều là protein tan, có chức năng

sinh học. Khoang chu chất của tế bào E. coli chứa các enzyme xúc tác

việc tạo thành hoặc tái sắp xếp cầu disulfide, vì vậy các protein tái tổ

hợp biểu hiện trong E. coli thường được định hướng vận chuyển đến đây.

2.1.3. Mồi khuếch đại các gene gltA, fcs và ech.

Để khuếch đại các gene gltA, ech, fcs từ E. coli, P.

fluorescensVTCC-B-668 và Amycolatopsissp. HR104 (DSM 9991),

chúng tôi sử dụng các cặp mồi được thiết kế dựa vào trình tự gene các

gene đã công bố trên NCBI. Trình tự các cặp mồi được trình bày trong

bảng 3.4.

Bảng 2.4: Trình tự mồi khuếch đại gene

Kích thước

Tên

Trình tự mồi (chiều 5’→3’)

gene (bp)

mồi

gltA-F 5'TGAGCTCAGAAGGATATACATATGGCTGATACAAAA3'

1284

gltA-R 5'AAAGCTTTTAACGCTTGATATCGCTTT3'

Ech-F 5'AGAATTCAGGAGGGCATCGCCATGAGCAACTACGA3'

831

Ech-R 5'GCGAGCTCTCAGCGTTTATACGCCTGCAG3'

Fcs-F 5'TAATGCGCAACCAGGGTCTG3'

1476

Fcs-R 5'ACCGTCACAGAGTAGCCGCA3'

Trình tự mồi được thiết kế vị trí cắt enzyme giới hạn mỗi đầu

tương ứng với mỗi gene để thuận lợi cho quá trình cắt, nối ADN. Ở

mồi xuôi bao gồm vị trí bám của ribosome, khoảng trống, bộ ba mở

đầu, trình tự bắt cặp. Ở mồi ngược bao gồm bộ ba kết thúc và trình tự

bắt cặp.

2.1.4. Hóa chất

- Gắn nối gene vào vector o Enzym nối T4 ADN ligase và buffer T4 ADN ligase được cung cấp từ

hãng Thermo Scientific

- Tách chiết ADN plasmid o Solution I: Tris HCl 1M pH8, EDTA 0.5M pH8, glucose, H2O khử ion o Solution II: NaOH 3M, SDS 10% o Solution III: CH3COOK 3M, CH3COOH, H2O khử ion - Điện di o Agarose o Dung dịch đệm TAE(Tris base, EDTA, NAOH, Acid acetic) o Đệm tra mẫu ( Loading dye6X) o Ethidium bromide - Cắt enzyme giới hạn o Các loại enzyme giới hạn: BamHI, SacI, EcoRI, HindIII , NcoI…và

buffer tương ứng - Thôi gel o Các hóa chất đi kèm bộ Kit tách chiết ADN từ gel: MEGA- spinTM

Agarose Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific

- Môi trường nuôi E. coli o LB lỏng: Bacto trypton, dịch chiết nấm men, NaCl, nước khử trùng o LB đặc: Bacto trypton, dịch chiết nấm men, NaCl, nước khử trùng, agar - Chuẩn bị tế bào khả biến o CaCl2 o Glycerol - Biến nạp, chọn lọc khuẩn lạc, cảm ứng sinh tổng hợp vanillin o Kháng sinh ampicilin o Xgal o IPTG - PCR o Buffer o MgCl220mM o Taq-ADN Polymerase o dNTPs o Nước khử ion - HPLC

o Dung môi A: ACN/methanol (v/v = 1: 1) o Dung môi B: nước khử ion/acetic acid (v/v = 99.8: 0.2, pH 2.88) o Chất chuẩn: Vanillin, Axit ferulic - Tinh chiết vanillin từ dịch nổi nuôi E. coli o Dichloromethane o NaCl - Dụng cụ

Pipet, eppendorf, đầu tip, ống fancol, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, đèn

cồn, giấy bạc...

2.1.5. Thiết bị

Bảng 2.5: Danh mục các thiết bị

STT

Tên thiết bị

Nguồn gốc xuất xứ

Bộ điện di

Scie – plas Ltd – UK

2 Máy chụp gel

Gel Logic 1500 – Kodak – USD

3 Máy cất nước

Canada Bio Water system – Pall Co.UK

Tủ an toàn sinh học cấp 2

Nu – 425 – 400E – Nuaire – USA

5 Máy đo pH

F – 51 BW – Horiba – Japan

6 Nồi hấp khử trùng

HV – 110 – Hirayama – Japan

Cân điện tử

TE 214S – Startorius Germany

8 Máy li tâm

Eppendorf – CHLB Đức

Tủ lạnh -200C; -800C

Super freezer Eco 130 – Ficchetti – Italy

10 Máy votex

Vortex Geneius 3 – IKA Genemany/ China

11 Máy spindown

E- centrifuge – Wealtex – Taiwan/USA

12 Bể ổn nhiệt

Techne – OSI

13 Máy lắc

S3000 – Jeotech – Korea

14 Máy PCR 15 HPLC

Amplied Biosystems USA/ Singapore Máy HPLC 1260 Agilent Cột RP C18 Zorbax (250 mm x 4.6 mm id, 5 µm, Agilent, USA).

16 Lên men

Labfors – Infors HT

Và một số thiết bị phòng thí nghiệm cơ bản khác

2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm: Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên.

Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 2/2015 đến tháng 06/2016

2.3. Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Tách dòng gene

Ba genes gltA mã hoá citrate synthase, fcs mã hóa feruloyl-CoA

synthase, và ech mã hóa enoyl-CoA hydratase/aldolase được tách dòng lần

lượt từ Escherichia coli, Amycolatopsis và Pseudomonas fluorescent. Các

dòng được giải trình tự và phân tích trình tự đảm bảo biểu hiện được protein

mã hóa. Các chủng vi sinh vật được đặt mua từ Ngân hàng Vi sinh vật Đức

(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell

Cultures) và Ngân hàng Vi sinh vật của Đại học Quốc gia Hà Nội.

Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện mang các genes gltA, ech và fcs

Các gene sau khi được tách dòng và xác định trình tự được chuyển sang

vector biểu hiện dưới dạng thiết kế 1 polycistronic operon để đảm bảo biểu

hiện đồng thời cả 2 gene đích. Đề tài sử dụng các hệ vector khác nhau nhằm

tìm ra hệ thống có năng lực sản xuất vanillin mạnh nhất.

Nội dung 3: Đưa vector vào tế bào chủ, cảm ứng biểu hiện các gene đích

Vector biểu hiện sau khi được kiểm tra bằng phương pháp lập bản đồ

giới hạn sẽ được đưa vào chủng E. coli BL21(DE3) để sản xuất ba enzyme

mã hóa con đường chuyển hóa vanillin.

Nội dung 4: Phân tích vanillin sản phẩm tạo thành

Vanillin sản phẩm tạo thành từ axit ferulic dưới sự xúc tác của các

enzyme feruloyl-CoA synthase và enoyl-CoA hydratase/aldolase do E. coli

tái tổ hợp tạo ra sẽ được phân tích định tính và định lượng bằng phương pháp

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mẫu chuẩn sử dụng trong HPLC là

vanillin tinh khiết 99% cung cấp bởi hãng Sigma-Aldrich.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Quy trình tách dòng gene và thiết kế vector biểu hiện

Quy trình của từng nội dung được thể hiện dưới các sơ đồ sau:

Cặn tế bào E. coli; P. fluorescensVTCC-B-668; Amycolatopsis sp. HR104

Tách chiết ADN, PCR

Vector tách dòng pTZ57R/T

Gene gltA, ech, fcs

Gắn nối

Sản phẩm gắn nối

Biến nạp, cấy trải trên đĩa thạch

Các dòng khuẩn lạc trắng

Nuôi và tách chiết plasmid

Các dòng plasmid

Điện di sàng lọc kích thước

Lập bản đồ giới hạn

Giải trình tự gene

So sánh với trình tự đã công bố trên ngân hàng gene

pTZ-gltA/ech/fcs

Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tách dòng các gene gltA, ech, fcs từ E.coli

DH5 ,

P. fluorescens VTCC-B-668 và Amycolatopsis sp.HR104

Vector biểu hiện

pTZ-gene

Cắt đồng thời 2 enzyme giới hạn ở 2 đầu gene và tinh sạch

Vector mở vòng

Gene

Gắn nối

Sản phẩm gắn nối

Biến nạp, cấy trải trên đĩa thạch

Các dòng khuẩn lạc trắng

Nuôi, tách chiết plasmid

Các dòng plasmid

Điện di sàng lọc kích thước

Lập bản đồ giới hạn

Vector tái tổ hợp mong muốn

Hình 2.5: Sơ đồ quy trình thiết kế vector biểu hiện chứa các gene

* Kiểm tra chiều gắn của gene trên vector biểu hiện

Các gene được gắn theo thứ tự gltA→ech→fcs tương ứng với thứ tự

của các vị trí cắt giới hạn duy nhất trên vector pET22b(+). Trong đó, gene

gltA được gắn trong tổ hợp HindIII→SacI, gene ech được gắn trong tổ hợp

SacI→EcoRI, gene fcs được gắn trong tổ hợp EcoRI-BamHI. Nếu gene gltA

bị gắn ngược chiều tức tổ hợp enzyme giới hạn ở 2 đầu của gene gltA là

SacI→HindIII, nằm ngược lại so với thiết kế ban đầu trên vector

(HindIII→SacI), như thế sẽ làm mất đi vị trí SacI để thực hiện gắn gene ech

tiếp theo. Điều này cũng xảy ra tương tự đối khi gắn gene fcs nếu gene ech bị

gắn ngược chiều. Do vậy để đảm bảo hiệu quả gắn nối, tôi tiến hành kiểm tra

chiều gắn của từng gene trên vector.

2.4.2. Nhân gene đích bằng PCR

Các vi khuẩn cho gene gồm E. coli DH5α, P. fluorescens VTCC-B-668

và Amycolatopsis sp. HR104 được nuôi phục hồi trong môi trường LB lỏng,

lắc ở 370C nuôi qua đêm, dịch nuôi cấy được ly tâm thu cặn tế bào và tách

chiết ADN tổng số bằng phương pháp CTAB.

Phản ứng nhân gene đặc hiệu tiến hành với thể tích 25 µl, thành phần

phản ứng PCR được trình bày dưới bảng 2.6.

Bảng 2.6: Thành phần phản ứng PCR

Hóa chất Thể tích

PCR Mastermix 2X 12,5 ul

ADN khuôn 2 ul

Mồi ( F+R) 3 ul

7,5 ul H2O

Trộn đều các thành phần sau đó đặt vào máy PCR, chu trình nhiệt của

phản ứng PCR khuếch đại gene ech, fcs được trình bày dưới hình sau:

Hình 2.6: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene ech

01:50

57oC 58oC 59oC 60oC

Hình 2.7: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene fcs

Do nhiệt độ nóng chảy (Tm) của 2 mồi dùng để khuếch đại gene fcs có

sự chênh lệch, nên chúng tôi tiến hành chạy PCR dải nhiệt độ để xác định

nhiệt độ thích hợp cho sự khuếch đại gene fcs.

2.4.3. Điện di trên gel agarose

- Đun gel agarose 0,8%, để cho gel nguội đến khoảng 50-60C

- Đổ gel vào khuôn có cài sẵn răng lược cho gel đông lại

- Nhấc lược ra, đặt bản gel vào bể điện di

- Đổ dung dịch TAE 1X vào bể điện di

- Trộn mẫu cần điện di với đệm tra mẫu (Loading dye) và tra vào giếng.

Dung dịch đệm mẫu có tác dụng làm tăng trong lượng riêng của acid nucleic,

vì vậy nó sẽ kéo phân tử acid nucleic lắng xuống đáy giếng.

- Tiến hành chạy điện di ở 100V. Quan sát khi mẫu chạy được 2/3 bản

gel thì tắt máy, nhấc bản gel ra và nhuộm trong dung dịch EtBr khoảng 5-10

phút, vớt gel ra rửa qua nước và đặt lên máy soi gel để quan sát các băng

ADN hoặc chụp ảnh.

Thuốc nhuộm EtBr có tác dụng phát huỳnh quang dưới ánh sáng tia tử

ngoại giúp cho việc hiện hình các băng rõ hơn.

2.4.4. Tách chiết ADN plasmid

Để sàng lọc kết quả gắn gene vào vector: Chọn lọc khuẩn lạc nuôi trong

môi trường LB lỏng, có bổ sung kháng sinh chọn lọc ampicilin, nuôi lắc 180

vòng/ phút ở 37oC qua đêm.

Tiến hành tách chiết plasmid dựa trên nguyên lí của việc biến tính bằng

kiềm đối với ADN plasmid và ADN nhân và sự hồi tính một cách chọn lọc

ADN plasmid sau khi trung hòa dung dịch.

2.4.4.1. Tách chiết plasmid theo phương pháp phân giải kiềm bổ sung SDS

(Alkaline Lysis with SDS) có sửa đổi

Các bước tiến hành:

- Bước 1: Thu cặn tế bào

+ Hút 1,5ml dịch nuôi cấy vào ống eppendorf

+ Ly tâm 5000 vòng/phút trong vòng 5 phút, loại dịch, thu cặn tế bào

+ Bổ sung thêm 1,5 ml dịch nuôi cấy ly tâm lần 2

- Bước 2: Phá tế bào và loại trừ protein

+ Bổ sung 150µl dung dịch Sol I, vortex để hòa tan hoàn toàn căn tế bào

+ Sau đó bổ sung 150µl dung dịch Sol II, đảo nhẹ nhàng 6-8 lần

+ Bổ sung 150µl dung dịch Sol III, đảo nhẹ nhàng

+ Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, thu dịch trong

+ Thêm 450µl chlorofom: isoaminalcohol tỷ lệ 24:1

+ Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút

- Bước 3: Tủa ADN plasmid

+ Hút 400µl dịch nổi chuyển sang ống mới

+ Bổ sung 400µl isopropanol giữ ở -20oC trong 3 phút

+ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút

+ Loại dịch thu ADN plasmid

- Bước 4: Rửa ADN plasmid

+ Bổ sung 1000 µl ethanol 70% ly tâm 13000 vòng/phút

+ Hòa tan ADN plasmid trong 50 l H2O + RNAse đảo nhẹ, bảo quản

ở -20C

2.4.4.2. Tách chiết plasmid bằng bộ kit ADN-spin của hãng Thermo

Siencetific

- Ly tâm 5000 vòng/ phút thu cặn tế bào

- Bổ sung 250 µl Resuspension buffer vào các ống tế bào, vortex đến

khi tan hết cặn khuẩn.

- Bổ sung 250 µl Lysis buffer, đảo nhẹ 3-4 lần

- Bổ sung 350 µl Neutralization buffer, ly tâm 13000 vòng/phút

trong 10 phút

- Hút dịch lỏng sang cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút,

loại bỏ dịch lỏng

- Bổ sung 700 µl Washing A buffer, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1

phút, loại bỏ dịch lỏng

- Ly tâm lần 2 ở 13000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn

ethanol

- Chuyển cột lọc sang ống eppendorf mới, bổ sung 50 µl Elution buffer,

đợi ít nhất 1 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu ADN

plasmid.

2.4.5. Lập bản đồ giới hạn

Bản đồ giới hạn (Restriction mapping) là bản đồ các vị trí enzyme giới

hạn đã biết có trong trình tự đoạn ADN. Lập bản đồ giới hạn là phương pháp

yêu cầu sử dụng các enzyme cắt giới hạn.

Tùy từng mục đích mà thực hiện phản ứng cắt enzyme giới hạn với

thành phần khác nhau. Thông thường phương pháp lập bản đồ giới hạn nhằm

kiểm tra xem ADN plasmid vừa tách chiết có mang đoạn chèn hay không, sau

phản ứng cắt kiểm tra bằng điện di trên gel agarose. Ngoài ra, còn được sử

dụng để xử lý đoạn gene và vector tạo đầu dính, thuận lợi cho việc gắn gene

vào vector. Trong đề tài, sử dụng một số enzyme cắt đầu so le như: HindIII,

SacI, EcoRI, BamHI. Phản ứng cắt được thực hiện trong điều kiện ủ ở 37oC

trong 40 phút.

Bảng 2.7: Thành phần phản ứng cắt enzyme

Thành phần Thể tích (l)

Enzyme 1 1

Enzyme 2 1

ADN plasmid 3

Bufferchung 1 hoặc 2

Thay đổi H2O

10 Tổng

2.4.6. Thu nhận ADN từ gel agarose

Sau khi điện di sản phẩm cắt đồng thời 2 enzyme giới hạn, vector

mở vòng được tinh sạch đảm bảo hiệu quả gắn nối. Quy trình thu nhận

ADN từ gel như sau:

- Chạy điện di mẫu cắt cần nghiên cứu, nhuộm gel bằng EtBr, đặt lên

máy soi gel, quan sát và cắt đoạn gene mong muốn vào ống effendoff.

- Bổ sung 600l dung dịch Binding buffer

- Ủ 55C trong 15 phút để gel tan hoàn toàn và kiểm tra màu hỗn hợp (vàng)

- Chuyển hỗn hợp gel tan sang cột QIA quick column và đặt vào

ống thu mẫu

- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút

- Loại dịch qua cột và đặt ống trở lại ống thu

- Bổ sung 500l Wash buffer, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch

qua cột

- Đặt cột vào ống effendof mới, bổ sung 750l Elution buffer, ly tâm

13000vòng/phút trong 1 phút, thu ADN. Bảo quản ở -20C

2.4.7. Nối ADN bằng ADN ligase

Phản ứng nối được thực hiện bởi T4 ADN ligase, một loại enzyme có

nguồn gốc từ phage T4, enzyme này có khả năng xúc tác phản ứng gắn nối

cho cả đầu bằng và đầu dính của đoạn gene vào vector.

Phản ứng gắn nối có thể thực hiện trong điều kiện ủ ở 22oC trong 1 giờ

hoặc ủ ở 4o qua đêm. Thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.8.

Bảng 2.8: Thành phần phản ứng nối

Thể Thành phần Thể tích Thành phần tích (Nối gene vào (Nối gene vào vector tách dòng) (l) vector biểu hiện) (l)

Sản phẩm PCR ( pha loãng 5 lần) Buffer T4 1 1

Vector T4 ADN ligase 1 1

Buffer 5X ADN đoạn chèn 5 2

T4 ADN ligase Vector 1 1

1 5 H2O H2O

2.4.8. Chuẩn bị tế bào khả biến

Để nhân dòng hay biểu hiện vector trong tế bào, thì tế bào đó phải được

xử lí để làm biến đổi cấu trúc màng nhằm tạo điều kiện cho sự khuếch tán

ADN plasmid ngoại lai vào bên trong tế bào. Phương pháp tạo tế bào khả biến

phổ biến, đơn giản thường là sử dụng CaCl2. Dưới đây là quy trình chuẩn bị

tế bào khả biến của Hanahan (1983) có sửa đổi.

- Chủng E.coli DH5α được nuôi qua đêm trên môi trường LB ở máy lắc

37C, 200 vòng/phút

- Lấy 1 ml dịch nuôi cấy vào 100 ml môi trường LB lỏng, tiếp tục nuôi

lắc 1,5h ở 37C, 200 vòng/phút, để OD=0,4-0,6

- Đặt trong đá, để khoảng 30 phút, thỉnh thoảng lắc đều

- Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu tế bào loại dịch

- Bổ sung 300l CaCl2 0,1M mix nhẹ cho tan đều

- Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu cặn tế bào và loại dịch

- Bổ sung 60l CaCl2 0,1M + 30l glycerol 60%

- Bảo quản ở -70C

2.4.9. Biến nạp ADN vào E. coli khả biến

Có hai phương pháp để biến nạp ADN ngoại lai vào tế bào khả biến đó

là xung điện và shock nhiệt. Xung điện có ưu điểm hơn shock nhiệt là có hiệu

suất biến nạp cao, tuy nhiên lại có nhược điểm làm chết nhiều tế bào. Tôi thực hiện

quá trình biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào khả biến được bằng phương pháp

sốc nhiệt.

Các bước thực hiện như sau:

- Làm tan tế bào khả biến trong đá 30 phút

- Bổ sung sản phẩm gắn nối và để trong đá 30 phút

- Sốc nhiệt 42C trong 90 giây, chuyển nhanh sang đá để trong 1- 2 phút

- Bổ sung 250l môi trường LB và lắc 37C, ở 200 vòng/phút trong 1 giờ

- Sau đó, đem cấy trải đều 100l trên đĩa Peptri có bổ sung Ampicilin là

100g/ml

- Nuôi ở tủ 37C qua đêm.

2.4.10. Xác định trình tự nucleotide

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc của phương pháp dideoxy cải

tiến của Sanger căn cứ vào sự kéo dài chuỗi ADN mới theo nguyên tắc bổ

sung bởi ADN polymerase khi có mặt của các ddNTP và mồi. Phản ứng kéo

dài được làm ngừng bằng cách bổ sung dideoxyribonucleosid triphosphate

(ddNTP). Mỗi ddNTP sử dụng có thể được gắn với một phân tử huỳnh quang

và mỗi nucleotide cho một màu riêng biệt. Cho tất cả bốn loại ddNTP đã đánh

dấu vào cùng một ống, sau đó các đoạn ADN có màu được phân tách theo

kích thước bằng điện di trên cùng một ống điện di mao quản. Các đoạn ADN

khác nhau sẽ phân tách trên gel mao quản và xuất hiện dưới dạng các đỉnh với

màu đi kèm. Các đỉnh được phát hiện bằng cách sử dụng nguồn laser. Đọc

trình tự ADN bằng cách xác định màu của đỉnh khi chúng đi qua thiết bị phát

hiệnvà thông tin này sẽ được chuyển trực tiếp đến một máy tính và sẽ xác

định được trình tự ADN.

Các dòng plasmid được giải trình tự ở công ty MACROGENE (Hàn

Quốc). Các gene được giải trình tự ởhai đầu sử dụng trình tự mồi xuôi và mồi

ngược M13/pUC trên vector tách dòng pTZ57R/T.

Sử dụng chức năng Align của phần mềm vector NTI để so sánh, tìm ra

điểm sai khác giữa 2 trình tự để có xử lí lỗi đồng thời tìm ra trình tự chung

giữa 2 trình tự gene được tổng hợp từ 2 mồi để nối ghép thành trình tự gene

hoàn chỉnh

2.4.11. Phân tích trình tự gene đã tách dòng

Các gene đích gltA, ech và fcs sau khi giải trình tự được so sánh với

trình tự gene gltA, ech, fcs đã được công bố trên ngân hàng gene NCBI thông

qua chương trình BLAST.(http://www.ncbi.nil.gov).

Trình tự các gene tách dòng được dịch mã in silico bằng phần mềm

Vector NTI v11.5 hoặc công cụ trực tuyến Translate Tool tại địa chỉ

http://web.expasy.org/translate/

2.4.12. Nuôi E. coli sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic

Phương pháp nuôi E. coli tái tổ hợp mang vector pET-GEF hoặc

pRSET-GEF để sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic được tiến hành theo

Yoon và cộng sự [84]. Khuẩn lạc trên đĩa thạch được nhặt sang nuôi trong 5

ml LB lỏng có bổ sung ampicilin 37oC lắc 200 v/p qua đêm. Sáng hôm sau, 5

ml dịch nuôi được chuyển sang 200 ml LB lỏng bổ sung ampicilin trong bình

tam giác 1 lít và nuôi lắc 200 v/p trong khoảng 3-4 tiếng. Khi OD 260 nm đạt

0.4, sinh tổng hợp vanillin được cảm ứng bằng IPTG nồng độ 0.5 mM (1 ml

dung dịch IPTG 100 mM được bổ sung vào 200 ml dịch nuôi). Đồng thời, cơ

chất axit ferulic được bổ sung vào để đạt nồng độ 3 g/L (0,6 ml dung dịch axit

ferulic nồng độ 100 g/L pH 7.0 được bổ sung vào 200 ml dịch nuôi). Tiếp tục

nuôi đến các mốc thời gian 6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 36h, 42h và 48h. Dịch

nuôi được thu tại một số mốc thời gian tùy theo yêu cầu thí nghiệm, đo OD

hoặc/và ly tâm 10000 v/p loại bỏ cặn tế bào. Dịch nổi được dùng cho phân

tích HPLC.

2.4.13. Lên men sinh tổng hợp vanillin từ cơ chất axit ferulic

Lên men E. coli sinh tổng hợp vanillin bổ sung cơ chất axit ferulic

được thực hiện theo hai phương pháp.

Phương pháp thứ nhất: Sử dụng bình tam giác theo Yoon và cộng sự.

Tương tự như mục 3.4.12 tuy nhiên thay đổi thể tích nuôi thành 1 lít nuôi

trong bình tam giác 2 lít.

Phương pháp thứ hai: Sử dụng hệ thống lên men Labfors, quy trình

theo Phùng Thu Nguyệt và CS (2009) với một số cải tiến [4].

Chủng lên men: Chủng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp mang vector pET-

GEF và pRSET-GEF. Chủng được chuẩn bị bằng cách nuôi trong bình tam

giác chứa 50 ml môi trường LB ở 37oC qua đêm, lắc 200 v/p.

Cơ chất axit ferulic: Axit ferulic được hòa tan trong môi trường LB và

chỉnh pH về 7.0 bằng NaOH 2N.

Thiết bị lên men: Sử dụng hệ thống lên men Labfors dung tích 2 lít của

hãng Infors HT. Hệ thống lên men được điều khiển bằng phần mềm Iris V5.3.

Môi trường lên men: Môi trường lên men LB được bổ sung kháng sinh

Ampicilin 100 µg/mL. Chất phá bọt polypropylene glycol (PPG) được bổ

sung với tỉ lệ 1/10000.

Điều kiện lên men: Các điều kiện lên men được thiết lập pH 7,0; nhiệt

độ 370C; khí được sục 1 lít/phút; tốc độ khuấy 200 vòng/phút. Giống lên men

chuẩn bị qua đêm được cấy vào bình lên men theo tỉ lệ 1/1000. Một số thông

số chính của quá trình lên men gồm pH, nhiệt độ, tốc độ khuấy… được điều

khiển tự động bằng phần mềm Iris V5.3.

Cảm ứng sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic: Khi OD260 đạt mức 0,4

trong bình lên men, cơ chất axit ferulic và chất cảm ứng IPTG được bổ sung

vào dịch lên men ở các nồng độ lần lượt là 3 g/L và 0,5 mM.

Thu dịch nổi chứa vanillin: Sau khi cảm ứng ở các mức thời gian xác

định, quá trình lên men được ngừng lại. Tế bào E. coli được loại bỏ bằng ly

tâm. Dịch nổi chứa vanillin được thu nhận.

2.4.14.Phân tích vanillin và axit ferulic bằng HPLC

Cơ chất axit ferulic còn lại và vanillin tạo thành trong dịch nổi nuôi cấy

tế bào E. coli được xác định định tính và định lượng bằng phương pháp HPLC

đảo pha theo quy trình của Sinha và cộng sự có cải tiến. Hệ thống phân tích

HPLC 1260 Agilent được trang bị cột RP C18 Zorbax (250 mm x 4.6 mm id,

5 µm, Agilent, USA). Dung môi A bao gồm ACN/methanol (v/v = 1: 1) và

dung môi B bao gồm nước khử ion/acetic acid (v/v = 99.8: 0.2, pH 2.88).

Bước sóng phát hiện 280 nm. Nhiệt độ duy trì trong buồng lưu giữ cột là 25

độ C, thể tích tiêm mẫu là 20 µL. Tốc độ dòng: 1 mL/phút. Chương trình chạy

23 phút được thiết lập như trong 2.9.

Bảng 2.9: Chương trình chạy HPLC phân tích axit ferulic và vanillin

Thời gian (phút) Dung môi A (%) Dung môi B (%)

0.01 95 5

5 75 25

15 50 50

20 25 75

23 10 90

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tách dòng và giải trình tự các gene mã hóa các enzyme xúc tác con

đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic

3.1.1. Tách dòng và giải trình tự gene gltA từ E. coli DH5α

Đoạn gene gltA được khuếch đại bằng cặp mồi gltA-F và gltA-R từ

hệ gene vi khuẩn E. coli DH5α, kết quả PCR thể hiện ở Hình 3.1A. Sản

phẩm PCR tương ứng với nhiệt độ gắn mồi tốt nhất ở 53 0C sẽ được tinh

sạch bằng phương pháp thôi gel (Hình 3.1B), sau đó gắn nối vào vector

tách dòng pTZ57R/T và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli. Cấy trải

trên môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin. Lựa chọn các khuẩn lạc

trắng để nuôi tăng sinh và tách chiết ADN plasmid (Hình 3.1C).

Hình 3.1: Sản phẩm PCR gene gltA (A), sản phẩm PCR sau khi tinh sạch

(A) LD: Thang ADN chuẩn 1 kb; ĐC: đối chứng; đường chạy đánh số 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59: sản phẩm PCR khuếch đại gene gltA tương ứng với nhiệt độ gắn mồi là 530C, 540C, 550C, 560C, 570C, 580C và 590C. (B) Sản phẩm PCR sau tinh sạch. (C): Đường chạy 1: Plasmid của khuẩn lạc màu xanh (đối chứng); đường chạy 2 -> 9: plasmid của các khuẩn lạc màu trắng

(B) và ADN plasmid các dòng khuẩn lạc màu trắng

Kết quả ở Hình 3.1A cho thấy, ở tất cả các nhiệt độ gắn mồi đều cho một

băng rõ nét có kích thước tương ứng với kích thước dự đoán của gene gltA là

1284 bp. Tuy nhiên, ở nhiệt độ gắn mồi là 530C, băng ADN sáng rõ nhất

(đường chạy 53). Tiếp tục thực hiện phản ứng PCR với nhiệt độ gắn mồi là

530C với thể tích lớn hơn để tiến hành tinh sạch sản phẩm, phục vụ thí nghiệm

gắn nối vào vector tách dòng. Hình 3.1B cho thấy sản phẩm PCR chỉ còn một

băng sáng rõ có kích thước của gene gltA.

Ở hình 3.1C, plasmid ở đường chạy 2 => 9 là của các dòng khuẩn lạc

trắng, có kích thước tương đồng nhau và cao hơn kích thước plasmid của

dòng khuẩn lạc màu xanh (đường chạy 1). Trong sàng lọc khuẩn lạc trên môi

trường LB/Amp/ IPTG/Xgal, khuẩn lạc trắng là dòng chứa vector đã gắn đoạn

chèn còn khuẩn lạc xanh là dòng có chứa vector pTZ57R/T tự đóng vòng. Do

được gắn thêm đoạn chèn nên những dòng chứa pTZ-E sẽ có vị trí băng

plasmid cao hơn so với plasmid từ khuẩn lạc xanh. Do vậy tất cả các plasmid

của khuẩn lạc màu trắng đã mang đoạn xen.

Lựa chọn plasmid dòng 1, 2, (tương ứng với đường chạy 2, 3) để kiểm tra

sự có mặt của gene gltA trong vector tách dòng bằng cắt enzyme giới hạn NcoI.

Lý do sử dụng enzyme này là vì trên vector tách dòng pTZ57R/T không có vị trí

cắt của enzyme này và trên gene gltA có duy nhất 1 vị trí cắt. Do vậy nếu chèn

đúng gene gltA vào vector tách dòng thì khi xử lý enzyme này vector tái tổ hợp

sẽ bị cắt tạo thành 1 băng có kích thước 4170 bp (kích thước 2886 bp của vector

pTZ57R/T l + kích thước 1284 bp của gene gltA) (Hình 3.2).

Hình 3.2: Plasmid tái tổ hợp có khả năng mang gene gltA được cắt bằng

ĐC1: plasmid của dòng 1 không cắt enzyme, đường chạy số 1: plasmid của dòng 1 cắt bằngNcoI; đường chạy 2: plasmid của dòng 2 cắt bằngNcoI; ĐC2 : plasmid của dòng 2 không cắt enzyme.

enzyme NcoI

Kết quả hình 3.2 cho thấy plasmid dòng 1 và 2 sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn đều cho 1 băng với kích thước xấp xỉ 4170 bp theo tính toán lý thuyết (đường chạy 1 và 2). Do vậy dòng 1 và 2 đều có gene gltA gắn vào vector tách dòng pTZ57R/T. Dòng 1 được lựa chọn để xác định trình tự nucleotide. Kết quả xác định trình tự gene gltA được thể hiện trong Hình 3.3 (A).

CGATGCATCTAGATTTGAGCTCAGAAGGAGATATACATATGGCTGATACAAA AGCAAAACTCACCCTCAACGGGGATACAGCTGTTGAACTGGATGTGCTGAAA GGCACGCTGGGTCAAGATGTTATTGATATCCGTACTCTCGGTTCAAAAGGTG TGTTCACCTTTGACCCAGGCTTCACTTCAACCGCATCCTGCGAATCTAAAAT TACTTTTATTGATGGTGATGAAGGTATTTTGCTGCACCGCGGTTTCCCGATC GATCAGCTGGCGACCGATTCTAACTACCTGGAAGTTTGTTACATCCTGCTGA ATGGTGAAAAACCGACTCAGGAACAGTATGACGAATTTAAAACTACGGTGAC CCGTCATACCATGATCCACGAGCAGATTACCCGTCTGTTCCATGCTTTCCGT CGCGACTCGCATCCAATGGCAGTCATGTGTGGTATTACCGGCGCGCTGGCGG CGTTCTATCACGACTCGCTGGATGTTAACAATCCTCGTCACCGTGAAATTGC CGCGTTCCGCCTGCTGTCGAAAATGCCGACCATGGCCGCGATGTGTTACAAG TATTCCATTGGTCAGCCATTTGTTTACCCGCGCAACGATCTCTCCTACGCCG GTAACTTCCTGAATATGATGTTCTCCACGCCGTGCGAACCGTATGAAGTTAA TCCGATTCTGGAACGTGCTATGGACCGTATTCTGATCCTGCACGCTGACCAT

GAACAGAACGCCTCTACCTCCACCGTGCGTACCGCTGGCTCTTCGGGTGCGA ACCCGTTTGCCTGTATCGCAGCAGGTATTGCTTCACTGTGGGGACCTGCGCA CGGCGGTGCTAACGAAGCGGCGCTGAAAATGCTGGAAGAAATCAGCTCCGTT AAACACATTCCGGAATTTGTTCGTCGTGCGAAAGACAAAAATGATTCTTTCC GCCTGATGGGCTTCGGTCACCGCGTGTACAAAAATTACGACCCGCGCGCCAC CGTAATGCGTGAAACCTGCCATGAAGTGCTGAAAGAGCTGGGCACGAAGGAT GACCTGCTGGAAGTGGCTATGGAGCTGGAAAACATCGCGCTGAACGACCCGT ACTTTATCGAGAAGAAACTGTACCCGAACGTCGATTTCTACTCTGGTATCAT CCTGAAAGCGATGGGTATTCCGTCTTCCATGTTCACCGTCATTTTCGCAATG GCACGTACCGTTGGCTGGATCGCCCACTGGAGCGAAATGCACAGTGACGGTA TGAAGATTGCCCGTCCGCGTCAGCTGTATACAGGATATGAAAAACGCGACTT TAAAAGCGATATCAAGCGTTAAAAGCTTTAATCGGATCCCGGGCCCGTCGAC TGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTTCCCTATAGTGAGTCGTATATTTCGTTTC GCTATAGTTCGCAATTTTCGAAA

(A)

>EMBOSS_001_1 MADTKAKLTLNGDTAVELDVLKGTLGQDVIDIRTLGSKGVFTFDPGFTST ASCESKITFI DGDEGILLHRGFPIDQLATDSNYLEVCYILLNGEKPTQEQYDEFKTTVTR HTMIHEQITR LFHAFRRDSHPMAVMCGITGALAAFYHDSLDVNNPRHREIAAFRLLSKMP TMAAMCYKYS IGQPFVYPRNDLSYAGNFLNMMFSTPCEPYEVNPILERAMDRILILHADH EQNASTSTVR TAGSSGANPFACIAAGIASLWGPAHGGANEAALKMLEEISSVKHIPEFVR RAKDKNDSFR LMGFGHRVYKNYDPRATVMRETCHEVLKELGTKDDLLEVAMELENIALND PYFIEKKLYP NVDFYSGIILKAMGIPSSMFTVIFAMARTVGWIAHWSEMHSDGMKIARPR QLYTGYEKRD FKSDIKR*

(B)

Hình 3.3: Kết quả xác định trình tự gene gltA

(A)Trình tự gene gltA tách dòng từ E. coli DH5α; (B) Trình tự amino acid dịch

mã in silico từ gene gltA.

Gene gltA tách dòng từ vi khuẩn E. coli DH5α có kích thước 1284 bp có

mã mở đầu ATG và mồi xuôi gltA-F (gạch chân) ở đầu 5’ và có bộ ba mã kết

thúc TAA và trình tự mồi ngược gltA-R (gạch chân) ở đầu 3’. Vị trí cắt của

enzyme giới hạn ở 2 đầu của gene được bảo toàn. Kết quả phân tích NCBI

BLAST cho thấy trình tự gene gltA tách dòng có độ tương đồng 100% với

trình tự gene gltA của E. coli sp. K-12 MC4100 mã số HG7388671. Trình tự

gene gltA được dịch mã in silico bằng công cụ trực tuyến EMBOSS Transeq

cho thấy gene được dịch mã thành công, đảm bảo cho sự biểu hiện của gene

này trong E. coli.

3.1.2. Tách dòng và giải trình tự gene ech từ Pseudomonas fluorescens

VTCC-B-668

 Kết quả khuếch đại gene ech từ cặn tế bào Pseudomonas fluorescens

1 M

≈860 bp

1 kb 750 bp

bằng phương pháp PCR

Đường chạy 1: Sản phẩm PCR; Đường chạy M: Thang ADN chuẩn 1 kb

Hình 3.4: Kết quả PCR khuếch đại gene ech

Sản phẩm PCR gene ech có kích thước dự kiến là 860 bp. Sản phẩm

PCR thu được 1 băng sáng rõ duy nhất nằm trong khoảng kích thước, đây có

thể là gene ech theo lý thuyết.

 Kết quả sàng lọc các dòng mang vector pTZ-ech bằng điện di so sánh

kích thước

Sau khi gắn gene ech vào vector pTZ57R/T và biến nạp sản phẩm gắn nối

vào E. coli DH5α, kết quả thu được 15 dòng khuẩn lạc trắng và 6 khuẩn lạc xanh.

Chọn ngẫu nhiên 9 khuẩn lạc trắng và 1 khuẩn lạc xanh nuôi trong môi trường LB

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

lỏng thu sinh khối, tách chiết plasmid và kết quả điện di như sau:

Đường chạy 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Plasmid các dòng khuẩn lạc trắng Đường chạy 10: Plasmid dòng khuẩn lạc xanh

Hình 3.5: Kết quả sàng lọc các dòng mang vector pTZ-ech

Plasmid các dòng sau khi điện di đều cho 2 băng tương ứng với hai cấu

hình dạng siêu xoắn ở dýới và dạng vòng ở trên. Plasmid các dòng 1, 2, 4, 6,

7, 8, 9 cho vị trí băng cao hơn so với dòng khuẩn lạc xanh, đây có thể là

những dòng mang pTZ-ech.

Dòng 3, 5 có vị trí băng plasmid tương đương với dòng khuẩn lạc

xanh, đây có thể cũng là vector tự đóng vòng, nhưng lại cho khuẩn lạc

màu trắng, điều này có thể là do trải Xgal không đều trên đĩa thạch nên ở

vị trí đó không có cơ chất để vector tự đóng vòng biểu hiện enzyme β-

galactosidase để phân giải thành màu xanh. Tôi chọn dòng 7, 8, 9 để tiến

hành bước sàng lọc tiếp theo.

 Kết quả chọn lọc các dòng mang vector pTZ-ech bằng lập bản đồ

giới hạn

Cơ sở: Ở 2 đầu của gene ech có chứa vị trí nhận biết của enzyme

HindIII và SacI, nếu gene ech đã được gắn vào vector tách dòng thì khi cắt

đồng thời 2 enzyme này sẽ tạo ra 2 đoạn tương ứng với gene ech khoảng 860

bp và vector pTZ57R/T mở vòng có kích thước gần 2,9 kb (2886 bp).

M 1 2 3 4 5

860 bp

A B

Hình 3.6: (A) Thiết kế in silico vector pTZ-ech; (B) Kết quả cắt kiểm tra

Đường chạy M: Thang ADN chuẩn 1 kb; Đường chạy 1,2,3: Sản phẩm cắt của dòng pTZ-ech 7,8,9 tương ứng; Đường chạy 4: plasmid pTZ-ech dòng 7; Đường chạy 5: Sản phẩm PCR khuếch đại gene ech

vector tái tổ hợp đồng thời bằng SacI và EcoRI

Sản phẩm cắt của 3 dòng đều cho 2 băng: băng phía trên có kích thước

gần 3 kb, còn băng phía dưới khoảng 860 bp và có vị trí tương đương với sản

phẩm PCR khuếch đại gene ech. Từ kết quả trên tôi kết luận rằng có thể đã

gắn được gene ech dự kiến vào vector tách dòng pTZ57R/T.

 Kết quả giải trình tự gene ech

Mục đích giải trình tự gene ech là để xác định trình tự và so sánh

gene ech được tách dòng từ chủng P. fluorescensVTCC-B-668 được phân

lập tại Việt Nam so với trình tự các gene ech đã được công bố trên ngân

hàng gene đồng thời kiểm tra đoạn gene ech được tách dòng có có khả

năng biểu hiện hay không.

Dòng 7 và 8 được chọn để giải trình tự gene ech tại công ty

MACROGENE (Hàn Quốc) sử dụng trình tự mồi xuôi, mồi ngược M13pUC

trên vector pTZ57R/T để giải trình tự từ hai đầu gene. Kết quả giải trình tự

gene ech ở plasmid pTZ-ech dòng 7 được trình bày ở hình 3.7.

AGAATTCAGGAGGGCATCGCCATGAGCAACTACGAAGGCCGTTGGACCACAGTCAA GGTTGAGATCGAAGAAGGCATCGCCTGGGTCATTCTCAATCGTCCGGAAAAACGCA ACGCCATGAGCCCGACCCTGAACCGGGAAATGATCGACGTCCTGGGAACCCTCGAG CAGGATCCTGCCGCCGGCGTGCTGGTCCTCACCGGTGCGGGCGAAGCCTGGACGGC GGGCATGGACCTCAAGGAATACTTTCGCGAAGTGGATGCCGGCCCGGAAATCCTCC AGGAGAAAATCCGCCGCGAAGCCTCGCAATGGCAATGGAAACTGCTGCGCATGTAC GCCAAGCCGACCATCGCCATGGTCAATGGCTGGTGCTTCGGCGGTGGCTTCAGCCC GCTGGTGGCGTGCGACCTGGCGATCTGCGCCGACGAAGCGACCTTCGGCCTTTCGG AAATCAACTGGGGCATCCCGCCGGGTAACCTGGTGAGCAAGGCCATGGCCGACACC GTGGGCCATCGTCAATCGCTGTACTACATCATGACCGGCAAGACCTTTGGCGGGCA GAAAGCCGCCGAAATGGGCCTTGTCAACGAAAGCGTGCCGCTGGCGCAACTGCGCG AAGTGACCATCGAACTGGCGCGTAACCTGCTCGAGAAAACCCCGGTGGTGCTGCGT GCCGCCAAGCATGGCTTCAAGCGCTGCCGCGAACTGACCTGGGAGCAGAACGAGGA TTACCTCTACGCCAAGCTCGATCAGTCGCGTCTGCTCGACACCGAAGGCGGTCGCG AGCAGGGCATGAAACAGTTCCTCGACGACAAGAGCATCAAGCCTGGCCTGCAGGCG TATAAACGCTGAGAGCTCGC

(A)

>EMBOSS_001_1 MSNYEGRWTTVKVEIEEGIAWVILNRPEKRNAMSPTLNREMIDVLGTLEQ DPAAGVLVLT GAGEAWTAGMDLKEYFREVDAGPEILQEKIRREASQWQWKLLRMYAKPTI AMVNGWCFGG GFSPLVACDLAICADEATFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRQSLYY IMTGKTFGGQ KAAEMGLVNESVPLAQLREVTIELARNLLEKTPVVLRAAKHGFKRCRELT WEQNEDYLYA KLDQSRLLDTEGGREQGMKQFLDDKSIKPGLQAYKR*

(B)

(C)

(D)

Hình 3.7: Kết quả xác định trình tự gene ech

(A) Trình tự gene ech tách dòng từ Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668. Mồi xuôi và mồi ngược được gạch chân, bộ ba mở đầu và kết thúc được in đậm;(B) Trình tự amino acid dịch mã in silico từ gene ech; (C) So sánh trình tự gene ech tách dòng với trình tự gene công bố trên NCBI.Query: Trình tự gene ech của Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668, Sbjct: Trình tự gene ech của Pseudomonas fluorescens JCM5963 công bố trên NCBI;(D) So sánh trình tự amino acid mã hóa bởi gene ech tách dòng với trình tự của P. fluorescent BF13. Userseq1: Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668, Userseq2: Pseudomonas fluorescens BF13.

Kết quả giải trình tự gene ech ở plasmid pTZ-ech dòng 7 (hình 3.7 A)

cho thấy bộ ba mở đầu ATG và bộ ba kết thúc TGA được bảo toàn, kích

thước đoạn gene (từ vị trí bộ ba mở đầu và kết thúc) là 831 bp bằng với kích

thước gene ech dùng để thiết kế mồi, vị trí cắt của enzyme giới hạn 2 đầu

gene được giữ nguyên và không đột biến. Như vậy các vị trí quan trọng thiết

kế trong mồi đều được bảo toàn đây là cơ sở đảm bảo cho công việc tiếp theo

có thể thành công và gene ech có thể biểu hiện trong vi khuẩn E. coli.

Kết quả dịch mã gene in silico (hình 3.7 B) không xuất hiện stop codon

vô nghĩa nào, đảm bảo sự biểu hiện hoàn toàn của gene ech tạo ra enzyme

tương ứng trong vi khuẩn E. coli.

Kết quả so sánh trình tự gene ech với trình tự đã công bố trên ngân

hàng gene NCBI (hình 3.7 C) cho thấy, gene ech trong pTZ-ech dòng 7 có độ

tương đồng 99% với gene ech của P. fluorescens JCM5963 đã được công bố

trên Genebank mã số DQ119298. Tiếp tục so sánh, gene ech trong pTZ-ech

dòng 7 có độ tương đồng 92% với gene ech của Pseudomonas fluorescens

BF13đã được công bố trên Genebank mã sốAJ536325, đây chính là gene ech

dựa vào để thiết kế mồi và giữa 2 gene này có sự tương đồng 98.2% về trình

tự chuỗi amino acid (hình 3.7 D).

Từ những dữ liệu trên, có thể kết luận gene ech thu được từ một chủng

Pseudomonas fluorescens được phân lập tại Việt Nam có tính đa hình so với

các trình tự của các chủng P. fluorescent quốc tế đã công bố. Gene ech này có

thể được sử dụng cho mục đích biểu hiện gene trong E. coli.

3.1.3. Tách dòng và giải trình tự gene fcs từ từ Amycolatopsis sp. HR104

 Kết quả tách chiết ADN tổng số từ Amycolatopsis sp. HR104

(DSM 9991)

Đường chạy từ 1-4 : tương ứng với bốn ống cặn xạ khuẩn

Hình 3.8: Kết quả tách ADN tổng số từ Amycolatopsis sp. HR104 (DSM 9991)

Trong 4 mẫu được tách chiết, ADN tổng số của mẫu số 1 và 2 bị nhiễm tạp chất

nhiều, trong khi đó mẫu số 3 và 4 cho băng gọn, sáng, không đứt gãy, do đó được lựa

chọn để thực hiện phản ứng khuếch đại gene fcs

 Kết quả khuếch đại và tách dòng gene fcs

Cặp mồi fcs-F và fcs-R được sử dụng để khuếch đại gene fcs từ tế bào vi

khuẩn Amycolatopsis sp. HR104 (DSM 9991), kiểm tra sản phẩm PCR bằng

điện di trên gel agarose (Hình 3.8 A). Vector tách dòng pTZ57R/T cũng được

sử dụng để gắn đoạn gene fcs và biến nạp vào tế bào E.coli, sau đó cấy trải trên môi

trường LB đặc có bổ sung ampicilin. Lựa chọn các dòng khuẩn lạc trắng để nuôi

tăng sinh và tách chiết ADN plasmid, kết quả ở hình 3.8 B. Dòng plasmid có mang

vector tái tổ hợp chứa gene fcs được cắt enzyme giới hạn EcoRI và BamHI để xác

định việc gắn thành công gene fcs vào vector tách dòng pTZ57R/T (Hình 3.8 C).

A B C

Hình 3.9: Sản phẩm PCR gene fcs (A), plasmid các dòng có khả năng

(A): L: Thang ADN chuẩn 1 kb; đường chạy 1: sản phẩm khuếch đại gene fcs (B): X: Khuẩn lạc xanh, Đường chạy từ 1->9: Các dòng khuẩn lạc trắng (C): L: thang ADN chuẩn 1 kb; 1: plasmid dòng 1 không cắt; 2: plasmid dòng 1 cắt bằng EcoRI và BamHI; 3: plasmid khuẩn lạc xanh cắt bằng EcoRI và BamHI; 4: plasmid khuẩn lạc xanh không cắt

mang gene fcs (B), cắt plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI và BamHI (C).

Hình 3.9A cho thấy, ở đường chạy số 1 có một băng duy nhất tương ứng

với kích thước sản phẩm PCR kích thước 1580bp của gene fcs. Vậy có thể đã

khuếch đại thành công gene fcs từ vi khuẩn Amycolatopsis sp. HR104 (DSM

9991). Có thể thấy ở hình 3.9B chỉ có plasmid ở đường chạy số 1 là có kích

thước cao hơn kích thước của khuẩn lạc xanh ở đường chạy X, đây có thể là

dòng mang vector pTZ-fcs nên được lựa chọn cho sàng lọc tiếp theo. Kết quả cắt

enzyme giới hạn EcoRI và BamHI ở hình 4.9C cho thấy ở plasmid dòng 1 khi

cắt bằng 2 enzyme này cho 2 băng (đường chạy 2): một băng có kích thước sản

phẩm PCR của gene fcs (1580bp) và một băng có kích thước 2847bp của vector

pTZ57R/T, điều đó chứng tỏ plasmid dòng 1 là vector pTZ57R/T đã gắn được

gene fcs.

 Kết quả giải trình tự gene fcs

Dòng 1 được tiếp tục xác định trình tự nucleotide, kết quả ở hình 3.10. TAATGCGCAACCAGGGTCTGGGCTCCTGGCCGGTGCGCCGCGCCAGGATGAG

CCCGCACGCGACAGCCGTCCGGCACGGCGGGACGGCGCTGACCTACGCCGAG

CTGTCCCGCCGCGTCGCGCGGCTCGCCAACGGGCTGCGGGCCGCCGGGGTCC

GCCCCGGCGACCGGGTGGCCTACCTCGGGCCGAACCACCCGGCCTACCTGGA

GACCCTGTTCGCGTGCGGGCAGGCCGGCGCGGTGTTCGTGCCGCTGAACTTC

CGGCTGGGCGTCCCGGAACTGGACCACGCGCTGGCCGACTCCGGCGCGTCGG

TCCTTATCCACACCCCGGAGCACGCGGAGACGGTCGCGGCGCTCGCCGCCGG

CCGGCTGCTGCGCGTGCCCGCGGGCGAGCTGGACGCCGCGGACGACGAGCCG

CCCGACCTGCCCGTCGGCCTCGACGACGTGTGCCTGCTGATGTACACCTCGG

GCAGCACCGGACGCCCCAAGGGCGCGATGCTCACCCACGGCAACCTCACCTG

GAACTGCGTCAACGTCCTGGTGGAGACCGACCTGGCGAGCGACGAGCGGGCA

CTGGTCGCCGCGCCGCTGTTCCACGCCGCCGCGCTCGGCATGGTGTGCCTGC

CCACCCTGCTCAAGGGCGGCACGGTGATCCTGCACTCCGCGTTCGACCCCGG

CGCCGTGCTGTCCGCGGTGGAACAGGAGCGGGTCACGCTCGTGTTCGGCGTG

CCCACGATGTACCAGGCGATCGCCGCGCACCCGCGGTGGCGCAGCGCCGACC

TGTCCAGCCTGCGGACCCTGCTGTGCGGCGGCGCGCCGGTGCCCGCCGACCT

CGCCAGCCGCTACCTCGACCGCGGGCTCGCGTTCGTGCAGGGCTACGGCATG

ACCGAGGCCGCGCCGGGCGTGCTGGTCCTCGACCGCGCGCACGTCGCGGAGA

AGATCGGCTCCGCCGGGGTGCCCTCGTTCTTCACCGACGTGCGGCTGGCCGG

CCCGTCCGGCGAGCCGGTGCCGCCGGGGGAGAAGGGCGAGATCGTGGTCAGC

GGGCCCAACGTGATGAAGGGCTACTGGGGCAGGCCGGAGGCGACCGCCGAGG

TGCTGCGCGACGGGTGGTTCCACTCCGGCGACGTGGCCACCGTGGGCGGCGA

CGGGTACTTCCACGTCGTCGACCGGCTCAAGGACATGATCATCTCCGGCGGC

GAGAACATCTACCCGGCCGAGGTGGAGAACGAGCTGTACGGCTACCCGGGTG

TGGAGGCGTGCGCCGTGATCGGCGTGCCGGACCCGCGCTGGGGCGAGGTGGG

CAAGGCGGTCGTCGTGCCCGCCGACGGGAGCCGCATCGACGGCGACGAGCTG

CTGGCCTGGCTGCGCACCCGGCTGGCCGGGTACAAGGTGCCCAAGTCGGTCG

AGTTCACCGACCGGCTGCCCACGACCGGCTCCGGCAAGATCCTCAAGGGCGA GGTCCGCCGCCGCTTCGGCTGACCAGGGGCCGATGAACCCCGCTCATGCGGC

CCTGCCGGCCCGCTGCGGCTACTCTGTGACGGT

>EMBOSS_001_1

MRNQGLGSWPVRRARMSPHATAVRHGGTALTYAELSRRVARLANGLRAAGVRPGDRVAYL

GPNHPAYLETLFACGQAGAVFVPLNFRLGVPELDHALADSGASVLIHTPEHAETVAALAA

GRLLRVPAGELDAADDEPPDLPVGLDDVCLLMYTSGSTGRPKGAMLTHGNLTWNCVNVLV

ETDLASDERALVAAPLFHAAALGMVCLPTLLKGGTVILHSAFDPGAVLSAVEQERVTLVF

GVPTMYQAIAAHPRWRSADLSSLRTLLCGGAPVPADLASRYLDRGLAFVQGYGMTEAAPG

VLVLDRAHVAEKIGSAGVPSFFTDVRLAGPSGEPVPPGEKGEIVVSGPNVMKGYWGRPEA

TAEVLRDGWFHSGDVATVGGDGYFHVVDRLKDMIISGGENEIYPAEVENELYGYPGVEACA

VIGVPDPRWGEVGKAVVVPADGSRIDGDELLAWLRTRLAGYKVPKSVEFTDRLPTTGSGK

ILKGEVRRRFG*

(A)

(B)

(C)

(D)

Hình 3.10: Kết quả xác định và phân tích trình tự gene fcs

(A) Trình tự gene fcs tách dòng từ Amycolatopsis sp. HR104 (DSM 9991). Mồi xuôi và mồi ngược được gạch chân, bộ ba mở đầu và kết thúc được in đậm; (B) Trình tự amino acid dịch mã in silico từ gene fcs; (C) So sánh trình tự gene fcs tách dòng với trình tự gene công bố trên NCBI. Query: Trình tự gene fcs của Amycolatopsis sp. HR104 (DSM 9991), Sbjct: Trình tự gene fcs của Amycolatopsis sp. HR167 công bố trên NCBI; (D) So sánh trình tự amino acid mã hóa bởi gene fcs tách dòng với trình tự fcs của các sinh vật khác. Query: Amycolatopsis sp. HR104, Sbjct: các trình tự tương đồng 99%.

Kết quả giải trình tự gene fcs cho thấy gene có độ dài 1476 bp có bộ

ba mã mở đầu (ATG) và mã kết thúc (TGA) được bảo toàn (hình 3.10A).

Dịch mã in silico gene fcs tách dòng không xuất hiện mã kết thúc giữa gene

(hình 4.10B). Gene fcs tách dòng từ Amycolatopsissp. HR104 tương đồng

99% với chủng Amycolatopsis sp. HR167 trên Genebank (mã số

AJ290449.1) được dùng trong thiết kế mồi (hình 3.10C). So sánh trình tự

amino acid cho thấy mức độ tương đồng 99% của gene tách dòng với gene fcs của

các sinh vật khác bao gồm Amycolatopsis sp. HR167 (mã số NCBI CAC18323.1);

E. coli (mã số NCBI AHZ90668.1); Pediococcus acidilactici (mã số NCBI

AIT38259.1); (hình 7D) và Streptomyces sp. V-1 (mã số NCBI AGR34008.1).

Như vậy có thể kết luận đã tách dòng thành công gene fcs có thể sử

dụng để thiết kế vector biểu hiện.

3.2. Thiết kế vector biểu hiện chứa 3 gene gltA, ech, fcs trên nền tảng

vector pET22b+

3.2.1. Chuyển gene gltA từ pTZ-gltA sang pET22b+ tạo vector tái tổ hợp

pET22-G

Gene gltA (1284 bp), mã hóa cho enzyme citrate synthase, xúc tác cho

phản ứng chuyển đổi acety-CoA thành CoA làm tăng hiệu quả tiêu thụ axit

ferulic, được tách dòng từ vi khuẩn E. coli DH5α. Ở 2 đầu gene gltA có chứa

vị trí cắt của hai enzyme giới hạn HindIII và SacI. Gene gltA đã được tách

dòng thành công từ vi khuẩn E. coli ở thí nghiệm trước đó, được sử dụng làm

vật liệu cung cấp gene gltA.

 Kết quả sàng lọc các dòng plasmid pET22-G bằng điện di plasmid sàng

lọc kích thước

Sau khi biến nạp sản phẩm gắn nối giữa gene gltA và vector pET22b(+)

mở vòng chúng tôi thu được 10 dòng khuẩn lạc. Kết quả tách chiết plasmid và

điện di sàng lọc trên gel agarose như hình 3.11.

D1→10: Các dòng plasmid khuẩn lạc trắng

Hình 3.11: Kết quả sàng lọc dòng mang vector pET22-G

Kết quả điện di cho thấy trong 10 dòng khuẩn lạc, có dòng 1, 2, 6, 7, 8,

9, 10 xuất hiện băng plasmid cóvị trí cao hơn băng đối chứng là vector gốc

pET22b(+), đây có thể là vector pET22b(+) đã được gắn gene gltA. Tôi chọn

dòng 1, 7 cho bước chọn lọc tiếp theo.

 Kết quả chọn lọc các dòng plasmid pET22-G bằng lập bản đồ giới hạn

Chọn lọc lần hai với plasmid dòng 1,7 bằng phản ứng cắt đồng thời hai

M 1 2

enzyme HindIII và SacI .

Đường chạy 1, 2: Sản phẩm cắt dòng 1, 7 Đường chạy M: Thang ADN chuẩn 1 kb

Hình 3.12: Cắt plasmid dòng 1,7 bằng đồng thời 2 enzyme HindIII và SacI

Sau khi cắt đã tạo ra được 2 băng: một băng kích thước khoảng 1284

bp (tương ứng với kích thước gene gltA) và một băng kích thước khoảng 5,5

kb (tương ứng với kích thước cuả vector pET22b+, còn băng mờ phía trên có thể

là do phản ứng cắt chưa hoàn toàn. Từ kết quả trên có thể coi đây là vector

pET22-G theo lý thuyết.

 Kiểm tra chiều gắn gene gltA trong pET22-G.

Dựa trên cơ sở trên gene gltA có 1 vị trí nhận biết của enzyme NcoI,

trên vector pET22 cũng có 1 vị trí cắt của NcoI. Có hai trường hợp xảy ra

A- Gắn ngược chiều

B- Gắn xuôi chiều

(hình 4.13):

Hình 3.13: Minh hoạ cơ sở kiểm tra chiều gắn gene gltA trong pET22-G

- Trường hợp 1: gltA gắn xuôi chiều. Trên bản đồ vector, khoảng cách

giữa 2 vị trí nhận biết của enzyme NcoI là 569 bp, nên khi cắt bằng enzyme

NcoI sẽ tạo ra hai băng có kích thước khoảng 569 bp và 6,2 kb.

- Trường hợp 2: gltA gắn ngược chiều. Khoảng cách giữa 2 vị trí nhận

biết NcoI là 809 bp, nên khi cắt bằng enzyme NcoI sẽ tạo ra hai băng có kích

thước khoảng 809 bp và 6 kb.

Đường chạy 1, 2: Sản phẩm cắt plasmid dòng 1 và 7 Đường chạy M: Thang ADN chuẩn 1 kb

Hình 3.14: Kết quả cắt pET22-G dòng 1,7 bằng enzyme NcoI

Kết quả điện di hình 3.13 đúng với trường hợp 1. Như vậy, gene gltA

được gắn đúng chiều trong vector pET22-G, đảm bảo vị trí enzyme SacI cho

phản ứng gắn gene ech tiếp theo.

3.2.2. Chuyển gene ech từ pTZ-ech sang pET22-G tạo vector tái tổ hợp

pET22-GE

 Kết quả sàng lọc các dòng plasmid pET22-GE bằng điện di plasmid sàng

lọc kích thước

Sau khi biến nạp sản phẩm gắn nối giữa ech và pET22-G tôi thu được 6

dòng khuẩn lạc. Tách chiết plasmid của 6 dòng này, điện di sàng lọc các dòng

có khả năng mang tổ hợp pET22-GE, bằng cách so sánh kích thước với đối

chứng pET22-G. Kết quả được thể hiện dưới hình 3.15.

D1→6: Các dòng plasmid khuẩn lạc trắng

Hình 3.15: Kết quả sàng lọc dòng mang vector pET22-GE

Trong các dòng plasmid trên có 5 dòng: dòng 2, 3, 4, 5, 6 có vị trí băng

cao hơn băng đối chứng là vector pET22-G. Đây có thể là các dòng đã được

gắn gene ech vào pET22-G. Plasmid dòng 1 có vị trí băng thấp hơn các

plasmid dòng còn lại, đây có thể là do bị nhiễm plasmid lạ trong quá trình

thao tác.

 Kết quả chọn lọc các dòng plasmid pET22-GE bằng lập bản đồ

giới hạn.

Đường chạy M: Thang ADN chuẩn 1 kb

Đường chạy 1: Sản phẩm cắt vector pET22-G

Đường chạy 2,3,4,5,6: Sản phẩm cắt các dòng 2,3,4,5,6 tương ứng

Hình 3.16: Kết quả cắt các dòng plasmid đồng thời bằng SacI và EcoRI

Cơ sở: Trên vector pET22-GE có duy nhất 2 vị trí của enzyme EcoRI

và SacI nằm ở 2 đầu của gene ech, nên khi cắt đồng thời 2 enzyme này, sẽ tạo

ra hai đoạn tương ứng với gene ech (khoảng 860 bp) và đoạn vector pET22 còn

lại (khoảng 6,8kb).

Kết quả điện di cho thấy, cắt dòng 2,3,4,5,6 đều cho tạo ra 2 đoạn theo

đúng lý thuyết. Trên pET22-GltA, do không gắn gene ech, khoảng cách giữa

SacI và EcoRI là 9bp nên khi cắt đồng thời 2 enzyme sẽ tạo ra một đoạn có

kích thước khoảng 7,6 kb, và một đoạn 9 bp do quá nhỏ nên bị chạy ra khỏi

bản gel trong quá trình điện di.

Dựa vào kết quả trên, tôi kết luận đã gắn được gene ech dự kiến vào

pET22-G, tạo tổ hợp pET22-GE.

 Kết quả kiểm tra chiều gắn gene ech trên pET22-GE

Cơ sở: Trên pET22-GE, sau vị trí EcoRI của gene ech có một vị trí của

enzyme BamHI. Khi cắt đồng thời bằng hai enzyme là EcoRI và BamHI, có 2

B- Gắn ngược chiều

A- Gắn cùng chiều

trường hợp xảy ra:

Hình 3.17: Minh họa cơ sở kiểm tra chiều gắn gene ech trong pET22-GE

- Trường hợp 1: gene ech gắn xuôi chiều. Khi đó, vị trí EcoRI nằm gần

với vị trí BamHI của pET22b+ (cách nhau khoảng 12 nucleotide) nên khi cắt

pET22-GE đồng thời bằng 2 enzyme này sẽ tạo ra 2 đoạn gene: Một đoạn

kích thước 12 nucleotide, đoạn này kích thước quá nhỏ nên sẽ bị chạy ra khỏi

bản gel trong quá trình điện di và một đoạn kích thước khoảng 7,6 kb (7634 bp).

Đây là kết quả mong đợi.

- Trường hợp 2: gene ech gắn ngược chiều. Khi đó, khoảng cách từ vị

trí EcoRI và BamHI bằng tổng kích thước gene ech cộng thêm 10 nucleotide,

tức là khi cắt đồng thời 2 enzyme đó sẽ tạo ra 2 đoạn: Một đoạn kích thước

khoảng 871 bp (tương ứng với gene ech) và một đoạn có kích thước khoảng 6,8

kb (tương ứng với đoạn vector còn lại).

Đường chạy 1: plasmid dòng 2 (pET22-GE2)

Đường chạy 2,3,4,5,6: Sản phẩm cắt EcoRI-BamHI dòng 2,3,4,5,6 Khi cắt các dòng bằng EcoRI và BamHI đều cho 1 băng duy nhất, trong

Hình 3.18: Kết quả cắt các dòng plasmid đồng thời bằng EcoRI và BamHI

khi plasmid có 3 băng, chứng tỏ enzyme cắt hoàn toàn, kết quả này đúng với

trường hợp 1. Như vậy gene ech được gắn cùng chiều trong vector tái tổ hợp

pET22-GE,đảm bảo vị trí enzyme EcoRI cho thí nghiệm gắn gene fcs.

3.2.3. Chuyển gene fcs từ pTZ-fcs sang pET22-GE tạo vector tái tổ hợp

pET22-GEF

Gene fcs được cắt ra từ vector tách dòng bằng 2 enzyme EcoRI và

BamHI và nối vào pET22-GE tại vị trí EcoRI và BamHI.

A B

(A) Cấu trúc theo lý thuyết của vector pET22-GEF; (B) Cắt plasmid bằng các tổ hợp enzyme khác nhau. Đường chạy L: thang chuẩn 1 kb; đường chạy H-B: sản phẩm cắt plasmid bằng enzyme HindIII và BamHI; đường chạy E-B: sản phẩm plasmid cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI và BamHI.

Hình 3.19: Thiết kế vector tái tổ hợp pET22 mang 3 gene gltA, ech và fcs

Hình 3.19 B cho thấy sản phẩm cắt bằng các cặp enzyme giới hạn cho kết quả đúng như tính toán lý thuyết. Khi cắt plasmid tái tổ hợp bằng HindIII và BamHI thu được hai băng có kích thước lần lượt khoảng 5.5 kb và 3.6 kb tương ứng với kích thước của vector pET22 gốc và cụm gene GEF. Khi cắt plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI và BamHI xuất hiện 2 băng có kích thước lần lượt khoảng 7.6 kb và 1.5 kb tương ứng với kích thước của vector pET22-GE và gene fcs. Kết quả này cho thấy đã gắn thành công gene fcs vào vector pET22-GE để tạo vector biểu hiện chứa cả 3 gene mong muốn là pET22-GEF. 3.3. Thiết kế vector biểu hiện chứa 3 gene gltA, ech, fcs trên nền tảng pRSET 3.3.1. Chuyển gene fcs từ pTZ-fcs sang vector pRSET tạo vector pRSET-F

Gene fcs sau khi tách dòng thành công sẽ được cắt văng từ vector pTZ57R/T và gắn nối vào vector pRSET mở vòng, biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli Dh5α. Sản phẩm biến nạp được nuôi cấy và chọn lọc ngẫu nhiên các khuẩn lạc để tách ADN, kết quả ở Hình 3.20A. Chọn khuẩn lạc nghi ngờ mang đoạn xen để cắt kiểm tra gene fcs có được gắn đúng chiều vào vector hay không bằng enzyme SacI và BamHI. Do trên 2 đầu của gene fcs có vị trí nhận biết của 2 enzyme này nên theo lý thuyết nếu gene fcs gắn được vào vector và xuôi chiều thì khi cắt đồng thời bằng 2 enzyme này sẽ tạo 2 băng: một băng có kích thước khoảng 1.5 kb và một băng có kích thước gần bằng 3 kb của vector pRSET, kết quả ở Hình 3.20B.

A B

Hình 3.20: ADN plasmid của các khuẩn lạc trắng có khả năng mang

(A): ĐC: Đối chứng (plasmid khuẩn lạc màu xanh), Đường chạy 1 -> 3: plasmid khuẩn lạc màu trắng. (B): Đường chạy L: marker 1kb, đường chạy 1: plasmid pRSET-F, đường chạy 2:sản phẩm cắt plasmid dòng 2 bằng SacI và BamHI.

pRSET-F (A) và cắt plasmid bằng enzyme SacI và BamHI (B)

Kết quả tách chiết ADN plasmid ở Hình 3.20A cho thấy trong 3 dòng

khuẩn lạc màu trắng, chỉ có dòng số 1 và 2 (ở đường chạy 1 và 2) cho plasmid có

băng cao hơn của khuẩn lạc màu xanh (đường chạy ĐC), đây có thể là những

dòng nghi ngờ mang đoạn gene fcs. Lựa chọn dòng số 2 để cắt kiểm tra và kết quả

ở Hình 3.20B đường chạy số 2 cho 2 băng, một băng có kích thước khoảng 1541

bp của gene fcs và một băng 2897 bp của vector pRSET. Điều này cho thấy gene

fcs đã được gắn đúng chiều vào vector pRSET để tạo pRSET-F.

3.3.2. Chuyển cụm hai gene gltA và ech từ pET22-GE sang pRSET-F tạo

vector tái tổ hợp pRSET-GEF

Cụm gene GE được cắt từ vector pET22-GE bằng enzyme HindIII và

EcoRI để chuyển sang pRSET-F cũng cắt mở vòng bằng 2 enzyme này. Sau

khi gắn nối cụm gene GE vào vector pRSET-F, biến nạp và cấy trải. Chọn các

dòng khuẩn lạc trắng để tách plasmid, điện di kiểm tra và chọn các plasmid có

khả năng mang cụm gene GE để cắt kiểm tra sự có mặt của cụm gene này

trong vector pRSET-F. Sử dụng nhiều tổ hợp enzyme giới hạn khác nhau để

cắt kiểm tra nhằm tăng độ tin cậy cho kết quả. Về mặt lý thuyết, nếu gắn

thành công cụm gene GE vào vector pRSET-F và tất cả các gene được gắn

xuôi chiều thì vector pREST-GEF sẽ có cấu trúc như Hình 3.18A. Do vậy,

nếu cắt bằng các tổ hợp enzyme khác nhau sẽ cho các băng có kích thước

khác nhau, tuỳ thuộc vào vị trí cắt của enzyme đó trên vector, bao gồm:

- Nếu cắt bằng enzyme SacI thì vector pREST-GEF sẽ tạo ra một băng

(vì chỉ có một vị trí cắt duy nhất của SacI trên vector) có kích thước khoảng

6582 bp (là kích thươc của vector pREST cộng với tổng kích thước của 3

gene gltA, ech và fcs).

- Nếu cắt đồng thời bằng EcoRI và HindIII thì sẽ tạo ra 2 băng: một băng

có kích thước 2144 của gene gltA cộng với ech và một băng có kích thước

4438 bpcủa gene fcs cộng với vector pRSET.

- Nếu cắt bằng tổ hợp BamHI và HindIII sẽ tạo 3 băng vì như trên Hình

8A có 2 vị trí cắt của enzyme BamHI và 1 vị trí cắt của HindIII. Khi ấy một

băng sẽ có kích thước gần 1.6kb là của gene fcs và một phần của gene ech,

một băng có kích thước xấp xỉ 2.2 kb là của phần còn lại của gene ech và

gene gltA, một băng có kích thước 2897 bp của vector pRSET.

- Nếu cắt bằng enzyme BamHI và EcoRI thì sẽ tạo 3 băng, một băng có

kích thước rất nhỏ (khoảng cách từ vị trí cắt EcoRI đến BamHI trên gene ech),

băng này sẽ bị trôi ra khỏi bản gel khi điện di và một băng có kích thước 1541

của gene fcs và một băng có kích thước xấp xỉ 5 kb của vector pRSET cộng

với gene gltA và phần còn lại của gene ech.

A B C

(B): Đường chạy L: thang ADN chuẩn 1 kb; đường chạy S: sản phẩm cắt plasmid bằng enzyme SacI, đường chạy E-H: sản phẩm cắt plasmid bằng enzyme EcoRI và HimdIII, đường chạy B-H: sản phẩm cắt plasmid bằng enzyme BamHI và HindIII, đường chạy B-E: sản phẩm cắt plasmid bằng enzyme BamHI và EcoRI.

Kết quả cắt enzyme giới hạn ADN plasmid có khả năng mang vector tái tổ hợp pRSET-GEF bằng các tổ hợp enzyme giới hạn khác nhau ở Hình 3.21B cho thấy tất cả các kết quả cắt của các tổ hợp enzyme đều cho các băng theo đúng tính toán lý thuyết của việc gắn thành công cụm gene GE vào vector pRSET-F. Đó là: khi cắt bằng SacI chỉ cho một băng có kích thước

khoảng 6.5 kb (đường chạy S), cắt bằng tổ hợp EcoRI và HindIII (đường chạy E-H) cho 2 băng: một băng khoảng 2.1 kb và một băng khoảng 4.5kb. Cắt đồng thời bằng enzyme BamHI và HindIII (đường chạy B-H) cho 3 băng: một băng xấp xỉ 1.6 kb, một băng 2.2 kb và một băng 2.9 kb. Khi cắt bằng BamHI và EcoRI thì xuất hiện 2 băng: một băng là 1541 bp của gene fcs, một băng khoảng 5 kb của vector pRSET cộng với gene gltA và phần còn lại của gene ech. Còn băng có kích thước nhỏ bị trôi ra khỏi bản gel.

Như vậy có thể kết luận đã gắn thành công cụm gene GE vào vector pRSET-F để tạo vector biểu hiện pRSET-GEF và các gene được gắn xuôi chiều phiên mã và được điều khiển bởi Promoter T7. Cấu trúc các gene trong vector pRSET-GEF thể hiện trong Hình 3.18A. Cả 3 gene được sắp xếp liền kề dưới dạng polycistronic operon và đều có mã mở đầu và mã kết thúc, vị trí bám của ribosome để đảm bảo biểu hiện đồng thời.

3.4. Sinh tổng hợp vanillin từ axit fefulic sử dụng E. coli tái tổ hợp làm tế bào chủ 3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ axit ferulic đến sinh trưởng của E. coli

Nồng độ axit ferulic cao gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của E. coli [43] [84]. Để tối ưu hóa năng suất sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic trước hết phải xác định được nồng độ axit ferulic tối đa bổ sung vào môi trường nuôi cấy mà không ảnh hưởng đến sinh trưởng tế bào. Dải nồng độ axit ferulic ban đầu được lựa chọn thử nghiệm nằm trong khoảng 1 g/L đến 5 g/L căn cứ theo một số nghiên cứu trước [43]. Axit ferulic được bổ sung vào dịch nuôi cấy khi OD260nm đạt 0.6 và nuôi tiếp 36 tiếng, là khoảng thời gian nuôi cấy có thể sinh tổng hợp vanillin tối đa.

Hình 3.22: Ảnh hưởng của nồng độ axit ferulic ban đầu với sinh trưởng

của E. coli tái tổ hợp mang vector pET22-GEF

Kết quả trên hình 3.22 cho thấy nồng độ axit ferulic 3 g/L là nồng độ cao

nhất có thể sử dụng mà ít gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của tế bào E. coli. Kết quả

này phù hợp với công bố trước [43]. Nồng độ 3 g/L axit ferulic được lựa chọn cho

các bước tối ưu hóa tiếp theo.

3.4.2. Xác định axit ferulic tồn dư và vanillin được tổng hợp bởi hệ thống pET22

Dòng E. coli tái tổ hợp chủng BL21(DE3) mang vector pET22-GEF được sử

dụng để sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic.

Hình 3.23: Phân tích HPLC động học sự chuyển hóa axit ferulic thành

(I) cơ chất ferulic axit và vanillin chuẩn; (II) sự chuyển hóa axit ferulic (FA) thành vanillin (VA) sau 12 giờ nuôi cấy; (III) sự chuyển hóa FA thành VA sau 36 giờ nuôi cấy. Axit ferulic (3 g/L) và IPTG (1 mM) được bổ sung vào dịch nuôi cấy tại thời điểm 4h khi OD600nm đạt 0.4

vanillin ở chủng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp mang vector pET22-GEF.

Kết quả ở hình 3.23.I cho thấy các đỉnh tương ứng với hai chất chuẩn axit

ferulic và vanillin thể hiện rõ ràng. Hình 3.23.II và III cho thấy lượng axit ferulic

bổ sung vào dịch nuôi cấy bị giảm đi theo thời gian do được sử dụng làm cơ chất

để chuyển hóa thành vanillin. Lượng vanillin sản phẩm được tạo thành tăng

tương ứng theo thời gian. Kết quả này cho thấy hệ thống sinh tổng hợp vanillin

từ cơ chất axit ferulic sử dụng tế bào E. coli tái tổ hợp do chúng tôi thiết kế đã hoạt

động thành công.

Tiếp theo, nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá một số điều kiện của hệ

thống sinh tổng hợp vanillin này nhằm tìm ra điều kiện tối ưu nhất.

3.5. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên năng suất sinh tổng hợp

vanillin

Các điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng đến hiệu suất sinh tổng hợp vanillin từ

axit ferulic. Chúng tôi thử nghiệm một số điều kiện bao gồm các loại môi trường

nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng và thời gian nuôi cấy.

3.5.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Trong một số nghiên cứu trước [43], [84] các tác giả đã tìm ra thời gian nuôi

cấy tối ưu cho sinh tổng hợp vanillin bằng E. coli tái tổ hợp là 36 tiếng. Tuy nhiên,

hệ vector được sử dụng trong các nghiên cứu đó dựa trên pBAD và pBluescript

khác với các hệ thống pRSET và pET của đề tài này, vì vậy chúng tôi tiến hành

đánh giá lại thời gian nuôi cấy tối ưu.

Hình 3.24: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh trưởng và

Axit ferulic (3 g/L) và IPTG (1 mM) được bổ sung vào dịch nuôi cấy tại thời điểm 4h khi OD600nm đạt khoảng 0.4

sinh tổng hợp vanillin của chủng E. coli tái tổ hợp.

Kết quả trên hình 3.24 cho thấy ở mốc 12h sinh trưởng tế bào đạt mức cao

nhất tuy nhiên lượng vanillin tạo thành còn thấp. Từ 12h trở đi sinh trưởng tế bào

giảm dần. Tại thời điểm 36h mặc dù sinh trưởng tế bào ở mức thấp nhưng hàm

lượng vanillin được tạo thành và tích tụ đạt mức tối đa. Nuôi thêm lên mốc thời

gian 42h hàm lượng vanillin giảm đi do mối tương quan giữa lượng vanillin được

sinh tổng hợp với lượng vanillin bị phân hủy đã trở nên bất lợi trong khi sinh trưởng

[84]. Điều này cho thấy yếu tố thời gian nuôi cấy không chịu sự chi phối của các hệ

tế bào đã đạt mức thấp nhất. Kết quả này đồng thuận với các nghiên cứu trước [43]

vector khác nhau mà do bản chất sinh học của tế bào vật chủ, ở đây là E. coli, và

bản chất hóa học của vanillin.

Thời gian nuôi 36h được lựa chọn cho các bước tiếp theo.

3.5.2. So sánh các môi trường LB, M9 và 2YT

Các nghiên cứu trước đã cho thấy thành phần môi trường có ảnh hưởng tới

sinh tổng hợp vanillin. Trong nghiên cứu này chúng tôi thử nghiệm 3 loại môi

trường bao gồm môi trường tiêu chuẩn LB, môi trường tối thiểu nghèo carbon M9

và môi trường giàu dinh dưỡng 2YT.

Hình 3.25: So sánh khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp vanillin của E.

coli tái tổ hợp trên các môi trường LB, M9 và 2YT.

Hình 3.25 cho thấy sinh trưởng của E. Coli thấp nhất ở môi trường tối thiểu

M9 đồng thời tỉ lệ thuận với lượng vanillin tạo thành. Tuy nhiên, ở môi trường giàu

dinh dưỡng 2YT, mặc dù sinh trưởng tế bào tốt hơn hai môi trường LB và M9

nhưng lượng vanillin tạo thành lại không bằng LB. Kết quả này cho thấy môi

trường cân bằng dinh dưỡng LB phù hợp hơn trong việc nuôi cấy E. coli tái tổ hợp

để sinh tổng hợp vanillin. Môi trường LB do đó được lựa chọn cho các thí nghiệm

tiếp theo.

3.5.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG

Ở các thí nghiệm trước chúng tôi sử dụng nồng độ IPTG 1 mM theo đề xuất

của nhà cung cấp vector. Trong thí nghiệm này chúng tôi bố trí dãy nồng độ IPTG

nhằm tìm ra nồng độ tối thiểu đáp ứng được nhiệm vụ cảm ứng biểu hiện các gene

đích gltA, ech và fcs xúc tác sinh tổng hợp vanillin.

Hình 3.26: Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến sinh tổng hợp vanillin.

Kết quả trên hình 3.26 cho thấy lượng vanillin tạo thành cao nhất đạt 1.6 g/L

khi được cảm ứng ở nồng độ IPTG 2 mM. Tuy nhiên, nồng độ IPTG 0.5 mM cũng

tạo thành lượng vanillin lên tới 1.52 g/L, vượt trội hoàn toàn so với mức 0.7 g/L ở

nồng độ IPTG 0.2 mM. Mức chênh lệch của lượng vanillin sản phẩm cảm ứng bởi

nồng độ IPTG 0.5 mM và 2 mM là không thật sự lớn, trong khi lượng IPTG cần

dùng chênh nhau 4 lần. Vì vậy, chúng tôi sử dụng nồng độ IPTG 0.5 mM cho các

bước tiếp theo.

3.6. So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin giữa hai hệ vector pET22 và

pRSET

Dựa trên sự phân tích chuyển hóa ở chủng E. coli BL21(DE3)/pET-GEF,

chúng tôi đã tiến hành phân tích tương tự với chủng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp

mang vector pRSET-GEF. Hiệu quả chuyển hóa axit ferulic thành vanillin giữa hai

hệ thống vector được so sánh trên hình 3.27.

Hình 3.27: So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin từ cơ chất axit

ferulic sử dụng các chủng E. coli tái tổ hợp mang vector pET22-GEF và

pRSET-GEF

Hình 3.27 cho thấy hệ thống biểu hiện trên nền tảng vector pET22b(+) có

hiệu suất sinh tổng hợp vanillin đạt 1.44 g/L cao hơn so với mức 1.17 g/L của

vector pRSET-A. Một trong những cơ sở có thể lý giải hiện tượng này là do ở hệ

thống pET22b(+) protein tái tổ hợp được dung hợp với trình tự tín hiệu pelB và do

đó được định vị ra ngoài khoang chu chất, nhờ đó giảm được tác dụng phân hủy của

các protease nội bào và tăng khả năng tiết ra môi trường.

Mặt khác, vector pRSET-A với điểm khởi đầu sao chép pUC được xếp vào

nhóm vector có số lượng bản sao lớn (khoảng 500 bản sao/tế bào) trong khi

pET22b(+) với điểm khởi đầu sao chép pBR322 thuộc nhóm số lượng bản sao thấp

(khoảng 15 đến 20 bản sao/tế bào). Kết quả so sánh 2 hệ vector cho thấy số lượng

bản sao của vector có ảnh hưởng đến mức độ sinh tổng hợp vanillin. Công bố trước

đây của Jones và cộng sự [34] kết luận số lượng bản sao của plasmid không ảnh

hưởng tới sinh tổng hợp của chất đích. Tuy nhiên, dữ liệu của chúng tôi đồng thuận

hơn với công bố của Barghini và cộng sự [12] khi vanillin được tổng hợp mạnh hơn

khi sử dụng plasmid số lượng bản sao thấp và promoter hiệu suất thấp.

Hiệu suất sinh tổng hợp vanillin trong nghiên cứu của chúng tôi cao

hơn mức 580 mg/L theo Yoon và cộng sự (2005) [84] khi gene gltA chưa

được sử dụng. Dữ liệu này góp phần khẳng định vai trò của gene gltA trong

sinh tổng hợp vanillin bằng E. coli tái tổ hợp vì gene này giúp tái sử dụng

acetyl-CoA theo chu trình [43].

Chương 4

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

1. Tách dòng thành công 3 gene mã hóa con đường sinh tổng hợp vanillin từ

axit ferulic, bao gồm: gltA, ech và fcs.

2. Thiết kế thành công 2 vector biểu hiện mang các gene gltA, ech và fcs là:

pRSET-GEF và pET22-GEF.

3. Đã cảm ứng biểu hiện các gen đích để sản xuất vanillin từ axit ferulic sử

dụng vật chủ E. coli BL21(DE3).

4. Phân tích lđược hiệu suất sinh tổng hợp vanillin tạo thành của E. coli tái tổ

hợp bằng phương pháp HPLC. Hệ thống pET22-GEF và pRSET-GEF đạt hiệu suất

lần lượt là 1.44 g/L và 1.17 g/L.

4.2. Kiến nghị

Tiếp tục nghiên cứu quy trình lên men E.coli sinh tổng hợp vanillin từ

axit ferulic để thu hồi vanillin thành phẩm.

Tiếp tục nghiên cứu tăng cường năng suất sinh tổng hợp vanillin theo

các hướng sau:

- Bất hoạt con đường trao đổi chất cạnh tranh để dồn nguồn năng lượng

và vật chất cho con đường sinh tổng hợp vanillin

- Giảm độc cho tế bào vật chủ bằng cách (1) sử dụng các chất hấp phụ;

(2) chọn lọc các chủng đột biến kháng vanillin/axit ferulic

- Thiết lập các quy trình lên men hiệu quả hơn như lên men đáp ứng bề

mặt hoặc lên men liên tục.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tiếng Việt

1. Đinh Thị Ngọ, Nguyễn Bích Thuỷ, Đào Văn Tường (1991) Tổng hợp vanillin từ

eugeneol. Tạp chí Hóa học 29 (4): 21-27.

2. Đinh Thị Ngọ, Nguyễn Thị Bích Thuỷ, Đào Văn Tường (1992) Nghiên cứu oxy

hóa lignin thành vanillin, Tạp chí Hóa học

3. Đinh Thị Ngọ (1996) Tổng hợp vanillin từ tinh dầu lá quế. Tạp chí Khoa học &

công nghệ

4. Phùng Thu Nguyệt, Nguyễn Hồng Thanh, Jan-Christer Janson, Trương Nam Hải

(2009) Nghiên cứu lên men lượng lớn chủng Escherichia coli BL21 tái tổ hợp

mang gene mã hóa lipase của Bacillus subtilis FS2. Tạp chí Khoa học và

Công nghệ, Tập 47, số 2, Tr109-116

II. Tiếng Anh

5. Abraham, D. J., Mehanna, A. S., Wireko, F. C., Whitney, J., Thomas, R. P., & Orringer, E. P. (1991). Vanillin, a potential agenet for the treatment of sickle cell anemia. Blood, 77(6), 1334-1341.

6. Achterholt, S., Priefert, H., & Steinbuchel, A. (2000). Identification of amycolatopsis sp. Strain hr167 genes, involved in the bioconversion of axit ferulic to vanillin. Appl Microbiol Biotechnol, 54(6), 799-807.

7. Akagi, K., Hirose, M., Hoshiya, T., Mizoguchi, Y., Ito, N., & Shirai, T. (1995). Modulating effects of ellagic acid, vanillin and quercetin in a rat medium term multi-organ carcinogenesis model. Cancer Lett, 94(1), 113-121.

8. Ashengroph, M., Nahvi, I., Zarkesh-Esfahani, H., & Momenbeik, F. (2011a). Candida galli strain pgo6: A novel isolated yeast strain capable of transformation of isoeugeneol into vanillin and vanillic acid. Curr Microbiol, 62(3), 990-998. doi:10.1007/s00284-010-9815-y

9. Ashengroph, M., Nahvi, I., Zarkesh-Esfahani, H., & Momenbeik, F. (2011b). Pseudomonas resinovorans spr1, a newly isolated strain with potential of transforming eugeneol to vanillin and vanillic acid. N Biotechnol, 28(6), 656- 664. doi:10.1016/j.nbt.2011.06.009

10. Ashengroph, M., Nahvi, I., Zarkesh-Esfahani, H., & Momenbeik, F. (2011c). Use of growing cells of pseudomonas aeruginosa for synthesis of the natural vanillin via conversion of isoeugeneol. Iran J Pharm Res, 10(4), 749-757. 11. Ashengroph, M., Nahvi, I., Zarkesh-Esfahani, H., & Momenbeik, F. (2012). Conversion of isoeugeneol to vanillin by psychrobacter sp. Strain csw4. Applied Biochemistry and Biotechnology, 166(1), 1-12. doi:10.1007/s12010- 011-9397-6

12. Barghini, P., Di Gioia, D., Fava, F., & Ruzzi, M. (2007). Vanillin production using metabolically engineered escherichia coli under non-growing conditions. Microb Cell Fact, 6, 13. doi:10.1186/1475-2859-6-13

Environmental Microbiology, 66(8), and

13. Barthelmebs, L., Divies, C., & Cavin, J.-F. (2000). Knockout of the p-coumarate decarboxylase gene from lactobacillus plantarum reveals the existence of two other inducible enzymatic activities involved in phenolic acid metabolism. 3368-3375. Applied doi:10.1128/aem.66.8.3368-3375.2000

Engineering, Bioprocess 18(5), and

14. Berza, I., Dishlers, A., Petrovskis, I., Tars, K., & Kazaks, A. (2013). Plasmid dimerization increases the production of hepatitis b core particles in e. Coli. Biotechnology 850-857. doi:10.1007/s12257-013-0188-5

15. Bjørsvik, H.-R., & Liguori, L. (2002). Organic processes to pharmaceutical chemicals based on fine chemicals from lignosulfonates. Organic Process Research & Development, 6(3), 279-290. doi:10.1021/op010087o

16. Boonchird, C., & Flegel, T. W. (1982). In vitro antifungal activity of eugeneol and vanillin against candida albicans and cryptococcus neoformans. Can J Microbiol, 28(11), 1235-1241.

17. Calisti, C., Ficca, A. G., Barghini, P., & Ruzzi, M. (2008). Regulation of ferulic catabolic genes in pseudomonas fluorescens bf13: Involvement of a marr family regulator. Applied Microbiology and Biotechnology, 80(3), 475-483. doi:10.1007/s00253-008-1557-4

18. Converti, A., Aliakbarian, B., Dominguez, J. M., Bustos Vazquez, G., & Perego, P. (2010). Microbial production of biovanillin. Braz J Microbiol, 41(3), 519- 530. doi:10.1590/s1517-83822010000300001

from axit

19. Di Gioia, D., Luziatelli, F., Negroni, A., Ficca, A. G., Fava, F., & Ruzzi, M. (2010). Metabolic engineering of pseudomonas fluorescens for the production of vanillin ferulic. J Biotechnol, 156(4), 309-316. doi:10.1016/j.jbiotec.2011.08.014

20. Dignum, M. J. W., Kerler, J., & Verpoorte, R. (2001). Vanilla production: Technological, chemical, and biosynthetic aspects. Food Reviews International, 17(2), 119-120. doi:10.1081/FRI-100000269

21. Durant, S., & Karran, P. (2003). Vanillins--a novel family of ADN-pk inhibitors.

Nucleic Acids Res, 31(19), 5501-5512.

22. Edlin, D. A. N., Narbad, A., Gasson, M. J., Dickinson, J. R., & Lloyd, D. (1998). Purification and characterization of hydroxycinnamate decarboxylase from brettanomyces anomalus. Enzyme and Microbial Technology, 22(4), 232-239. doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0141-0229(97)00169-5

23. Fitzgerald, D. J., Stratford, M., Gasson, M. J., & Narbad, A. (2005). Structure- function analysis of the vanillin molecule and its antifungal properties. J Agric Food Chem, 53(5), 1769-1775. doi:10.1021/jf048575t

24. Furia, T. E., & Bellanca, N. (1975). Fenaroli's handbook of flavor ingredients: C

R C Press LLC.

25. Gasson, M. J., Kitamura, Y., McLauchlan, W. R., Narbad, A., Parr, A. J., Parsons, E. L., . . . Walton, N. J. (1998). Metabolism of axit ferulic to vanillin. A bacterial gene of the enoyl-scoa hydratase/isomerase superfamily encodes an enzyme for the hydration and cleavage of a hydroxycinnamic acid scoa thioester. J Biol Chem, 273(7), 4163-4170.

26. Gupta, J., Hamp, S., Buswell, J., & Eriksson, K.-E. (1981). Metabolism of trans- axit ferulic by the white-rot fungus sporotrichum pulverulentum. Archives of Microbiology, 128(4), 349-354. doi:10.1007/BF00405911

27. Gustafson, D. L., Franz, H. R., Ueno, A. M., Smith, C. J., Doolittle, D. J., & Waldren, C. A. (2000). Vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) inhibits mutation induced by hydrogene peroxide, n-methyl-n-nitrosoguanidine and mitomycin c but not 137cs γ-radiation at the cd59 locus in human–hamster hybrid al cells. Mutagenesis, 15(3), 207-213. doi:10.1093/mutage/15.3.207

28. Havkin-Frenkel, D., & Belanger, F. (2007). Application of metabolic engineering to vanillin biosynthetic pathways in vanilla planifolia. In R. Verpoorte, A. W.

Alfermann, & T. S. Johnson (Eds.), Applications of plant metabolic engineering (pp. 175-196): Springer Netherlands.

29. Havkin-Frenkel, D., & Belanger, F. (2010). Handbook of vanilla science and

technology: Wiley.

30. Havkin-Frenkel, D., Podstolski, A., & Knorr, D. (1996). Effect of light on vanillin precursors formation by in vitro cultures of vanilla planifolia. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 45(2), 133-136. doi:10.1007/BF00048756 31. Hopp, R., & Rabenhorst, J. (2000). Process for the preparation of vanillin and

microorganisms suitable therefor: Google Patents.

32. Huang, Z., Dostal, L., & Rosazza, J. P. (1993a). Mechanisms of axit ferulic conversions to vanillic acid and guaiacol by rhodotorula rubra. J Biol Chem, 268(32), 23954-23958.

33. Huang, Z., Dostal, L., & Rosazza, J. P. (1993b). Microbial transformations of axit ferulic by saccharomyces cerevisiae and pseudomonas fluorescens. Appl Environ Microbiol, 59(7), 2244-2250.

bacteria. Metab 2(4), Eng, of

34. Jones, K. L., Kim, S. W., & Keasling, J. D. (2000). Low-copy plasmids can perform as well as or better than high-copy plasmids for metabolic engineering 328-338. doi:10.1006/mben.2000.0161

35. Kamat, J., Ghosh, A., & Devasagayam, T. A. (2000). Vanillin as an antioxidant in rat liver mitochondria: Inhibition of protein oxidation and lipid peroxidation induced by photosensitization. Molecular and Cellular Biochemistry, 209(1- 2), 47-53. doi:10.1023/A:1007048313556

36. Kamoda, S., Habu, N., Samejima, M., & Yoshimoto, T. (1989). Purification and some properties of lignostilbene-?,?-dioxygenease responsible for the c?-c? Cleavage of a diarylpropane type lignin model compound from pseudomonas sp. Tmy1009. Agricultural and biological chemistry, 53(10), 2757-2761. 37. Kanski, J., Aksenova, M., Stoyanova, A., & Butterfield, D. A. (2002). Axit ferulic antioxidant protection against hydroxyl and peroxyl radical oxidation in synaptosomal and neuronal cell culture systems in vitro: Structure-activity studies. The Journal of nutritional biochemistry, 13(5), 273-281.

38. Keen, H., Glynne, A., Pickup, J. C., Viberti, G. C., Bilous, R. W., Jarrett, R. J., & Marsden, R. (1980). Human insulin produced by recombinant ADN

technology: Safety and hypoglycaemic potency in healthy men. Lancet, 2(8191), 398-401.

39. Kirk, R. E., & Othmer, D. F. (1983). Kirk-othmer encyclopedia of chemical

technology: Sulfonation and sulfation to thorium and thorium compounds: Wiley. 40. Knuth, M. E., & Sahai, O. P. (1991). Flavor composition and method: Google Patents. 41. Krueger DA, K. H. (1985). Detection of fraudulent vanillin labeled with 13c in

the carbonyl carbon. J. Agric Food Chem, 33, 323-325.

42. Kumar, R., Sharma, P. K., & Mishra, P. S. (2012). Cheminform abstract: Vanillin derivatives showing various biological activities. ChemInform, 43(28), no-no. doi:10.1002/chin.201228263

43. Lee, E. G., Yoon, S. H., Das, A., Lee, S. H., Li, C., Kim, J. Y., . . . Kim, S. W. (2009). Directing vanillin production from axit ferulic by increased acetyl-coa consumption in recombinant escherichia coli. Biotechnol Bioeng, 102(1), 200- 208. doi:10.1002/bit.22040

44. Lomascolo, A., Stentelaire, C., Asther, M., & Lesage-Meessen, L. (1999). Basidiomycetes as new biotechnological tools to generate natural aromatic flavours for the food industry. Trends in biotechnology, 17(7), 282-289. 45. López-Malo, A., Alzamora, S. M., & Argaiz, A. (1995). Effect of natural vanillin on germination time and radial growth of moulds in fruit-based agar systems. Food Microbiology, 12(0), 213-219. doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0740- 0020(95)80100-6

46. Luziatelli, F., & Ruzzi, M. Genetic engineering of escherichia coli to enhance

biological production of vanillin from axit ferulic.

Industrial Health, Toxicology 28(7), and

47. Makni, M., Chtourou, Y., Barkallah, M., & Fetoui, H. (2012). Protective effect of vanillin against carbon tetrachloride (ccl4)-induced oxidative brain injury in 655-662. rats. doi:10.1177/0748233711420472

48. Markus, P. H., Peters, A. L., & Roos, R. (1994). Process for the preparation of

phenylaldehydes: Google Patents.

49. Martínez-Cuesta, M. d. C., Payne, J., Hanniffy, S. B., Gasson, M. J., & Narbad, A. (2005). Functional analysis of the vanillin pathway in a vdh-negative mutant strain of pseudomonas fluorescens an103. Enzyme and Microbial Technology, 37(1), 131-138. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.enzmictec.2005.02.004

50. Mathew, S., & Abraham, T. E. (2006). Bioconversions of axit ferulic, an 115-125. acid. Crit Rev Microbiol, 32(3),

hydroxycinnamic doi:10.1080/10408410600709628

51. Muheim, A., & Lerch, K. (1999). Towards a high-yield bioconversion of axit ferulic to vanillin. Applied Microbiology and Biotechnology, 51(4), 456-461. doi:10.1007/s002530051416

52. Muheim, A., MÜLLER, B., Münch, T., & Wetli, M. (2012). Process for the

production of vanillin: Google Patents.

53. Narbad, A., & Gasson, M. J. (1998). Metabolism of axit ferulic via vanillin using a novel coa-dependent pathway in a newly-isolated strain of pseudomonas fluorescens. Microbiology, 144 ( Pt 5), 1397-1405.

54. Nausch, H., Huckauf, J., Koslowski, R., Meyer, U., Broer, I., & Mikschofsky, H. (2013). Recombinant production of human interleukin 6 in escherichia coli. PLoS One, 8(1), e54933. doi:10.1371/journal.pone.0054933

55. Ner, S. S., Bhayana, V., Bell, A. W., Giles, I. G., Duckworth, H. W., & Bloxham, D. P. (1983). Complete sequence of the glta gene encoding citrate synthase in escherichia coli. Biochemistry, 22(23), 5243-5249. doi:10.1021/bi00292a001

56. Ngarmsak, M., Delaquis, P., Toivonen, P., Ngarmsak, T., Ooraikul, B., & Mazza, G. (2006). Antimicrobial activity of vanillin against spoilage microorganisms in stored fresh-cut mangoes. J Food Prot, 69(7), 1724-1727.

57. Odoux, E., Escoute, J., Verdeil, J. L., & Brillouet, J. M. (2003). Localization of beta-d-glucosidase activity and glucovanillin in vanilla bean (vanilla planifolia andrews). Ann Bot, 92(3), 437-444. doi:10.1093/aob/mcg150

58. Ou, S., & Kwok, K.-C. (2004). Axit ferulic: Pharmaceutical functions, preparation and applications in foods. Journal of the science of food and agriculture, 84(11), 1261-1269. doi:10.1002/jsfa.1873

59. Overhage, J., Priefert, H., & Steinbuchel, A. (1999). Biochemical and genetic analyses of axit ferulic catabolism in pseudomonas sp. Strain hr199. Appl Environ Microbiol, 65(11), 4837-4847.

60. Overhage, J., Steinbuchel, A., & Priefert, H. (2003). Highly efficient biotransformation of eugeneol to axit ferulic and further conversion to vanillin in recombinant strains of escherichia coli. Appl Environ Microbiol, 69(11), 6569-6576.

61. Plaggeneborg, R., Overhage, J., Loos, A., Archer, J. C., Lessard, P., Sinskey, A., . . . Priefert, H. (2006). Potential of rhodococcus strains for biotechnological vanillin production from axit ferulic and eugeneol. Applied Microbiology and Biotechnology, 72(4), 745-755. doi:10.1007/s00253-005-0302-5

62. Plaggeneborg, R., Overhage, J., Steinbüchel, A., & Priefert, H. (2003). Functional analyses of genes involved in the metabolism of axit ferulic in pseudomonas putida kt2440. Applied Microbiology and Biotechnology, 61(5-6), 528-535. doi:10.1007/s00253-003-1260-4

63. Plaggeneborg, R., Steinbuchel, A., & Priefert, H. (2001). The coenzyme a- dependent, non-beta-oxidation pathway and not direct deacetylation is the major route for axit ferulic degradation in delftia acidovorans. FEMS Microbiol Lett, 205(1), 9-16.

64. Rabenhorst, J. D., & Hopp, R. D. (1997). Verfahren zur herstellung von vanillin

und dafür geeignete mikroorganismen: Google Patents.

65. Ramachandra Rao, S., & Ravishankar, G. A. (2000). Vanilla flavour: Production by conventional and biotechnological routes. Journal of the science of food and agriculture, 80(3), 289-304.

66. Ranadive, A. S. (1994). Vanilla--cultivation, curing, chemistry, technology and

commercial products. Developments in food science., 34, 517-577.

67. Ravendra, K., Sharma, P. K., & Prem Shanker, M. (2012). Cheminform abstract: Vanillin derivatives showing various biological activities. ChemInform, 43(28). doi:10.1002/chin.201228263

68. Rezaei, M., & Zarkesh-Esfahani, S. H. (2012). Optimization of production of

recombinant human growth hormone in escherichia coli.

69. Rosazza, J. P. N., Huang, Z., Dostal, L., Volm, T., & Rousseau, B. (1995). Review: Biocatalytic transformations of axit ferulic: An abundant aromatic natural product. Journal of Industrial Microbiology, 15(6), 457-471. doi:10.1007/BF01570016

70. Shimoni, E., Ravid, U., & Shoham, Y. (2000). Isolation of a bacillus sp. Capable

of transforming isoeugeneol to vanillin. J Biotechnol, 78(1), 1-9.

71. Sinha, A. K., Sharma, U. K., & Sharma, N. (2008). A comprehensive review on vanilla flavor: Extraction, isolation and quantification of vanillin and others

Int J Food Sci Nutr, 59(4), 299-326.

constituents. doi:10.1080/09687630701539350

72. Srinivasan, M. R., & Chandrasekhara, N. (1992). Comparative influence of vanillin & capsaicin

on liver & blood lipids in the rat. Indian J Med Res, 96, 133-135.

73. Sutherland, J. B., Crawford, D. L., & Pometto, A. L., 3rd. (1983). Metabolism of cinnamic, p-coumaric, and axit ferulics by streptomyces setonii. Can J Microbiol, 29(10), 1253-1257.

74. Tawatsin, A., Wratten, S. D., Scott, R. R., Thavara, U., & Techadamrongsin, Y. (2001). Repellency of volatile oils from plants against three mosquito vectors. J Vector Ecol, 26(1), 76-82.

75. Torre, P., De Faveri, D., Perego, P., Ruzzi, M., Barghini, P., Gandolfi, R., & Converti, A. (2004). Bioconversion of ferulate into vanillin by escherichia coli strain jm109/pbb1 in an immobilized-cell reactor. Annals of microbiology, 54(4), 517-527.

76. Vaghasiya, Y. K., Nair, R., Soni, M., Baluja, S., & Shanda, S. (2004). Synthesis, structural determination and antibacterial activity of compounds derived from vanillin and 4-aminoantipyrine. Journal of the Serbian Chemical Society, 69(12), 991-998.

77. van den Heuvel, R. H., Fraaije, M. W., Laane, C., & van Berkel, W. J. (2001). Enzymatic synthesis of vanillin. J Agric Food Chem, 49(6), 2954-2958. 78. Venturi, V., Zennaro, F., Degrassi, G., Okeke, B. C., & Bruschi, C. V. (1998). Genetics of axit ferulic bioconversion to protocatechuic acid in plant-growth- promoting pseudomonas putida wcs358. Microbiology, 144(4), 965-973. doi:10.1099/00221287-144-4-965

79. Walton, N. J., Mayer, M. J., & Narbad, A. (2003). Vanillin. Phytochemistry,

63(5), 505-515.

135-138. 35(1),

80. Westcott, R. J., Cheetham, P. S. J., & Barraclough, A. J. (1993). Use of organized viable vanilla plant aerial roots for the production of natural vanillin. doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0031- Phytochemistry, 9422(00)90521-1

81. Xu, P., Hua, D., & Ma, C. (2007). Microbial transformation of propenylbenzenes for natural flavour production. Trends Biotechnol, 25(12), 571-576. doi:10.1016/j.tibtech.2007.08.011

82. Yamada, M., Okada, Y., Yoshida, T., & Nagasawa, T. (2007). Biotransformation of isoeugeneol to vanillin by pseudomonas putida ie27 cells. Applied Microbiology and Biotechnology, 73(5), 1025-1030. doi:10.1007/s00253-006-0569-1

83. Yamada, M., Okada, Y., Yoshida, T., & Nagasawa, T. (2008). Vanillin isoeugeneol production using escherichia coli cells over-expressing monooxygenease of pseudomonas putida. Biotechnol Lett, 30(4), 665-670. doi:10.1007/s10529-007-9602-4

84. Yoon, S.-H., Li, C., Lee, Y.-M., Lee, S.-H., Kim, S.-H., Choi, M.-S., . . . Kim, S.- W. (2005). Production of vanillin from axit ferulic using recombinant strains ofescherichia coli. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 10(4), 378- 384. doi:10.1007/BF02931859

85. Yoon, S. H., Lee, E. G., Das, A., Lee, S. H., Li, C., Ryu, H. K., . . . Kim, S. W. (2007). Enhanced vanillin production from recombinant e. Coli using ntg mutagenesis and adsorbent resin. Biotechnol Prog, 23(5), 1143-1148. doi:10.1021/bp070153r

86. Yoon, S. H., Li, C., Kim, J. E., Lee, S. H., Yoon, J. Y., Choi, M. S., . . . Kim, S. W. (2005). Production of vanillin by metabolically engineered escherichia coli. Biotechnol Lett, 27(22), 1829-1832. doi:10.1007/s10529-005-3561-4 87. Zamzuri, N. A., & Abd-Aziz, S. (2013). Biovanillin from agro wastes as an J Sci Food Agric, 93(3), 429-438. flavour. food

alternative doi:10.1002/jsfa.5962

88. Zenk, M. H., Ulbrich, B., Busse, J., & Stockigt, J. (1980). Procedure for the enzymatic synthesis and isolation of cinnamoyl-coa thiolesters using a bacterial system. Anal Biochem, 101(1), 182-187.

89. Zhang, C., Li, X., Lian, L., Chen, Q., Abdulmalik, O., Vassilev, V., . . . Asakura, T. (2004). Anti-sickling effect of mx-1520, a prodrug of vanillin: An in vivo study using rodents. Br J Haematol, 125(6), 788-795. doi:10.1111/j.1365- 2141.2004.04892.x

90. Zhang, Y., Xu, P., Han, S., Yan, H., & Ma, C. (2006). Metabolism of isoeugeneol via isoeugeneol-diol by a newly isolated strain of bacillus subtilis hs8. Applied Microbiology and Biotechnology, 73(4), 771-779. doi:10.1007/s00253-006-0544-x

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli có khả năng sản xuất vanillin từ axit ferulic

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC MA THỊ TRANG NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI

CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULIC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC MA THỊ TRANG NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI

CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULIC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Dương Văn Cường

Cơ chất

Vi sinh vật

Nguồn tham khảo

Năng suất(g/L) 0.28 0.44

Thành phần

Vai trò

Vị trí

Kích thước

Tên

Trình tự mồi (chiều 5’→3’)

gene (bp)

mồi

STT

Tên thiết bị

Nguồn gốc xuất xứ

(A)Trình tự gene gltA tách dòng từ E. coli DH5α; (B) Trình tự amino acid dịch

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Quản lý hoạt động phát triển nhận thức cho trẻ mẫu giáo ở các trường mầm non, huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về điều kiện đầu tư kinh doanh trong lĩnh vực giáo dục, đào tạo ở Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Sự nghiệp nghiên cứu phê bình văn học của Hoài Thanh

Luận văn Thạc sĩ: Tiểu thuyết của Đỗ Phấn từ góc nhìn sinh thái

Luận văn Thạc sĩ: Giải pháp ứng phó với nhập cư ở Liên minh Châu Âu

Luận văn Thạc sĩ: Diễn ngôn về giới nữ trong văn xuôi nữ Việt Nam đương đại (khảo sát sáng tác của Dạ Ngân, Y Ban, Lý Lan, Nguyễn Thị Thu Huệ)

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng mức phát thải tham chiếu rừng khu vực huyện Bảo Lâm tỉnh Lâm Đồng

Luận văn Thạc sĩ: Đặc điểm nhân vật chính trong ba tác phẩm của Franz Kafka: Lâu đài, Vụ án, Hóa thân

Kháo luận tốt nghiệp: Vận dụng lí thuyết học tập trải nghiệm vào dạy học Thống kê - Xác suất ở lớp Hai

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng hệ thống điều khiển và thu nhận dữ liệu cho Robot dịch vụ

Luận văn Thạc sĩ: Thế giới nhân vật trong truyện ngắn Lê Minh Khuê sau năm 1975

Luận văn Thạc sĩ: Tác động của cấu trúc vốn đến hiệu quả hoạt động của các ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Kiểm soát rủi ro tín dụng bán lẻ tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Đầu tư và Phát triển Việt Nam chi nhánh Thủ Thiêm

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kinh doanh của ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hành vi sử dụng dịch vụ ngân hàng điện tử tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Ngoại thương Việt Nam – Chi nhánh Thủ Đức

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố tác đồng đến nợ xấu tại Ngân hàng Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn - Chi nhánh Tiền Giang

Luận văn Thạc sĩ: Yếu tố ảnh hưởng đến quyết định sử dụng dịch vụ thanh toán không dùng tiền mặt tại Ngân hàng TMCP Công thương Việt Nam (Vietinbank)

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về du lịch biển, thực tiễn tại tỉnh Bình Định

Luận văn Thạc sĩ: Ảnh hưởng của các yếu tố thương hiệu với vai trò trung gian của Marketing truyền miệng đến quyết định chọn việc làm của nhân viên GenZ tại chuỗi nhà hàng gà rán Popeyes khu vực Thành Phố Hồ Chí Minh

Luận văn Thạc sĩ: Ảnh hưởng của Marketing mix đến ý định học cao học của sinh viên khối ngành kinh tế thuộc Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán