Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu khả năng ứng dụng kit realtime PCR đa mồi Septifast trong chẩn đoán nhiễm trùng huyết ở trẻ em tại bệnh viện Nhi Trung ương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -----------------------

Nguyễn Minh Hằng

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KIT REALTIME PCR ĐA MỒI

SEPTIFAST TRONG CHẨN ĐOÁN NHIỄM TRÙNG HUYẾT Ở TRẺ EM

TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƢƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -----------------------

Nguyễn Minh Hằng

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KIT REALTIME PCR ĐA MỒI SEPTIFAST TRONG CHẨN ĐOÁN NHIỄM TRÙNG HUYẾT Ở TRẺ EM

TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƢƠNG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHÙNG THỊ BÍCH THỦY PGS.TS BÙI THỊ VIỆT HÀ

Hà Nội - 2016

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới:

TS. Phùng Thị Bích Thủy – Trưởng khoa Nghiên cứu Sinh học phân tử các

bệnh Truyền nhiễm – Bệnh viện Nhi Trung Ương.

PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà– Chủ nhiệm bộ môn Vi sinh vật học – Trường Đại

học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội.

Là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và

động viên tôi trong suốt quá trình tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám đốc Bệnh viện Nhi Trung

Ương, phòng Tổ chức cán bộ, tập thể khoa Vi sinh, các anh chị và các bạn đồng

nghiệp Khoa Nghiên cứu Sinh học phân tử các bệnh Truyền nhiễm - những người

đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành luận văn này.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban giám hiệu, phòng đào tạo Sau đại

học, các thầy, cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học

Quốc Gia Hà Nội, đặc biệt là các thầy, cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học đã truyền

đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập.

Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm

luận văn tốt nghiệp đã cho tôi những ý kiến quý báu, giúp đỡ để tôi có thể bảo vệ

thành công đề tài này.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã tạo

cho tôi điều kiện tốt nhất để hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày 01 tháng11 năm 2016

Học viên

Nguyễn Minh Hằng

Khóa 2014 - 2016

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. 1

MỤC LỤC ........................................................................................................ 2

DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................. 4

DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... 5

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ......................................... 6

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4

1.1. Tổng quan về nhiễm trùng huyết ................................................................. 4

1.2. Dịch tễ học bệnh nhiễm trùng huyết ........................................................... 5

1.2.1 Trên thế giới................................................................................................ 5

1.2.2. Tình hình nhiễm trùng huyết tại Việt Nam.............................................. 7

1.3. Nguyên nhân gây nhiễm trùng huyết ở trẻ em............................................ 8

1.4. Cơ chế gây bệnh nhiễm trùng huyết ............................................................ 9

1.5. Các tác nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết ................................................ 10

1.5.1. Vi khuẩn Gram âm gây nhiễm trùng huyết ........................................... 11

1.5.2. Vi khuẩn Gram dương gây nhiễm trùng huyết ...................................... 19

1.5.3. Nấm gây nhiễm trùng huyết ................................................................... 29

1.6. Phƣơng pháp sinh học phân tử realtime PCR đa mồi Septifast trong

chẩn đoán nhiễm trùng huyết ở trẻ em ............................................................. 34

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined.

2.1 Địa điểm nghiên cứu ......................................... Error! Bookmark not defined.

2.2 Thời gian nghiên cứu ........................................ Error! Bookmark not defined.

2.3 Đối tƣợng nghiên cứu ....................................... Error! Bookmark not defined.

2.3.1 Tiêu chuẩn lựa chọn .................................... Error! Bookmark not defined.

2.3.2. Tiêu chuẩn loại trừ ...................................... Error! Bookmark not defined.

2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu ................................. Error! Bookmark not defined.

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu ...................................... Error! Bookmark not defined.

Khóa 2014 - 2016

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

2.4.2 Phương pháp lấy mẫu .................................. Error! Bookmark not defined.

2.4.3 Sơ đồ nghiên cứu .......................................... Error! Bookmark not defined.

2.5 Phƣơng pháp cấy máu truyền thống ............... Error! Bookmark not defined.

2.6 Phƣơng pháp realtime PCR đa mồi Septifast trong chẩn đoán nhiễm

trùng huyết ở trẻ em ............................................... Error! Bookmark not defined.

2.6.1 Thiết bị, sinh phẩm và hóa chất ................... Error! Bookmark not defined.

2.6.2 Bảo quản và lưu trữ ..................................... Error! Bookmark not defined.

2.6.3 Bệnh phẩm thu nhận.................................... Error! Bookmark not defined.

2.6.4 Quy trình thực hiện ...................................... Error! Bookmark not defined.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...... Error! Bookmark not defined.

3.1. Tỷ lệ dƣơng tính với nhiễm trùng huyết bằng kỹ thuật realtime PCR đa

mồi Septifast ............................................................ Error! Bookmark not defined.

3.2. Tỷ lệ các tác nhân gây nhiễm trùng huyết bằng kỹ thuật realtime PCR

đa mồi Septifast ....................................................... Error! Bookmark not defined.

3.3. So sánh tỷ lệ phát hiện các tác nhân nhiễm trùng huyếtbằng 2 phƣơng

pháp cấy máu truyền thống và realtime PCR đa mồi Septifast ............... Error!

Bookmark not defined.

3.4. Tỷ lệ trẻ nhiễm trùng huyết theo giới tính .... Error! Bookmark not defined.

3.5. Đặc điểm nhiễm trùng huyết theo mùa .......... Error! Bookmark not defined.

3.6. Phân bố nhiễm trùng huyết theo nhóm tuổi .. Error! Bookmark not defined.

3.7. Mối liên quan giữa nhiễm trùng huyết với các chỉ số huyết học ....... Error!

Bookmark not defined.

KẾT LUẬN ........................................................ Error! Bookmark not defined.

KIẾN NGHỊ ....................................................... Error! Bookmark not defined.

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 42

Khóa 2014 - 2016

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng1.1 Các vi sinh vật được nêu trong danh sách xét nghiệm SeptiFast .... 38

Bảng 1.2 Các loài đại diện cho Nhóm CoNS và Streptococcusspp. .............. 38

Bảng 2.1 Giá trị baseline của mỗi bước sóng ..... Error! Bookmark not defined.

Bảng 2.2 Giá trị Tm bar của mỗi bước sóng ...... Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.1 Các tác nhân nhiễm trùng huyết được phát hiện bằng kỹ thuật cấy

máu ...................................................................... Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.2 So sánh các tác nhân nhiễm trùng huyết phát hiện bằng 2 phương

pháp ..................................................................... Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.3 Tác nhân nhiễm trùng huyết có kết quả âm tính với cấy máu được

phát hiện bằng kỹ thuật realtime PCR đa mồi SeptifastError! Bookmark not defined.

Bảng 3.4 Phân bố nhiễm trùng huyết theo nhóm tuổi với bệnh nhi được phát

hiện dương tính ................................................... Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.5Liên quan giữa nhiễm trùng huyết và các chỉ số huyết họcError! Bookmark not defined.

Khóa 2014 - 2016

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Mối quan hệ giữa SIRS, Nhiễm trùng huyết và nguồn gốc của

nhiễm trùng huyết vật chủ (Bone et al.1992) .................................................... 4

Hình 1.2 Real-time PCR với các đầu dò lai ghép gen. A: Bước biến tính, B:

Bước ủ (đo lường huỳnh quang), C: Bước kéo dài, D: Kết thúc .................... 35

Hình 1.3 Kênh bước sóng của vi khuẩn Gram dương .................................... 36

Hình 1.4 Kênh bước sóng của vi khuẩn Gram âm ......................................... 36

Hình 1.5 Kênh bước sóng của Nấm ............................................................... 37

Hình 1.6 Chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR đa mồi Septifast .............. 39

Hình 2.1 SeptiFastLys kit Mgrade ......................... Error! Bookmark not defined.

Hình 2.2 Hệ thống đồng nhất mẫu MagNa LyserError! Bookmark not defined.

Hình 2.3 SeptiFastPrep kit Mgrade ....................... Error! Bookmark not defined.

Hình 2.4 Septifast Cooling block ....................... Error! Bookmark not defined.

Hình 2.5 Hệ thống LightCycler 2.0 .................... Error! Bookmark not defined.

Hình 2.6 Tm bar đặt đúng ở đỉnh được xác định Error! Bookmark not defined.

Hình 2.7 Dữ liệu kết quả của realtime PCR đa mồi SeptifastError! Bookmark not defined.

Hình 3.1 Tỷ lệ dương tính nhiễm trùng huyết bằng kỹ thuật SeptifastError! Bookmark not defined.

Hình 3.2 Tỷ lệ các tác nhân gây nhiễm trùng huyết bằng kỹ thuật SeptifastError! Bookmark not defined.

Hình 3.3 Tỷ lệ phát hiện các tác nhân nhiễm trùng huyết bằng hai phương

pháp cấy máu truyền thống và Septifast ............. Error! Bookmark not defined.

Hình 3.4 Tỷ lệ trẻ nhiễm trùng huyết theo giới tínhError! Bookmark not defined.

Hình 3.5 Đặc điểm nhiễm trùng huyết theo mùa Error! Bookmark not defined.

Hình 3.6 Liên quan giữa nhiễm trùng huyết và các chỉ số huyết họcError! Bookmark not defined.

Khóa 2014 - 2016

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

NTH: Nhiễm trùng huyết

ADN: Axit Deoxyribonucleic

ARN: Axit ribonucleic

PCR: Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

ACCP: American College of Chest Physicians

SCCM: Society of Critical Care Medicine

SIRS: Systemic Inflammatory Response Syndrome

(Hội chứng đáp ứng viêm hệ thống)

LPS: Lypopolysaccarit

ITS: Internal transcribed spacer

(Vùng không gian phiên mã)

IC: Internal control (Nội kiểm chứng)

dsADN: double-strand ADN (ADN sợi kép)

CFU/ml: Colony Forming Units/ml

(Số đơn vị khuẩn lạc trên 1ml mẫu)

EDTA: Ethylen Diamin Tetra Acetat (Chất chống đông)

TM: Thạch máu

CHO: Thạch chocolate

KSĐ: Kháng sinh đồ

BET: Blood Extraction Tubes

A.baumannii: Acinetobacter baumannii

E.coli: Escherichia coli

K.pneumoniae: Klebsiella pneumoniae

CoNS: Coagulase negative Staphylococci

Khóa 2014 - 2016

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

MỞ ĐẦU

Nhiễm trùng huyết, sốc nhiễm trùng huyết và hội chứng rối loạn chức năng đa

cơ quan là những tập hợp bệnh lý rất thường gặp trong lâm sàng và đặc biệt nhất là

trong các đơn vị hồi sức. Nhiễm trùng huyết là nguyên nhân gây tử vong cao ở bệnh

nhân, theo số liệu công bố tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng huyết là 5,9 trong tổng số

100.000 trẻ, trong số đó tỷ lệ tử vong ở trẻ từ 1-4 tuổi là 0,6/100.000 và 0,2/100.000

ở trẻ từ 5-14 tuổi [43]. Chỉ riêng ở Hoa Kỳ thì mỗi năm có khoảng 750.000 ca bệnh

trong số đó 215.000 trường hợp tử vong, chiếm 9,3% tổng số ca tử vong tại đất

nước này [15]. Như vậy, đứng về số lượng thì tử vong do nhiễm trùng huyết tương

đương với tử vong do nhồi máu cơ tim và cao hơn nhiều so với AIDS và ung thư

vú. Thời gian nằm viện trung bình là 19,6 ngày và chi phí điều trị cho mỗi trường

hợp là 22.100 USD tức là khoảng 16,7 tỷ USD nếu tính trên toàn Hoa Kỳ [15,42].

Mặc dù có nhiều tiến bộ vượt bậc trong hiểu biết cơ chế sinh lý bệnh của nhiễm

trùng huyết cũng như sự phát triển của các phương pháp chẩn đoán điều trị song tỷ

lệ bệnh nhân mắc và tử vong vì nhiễm trùng huyết trên thế giới vẫn không ngừng

gia tăng và chiếm tỷ lệ không nhỏ.

Tại Việt Nam, nhiễm trùng huyết là tình trạng nhiễm khuẩn nặng và gây tử vong

rất cao đặc biệt là ở trẻ sơ sinh. Nhiễm trùng huyết cũng là nguyên nhân gây bệnh

cảnh lâm sàng nặng nề cho bệnh nhân, làm tăng chi phí điều trị, kéo dài thời gian

nằm viện đồng thời làm xuất hiện những chủng vi khuẩn kháng kháng sinh trong

bệnh viện. Nhiễm trùng huyết ở trẻ em trong giai đoạn sớm có triệu chứng không rõ

ràng nhưng bệnh tiến triển rất nhanh và có nhiều biến chứng nguy hiểm như sốc

nhiễm trùng, rối loạn chức năng đa cơ quan để lại di chứng nặng nề và dẫn tới gây

tử vong cho bệnh nhân [38]. Ở trẻ em, đặc biệt là ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ sức đề

kháng yếu, trẻ không thể uống thuốc theo đường miệng, khi điều trị trẻ phải chịu

nhiều các thủ thuật xâm lấn như tiêm, truyền. Vì vậy việc xác định nhiễm trùng

huyết sớm sẽ làm giảm tỷ lệ tử vong cho các bệnh nhân. Hiện tại phương pháp chẩn

đoán nhiễm trùng huyết tại hầu hết các bệnh viện trong nước kể cả tại bệnh viện

Nhi trung ương chủ yếu dựa vào cấy máu truyền thống.

Khóa 2014 - 2016

1

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

Cấy máu là phương pháp phổ biến và được coi là tiêu chuẩn vàng “gold

standard” trong chẩn đoán và xác định các căn nguyên gây bệnh nhiễm trùng huyết.

Thông thường cấy máu được thực hiện trước khi bắt đầu điều trị kháng sinh. Tuy

nhiên phương pháp cấy máu thường có độ nhạy thấp đối với các bệnh nhân trước đó

đã sử dụng thuốc kháng sinh hoặc đối với những loại vi khuẩn phát triển chậm hoặc

có sự tạp nhiễm.

Việc điều trị kháng sinh sớm cho thấy hiệu quả lớn tới kết quả điều trị đầu ra của

bệnh nhân. Người ta tính rằng với mỗi 1 giờ chậm điều trị kháng sinh thì trung bình

giảm 8% khả năng sống sót của các bệnh nhân [23]. Khi mà các vi sinh vật sinh

trưởng chậm được nghi ngờ, quá trình điều trị được tiến hành trước khi có kết quả

cấy máu, vì vậy việc phát hiện nhanh các tác nhân gây nhiễm trùng huyết sẽ cho

phép điều trị kháng sinh đúng, nhanh dẫn tới làm giảm tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân

[23].

Hiện nay, bên cạnh phương pháp cấy máu truyền thống, một kỹ thuật mới đang

được các nước trên thế giới ứng dụng để sàng lọc các căn nguyên sớm bắt đầu được

triển khai rộng rãi – kỹ thuật realtime PCR đa mồi (Septifast) để chẩn đoán các tác

nhân gây nhiễm trùng huyết. Đây là xét nghiệm sinh học phân tử dựa trên việc phát

hiện ADN của vi sinh vật trong máu bệnh nhân. Kỹ thuật realtime PCR đa mồi có

độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn và thời gian cho kết quả ngắn hơn (chỉ trong 5h),

đồng thời có khả năng phát hiện cùng lúc 25 loại căn nguyên gây bệnh phổ biến

trong nhiễm trùng huyết bao gồm vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli, Klebsiella

(pneumonia/oxytoca), Serratia marcescens, Enterobacter (cloacae/aerogenes),

Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii,

Stenotrophomonas maltophilia; vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus, CoNS

(Coagulase negative Staphylococci(-S.epidermiils, S.haemolyticus), Streptococcus

pneumonia, Streptococcus spp. (S.pyogenes, S.agalactiae, S.mitis), Enterococcus

faecium, Enterococcus faecalis) và các chủng nấm: Candida albicans, Candida

tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida glabrata, Aspergillus

fumigates. Sử dụng kỹ thuật realtime PCR đa mồi được xem là phương pháp ưu việt

Khóa 2014 - 2016

2

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

vì có thể chẩn đoán các vi sinh vật gây bệnh mà phương pháp cấy máu cho kết quả

âm tính do bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh trước khi cấy máu.

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu khả năng ứng dụng kit realtime

PCR đa mồi Septifast trong chẩn đoán nhiễm trùng huyết ở trẻ em tại bệnh viện Nhi Trung Ƣơng” với mục tiêu như sau:

- Xác định tỷ lệ và các căn nguyên gây nhiễm trùng huyết ở trẻ em bằng

phƣơng pháp realtime PCR đa mồi (Septifast) tại bệnh viện Nhi Trung

ƣơng.

- Tìm hiểu tính ƣu việt của kỹ thuật Septifast so với phƣơng pháp cấy

máu truyền thống trong chẩn đoán căn nguyên nhiễm trùng huyết ở trẻ

em tại bệnh viện Nhi Trung Ƣơng.

Khóa 2014 - 2016

3

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về nhiễm trùng huyết

Thuật ngữ nhiễm trùng huyết được giới thiệu lần đầu tiên bởi Hippocrates vào

năm 660-370 BC. Năm 1865 Ignaz Semmelweis là nhà nghiên cứu đầu tiên có một

cái nhìn tổng thể về bệnh này. Đến năm 1895 nhà hóa học người Pháp Louis

Pasteur đã khám phá ra các vi khuẩn trong máu là nguyên nhân gây nên bệnh nhiễm

trùng huyết [6].

Năm 1914, định nghĩa hiện đại đầu tiên về nhiễm trùng huyết được phát biểu

bởi nhà vi trùng học người Đức Hugo Schottmuller (1867-1936): “Nhiễm trùng

huyết xuất hiện khi có một ổ nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra hình thành và phát

triển trong cơ thể, sau đó các nhân tố vi khuẩn này xâm nhập vào máu và gây nên

các triệu chứng của bệnh” [51]. Từ đó về sau, định nghĩa nhiễm trùng huyết đã trải

qua một quá trình phát triển và hoàn thiện đáng kể. Các tiêu chí chẩn đoán nhiễm

trùng huyết được sử dụng nhiều nhất được phát triển bởi Bone và cộng sự [16]

Năm 1991, hiệp hội ACCP (American College of Chest Physicians) và hiệp hội

SCCM (Society of Critical Care Medicine) đã triệu tập một “Hội nghị đồng thuận”

với mục đích cung cấp, công bố các định nghĩa về nhiễm trùng huyết và các hội

chứng liên quan. Định nghĩa này được trình bày sơ lược như sau [16]

Hình 1.1 Mối quan hệ giữa SIRS, Nhiễm trùng huyết và nguồn gốc của nhiễm trùng

huyết vật chủ (Bone et al.1992)

Khóa 2014 - 2016

4

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

Nhiễm trùng(Infection): Phản ứng viêm của tổ chức với sự hiện diện của vi sinh

vật hoặc sự xâm nhập của vi sinh vật vào các tổ chức bình thường vốn vô trùng.

Vãng khuẩn huyết(Bacteremia): Có sự hiện diện của các vi khuẩn sống trong máu.

Hội chứng đáp ứng viêm hệ thống(Systemic Inflammatory Response Syndrome –

SIRS): Đáp ứng viêm hệ thống của cơ thể với các tác nhân lâm sàng nặng nề khác

nhau, đặc trưng bởi sự hiện diện của ít nhất 2 trong các tiêu chuẩn sau:

- Nhiệt độ cơ thể >380C hoặc < 360C

- Tần số tim > 90 lần/phút

- Tần số thở > 20 lần/phút hoặc PaCO2 < 32 mmHg - Số lượng bạch cầu máu ngoại biên > 12000 BC/mm3 hoặc < 4000 BC/mm3

Nhiễm trùng huyết(Sepsis): Hội chứng đáp ứng viêm toàn thân được gây nên do

nguyên nhân vi khuẩn, siêu vi hoặc nấm.

Nhiễm trùng huyết nặng(Severe sepsis): Nhiễm trùng huyết kèm với rối loạn chức

năng cơ quan, giảm tưới máu. Giảm tưới máu và bất thường tưới máu có thể bao

gồm hạ huyết áp, rối loạn phân bố máu, hoặc thay đổi đột ngột tình trạng ý thức

nhưng không chỉ giới hạn ở các biểu hiện này.

Sốc nhiễm trùng huyết (Septic shocks): Gây ra do nhiễm trùng huyết biểu hiện

bằng hạ huyết áp, không đáp ứng với liệu trình bù dịch, đi kèm với những rối loạn

về phân bố lưu lượng máu hoặc biến đổi tình trạng thần kinh cấp tính.

1.2. Dịch tễ học bệnh nhiễm trùng huyết

1.2.1 Trên thế giới

Nhiễm trùng huyết là một trong những căn nguyên chủ yếu gây bệnh nặng và tử

vong cho người bệnh. Một khảo sát tiến cứu dựa theo mức độ của SIRS và nhiễm

trùng huyết đã cho thấy rằng tỉ lệ tử vong tăng lên khi bệnh nhân có nhiều tiêu

chuẩn của SIRS hoặc có nhiều biểu hiện của nhiễm trùng huyết. Tỉ lệ tử vong cao

Khóa 2014 - 2016

5

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

3% ở những bệnh nhân không có tiêu chuẩn chẩn đoán SIRS, 7% khi có hai tiêu

chuẩn SIRS, 10% khi có 3 tiêu chuẩn SIRS, 17% khi có 4 tiêu chuẩn SIRS, 16% khi

có biểu hiện nhiễm trùng huyết, 20% trong nhiễm trùng huyết nặng và 46% trong

sốc nhiễm trùng huyết [52].

Theo thống kê cho thấy, chi phí phát sinh do nhiễm trùng huyết bệnh viện là 34508

đến 56000 USD ở Hoa Kỳ. Một nghiên cứu dịch tễ học khác cho thấy ở Bắc Mỹ tỉ

lệ nhiễm trùng huyết là khoảng 3 trường hợp trên 1000 dân. Tỉ lệ tử vong chung vào

khoảng 30%, tăng đến 40% ở người già và lên đến 50% hoặc cao hơn ở bệnh nhân

có hội chứng nhiễm trùng huyết nặng, mặc dù vậy những con số này chỉ mới phản

ánh những bệnh nhân được nhập viện vào các đơn vị chăm sóc tích cực và có đầy

đủ các phương tiện hồi sức [53]. Tại Pháp, tỷ lệ nhiễm trùng huyết chiếm 13,7%,

còn ở Ấn Độ các nhà nghiên cứu đã thống kê được tỷ lệ nhiễm trùng huyết nặng là

16,5%, tỷ lệ tử vong sau nhập viện và tử vong sau 28 ngày do nhiễm trùng huyết

nặng tương ứng là 65,2% và 64,6% [44]. Tại Anh, theo nghiên cứu của tác giả

Harrison và cộng sự năm 2006 trên 92673 bệnh nhân nhập viện cho thấy tình trạng

nhiễm trùng huyết nặng xuất hiện trong vòng 24 giờ đầu tăng từ 23,5% (1996) lên

đến 28,7% (2004) và số ca tử vong tăng từ 9000 ca (48,3%) năm 1996 lên đến

14000 ca (44,7%) năm 2004 [24]. Theo nghiên cứu của Jason và cộng sự năm 2011

tại 150 khoa hồi sức tích cực của 16 quốc gia trong khu vực châu Á, tỷ lệ nhiễm

trùng huyết dao động từ 5% đến 53% tùy theo từng quốc gia [25]. Ngoài ra, ở thị

trấn Ile-Ife (Nigeria), nghiên cứu của 2 tác giả Komolate và Adegoke năm 2008, tỷ

lệ nhiễm trùng huyết là 15 đến 20% [26].

Mặc dù có sự khác biệt về con số cụ thể của nhiễm trùng huyết theo các nghiên cứu

khác nhau, nhưng tất cả đều có một đặc điểm chung là tỉ lệ mắc ngày càng tăng rõ

rệt. Tỉ lệ mắc mới (incidence) tăng khoảng 1,06 lần trên 1000 bệnh nhân/ngày đến

16 đến 260 lần trên 1000 bệnh nhân/ngày. Có nhiều yếu tố khác nhau chịu trách

nhiệm cho việc tăng cao tỉ lệ mới mắc này. Yếu tố quan trọng nhất có lẽ là sự tăng

cao tỉ lệ hiện mắc (prevalence) các bệnh lý liên quan đến tình trạng suy giảm miễn

Khóa 2014 - 2016

6

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

dịch, các thuốc ức chế miễn dịch hay độc tế bào, suy dinh dưỡng, nghiện rượu, bệnh

lý ác tính, suy thận, đái tháo đường, và tăng số lượng các trường hợp bệnh

nhân ghép tạng. Các yếu tố khác có thể là việc sử dụng các dụng cụ y khoa dài ngày

vào cơ thể (catheter tĩnh mạch, các dụng cụ chỉnh hình…), và đặc biệt các vi sinh

vật đề kháng xuất hiện ngày càng gia tăng.

1.2.2. Tình hình nhiễm trùng huyết tại Việt Nam

Tại Việt Nam, theo báo cáo của tác giả Nguyễn Văn Kính và cộng sự năm 2008, khi

phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh tại Việt Nam cho thấy tỷ lệ nhiễm trùng

huyết nói chung là 8% [5]. Mới đây, nghiên cứu của Vũ Đình Phú và cộng sự năm

2013, ở các khoa hồi sức tích cực của 15 bệnh viện toàn quốc, nhiễm trùng huyết

chiếm tỷ lệ 10,4% [8].

Một nghiên cứu khác tại bệnh viện Bạch Mai năm 2008 của tác giả Đoàn Mai

Phương và cộng sự đã phân lập các tác nhân gây nhiễm trùng huyết cho thấy tỷ lệ

dương tính là 8,1%, trong đó vi khuẩn Gram âm chiếm 71,9%, vi khuẩn Gram

dương chiếm 23,4% và nấm chiếm 4,7% [9]. Tại bệnh viện Trung ương Huế, tỷ lệ

nhiễm trùng huyết do E.coli chiếm 35,1%, K.pneumonie chiếm 14,9% [1]. Năm

2010, tác giả Phạm Thị Ngọc Thảo và cộng sự đã tổng hợp các tác nhân gây nhiễm

trùng huyết thường gặp nhất bệnh viện Chợ Rẫy là Acinerobacter baumanii và

Pseudomonas aeruginosa, chiếm 40,5% các trường hợp mắc bệnh [10]. Cũng theo

một nghiên cứu cắt ngang tại đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh phân tích 130 trẻ

sơ sinh dưới 1 tháng tuổi điều trị tại Bệnh viện Nhi Đồng 1 với chẩn đoán nhiễm trùng

huyết sơ sinh dựa trên kết quả cấy máu dương tính cho thấytác nhân gây bệnh nhiễm

thường gặp nhất là Klebsiella sp. (36,9%), tiếp đến là Staphylococcus sp.(26,9%) và

Acinetobacter sp. (10,8%) [3]. Một nghiên cứu khác tại Bệnh Viện Nhi Trung ương

tiến hành trên 303 bệnh nhi được chẩn đoán nhiễm trùng huyết cho thấy các tác nhân

chiếm tỷ lệ cao nhất làKlebsiellasp. (25,7%), Pseudomonas(14,3%) và Staphylococcus

(14,3%) tiếp theo là E.coli (11,4%Acinetobacter (8,6%) [7].

Khóa 2014 - 2016

7

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

1.3. Nguyên nhân gây nhiễm trùng huyết ở trẻ em

Nhiễm trùng huyết có thể tiến triển như một biến chứng của nhiễm trùng tại chỗ

hoặc có thể sau cư trú và xâm nhập niêm mạc bởi các vi khuẩn gây độc. Các trường

hợp có nguy cơ nhiễm trùng toàn thân là trẻ có thương tích nghiêm trọng, trẻ đang

dùng liệu pháp kháng sinh dài ngày, trẻ suy dinh dưỡng. Ngoài ra, trẻ suy giảm

miễn dịch (dùng thuốc ức chế miễn dịch hoặc corticosteroid, trẻ suy giảm miễn dịch

bẩm sinh hay mắc phải) cũng làm tăng nguy cơ nhiễm trùng, bao gồm nhiễm khuẩn

toàn thân và sốc nhiễm khuẩn.

Tác nhân nhiễm trùng liên quan đến nhiễm khuẩn toàn thân thay đổi theo tuổi và

tình trạng miễn dịch của trẻ.

Những trường hợp nhiễm trùng huyết trước khi sinh thường là do trong thời gian

mang thai, mẹ bầu mắc các tác nhân vi sinh vật như rubella, toxoplasmosis,

cytomegalovirus, herpes simplex virus, nhiễm trùng đường tiết niệu… Những tác

nhân gây bệnh này sẽ thông qua nhau thai và gây ảnh hưởng đến hệ tuần hoàn máu

của trẻ.

Nhiễm trùng khi sinh: thời gian sinh nở kéo dài, màng thai vỡ sớm… vi khuẩn xâm

nhập vào khoang màng ối qua đường sản đạo, thai nhi có thể hít phải hoặc nuốt

nước ối bẩn vào trong bụng gây viêm phổi, viêm dạ dày và phát triển thành nhiễm

trùng máu, cũng có thể do khử trùng không tốt, khiến vi khuẩn trực tiếp xâm nhập

vào máu từ những chỗ bị thương trên niêm mạc da. Trẻ thường mắc bệnh khi người

mẹ mang thai nhiễm trùng trước khi sinh và lúc sắp sinh, sinh nở bất thường, viêm

rốn, tổn thương niêm mạc da và từng bị nhiễm trùng.

Nhiễm trùng sau khi sinh: vi khuẩn có thể xâm nhập vào tuần hoàn máu qua các con

đường như niêm mạc da, đường hô hấp, đường tiêu hóa, đường tiết niệu, rốn cũng

là nơi vi khuẩn dễ xâm nhập nhất.

Khóa 2014 - 2016

8

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

Ở trẻ sơ sinh thường do Streptococcus nhóm B, E.coli, Klebsiella, Enterococcus,

Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae,

Anaerobe clostridium, Staphylococcus aureus.

Ở trẻ ngoài sơ sinh, hay gặp do Staphylococcus aureus, Streptococcus nhóm A và B,

Streptococcus pneumoniae, Meningococcus, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, Klebsiella, Hemophilus influenzae. Ngoài ra có thể do Candida

albicans.

Đối với trẻ suy giảm miễn dịch cũng có tác nhân gây bệnh giống như trẻ bình

thường, tuy nhiên tùy tình trạng chúng có thể nhiễm trùng huyết do các vi khuẩn

thêm vào. Bệnh nhi giảm bạch cầu có nguy cơ nhiễm trùng do vi khuẩn Gram âm

(Pseudomonas aeruginosa)và cytomegalovirus. Bệnh nhi suy giảm miễn dịch mắc

phải (AIDS) có nguy cơ cao của nhiễm trùng huyết do Streptococcus pneumoniae,

P.aeruginosa, S.aureus và Hemophilusinfluenza type B.

Bên cạnh đó, nhiễm trùng bệnh viện cũng là một nguy cơ cao với bệnh nhi suy giảm

miễn dịch. Catheter động mạch và tĩnh mạch, catheter tiết niệu, và ống nội khí quản

là những đường vào gây nhiễm trùng bệnh viện. Nhiễm trùng vi khuẩn Gram âm

(Pseudomonas, Acinetobacter, Klebsiella, Serratia, Enterobacter, E.coli..) và nấm

(Candida, Aspegillus) thường gặp ở bệnh nhi suy giảm miễn dịch và nằm viện dài

ngày. Nhiễm khuẩn toàn thân đa chủng xảy ra ở những trường hợp trẻ có nguy cơ

cao và có liên quan đến catheter, bệnh tiêu hóa, giảm bạch cầu và bệnh ác tính.

1.4. Cơ chế gây bệnh nhiễm trùng huyết

Nhiễm trùng huyết là một quá trình phức tạp. Quá trình này được bắt đầu bởi sự

hiện diện của vi khuẩn trong máu, đáp ứng đầu tiên của cơ thể là huy động những tế

bào viêm, đặc biệt là bạch cầu đa nhân trung tính và đại thực bào đến vị trí nhiễm

khuẩn. Những tế bào viêm này phóng thích những chất gây viêm vào tuần hoàn,

quan trọng nhất là các cytokines, kích hoạt những hóa chất trung gian khác gây nên

đáp ứng toàn thân. Sự tổng hợp hóa chất trung gian ngày càng nhiều và nếu không

Khóa 2014 - 2016

9

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

được kiểm soát, nhiễm trùng huyết sẽ xảy ra. Độc tố được phóng thích kéo dài, đáp

ứng viêm cũng sẽ kéo dài cùng với sự hoạt hóa chất trung gian gây tổn thương mô,

sốc, suy đa cơ quan hoặc nguy hiểm hơn dẫn đến tử vong..

Nhiễm trùng huyết là quá trình diễn ra trong nội mạch. Khi mô bị tổn thương hay bị

viêm, các cytokines tiền viêm hay kháng viêm sẽ được phóng thích. Hậu quả quan

trọng của phản ứng viêm là tổn thương nội mạch, rối loạn chức năng vi tuần hoàn,

giảm tình trạng cung cấp oxy cho mô và tổn thương cơ quan. Hậu quả của quá trình

kháng viêm là tình trạng giảm năng lượng và ức chế miễn dịch. Song song với đó,

quá trình tiền viêm và kháng viêm cũng tương tác với nhau tạo nên rối loạn miễn

dịch.

Những cytokines kích thích phản ứng viêm gọi là cytokines tiền viêm. Bao gồm:

Interleukin-1 và TNF-α, interleukin-12 và IFN-gamma, đây là những cytokines có

vai trò quan trọng trong nhiễm trùng huyết và sốc nhiễm khuẩn. Ức chế các

cytokines này cũng là ức chế được nhiễm trùng huyết.

Các cytokines kháng viêm: là các phân tử điều hòa hoạt động của cytokines tiền

viêm, chúng hoạt động thông qua các thụ thể, bao gồm: IL-4, IL-6, IL-10, IL-11,

IL-13.

Các cytokines quan trọng nhất trong nhiễm trùng huyết bao gồm: TNF-α, IL-1, IL-

6, IL-8 và IL-10.

1.5. Các tác nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết

Nguyên nhân gây nhiễm trùng huyết do vi khuẩn xâm nhập trực tiếp vào máu hoặc

từ các ổ nhiễm khuẩn ở các mô tế bào, những cơ quan như: da, mô mềm, cơ, xương,

khớp, hô hấp, tiêu hóa... Các loại vi khuẩn thường gây nhiễm trùng huyết gồm vi

khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương. Vi khuẩn Gram âm chủ yếu là vi khuẩn

đường ruột họ Enterobacteriacae như:Escherichia coli, Klebsiella, Serratia và các

vi khuẩn Enterobacter...; ngoài ra còn có Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia

Khóa 2014 - 2016

10

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

pseudomallei. Vi khuẩn Gram dương thường gặp là Streptococcus pneumoniae,

Staphylococcus aureus, Streptococcus suis... Ngoài ra một trong những tác nhân

không thể thiếu là Nấm : Aspergillus fumigatus, Candidaalbicans, Candida

tropicalis, Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida krusei.

1.5.1. Vi khuẩn Gram âm gây nhiễm trùng huyết

Vi khuẩn Gram âm là một nhóm các loại vi khuẩn không giữ được tinh thể tím khi

cho phản ứng với hoá chất thử nghiệm theo tiêu chuẩn nhuộm Gram.

 Có màng ngoài

 Có lớp peptidoglican mỏng,ít lớp

 Không có axit teicoit

 Có khoang chu chất

 Ít mẫn cảm với lizôxôm

 Không bắt màu với thuốc nhuộm gram

 Có lớp Lipopolysaccarit

Con đường lây nhiễm: do ổ nhiễm trùng nội tạng như đường mật, tiết niệu, ổ bụng,

đường ruột, tử cung, nhiễm trùng bệnh viện: sau mở khí quản, đặt nội khí quản, thở

máy, catheter tĩnh mạch.

 Klebsiella pneumonia

- Giới thiệu: Klebsiealla pneumoniae thường gây bệnh nhiễm đường hô hấp, một

loại vi khuẩn phát triển rất tốt trong đường hô hấp của người, tác nhân tạo nên

“bệnh cơ hội”. Hầu hết các cơ quan đều có thể bị nhiễm trùng do Klebsiella. Nó có

khả năng gây nhiễm trùng huyết, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xoang, nhiễm

khuẩn đường tiết niệu, áp xe gan...

- Đặc điểm sinh học:

Khóa 2014 - 2016

11

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

+ Hình thái: Trực khuẩn ngắn, gram âm, bắt màu đậm ở hai cực,vi khuẩn có nhiều

hình thể, có khi như cầu khuẩn, có khi lại hình dài, có vỏ, không di động, không

sinh nha bào.

+ Tính chất nuôi cấy: Dễ mọc trên môi trường nuôi cấy thông thường như thạch

dinh dưỡng hay thạch máu, khuẩn lạc lầy nhầy, màu xám. Trong canh thang, vi

khuẩn mọc nhanh, đục đều hoặc lắng cặn ở đáy ống nghiệm.

+ Cấu trúc kháng nguyên: kháng nguyên O - 5 type; kháng nguyên vỏ K - bản chất

là polysaccharide, mang tính chất đặc hiệu, có 72 type, trong đó type 1 và 2 phổ

biến nhất.

 Serratia marcescens

- Giới thiệu: Trực khuẩn hình que Gram âm, kỵ khí tùy nghi, thuộc họ

Enterobacteriaceae. Loài vi khuẩn này thường được tìm thấy trong đất, nước, thực

vật và động vật. Phương thức lây truyền của vi khuẩn này bằng cách trực tiếp hoặc

bằng ống thông. Serratia marcescens có thể gây nên bệnh viêm phổi, nhiễm trùng

huyết, viêm màng não và áp xe não, nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng mắt.

Chúng xâm nhập vào thức ăn từ môi trường không khí, nước.

- Đặc điểm sinh học:

+ Hình thái: trực khuẩn Gram âm, di động, khuẩn lạc có sắc tố đỏ gạch,kỵ khí tùy

tiện, sinh bào tử.

+ Tính chất nuôi cấy: phát triển ở nhiệt độ 5-40ºC,tối ưu ở 37ºC, pH:5-9.

+Yếu tố độc lực gồm các loại enzyme sau: enzyme Catalase, enzyme Gelatinease,

enzyme DNase, enzyme Esculiase.

 Pseudomonas aeruginosa

- Giới thiệu: Pseudomonas aeruginosa (hay còn gọi là Trực khuẩn mủ xanh) là vi

khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và con người. Nó được tìm thấy trong đất,

Khóa 2014 - 2016

12

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

nước, hệ vi sinh vật trên da và các môi trường nhân tạo trên khắp thế giới. Vi khuẩn

không chỉ phát triển trong môi trường không khí bình thường, mà còn có thể sống

trong môi trường có ít khí ôxy, và do đó có thể cư trú trong nhiều môi trường tự

nhiên và nhân tạo. Vi khuẩn này dinh dưỡng bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ.

Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông thường là gây ra viêm nhiễm và nhiễm

trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ thể

như phổi, đường tiết niệuvà thận, sẽ gây ra những hậu quả chết người; vì vi khuẩn

này phát triển tốt trên các bề mặt bên trong cơ thể. Vi khuẩn cũng được phát hiện

trên các dụng cụ y khoa bao gồm catheter, gây ra nhiễm trùng bệnh viện.

- Đặc điểm sinh học:

+ Hình thái: Trực khuẩn Gram âm, nhỏ, đứng riêng lẻ, thành đôi, có khi xếp thành

chuỗi, di động nhờ một lông duy nhất ở một cực, có pili, không có bào tử.

+ Tính chất nuôi cấy: Ưa khí tuyệt đối, phát triển dễ trên các môi trường thông thường, nhiệt độ 30 – 37oC, có thể mọc ở 42oC, pH: 7,0 - 7,2.

-Cấu trúc kháng nguyên:

+ Kháng nguyên H không nhiệt, là các protein đặc hiệu nằm trong lông của vi

khuẩn.

+ Kháng nguyên O là kháng nguyên chịu nhiệt, bản chất là lipopolysaccharide

(LPS) - protein. LPS là nội độc tố của vi khuẩn. LPS của P. aeruginosa gồm 3

phần: phần lõi (core), chuỗi bên đặc hiệu O (mang tính kháng nguyên đặc hiệu type)

và lipit A chịu trách nhiệm độc tính. Kháng nguyên O được nghiên cứu nhiều và

được sử dụng kích thích miễn dịch bảo vệ chống P. aeruginosa.

+ Protein màng ngoài: các protein ở màng ngoài tế bào có thể kết hợp với LPS tạo

thành những thụ thể đặc hiệu của trực khuẩn mủ xanh.

+ Polysaccharide ngoại tiết: có 2 loại polysaccarit được tạo ra bởi những chủng P.

aeruginosa có khuẩn lạc dạng M và dạng R.

Khóa 2014 - 2016

13

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

+ Các kháng nguyên ngoại bào: vi khuẩn tiết ra rất nhiều chất chuyển hoá trong môi

trường (protease, elastase, exotoxin A, glycocalx, hemolysine, ...) là những yếu tố

độc lực của vi khuẩn đồng thời còn là những kháng nguyên được nghiên cứu để sử

dụng chế tạo vaccine gây miễn dịch.

+ Yếu tố độc lực: P. aeruginosa là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội. Độc tố của P.

aeruginosa chỉ có tác động gây tử vong khi chúng được tạo ra với số lượng lớn. Tuy

nhiên, loài vi khuẩn này có nhiều yếu tố độc lực tạo điều kiện thuận lợi cho vi

khuẩn xâm nhập, lan truyền và gây bệnh.

- Nội độc tố (endotoxin): là thành phần của vách tế bào vi khuẩn. Nội độc tố bao

gồm chủ yếu là lipopolysaccarit và một lượng nhỏ protein. Hoạt tính sinh học của

nội độc tố chủ yếu do phức hợp lipopolysaccarit đảm nhiệm. Lipopolysaccarit có

vai trò quan trọng trong bệnh sinh nhiễm trùng huyết và sốc nhiễm trùng huyết.

- Ngoại độc tố (exotoxin A): bản chất là protein có trọng lượng phân tử 66,6 kDa.

Exotoxin A hoạt động tượng tự như cơ chế hoạt động của độc tố vi khuẩn bạch hầu.

Với khả năng khuếch tán và ức chế sự tổng hợp protein của tế bào, exotoxin A là

một độc tố mạnh nhất của P. aeruginosa. Exotoxin A gây rối loạn chức năng huyết

động trung tâm, thay đổi chức năng đông máu, rối loạn chuyển hoá lipit, gây tổn

thương nhiều cơ quan, nhưng biểu hiện rõ rệt nhất là tổn thương gan. 90% số

chủng P. aeruginosa sản xuất exotoxin A nhưng đặc tính của độc tố này rất khác

nhau tuỳ từng chủng.

- Các enzyme ngoại tiết: vi khuẩn có khả năng sinh nhiều enzyme ngoại tiết, các

enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập, gây bệnh tại chỗ:

+ Protease: gần 90% các chủng P. aeruginosa có khả năng phân giải protein. P.

aeruginosa tiết ra 2 loại protease quan trọng là alcaline và elastase. Nhiều chủng tiết

ra collagenase. Các protease này thường có tác dụng hiệp đồng. Elastase có thể phá

hủy lớp chun keo thành mạch máu gây tổn thương xuất huyết, tạo nên những ổ hoại

tử trong thành mạch máu. Enzyme này còn gây ức chế hiện tượng opsonin hoá, làm

Khóa 2014 - 2016

14

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

giảm khả năng thực bào của bạch cầu đa nhân trung tính. Ngoài tác động trực tiếp,

các protease còn có khả năng làm thay đổi sức đề kháng của vật chủ thông qua việc

bất hoạt bổ thể, phá hủy cấu trúc của các globulin miễn dịch.

+ Hemolysine có 2 loại: Hemolysine chịu nhiệt: không có tính enzyme, không có

tính kháng nguyên và ít độc. Glycolipide đóng vai trò như một chất tẩy hoà tan các

lipid là những chất cần cho hoạt động của phospholipase C.Phospholipase C

(hemolysine không chịu nhiệt): là một enzyme tan máu nằm trong một polypeptid

đơn. Phospholipase C thường tác động hiệp đồng với glycolipide và protease

alcaline gây xuất huyết, hoại tử tại chỗ tổn thương.

+ Cytotoxine (leucocidin): là một protein rất độc với bạch cầu đa nhân trung tính và

các tế bào lympho.

+ Exoenzyme S: là một protein, có thể có 2 dạng: dạng không hoạt động và không

có tính enzyme và dạng hoạt động, có tính enzyme.

+ Enterotoxin và yếu tố thấm qua thành mạch: các độc tố này còn ít được biết đến.

Một số nghiên cứu đã chứng minh, trong thực nghiệm enterotoxin gây nên tình

trạng ứ dịch trong đường ruột; độc tố này có thể là một trong những nguyên nhân

gây viêm ruột non. Khi gây nhiễm qua da, yếu tố này có thể thấm vào trong lòng

mạch, gây ban đỏ kèm theo xuất huyết ra ngoài lòng mạch.

+ Glycocalyx - capsule: ngoài chức năng bảo vệ vi khuẩn chống các yếu tố có hại

cho chúng từ vật chủ như thực bào, kháng thể, bổ thể, kháng sinh, giúp cho quá

trình nhân lên của vi khuẩn trong các mô còn thực hiện chức năng bám vào tế bào.

+ Lông (flagella): vai trò của flagella trong sinh bệnh học nhiễm P. aeruginosa còn

chưa rõ ràng.

+ Pili: giúp cho vi khuẩn bám vào tế bào biểu mô của vật chủ.

+ Khả năng gây bệnh

Khóa 2014 - 2016

15

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

P. aeruginosa thường tồn tại nhiều và dai dẳng trong môi trường bệnh viện. Chúng

có mặt ở nền nhà, giường, chăn, đệm, lavabo, tay nhân viên y tế, dụng cụ y tế…Từ

đó, vi khuẩn dễ lây lan, xâm nhập vào bệnh nhân và gây bệnh. P. aeruginosa là vi

khuẩn gây bệnh cơ hội nên trong những điều kiện nhất định chúng có thể xâm nhập

vào cơ thể và gây bệnh. Nhiễm khuẩn do P. aeruginosa thường gặp nhiều ở các

khoa Hồi sức cấp cứu, khoa bỏng, khoa Tiết niệu, khoa chăm sóc bệnh nhân sau

phẫu thuật. P. aeruginosa thường gây nhiễm khuẩn có mủ ở vết thương, vết mổ,

vết bỏng. Từ vết thương, vi khuẩn có thể vào máu gây nhiễm trùng huyết.

 Stenotrophomonas maltophilia

- Giới thiệu : Vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, là loài vi khuẩn gây nhiễm trùng huyết

khó điều trị.

- Đặc điểm sinh học

+ Hình thái: hơi nhỏ (0,7-1,8 x 0,4-0,7 mm) so với các thành viên khác của chi, di

động, di chuyển bằng cực roi.

+ Tính chất nuôi cấy: sống phổ biến trong môi trường dung dịch nước, đất và cây

trồng.

S.maltophilia thường xuyên có mặt trong điều kiện môi trường có bề mặt ẩm như

ống sử dụng trong hệ thống thông gió, ống thông niệu cũng như các thiết bị y tế như

ống nội soi. Ở người có hệ miễn dịch suy yếu, S.maltophilia cũng là một trong

những nguyên nhân gây viêm phổi, nhiễm trùng đường tiết niệu hay nhiễm trùng

huyết.

 Escherichia coli

- Giới thiệu: Vi khuẩn ký sinh, có ở ruột là tác nhân gây bệnh khi chúng xâm nhập

qua đường máu, cơ quan niệu.

Khóa 2014 - 2016

16

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

- Là trực khuẩn đường ruột gây bệnh Colenterit ở trẻ em và bệnh lỵ Disenterie ở

người lớn. Có khả năng sinh chất kháng sinh như Colicin làm chết các vi khuẩn gây

bệnh khác. Khi dùng chất kháng sinh để diệt trực khuẩn đường ruột thì sẽ kích thích

vi khuẩn thối rữa và những vi khuẩn gây bệnh khác.

- Nhóm trực khuẩn đường ruột đặt biệt rất nguy hiểm ở chỗ chúng rất dễ thích nghi

với cơ thể người. Chúng bền vững cả với dịch vị của người. Trong điều kiện tự

nhiên như nước, đất, kể cả thực phẩm, ở da, chúng có thể tồn tại hàng tuần thậm chí

hàng tháng. Tuy nhiên khi đun sôi hay sử dụngcác dung dịch chất kháng sinh 3-5%

(như dung dịch Chioramin, phenol, formalin) trong vòng 10-15 phút có thể tiêu diệt

được chúng.

- Đặc điểm sinh học:

+ Hình thái : Là trực khuẩn Gram âm, di động do có lông quanh thân, một số chủng

có vỏ polysaccarit, không sinh nha bào

+ Tính chất nuôi cấy: Vi khuẩn hiếu khí hay kị khí không bắt buộc, phát triển dễ

dàng trên môi trường nuôi cấy thông thường, một số phát triển trong môi trường đơn giản, nhiệt độ 37oC, pH: 7-7.2

+ Kháng nguyên: kháng nguyên thân O gồm 150 yếu tố khác nhau về mặt huyết

thanh; kháng nguyên vỏ K chia thành nhiều loại bao gồm L, A, B tuỳ theo sức đề

kháng đối với nhiệt (khoảng 100 kháng nguyên K khác nhau); kháng nguyên lông H

gồm 50 yếu tố H .

 Proteus mirabilis

-Đặc điểm sinh học:

+ Hình thái: trực khuẩn Gram âm, di động rất tốt, hình thể có nhiều dạng thay đổi

khác nhau trên từng môi trường, từ dạng trực khuẩn đến dạng sợi dài.

Khóa 2014 - 2016

17

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

+ Tính chất nuôi cấy: khuẩn lạc mọc trên môi trường nuôi cấy thông thường. Trên

môi trường thạch dinh dưỡng, khuẩn lạc có một trung tâm lan dần ra, từng đợt, từng

đợt, mỗi đợt là một gợn sóng, có một điểm đen làm trung tâm, xung quanh màu

trắng nhạt.

+ Kháng nguyên: Cấu trúc kháng nguyên của Proteus phức tạp và không được ứng

dụng nhiều trong thực tế.Người ta thấy có một mối tương quan đặc biệt giữa kháng

nguyên O của một số chủng Proteus (được gọi là OX2 ; OX19; OXK) và Rickettsia.

Vì vậy, người ta dùng các chủng này để làm kháng nguyên trong chẩn đoán huyết

thanh bệnh do Rickettsia (phản ứng Weil - Felix).

+ Khả năng gây bệnh: là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội như nhiễm trùng huyết,

nhiễm khuẩn đường tiết niệu...

 Acinetobactor baumannii

Acinetobactor baumannii (A. baumannii) là các vi khuẩn được tìm thấy phổ biến

trong đất, nước và môi trường. Chúng dễ dàng được phân lập từ da, họng và nhiều

dịch tiết của người khoẻ mạnh và cũng là tác nhân gây nhiễm trùng ở người.

A. baumannii đóng vai trò quan trọng trong nhiều nhiễm trùng cơ hội và nhiễm

trùng bệnh viện. Các yếu tố nguy cơ thuận lợi cho nhiễm trùng huyết và nguồn lây

phổ biến là vi khuẩn từ bệnh nhân bị viêm phổi, sang chấn, phẫu thuật, đặt

catheter, đường truyền tĩnh mạch, lọc máu và bỏng. Sự suy giảm miễn dịch hoặc

suy giảm chức năng hô hấp lúc vào viện làm tăng nguy cơ nhiễm trùng huyết lên 3

lần. Trường hợp bệnh nhân nằm việnlâungày,cho ăn uống qua ống thông và sử

dụng kháng sinh cephalosporins thế hệ ba trước đó đều là những yếu tố nguy cơ

của việc vi khuẩn cư trú và nhiễm trùng do A. baumannii, do vậy làm tăng nguy cơ

nhiễm trùng huyết do Acinetobacter. Tỷ lệ nhiễm khuẩn huyết do A. baumannii

đứng thứ hai sau viêm phổi và tiên lượng phụ thuộc nhiều vào bệnh nền của bệnh

nhân.

Khóa 2014 - 2016

18

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

1.5.2. Vi khuẩn Gram dương gây nhiễm trùng huyết

Đặc điểm sinh học:

 Không có màng ngoài

 Có lớp peptidoglican dày,nhiều lớp

 Có axit teicoit

 Không có khoang chu chất

 Mẫn cảm vời lizoxom

 Bắt màu với thuốc nhuộm gram

 Không có lớp LPS

 Staphylococcus aureus

- Giới thiệu: Staphylococcus (tụ cầu vàng) có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp “staphy”

là chùm nho hay là các cầu khuẩn kị khí tùy ý, là vi khuẩn Gram dương kỵ khí tùy

nghi, và là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong các loài tụ

cầu. Nó là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy ở cả mũi

và da. Sắc tố carotenoid staphyloxanthin làm nên tính chất màu vàng của S.aureus,

có thể thấy được từ các khúm cấy trên thạch của vi khuẩn này. Sắc tố đóng vai trò là

một tác nhân độc hại có tính chất chống oxy hóa giúp cho vi sinh vật không bị chết

bởi các chủng oxy gây phản ứng được sử dụng bởi hệ thống miễn dịch. Các tụ cầu

thiếu sắc tố sẽ dễ dàng bị tiêu diệt bởi hệ thống miễn dịch của cơ thể ký chủ.

Loài phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có nhiều trong thực phẩm như : thịt, trứng,

sữa.. và trên da, lông, tóc của người và động vật.

S.aureus được xếp vào nhóm vi khuẩn cơ hội vì nó có mặt rộng rãi và thường xuyên

trong mô và luôn chờ đợi điều kiện thuận lợi để xâm nhập.

- Đặc điểm sinh học:

Khóa 2014 - 2016

19

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

+ Hình thái: Hình cầu, đường kính 0,7 - 1 µm, không sinh nha bào, lông, một số

chủng có giáp mô, trong bệnh phẩm vi khuẩn thường xếp thành từng đôi, từng đám

nhỏ, hay gặp vi khuẩn xếp thành từng đám giống 1 chùm nho.

+Tính chất nuôi cấy: Vi khuẩn phát triển trên môi trường thông thường, không thể

sinh trưởng ở nhiệt độ thấp. Nhiệt độ sinh trưởng tốt của S.aureus là 18-40ºC, pH:

7,2. Tuy nhiên, chủng mọc tốt nhất ở 25ºC, kị khí tùy ý. Ở môi trường thạch, khuẩn

lạc có hình tròn lồi, bóng láng, óng ánh, có thể có màu vàng đậm, vàng cam hay

màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ. Ngoài ra, S.aureus có thể sinh trưởng trên môi

trường có hoạt độ thấp hơn các loại vi khuẩn khác hoặc môi trường có nồng độ

muối cao.

- Khi phát hiện trong môi trường sống, tiết sắc tố vàng sau 1-2 ngày ở nhiệt độ

phòng đều tổng hợp enterotoxin ở 15ºC và nhiều nhất khi tăng trưởng ở 35-37ºC

- Những chủng khác nhau làm tan máu ở các mức độ khác nhau. Ở thạch máu, type

tan máu β được quan sát quanh khuẩn lạc. S. aureus được xác định trên cơ sở các

đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết tương từ các dòng thuần từ các khuẩn

lạc đặc trưng trên môi trường phân lập. Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus

trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình

chế biến nên thường có mặt trong nhóm thực phẩm đã qua chế biến và nấu chín.

- Tính chất sinh hóa:

+ Phát triển tốt ở môi trường tổng hợp, đặc biệt trên môi trường thạch máu hoặc

huyết thanh. Sinh ra Beta Hemolysis trong môi trường thạch máu

+ Phản ứng indol, NH3, thủy phân gelatine, đông huyết thanh

+ Trên môi trường thạch, khuẩn lạc có dạng hình tròn trơn bóng, đục mờ

+ Tụ cầu vàng tương đối chịu nhiệt và thuốc sát khuẩn hơn các chủng vi khuẩn

khác, chịu độ khô và có thể sống trong môi trường có nồng độ muối cao (9%),

nhiều chủng tụ cầu vàng đề kháng với penicillin và các kháng sinh khác.

Khóa 2014 - 2016

20

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

+ Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất penicillase (β-lactamase).Men phá hủy

vòng β-lactam, cấu trúc cơ bản của kháng sinh penicillin G, Ampicillin,

Ureidopenicillin, làm cho kháng sinh này mất tác dụng.

+ Ngoài ra S.aureus không có khả năng tạo bào tử.

Trên môi trường lỏng tế bào có dạng cặn, vòng nhãn mờ trong ống nghiệm ở bề mặt

môi trường.

-Kháng nguyên:

+ Tụ cầu có cấu trúc kháng nguyên phức tạp, trên màng tế bào vi khuẩn có 3 loại

kháng nguyên:

 Protein A: là những protein bao quanh bề mặt vách tụ cầu vàng và là một tiêu

chuẩn để xác định tụ cầu vàng. 100% các chủng tụ cầu vàng có protein này

 Axit Techoic: là kháng nguyên ngưng kết chủ yếu của tụ cầu và làm tăng tác

dụng hoạt hóa bổ thể. Đây là chất bám dính của tụ cầu vào niêm mạc mũi. Axit

này gắn polysaccarit vách tụ cầu vàng. Đây là kháng nguyên O.

 Peptidoglycan (glucopeptid)

-Yếu tố độc lực: Khả năng gây bệnh của tụ cầu vàng là do vi khuẩn phát triển nhanh

và lan tràn rộng rãi trong mô cũng như tạo nhiều độc tố và enzyme, hầu hết các

chủng S. aureus đều có thể tổng hợp enteroroxin trong môi trường có nhiệt độ trên

15ºC

- Các enzyme ngoại bào :

+ Protease : phân giải protein tế bào chủ

+ Lipase phân giải lipid

+ DNase phân giải DNA và các enzyme sửa đổi axit béo

-Sức đề kháng:

Khóa 2014 - 2016

21

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

+ Vi khuẩn đề kháng kém với nhiệt độ: 70⁰C / 1h, 80⁰C / 10 - 30 phút, 100⁰C / sau

vài phút

- Chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn nhanh.

- Nơi khô ráo vi khuẩn sống trên 200 ngày.

- Vi khuẩn đề kháng cao ở nhiệt độ lạnh.

 Streptococcus pneumoniae

- Giới thiệu: S. pneumoniae là vi khuẩn Gram dương thuộc chi Streptococcus. S.

pneumoniae cư trú nhưng không gây ra bệnh trong mũi họng của người khỏe mạnh.

Tuy nhiên, ở những người nhạy cảm, chẳng hạn như người già, người suy giảm

miễn dịch và trẻ em, vi khuẩn có thể gây bệnh.

S. pneumoniae là nguyên nhân chính của viêm phổi lây nhiễm cộng đồng, viêm

màng não ở trẻ em, và nhiễm trùng huyết. Mặc dù tên gọi là phế cầu khuẩn, loài này

lại gây ra nhiều loại bệnh nhiễm trùng phế cầu khuẩn khác với viêm phổi. Các bệnh

phế cầu khuẩn xâm lấn bao gồm viêm xoang cấp tính, viêm tai giữa, viêm kết

mạc, viêm màng não, nhiễm trùng huyết, viêm tủy xương, viêm khớp nhiễm khuẩn,

viêm nội tâm mạc, viêm phúc mạc, viêm màng ngoài tim, viêm mô tế bào, và áp xe

não.

S. pneumoniae là một trong những nguyên nhân phổ biến nhất của bệnh viêm màng

não ở người lớn và thanh thiếu niên, cùng với Neisseria meningitidis, và là nguyên

nhân hàng đầu của bệnh viêm màng não ở người lớn ở Hoa Kỳ. Nó cũng là một

trong hai chủng đầu được tìm thấy trong nhiễm trùng tai, tai giữa, viêm phổi phế

cầu khuẩn là phổ biến hơn ở trẻ em. Trong quá trình xâm nhập các tổ chức, phế cầu

có thể vào máu gây nhiễm trùng huyết với các biến chứng nghiêm trọng như nhiễm

khuẩn lan tràn, sốc nhiễm khuẩn.

- Đặc điểm sinh học

Khóa 2014 - 2016

22

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

+ Hình thái: Liên cầu là những cầu khuẩn bắt màu Gram dương, đường kính khoảng

0,6- 0,8 μm, xếp liên tiếp với nhau thành từng chuỗi, dài ngắn khác nhau và có thể

đứng với nhau thành từng đôi hoặc từng đám. Liên cầu không có lông, không di

động, không sinh nha bào, một số loài có vỏ.

+ Tính chất nuôi cấy : Liên cầu hiếu khí kỵ khí tùy nghi và thường đòi hỏi môi

trường nuôi cấy có nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh, đường... Vi khuẩn

phát triển tốt hơn ở điều kiện khí trường có thêm 5-10% CO2. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 37oC , một số phát triển được ở 10- 40oC như liên cầu đường ruột.

- Trong môi trường lỏng (canh thang): Liên cầu dễ tạo thành những chuỗi dài không

bị gẫy, sau đó tạo thành những hạt nhỏ hoặc những hạt như bông rồi lắng xuống đáy

môi trường nuôi cấy. Do đó sau 24 giờ, môi trường trở nên trong và có lắng cặn.

- Trên môi trường đặc: Liên cầu có khuẩn lạc tròn, lồi, bóng khô, màu hơi xám

trong. Những chủng có vỏ khuẩn lạc lầy nhầy.

- Trên môi trường thạch máu: Liên cầu phát triển tốt, có thể làm tan máu dưới 3

hình thức α, β, γ tuỳ thuộc từng nhóm liên cầu:

Tan máu (α): đây là tan máu không hoàn toàn, vòng tan máu có xuất hiện màu xanh.

Liên cầu tan máu α, loài Streptococcus viridans thường là loại không gây bệnh. Tuy

nhiên, trong một số trường hợp chúng có khả năng gây các bệnh nhiễm trùng ở

người, như viêm nội tâm mạc bán cấp (subacute endocarditis) có thể dẫn đến tổn

thương van tim và suy tim nếu không điều trị. Streptococus pneumoniae, căn

nguyên gây viêm phổi thuỳ (lobar pneumonia).

Tan máu (β): Tan máu β, đây là tan máu hoàn toàn, vòng tan máu trong suốt và có

đường kính gấp 2 - 4 lần đường kính của khuẩn lạc. Những Streptococci có khả

năng gây tan máu β phần lớn có khả năng gây bệnh. Tan máu β chủ yếu ở liên cầu

nhóm A, ngoài ra có thể gặp ở nhóm B, C, D.

Khóa 2014 - 2016

23

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

Tan máu (γ): Tan máu γ là loại tan máu không có vòng tan máu xung quanh của

khuẩn lạc. Hầu hết các Streptococci gây tan máu γ không mang tính độc lực. Tan

máu kiểu này đối với liên cầu nhóm D (E. faecalis).

- Cấu trúc kháng nguyên:

+ Kháng nguyên C đặc hiệu nhóm: Năm 1930, Lancefield dựa vào kháng nguyên C

(carbohydrat) của vách tế bào vi khuẩn để xếp liên cầu thành các nhóm từ A, B, C...

R. Liên cầu nhóm A và D có khả năng gây bệnh cho người. Các nhóm khác (B,C)

gây bệnh cho súc vật hoặc không gây bệnh.

- Kháng nguyên M đặc hiệu type: Kháng nguyên M (Protein M) cũng nằm ở vách tế

bào vi khuẩn. Dựa vào kháng nguyên này Lancefiel xếp liên cầu nhóm A thành 80

type huyết thanh khác nhau. Protein M nằm trên bề mặt tế bào nên dễ dàng kết hợp

với kháng thể kháng protein M. Kháng nguyên M có khả năng chống lại thực bào vì

vậy nó liên quan trực tiếp tới độc lực của liên cầu.

- Những kháng nguyên khác của liên cầu:

 Kháng nguyên T: Là protein của vách tế bào vi khuẩn, bị phá huỷ bởi nhiệt

độ ở pH axit.

 Kháng nguyên P: Bản chất là nucleoprotein, kháng nguyên này có phản ứng

chéo với nucleoprotein của tụ cầu.

 Kháng nguyên R: Bản chất là protein, nằm ở vách tế bào vi khuẩn, có một số

type M của liên cầu nhóm A.

 Kháng nguyên vỏ acid hyaluronic: Có ở những liên cầu có vỏ của nhóm A.

Yếu tố độc lực

- Các enzyme (men):

+ Men Streptokinase: Thường có ở liên cầu nhóm A, C, G. Men này là một kháng

nguyên có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể Anti Streptokinase

Khóa 2014 - 2016

24

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

(ASK). Streptokinase có khả năng làm tan tơ huyết, hoạt hoá xung quanh vùng tổn

thương tạo điều kiện cho vi khuẩn lan tràn.

+ Streptodornase (Desoxyribonuclease): Streptodornase có khả năng thuỷ phân

ADN, do đó làm lỏng mủ nhưng chỉ có tác dụng khi có mặt của ion Mg. Men

streptodornase có 4 loại A,B,C,D và đều là những kháng nguyên kích thích cơ thể

hình thành những kháng thể đặc hiệu.

+ Hyaluronidase: Men có tác dụng phân huỷ acid hyaluronic của tổ chức, tạo điều

kiện cho vi khuẩn lan truyền sâu rộng vào các mô. Men này cũng có tính kháng

nguyên kích thích cơ thể sinh kháng thể anti Atreptohyaluronidase.

+ Diphospho pyridine nucleotidase (DPNase): Men này có ở liên cầu nhóm A, C, G.

Có độc tính với tế bào bạch cầu và gây chết bạch cầu. Đây cũng là men có tính

kháng nguyên và kích thích cơ thể hình thành kháng thể.

+ Proteinase: Có tác dụng phân huỷ protein và kích thích cơ thể hình thành kháng

thể.

- Độc tố:

+Dung huyết tố - liên cầu tan máu α có khả năng hình thành hai loại dung huyết tố:

Streptolysin O: Hầu hết liên cầu tan máu β đều có khả năng sinh ra men này. Chúng

bị mất hoạt tính bởi oxy nên trên môi trường nuôi cấy, chúng gây tan máu ở phía

sâu trong thạch. Độc tố này mang tính chất của một ngoại độc tố, có tính kháng

nguyên mạnh nên kích thích cơ thể hình thành kháng thể (anti streptolysin O). Việc

định lượng kháng thể này có giá trị trong chẩn đoán bệnh liên cầu đặc biệt trong

bệnh thấp tim và viêm cầu thận cấp.

Streptolysin S: Nhiều liên cầu tiết ra loại men này, men gây tan máu ở bề mặt môi

trường nuôi cấy, tính kháng nguyên yếu nên không kích thích cơ thể hình thành

kháng thể.

Khóa 2014 - 2016

25

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

- Độc tố hồng cầu: Còn được gọi là độc tố sinh đỏ, bản chất là protein gây phát ban

trong bệnh tinh hồng nhiệt.

- Khả năng gây bệnh: Liên cầu nhóm A gây bệnh quan trọng nhất ở người. Tuỳ

từng typ huyết thanh học mà gây nên các thể lâm sàng.

Nhiễm khuẩn tại chỗ: Viêm họng, eczema, chốc lở, nhiễm khuẩn vết thương, viêm

tai giữa, viêm phổi, nhiễm trùng tử cung sau đẻ.

Các nhiễm khuẩn thứ phát: Từ nhiễm khuẩn tại chỗ bệnh nhân có thể bị

nhiễm trùng huyết, viêm màng trong tim ác tính.

 Enterococcus faecium

- Giới thiệu: Trước năm 1984, Enterococcus là thành viên của chi Streptococcus vì

vậy Enterococcus faecium cònđược gọi là Streptococcus faecium.

- Đặc điểm sinh học:

+ Có đầy đủ tính chất của Streptococcus

+ Thuộc nhóm liên cầu khuẩn phân

+ Đường kính nhỏ hơn 2 µm

+ Nhiệt độ thích hợp để sinh trưởng và phát triển là 30-35ºC

+ Enterococcus faecium có thể sống trên bề mặt môi trường (đất: 77 ngày, phomat :

180 ngày)

+ Không chịu được sự thanh trùng, chất sát trùng, chất kháng sinh..

+ Có khả năng lên men glucose, sinh axit làm giảm pH môi trường

+ Nó có thể sản xuất một phản ứng pseudocatalase nếu trồng trên thạch máu

Khóa 2014 - 2016

26

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

+ Là vi khuẩn Gram dương,vừa có sức sống lẫn khả năng tăng sinh mạnh mẽ. Vi

khuẩn sống hòa bình trong ruột của con người, nhưng nó cũng phát triển mạnh mẽ

trên vết thương và vết bỏng.

 Enterococcus faecalis

-Giới thiệu: Trước đây được phân loại như một phần của Streptococcus nhóm D, là

vi khuẩn Gram dương. Giống như các loài khác trong chi Enterococcus, E.faecalis

có thể gây nhiễm trùng đe dọa tính mạng ở người, đặc biệt là trong môi trường bệnh

viện, nơi mà mức độ cao tự nhiên của kháng kháng sinh được tìm thấy rong E.

faecalis góp phần gây bệnh của nó.

- Đặc điểm sinh học

+ Hình thái: cầu khuẩn, bắt màu Gram dương, xếp thành chuỗi dài ngắn khác nhau,

không di động, đôi khi có vỏ, đường kính 0,6-1µm.

+ Tính chất nuôi cấy: vi khuẩn hiếu khí tùy tiện; môi trường nuôi cấy phải nhiều

chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh, đường; phát triển thuận trong môi trường có

nhiều oxy hoặc 5-10% CO2, nhiệt độ thích hợp 30-35ºC. Có thể sống trên bề mặt

môi trường (đất:77 ngày, phomat: 180 ngày); không chịu được sự thanh trùng,

pH<6, 3, chất sát trùng, chất kháng sinh.

+ Tính chất sinh hóa:

 Có khả năng lên men glucose. Trong môi trường lỏng (canh thang): Liên cầu dễ

tạo thành những chuỗi dài không bị gẫy, sau đó tạo thành những hạt nhỏ hoặc

những hạt như bông rồi lắng xuống đáy môi trường nuôi cấy. Do đó sau 24 giờ,

môi trường trở nên trong và có lắng cặn.

 Không lên men catalase, có khả năng phát triển trong môi trường chứa mật,muối

mật hoặc methyl-hydrocuprein

 Kháng nguyên: Cấu trúc kháng nguyên khá phức tạp. Kháng nguyên C (đặc hiệu

nhóm) là kháng nguyên nằm ở vách tế bào. Kháng nguyên M (đặc hiệu type)

Khóa 2014 - 2016

27

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

cũng là nằm ở vách tế bào. Protein M nằm rải rác ở bề mặt tế bào, gắn ở rìa tế

bào nên dễ kết hợp với kháng thể kháng protein M ngay cả khi môi trường có

axit. Ngoài ra nó chống lại thực bào, vì vậy nó liên quan đến độc lực của liên

cầu, bị thủy phân bởi pepsin hay trypsin. Ngoài ra, còn có các kháng nguyên

khác như kháng nguyên T (là protein vách tế bào vi khuẩn, bị phá hủy bởi nhiệt

độ ở pH axit), kháng nguyên P (kháng nguyên này có phản ứng chéo với

nucleoprotein của tụ cầu), kháng nguyên R (bản chất là protein, nằm ở vách tế

bào,có phản ứng chéo giữa các type huyết thanh hoặc giữa các nhóm, đề kháng

với trypsin).

-Yếu tố độc lực:

+ Streptokinase: kháng nguyên này tìm thấy ở liên cầu nhóm A và một số nhóm liên

cầu khác, là kháng nguyên có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể

antitreptokinase, có khả năng làm tan tơ huyết, hoạt hóa xung quanh vùng tổn

thương vì thế tạo điều kiện để liên cầu lan tràn nhanh.

+ Streptodornase: có 4 loại A, B, C, D là những loại khác nhau,có khả năng kích

thích cơ thể hình thành kháng thể đặc hiệu. Streptodornase có khả năng phân hủy

ADN, do đó nó có khả năng làm lỏng mủ.

+ Hyaluronidase: thủy phân acid hyaluronic, làm vi khuẩn lan tràn sâu rộng vào các

mô, là kháng nguyên có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể anti

streptphyaluronidase.

+ DPNase : được tìm thấy ở các nhóm liên cầu A, C, G, là enzyme có khả năng diệt

bạch cầu, có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể.

 Proteinase : có khả năng thủy phân protein

 Dung huyết tố :Liên cầu làm tan máu β có khả năng hình thành hai loại dung

huyết tố.

Khóa 2014 - 2016

28

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

Streptolysin O : dễ bị mất hoạt tính bởi oxy, vì thế trên môi trường nuôi cấy, nó gây

tan máu ở trong thạch. Độc tố này mang tất cả những tính chất của một ngoại độc

tố, đặc biệt tính kháng nguyên mạnh, kích thích cơ thể hình thành kháng thể

antistreptolysin O.

Streptolysin S: gây tan máu ở bề mặt môi trường nuôi cấy, không mất hoạt tính bởi

oxy, tính kháng nguyên kém vì vậy không kích thích cơ thể hình thành kháng thể.

Độc tố hồng cầu: bản chất là protein, làm cho da trẻ em dễ mẫn cảm .

- Khả năng gây bệnh: E. faecilis là vi khuẩn sống trong vi hệ bình thường của

người, chúng là một trong những nguyên nhân gây nhiễm trùng cơ hội, đặc biệt là ở

bệnh nhân suy giảm miễn dịch. E. faecilis đã trở thành một trong những nguyên

nhân chính gây nhiễm trùng huyết.

1.5.3. Nấm gây nhiễm trùng huyết

Nấm thuộc nhóm sinh vật nhân thật. Cơ thể nấm không có vi mạch, sinh sản bằng

bào tử và phát tán vào môi trường nhờ gió. Bào tử có hai loại: Bào tử hữu tính và

bào tử vô tính.

Các bào tử này được sinh ra tuỳ thuộc loài và các điều kiện ngoại cảnh.

Thể dưỡng sinh của nấm có thể là đơn bào (nấm men) hoặc dạng sợi (nấm mốc).

Một số loài có dạng lưỡng hình (tồn tại cả hai dạng trên ở các điều kiện môi trường

khác nhau).

Nấm giống thực vật đều có sự thay đổi thế hệ, không có khả năng di động (ngoại trừ

một số ít thuộc bộ nấm roi có pha di động). Thành tế bào của nấm giống thành tế

bào của thực vật nhưng khác nhau về thành phần hóa học: chủ yếu là chixin (thành

tế bào của thực vật là xenllulose)

Nấm khác thực vật ở chỗ nó là sinh vật dị dưỡng (giống động vật) nhưng nấm khác

động vật ở chỗ động vật thì nuốt thức ăn vào dạ dày rồi mới tiêu hóa, còn nấm thì

Khóa 2014 - 2016

29

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

ngược lại tiết ra các men ngoại bào phân giải các chất hữu cơ phức tạp thành các

chất đơn giản rồi mới hấp thụ vào cơ thể. Nấm tích trữ năng lượng dưới dạng

glycogen như động vật.

Màng tế bào nấm có một nhân sterol duy nhất là ergosterol, chất thay thế

cholesterolcos ở màng tế bào động vật.

Nhân tế bào của nấm rất nhỏ và ADN ít trùng lặp. Quá trình nguyên phân nói chung

được kết thúc mà không có sự phân hủy màng nhân.

Tùy thuộc vào ngoại cảnh mà nấm có thể có các trạng thái dinh dưỡng: hoại sinh,

ký sinh và cộng sinh.

- Cơ chế gây bệnh : Mặc dù số lượng chi và loài được mô tả của nấm là rất lớn

(khoảng 6000 chi với 65000 loài nhưng chỉ có khoảng 50 loài có khả năng gây bệnh

cho người. Nấm gây bệnh thông qua cơ chế sau:

 Gây bệnh thông qua đáp ứng miễn dịch: một số nấm gây ra các đáp ứng miễn di ̣ch

và các đáp ứng này có thể dẫn đến các phản ứng di ̣ ứng (hiện tượng quá mẫn) khi

xuất hiện các kháng nguyên đặc hiệu. Ví dụ: loài thuộc chi Aspergillus sống hoại

sinh rất phổ biến ở trong tự nhiên và là tác nhân gây di ̣ ứng thường gặp, có thể gây

ra cơn co tắt phế quản (Asthma) và các phản ứng quá mẫn khác.

 Gây bệnh thông qua độc tố (mycotoxin): các độc tố thường được tạo ra trên các

chất hữu cơ chết khi nấm lây nhiễm và phát triển. Mycotoxin (chủ yếu là extoxin)

là các sản phảm chuyển hoá thứ cấp của nấm, đây là một nhóm hợp chất đa dạng

về cấu trúc. Nhiều chất rất độc với người và động vật khi ăn phải, hít phải kể cả

khi chỉ tiếp xúc ngoài da. Tuỳ thuộc loại độc tố và thời gian tiếp xúc chúng có thể

gây ra bệnh cấp tính hoặc mạn tính và cũng có thể dẫn đến quái thai hoặc ung thư.

Ví dụ: độc tố nấm Aflatoxin và là loài sinh ra độc tố thường gặp trên thực phẩm

bảo quản không hợp lý nhất là các loại hạt. có vai trò gây ra các bệnh ung thư

gan...

Khóa 2014 - 2016

30

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

- Khả năng gây bệnh : Các bệnh nhân có nguy cơ cao nhiễm nấm cơ hội bao gồm

các đối tượng:

 Khối u ác tính, cấy ghép cơ quan hoặc tủy xương, bỏng, bị các bệnh phải can thiệp

dụng cụ như catheter, sonde bàng quang dài ngày, suy dinh dưỡng phải nuôi qua

đường tĩnh mạch.

 Trải qua phẫu thuật, sử dụng kháng sinh phổ rộng ..

 Giảm bạch cầu hạt, bệnh máu ác tính, sử dụng corticoid kéo dài…

 Trẻ em ốm yếu, miễn dịch kém, đẻ non…

-Nấm bao gồm nấm mốc và nấm men.

 Nấm mốc

Nấm mốc phát triển thành ống dạng sợi, nhỏ bé, thường không nhìn thấy bằng

mắt thường và phân nhánh. Các đoạn sợi này gọi là hyphae và tập trung thành

hệ sợi mycelium. Hệ sợi là cái mà chúng ta nhìn thấy khi chúng ta quan sát lớp màu

trắng trên các quả bị mốc. Các sợi hyphae hoặc có vách ngăn, hoặc dạng cộng bào

(sợi đa nhân nhưng không có vách ngăn cho từng tế bào). Đây là các đặc điểm hình

thái của nấm được sử dụng trong chẩn đoán xác đi ̣nh ở các lab xét nghiệm. Trên

thạch, các sợi phát triển nhanh từ điểm cấy bằng việc phát triển các chóp sợi và sau

đó phân thành các nhánh.

Đại diện : Aspergillus fumigatus

Aspergillus fumigatus: là loại nấm gây dị ứng các bệnh về đường hô hấp và nhiễm

trùng máu, những bào tử A. fumigatus thường không gây bệnh ở những người có hệ

miễn dịch khỏe mạnh, chỉ gây bệnh trên những người có hệ miễn dịch bị suy yếu.

Aspergillus luôn tồn tại dưới dạng nấm sợi., A. fumigatus có khả năng phát triển ở

nhiệt độ cao tới 50ºC.

Phương thức lây nhiễm: dụng cụ phẫu thuật, tiếp xúc trực tiếp.

Khóa 2014 - 2016

31

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

Cơ chế gây bệnh: bằng cách gây di ̣ ứng hoặc gây ngộ độc bằng độc tố, hoặc gây

xâm nhiễm trực tiếp vào các cơ quan trong cơ thể.

Yếu tố thuận lợi xâm nhiễm nấm: giảm bạch cầu hạt, suy giảm miễn dịch, dùng

corticoid, tổn thương niêm mạc, tia xạ, bệnh phổi sẵn có (lao hoặc các bệnh bẩm

sinh của phổi…), nồng độ bào tử đủ lớn trong không khí, người bệnh không may

hít vào.

 Nấm men

Candida là loại nấm men tồn tại khá phổ biến trong thiên nhiên, ký sinh trên người

và động vật, Candida thuộc chi nấm men, thuộc họ Cryptococcaceae

Hình dạng: tồn tại ở trạng thái đơn bào, có nhân chuẩn, là nấm đơn bào, có vách

ngăn rộng, hình tròn hoặc hình bầu dục, đôi khi gặp dạng sợi hay dạng vô định

hình.

Kích thước: dao động từ 3-10µm, lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn.

Sinh sản theo phương thức nảy chồi, khi bào tử chồi sinh ra theo dạng tuyến tính thì

hình thành nên cấu trúc giá sợi nấm.

Thích nghi với môi trường đường cao : hoa quả, rau dưa, mật mía

Khi nấm Candida xâm nhập vào máu, nó có thể lan đến các phần khác của cơ thể.

Loại nhiễm trùng này được gọi là Candida huyết.

Candida huyết xảy ở những bệnh nhân có hệ miễn dịch suy yếu hoặc có sẵn một

tình trạng nhiễm nấm men kéo dài không được điều trị.

Triệu chứng của nhiễm nấm men xâm lấn có thể rất mơ hồ và phụ thuộc vào việc cơ

quan nào trên cơ thể bị ảnh hưởng. Các triệu chứng phổ biến bao gồm sốt và ớn

lạnh tiếp diễn kể cả sau khi đã dùng kháng sinh. Loại nhiễm nấm này thường gặp ở

những người đang hoặc đã từng nhập viện. Đây là nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm

Khóa 2014 - 2016

32

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

trùng huyết và nguy hiểm hơn có thể dẫn đến tử vong nếu không được phát hiện kịp

thời và điều trị.

Có hơn 300 loài Candida gây bệnh, trong đó Candida albicans bắt gặp nhiều nhất,

tiếp theo là Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida

krusei.

Candida albican : Nấm men gây bệnh chính, thường gặp nấm men bắt màu Gram

dương. Hình dạng trái xoan, thành tương đối dày, kích thước (46µm) x ( 6-10µm),

nảy chồi hẹp kiểu số 8 và kèm theo những sợi nấm giả, thanh mảnh.

Candida tropicalis:Lên men tốt ở các dịch đường glucose, galactose.. không hấp

thụ được lactose..

Candida glabrata :Bắt màu Gram dương, hình tròn hoặc oval, kích thước rất nhỏ

(2-3 µm) x (3-4 µm). Có thể nảy chồi nhiều bên..

Candida krusei: Hình trứng, thon dài, có khi gặp dạng hình trụ, kích thước dao động

(3-6 µm) x (6- 12 µm). Là nấm men kích thước lớn và nảy chồi dài hơn Candida

albicans.

Trẻ nhỏ có hệ miễn dịch suy yếu hoặc có cân nặng sơ sinh rất thấp cũng là đối

tượng nguy cơ cao nhiễm nấm men xâm lấn. Nhiễm nấm men xâm lấn là tình trạng

hết sức nghiêm trọng và cần được điều trị cấp cứu kịp thời. Bệnh nhi phải được điều

trị trong bệnh viện và có thể sẽ phải dùng thuốc chống nấm đường uống hoặc truyền

tĩnh mạch trong vài tuần.

Có thể thấy, việc phát hiện sớm các tác nhân gây nhiễm trùng huyết (vi khuẩn Gram

dương, Gram âm hay nấm) không chỉ làm giảm nguy cơ tử vong cho bệnh nhi, giảm

chi phí điều trị, hỗ trợ bác sỹ lâm sàng trong chẩn đoán cũng như điều trị kháng sinh

hợp lý, mà còn cách ly sớm bệnh nhi, tránh nhiễm chéo hoặc nhiễm trùng bệnh

viện.

Khóa 2014 - 2016

33

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

1.6. Phƣơng pháp sinh học phân tử realtime PCR đa mồi Septifast trong chẩn

đoán nhiễm trùng huyết ở trẻ em

Realtime PCR đa mồi chẩn đoán nhiễm trùng huyết (Septifast) là xét nghiệm

sinh học phân tử dựa trên việc phát hiện ADN của vi sinh vật. Phản ứng realtime

PCR đa mồi sử dụng các đầu dò nằm trong vùng ITS (internal transcribed

spacer)16S-23S và 18S-5.8S tương ứng với các gen rARN của vi khuẩn và ADN

của nấm. Xét nghiệm Septifast cho phép phát hiện 25 tác nhân vi khuẩn và nấm

thông qua việc phân tích các đường cong nóng chảy và các profile đặc hiệu cho mỗi

sản phẩm khuếch đại bằng phần mềm phân tích SF Identification System software.

Nguyên lý hoạt động: Xét nghiệm realtime PCR đa mồi Septifast được thực hiện

dựa trên 3 quá trình chính:

 Chuẩn bị các mẫu thử bằng cách ly giải cơ học và tinh sạch ADN:

Quá trình ly giải cơ học các mẫu bệnh phẩm được thực hiện bằng cách sử dụng SeptiFastLys kit Mgrade và hệ thống MagNA Lyser. Với SeptiFastPrep kit Mgrade

mẫu bệnh phẩm cần ly giải được ủ ở nhiệt độ cao với protease và đệm dung dịch ly

giải để giải phóng axit nucleic và bảo vệ ADN sinh ra từ ADNase trong máu. Nội

kiểm chứng - IC (Internal control) được đưa vào cùng các mẫu với dung dịch ly

giải. Nội chứng bao gồm các phân tử ADN chuỗi kép được tổng hợp với các vị trí

bám mồi giống hệt với các trình tự mục tiêu. Các IC này chứa vùng gắn đầu dò

Hybprobe duy nhất cho phép sự khác biệt của khuếch đại IC từ mục tiêu cụ thể. Sau

khi thêm dung dịch đệm bám, hỗn hợp này được chuyển sang cột lọc với bộ lọc có

chèn các sợi thủy tinh. Hệ gen người và ADN mục tiêu của nấm/ vi khuẩn sẽ bám

vào bề mặt của sợi thủy tinh đó. Những chất không bám như muối, protein và các

mảnh vỡ tế bào khác được loại bỏ sau đó bởi 2 bước rửa. Sau khi hoàn thành các

bước rửa, axit nucleic hấp phụ được đẩy bằng dung dịch đã ủ ở nhiệt độ cao. Dung

dịch thu được cuối cùng là sản phẩm chuẩn bị cho bước tiếp theo.

Khóa 2014 - 2016

34

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

 Realtime PCR khuếch đại ADN mục tiêu trong 3 phản ứng song song (vi

khuẩn Gram dƣơng, vi khuẩn Gram âm, nấm) và phát hiện bằng đầu dò lai

đặc hiệu:

Mỗi đoạn dò lai ghép gen có một loại chất nhuộm đơn gắn vào hai đầu dò liền kề.

Chất cho chuyển năng lượng được gắn vào một đầu dò, và chất nhận bước sóng dài

được đặt trên đầu dò khác. Trong khi thực hiện PCR, các đầu dò bên cạnh nhau ở

đoạn ủ mỗi chu kỳ (Hình 1.2). Chất cho chuyển năng lượng hấp thụ cho chất nhận

và chất nhận phát ra một bước sóng khác. Sự phát xạ tăng của chất nhận được giám

sát để theo dõi sự xuất hiện của mục tiêu. Xác định các tác nhân gây bệnh hoặc các

gen kháng được đưa ra bởi việc thực hiện phân tích đường cong nóng chảy sau khi

hoàn thành quá trình chạy realtime PCR. Các xét nghiệm LightCycler® SeptiFast

sử dụng các đoạn dò lai ghép gen với nhiệt độ nóng chảy khác nhau (Tm) với bốn

loại chất nhuộm khác nhau cho phép xác định 25 mầm bệnh khác nhau cùng một

lúc.

Hình 1.2 Real-time PCR với các đầu dò lai ghép gen. A: Bước biến tính, B: Bước ủ

(đo lường huỳnh quang), C: Bước kéo dài, D: Kết thúc

Khóa 2014 - 2016

35

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

Hình 1.3Kênh bước sóng của vi khuẩn Gram dương

Hình 1.4 Kênh bước sóng của vi khuẩn Gram âm

Khóa 2014 - 2016

36

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

Hình 1.5 Kênh bước sóng của Nấm

Realtime PCR đa mồi Septifast là xét nghiệm khuếch đại axit nucleic trong ống

nghiệm để phát hiện và nhận dạng ADN của vi khuẩn và nấm từ các vi sinh vật

được nêu trong Danh sách xét nghiệm Septifast sử dụng công cụ LightCycler 2.0

(Bảng 1.1, bảng 1.2). LightCycler® SeptiFast Test MGRADE sử dụng các đoạn

dò lai ghép gen với bốn loại chất nhuộm khác nhau. Xét nghiệm này bao gồm tất

cả các hoá chất cần thiết để chuẩn bị ba hỗn hợp PCR cho vi khuẩn Gram dương,

vi khuẩn Gram âm, và nấm cũng như chứng âm, chứng dương và nội chứng. Độ

nhạy trong phân tích của xét nghiệm LightCycler SeptiFast được phân tích bởi nhà

sản xuất với phân tích tỷ suất đụng của mỗi chất phân tích với một loạt nồng độ

pha loãng là 100, 30, và 3 CFU/ml trong máu EDTA từ các mẫu của người khỏe

mạnh. Độ nhạy tối thiểu là 30 CFU/ml thu được cho tất cả các loài, trừ

Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus

agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, và Streptococcus

mitis (100 CFU/ml).

Khóa 2014 - 2016

37

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

Bảng1.1 Các vi sinh vật được nêu trong danh sách xét nghiệm SeptiFast

Nấm

Gram (-) Escherichia coli Gram (+) Staphylococcus aureus Candida albicans

Klebsiella CoNS1 Candida tropicalis

(pneumoniae/oxytoca) Serratia marcescens Enterobacter Streptococcus Streptococcus spp.2 pneumoniae Candida Candida glabrata parapsilosis

(cloacae/aerogenes) Proteus mirabilis Enterococcus faecium Candida kruesi

Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Aspergillus

Acinetobacter baumanii fumigatus

Stenotrophomonas 1Coagulase negative Staphylococci (loài đại diện cho CoNS nhóm được liệt kê maltophilia trong Bảng 1.2.); 2Loài đại diện cho các nhóm Streptococcus spp. (Bảng 1.2).

Bảng 1.2 Các loài đại diện cho Nhóm CoNS và Streptococcusspp.

Coagulase negative Staphylococci Streptococcus spp.

S. agalactiae S. anginosus S. bovis S. constellatus S. cristatus S. gordonii S. intermdius S. milleri S. mitis S. oralis S. parasanguinis

(CoNS) S. hominis subsp. novobiosepticus S. pasteuri S. warneri S. cohnii subsp. Urealyticum S. hominis subsp. hominis S. lugdunensis S. cohnii subsp. Cohnii S. captitis subsp. ureolyticus S. captitis subsp. captisi S. caprae S. saprophyticus S. saprophyticus subsp. sapropyticus S. pneumoniae S. xylosus S. epidermidis S. haemolyticus

S. pyogenes S. salivarisus S. sanguinis S. thermophiles S. vestibularis S. viridans

Khóa 2014 - 2016

38

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

Hình 1.6 Chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR đa mồi Septifast

 Xuất kết quả tự động sau khi phân tích điểm nhiệt độ biến tính

Realtime PCR đa mồi Septifast là kỹ thuật được thiết kế để phát hiện ra 25 loại vi

sinh vật được coi là chiếm đến 90% các tác nhân gây nhiễm trùng huyết [47] trong

thời gian chỉ 5 giờ. Các mô tả kết quả thực hiện kỹ thuật ban đầu của Lehmann

cùng cộng sự [29], sau đó các thử nghiệm được đánh giá chủ yếu ở những bệnh

nhân hồi sức cấp cứu. Trong những nghiên cứu trên bệnh nhân nghi ngờ nhiễm

trùng huyết, nhiễm trùng huyết nặng và sốc nhiễm khuẩn, tỷ lệ phát hiện dương tính

với kỹ thuật Septifast cao hơn đáng kể so với kỹ thuật cấy máu. Tỷ lệ dương tính

với Septifast dao động từ 25 đến 35%, trong khi cấy máu từ 13 đến 21% [17,33].

Đây cũng là kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong việc chẩn đoán

nhanh, sàng lọc sớm hay thậm chí cả với những bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh

Khóa 2014 - 2016

39

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

hoặc trên nhiều đối tượng quần thể bệnh nhân khác nhau có nghi ngờ nhiễm trùng

huyết. Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả trên thế giới về kỹ

thuật này.

Năm 2007 tác giả Mussap M cùng cộng sự khi tiến hành nghiên cứu về ứng dụng

công cụ chẩn đoán mới trong nhiễm trùng huyết ở trẻ sơ sinh, và đánh giá vai trò

của PCR đa mồi trong việc phát hiện sớm cũng như xác định vi khuẩn và nấm

trong máu bệnh nhi đã kết luận realtime PCR đa mồi Septifast hoàn toàn được áp

dụng trong bệnh viện để đánh giá nhiễm trùng huyết ở trẻ em [39]

Tác giả Vince A năm 2008 với nghiên cứu trên 39 mẫu máu của 36 bệnh nhân với

chẩn đoán lâm sàng nhiễm trùng huyết, đặc biệt tất cả 36 bệnh nhân đều đã được

điều trị kháng sinh tại bệnh viện đại học các bệnh truyền nhiễm ở Croatia, nghiên

cứu phát hiện 13/39 mẫu dương tính (chiếm 33%), 11/13 mẫu dương tính với vi

khuẩn Gram âm, 2 mẫu dương tính với Gram dương, ADN của nấm Aspergillus

fumigatus cũng được phát hiện trong 2 mẫu máu của bệnh nhân sốt và thâm nhiễm

phổi [49].

Cũng theo một nghiên cứu năm 2009 của tác giả Varani S cùng cộng sự khi ứng

dụng kỹ thuật Septifast trên 100 bệnh nhân suy giảm miễn dịch có chẩn đoán nghi

ngờ nhiễm trùng huyết, trong đó có 98 bệnh nhân mắc ung thư, kết quả cho thấy kỹ

thuật Septifast có thể xác định sự có mặt hay vắng mặt của các vi khuẩn nhanh hơn

so với cấy máu, hỗ trợ tích cực cho kỹ thuật cấy máu đặc biệt là ở bệnh nhân suy

giảm miễn dịch [48].

Về độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp, năm 2010 tác giả Lehmann LE khi

đánh giá tính khả thi về kỹ thuật cũng như khả năng xác định các tác nhân nhiễm

trùng huyết của phương pháp Septifast trên 453 mẫu máu của 108 bệnh nhân nhiễm

trùng huyết nặng cũng thu cho thấy 114 mẫu được phát hiện dương tính so với chỉ

58 mẫu dương tính bằng phương pháp cấy máu. So với cấy máu thông thường, độ

nhạy và độ đặc hiệu của PCR là 0,69 và 0,81 [30]. Tác giả Torres-Martos E cùng

cộng sự với nghiên cứu năm 2013 khi đánh giá thử nghiệm kỹ thuật realtime PCR

đa mồi Septifast trên đối tượng trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ có lâm sàng chẩn đoán nghi

Khóa 2014 - 2016

40

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

ngờ nhiễm trùng huyết cũng cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu cho của phương pháp

là 79% và 87% [45]. Hơn nữa, nghiên cứu năm 2011 của Lucignano B chỉ ra rằng

PCR đa mồi Septifast cho phép chẩn đoán nhanh và chính xác các tác nhân gây

bệnh ở đối tượng trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ có nghi ngờ nhiễm trùng huyết. 1673 mẫu

máu của 803 trẻ có nghi nhiễm trùng huyết được áp dụng kỹ thuật Septifast có độ

nhạy, độ đặc hiệu tương ứng là 85% và 93,5%. Ngoài ra kỹ thuật Septifast cho tỷ lệ

phát hiện các tác nhân dương tính cao hơn đáng kể so với phương pháp cấy máu:

14,6% so với 10,3%. Đặc biệt, trong số các mẫu máu thu thập từ bệnh nhi đã điều

trị kháng sinh, kết quả cũng cho thấy tỷ lệ phát hiện dương tính bằng kỹ thuật

Septifast cao hơn hẳn so với cấy máu: 14,1% so với 6,5% [34]

Năm 2012, một nghiên cứu hồi cứu của tác giả Tschiedel E cùng cộng sự trên 110

mẫu máu của 75 trẻ có nghi ngờ nhiễm trùng huyết cũng cho tỷ lệ phát hiện bằng kỹ

thuật Septifast là 24%, với những bệnh nhi có điều trị kháng sinh Septifast phát hiện

được 24 mẫu dương tính (chiếm 25%). Ngoài ra, 14 bệnh nhi (13%) có tiến triển

bệnh khả quan khi được điều trị kháng sinh phù hợp dựa trên kết quả của kỹ thuật

Septifast [47]

Mới đây, Gies F trong nghiên cứu được công bố năm 2016 khi đánh giá tiềm năng

của kỹ thuật realtime PCR đa mồi Septifast ở 39 trẻ có đáp ứng viêm hệ thống đã

qua điều trị kháng sinh cũng cho kết quả rất khả quan. 14/39 mẫu phát hiện dương

tính bằng Septifast, trong khi cấy máu chỉ phát hiện 4 trường hợp (p<0,05) [22].

Thời gian trung bình cho kết quả dương tính với cấy máu là 3-4 ngày, so với chỉ 5

giờ ở kỹ thuật Septifast.

Có thể thấy việc ứng dụng kỹ thuật đa mồi trong chẩn đoán nhiễm trùng huyết là

một công cụ hỗ trợ đắc lực bên cạnh phương pháp cấy máu truyền thống. Đây cũng

là kỹ thuật được bệnh viện Nhi trung ương áp dụng đầu tiên trên cả nước trong việc

chẩn đoán nhiễm trùng huyết ở trẻ em, kỹ thuật cho độ nhạy, độ đặc hiệu cao,

không chịu ảnh hưởng tác động của kháng sinh, đồng thời có khả năng phát hiện

nhiều căn nguyên vi sinh vật trong cùng một thời gian xét nghiệm.

Khóa 2014 - 2016

41

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Trần Xuân Chương và CS (2012), Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và kết quả

điều trị nhiễm khuẩn huyết tại bệnh viện Trung ương Huế2009 – 2012, Hội nghị

khoa học bệnh truyền nhiễm và HIV/AIDS toàn quốc.

2. Trần Xuân Chương, Nguyễn Thị Phương Thảo và CS (2010), Một số đặc điểm

lâm sàng, huyết học và kết quả điều trị nhiễm trùng huyết tại Bệnh viện Trung

ương Huế năm 2009-2010, Kỷ yếu các công trình nghiên cứu khoa học Đại hội

Hội Truyền nhiễm Việt Nam lần thứ IV, tr.36.

3. Võ Tăng Duyên, Bùi Quốc Thắng (2009),“Các yếu tố dịch tễ học, lâm sàng và

cận lâm sàng liên quan đến tử vong do nhiễm trùng huyết sơ sinh”, Tạp chí Y học

TP. Hồ Chí Minh,13(1),tr. 35 – 39

4. Hoàng Trọng Kim, Trương Thị Hòa, Đỗ Văn Dũng (2005),“Những yếu tố tiên

lượng nặng trong nhiễm trùng huyết tại khoa hồi sức cấp cứu Bệnh viện Nhi

Đồng 1”, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh,13(1), tr. 7-16

5. Nguyễn Văn Kính (2008), “Phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh tại Việt

Nam”, GARP Việt Nam, http://www.cddep.org/sites/cddep.org.

6. Nguyễn Thanh Liêm, Lâm Thị Mỹ (2005),“Đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng, huyết

học, vi trùng học ở trẻ sơ sinh sanh non bị nhiễm trùng huyết tại BV Nhi đồng 1 từ

tháng 1-99 đến 1-04”, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, 13(1), tr. 196.

7. Lê Kiến Ngãi, Trần Văn Hường, Colin Partridge và cộng sự, “Tỷ lệ mắc mới và

một số yếu tố liên quan của nhiễm khuẩn huyết bệnh viện tại các Khoa Hồi sức

cấp cứu Bệnh viện Nhi Trung ương”.

8. Vũ Đình Phú (2013), Khảo sát nhiễm trùng bệnh viện và sử dụng kháng sinh tại

khoa Hồi sức tích cực ở Việt Nam, Hội nghị kháng kháng sinh Châu Á, Bệnh

viện BạchMai.

9. Đoàn Mai Phương (2008), “Đặc điểm của các tác nhân gây nhiễm trùng máu tại

Khóa 2014 - 2016

42

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

bệnh viện Bạch Mai năm 2008”, Tạp chí Y học lâm sàng, Số 48, tr.32-38.

10. Phạm Thị Ngọc Thảo (2010), “Đặc điểm bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết điều trị

tại khoa hồi sức cấp cứu bệnh viện Chợ Rẫy”, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh,

14 (2), tr.348-352.

11. Phạm Thị Xuân Tú, Nguyễn Thanh Hà (2003), “Tìm hiểu một số yếu tố nguy

cơ của nhiễm khuẩn mẹ con do vi khuẩn tại Bệnh viện phụ sản trung ương”,Tạp

chíY học thực hành, (495), tr.96-100.

12. Phạm Thị Xuân Tú, Phạm Văn Hùng (2001), “Đặc điểm lâm sàng, sinh học của

nhiễm khuẩn huyết trẻ sơ sinh”, Tạp chíNhi khoa, 10, tr.86-89.

13. Hà Mạnh Tuấn, Hoàng Trọng Kim (2005), “Tần suất nhiễm khuẩn bệnh viện tại

khoa Hồi sức cấp cứu Nhi”, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, 9(2) , tr. 78.

Tiếng Anh

14. Adrienne G Randolph, Russell J McCulloh (2014),“Pediatric sepsis important

considerations for diagnosing and managing severe infections in infants,

children, and adolescents”.Virulence, 5(1), pp. 179–189.

15. Augus DC, Linde-Zwirbe WT, Lidicker J, Clermont G, Carcillo J, Pinsky MR

(2001), “Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of

incidence, outcome, and associated costs of care”. Crit Care Med, 29, pp. 1303-

1310.

16. Bone, R. C., et al (1992),“Definitions for Sepsis and Organ Failure and

Guidelines for the use of Innovative Therapies in Sepsis. The ACCP/SCCM

Consensus Conference Committee. American College of Chest

Physicians/Society of Critical Care Medicine”, Chest, 101(6), pp.1644-1655.

17. Dierkes C, Ehrenstein B, Siebig S, Linde HJ, Reischl U, Salzberger B

(2009),“Clinical impact of a commercially available multiplex PCR system for

rapid detection of pathogens in patients with presumed sepsis”. BMC Infect Dis,

9, pp.126.

Khóa 2014 - 2016

43

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

18. Dinç F, Akalin H, Özakin C, Sinirtaş M, Kebabçi N, Işçimen R, Kelebek Girgin

N, Kahveci F(2016),“Comparison of blood culture and multiplex real-time PCR

for the diagnosis of nosocomial sepsis”, Minerva Anestesiol, 82(3), pp.301.

19. Elisa Burdino, Tina Ruggiero, Tiziano Allice, Maria Grazia Milia, Gabriella

Gregori, Rosangela Milano, Francesco Cerutti, Francesco Giuseppe De

Rosa, Pietro Caramello, Giovanni Di Perri(2014), “Combination of conventional

blood cultures and the SeptiFastmolecular test in patients with suspected sepsis

for the identification of bloodstream pathogens”,Diagn Microbiol Infect

Dis,79(3), pp. 287–292.

20. Ephraim L. Tsalik, Daphne Jones, Bradly Nicholson, Lynette Waring, Oliver

Liesenfeld, Lawrence P. Park, et al.(2010),“Multiplex PCR To Diagnose

Bloodstream Infections in Patients Ad mitted from the Emergency Department

with Sepsis”. J Clin Microbiol, 48(1): 26.

21. Figueroa JR, Ortiz J, Morales I (2010),“Use of the LightCycler SeptiFast test

for rapid etiologic diagnosis of nosocomial infection in gynecological sepsis”,

Gynecol Obstet Invest, 70(3), pp. 215–216.

22. Gies F, Tschiedel E, Felderhoff-Müser U, Rath PM, Steinmann J, Dohna-

Schwake C (2016),“Prospective evaluation of SeptiFast Multiplex PCR in

children with systemic inflammatory response syndrome under antibiotic

treatment”.BMC Infect Dis.16:378.

23. G. Martin, D.Mannino, S. Eaton, et all (2003), “The epidemiology of sepsis in the

united states from 1979 through 2000”, N Engl J Med, 348, pp. 1546.

24. Harrison D.A., Welch C.A., Eddleston J.M. (2006), "The epidemiology of

severe sepsis in England, Wales and Northern Ireland, 1996 to 2004: secondary

analysis of a high quality clinical database, the ICNARC Case Mix Programme

Database". Critical Care, 10, pp.42.

25. Jason P. et al. (2011), "Management of severe sepsis in patients admitted to

Asian intensive care units: prospective cohort study", British Medical Journal,

Khóa 2014 - 2016

44

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

pp.342-345.

26. Komolate A.D., Adegoke A.A (2008), “Incidence of bacterial septicaemia in

IIe - Ife Metropolis, Nigeria”, Malaysian journal of microbiology, 4(2), pp.51-

61.

27. Lamoth F, Jaton K, Prod'hom G, Senn L, Bille J, Calandra T, Marchetti O.

(2010), “Multiplex blood PCR in combination with blood cultures for

improvement of microbiological documentation of infection in febrile

neutropenia”. J Clin Microbiol, 48(10), pp. 3510–3516.

28. Lefevre N, Noyon B, Biarent D, Corazza F, Duchateau J, Casimir G.(2016),

“Sex Differences in Inflammatory Response and Acid-Base Balance in

Prepubertal Children with Severe Sepsis”, Shock

29. Lehmann LE, Hunfeld KP, Emrich T, Haberhausen G, Wissing H, Hoeft A,

Stüber F (2008),“A multiplex real-time PCR assay for rapid detection and

differentiation of 25 bacterial and fungal pathogens from whole blood

samples”. Med Microbiol Immunol, 197(3), pp. 313–324.

30. Lehmann LE, Hunfeld KP, Steinbrucker M, Brade V, Book M, Seifert H,

Bingold T, Hoeft A, Wissing H, Stüber F (2010),“Improved detection of blood

stream pathogens by real-time PCR in severe sepsis”. Intensive Care Med, 36(1),

pp. 49–56.

31. Leonella Pasqualini, et al (2012), “Diagnostic Performance of a Multiple Real-

Time PCR Assay in Patients with Suspected Sepsis Hospitalized in an Internal

Medicine Ward”. J Clin Microbiol, 50(4), pp.1285.

32. Lilienfeld-Toal M, Lehmann LE, Raadts AD, Hahn-Ast C, Orlopp KS,

Marklein G, Purr I, Cook G, Hoeft A, Glasmacher A, Stüber F (2009),“Utility of

a commercially available multiplex real-time PCR assay to detect bacterial and

fungal pathogens in febrile neutropenia”. J Clin Microbiol, 47(8), pp. 2405–

2410.

Khóa 2014 - 2016

45

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

33. Louie RF, Tang Z, Albertson TE, Cohen S, Tran NK, Kost GJ (2008),

“Multiplex polymerase chain reaction detection enhancement of bacteremia and

fungemia”. Crit Care Med, 36(5), pp. 1487–1492.

34. Lucignano B, Ranno S, Liesenfeld O, Pizzorno B, Putignani L, Bernaschi P,

Menichella D (2011),“Multiplex PCR allows rapid and accurate diagnosis of

bloodstream infections in newborns and children with suspected sepsis”. J Clin

Microbiol, 49(6), pp. 2252–2258.

35. Mancini N, Clerici D, Diotti R, Perotti M, Ghidoli N, De Marco D, Pizzorno B,

Emrich T, Burioni R, Ciceri F, Clementi M (2008),“Molecular diagnosis of

sepsis in neutropenic patients with haematological malignancies”. J Med

Microbiol,57(5), pp. 601–604.

36. Mencacci A, Leli C, Cardaccia A, Montagna P, Moretti A, Bietolini C, Meucci

M, Perito S, Cenci E, Bistoni F (2011),“Comparison of conventional culture with

SeptiFast real-time PCR for microbial pathogen detection in clinical specimens

other than blood”. J Med Microbiol, 60(12), pp. 1774–1778.

37. Mohsen AH, Kamel BA(2015),“Predictive values for procalcitonin in the

diagnosis of neonatal sepsis”.Electron Physician.7(4):1190-5.

38. M.Paolucci, M.G. Capretti, P.D.Monte and et all (2009), “Laboratory diagnosis of

late-oneset sepsis in newborns by multiplex real-time PCR”, J Med Microbiol,p.533-

534.

39. Mussap M, Molinari MP, Senno E, Gritti P, Soro B, Mannelli S, Fabris C

(2007),“New diagnostic tools for neonatal sepsis: the role of a real-time

polymerase chain reaction for the early detection and identification of bacterial

and fungal species in blood samples”. J Chemother, 19(2):31–34.

40. Pedro Tda C, Morcillo AM, Baracat EC (2015), “Etiology and prognostic

factors of sepsis among children and adolescents admitted to the intensive care

unit”.Rev Bras Ter Intensiva.27(3):240-6.

41. Roberta Sitnik, Alexandre Rodrigues Marra , Roberta Cardoso Petroni , Ozires Pereira Santos Ramos , Marines Dalla Valle Martino , Jacyr Pasternak, Oscar

Khóa 2014 - 2016

46

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

Fernando Pavão dos Santo, Cristóvão Luis Pitangueira Mangueira, João Renato

Rebello Pinho (2014), “SeptiFast for diagnosis of sepsis in severely ill patients

from a Brazilian hospital”, Einstein (Sao Paulo), 12(2).

42. R.Peters, M. Agtmael, S. Danner and et all (2004), “New developments in the

diagnosis of bloodstream infections”, The Lanced Infect Dis,Vol 4(751), pp. 60.

43. Stephen M. Schexnayder (1999). “Pediatric Septic Shock”. Pediatr.

Rev.;20;303-308.

44. Todi S., Chatterjee S., Sahu S., Bhattacharyya M (2010), “Epidemiology of

severe sepsis in India: an update”, Critical Care, 14(1): 382.

45. Torres-Martos E, Pérez-Ruiz M, Pedrosa-Corral I, Pena-Caballero M, Jiménez-

Valera MM, Pérez-Ramírez MD, Navarro-Marí JM (2013), “Evaluation of the

LightCycler® SeptiFast test in newborns and infants with clinical suspicion of

sepsis”. Enferm Infecc Microbiol Clin.31(6):375-9.

46. Troger B, Hartel C, Buer J, Dordelmann M, Felderhoff-Muser U, Hohn

T, Hepping N, Hillebrand G, Kribs A, Marissen J, Olbertz D, Rath

PM, Schmidtke S, Siegel J, Herting E, Gopel W, Steinmann J, Stein A

(2016),“Clinical Relevance of Pathogens Detected by Multiplex PCR in Blood of

Very-Low-Birth Weight Infants with Suspected Sepsis, Multicentre Study of the

German Neonatal Network,PLoS One.,11(7).

47. Tschiedel E, Steinmann J, Buer J, Onnebrink JG, Felderhoff-Müser U, Rath

PM, Dohna-Schwake C (2012),“Results and relevance of molecular detection of

pathogens by SeptiFast--a retrospective analysis in 75 critically ill children”. Klin

Padiatr, 224(1):12–16.

48. Varani S, Stanzani M, Paolucci M, Melchionda F, Castellani G, Nardi L,

Landini MP, Baccarani M, Pession A, Sambri V (2009),“Diagnosis of

bloodstream infections in immunocompromised patients by real-time PCR”. J

Infect, 58(5):346–351.

Khóa 2014 - 2016

47

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng

49. Vince A, Lepej SZ, Barsić B, Dusek D, Mitrović Z, Serventi-Seiwerth R, Labar

B (2008)“LightCycler SeptiFast assay as a tool for the rapid diagnosis of sepsis

in patients during antimicrobial therapy”. J Med Microbiol, 57(10):1306–1307.

50. Westh H, Lisby G, Breysse F, Böddinghaus B, Chomarat M, Gant V, Goglio A,

Raglio A, Schuster H, Stuber F, Wissing H, Hoeft A (2009),“Multiplex real-time

PCR and blood culture for identification of bloodstream pathogens in patients

with suspected sepsis”. Clin Microbiol Infect, 15(6):544–551.

Trang web

51. http.uptodate.com

52. https://vi.wikipedia.org/wiki/Nhiễm_trùng_huyết

53. http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Miễn_dịch_bệnh_sinh_của_nhiễm_trùn

g_huyết

Khóa 2014 - 2016

48