Nuôi cấy và định danh vi khuẩn Porphyromonas gingivalis từ mảng bám dưới nướu của bệnh nhân viêm nha chu

Chia sẻ: ViHani2711 ViHani2711 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

39
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nuôi cấy và định danh vi khuẩn Porphyromonas gingivalis từ mảng bám dưới nướu của bệnh nhân viêm nha chu. Porphyromonas gingivalis có vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của viêm nha chu. Nuôi cấy thành công Porphyromonas gingivalis tạo nguồn vi khuẩn có độc lực phục vụ cho các thử nghiệm với vi khuẩn nha chu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nuôi cấy và định danh vi khuẩn Porphyromonas gingivalis từ mảng bám dưới nướu của bệnh nhân viêm nha chu

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 NUÔI CẤY VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN PORPHYROMONAS GINGIVALIS TỪ MẢNG BÁM DƯỚI NƯỚU CỦA BỆNH NHÂN VIÊM NHA CHU Trần Thị Phương Thảo*, Lương Thị Mỹ Ngân**, Phạm Anh Vũ Thụy*** TÓM TẮT Mục tiêu: Nuôi cấy và định danh vi khuẩn Porphyromonas gingivalis từ mảng bám dưới nướu của bệnh nhân viêm nha chu. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Vi khuẩn trong nghiên cứu này được phân lập từ mảng bám dưới nướu của bệnh nhân viêm nha chu mạn mức độ trung bình đến nặng. Môi trường nuôi cấy được sử dụng là thạch máu cừu và ủ ở 37ºC trong điều kiện kỵ khí trong 10 ngày. Sau khi xác định gram (-), hình dáng tròn và màu sắc đen đặc trưng, mẫu khuẩn lạc được gửi định danh bằng phương pháp Maldi-Tof và khẳng định kết quả bằng phương pháp PCR. Kết quả: Khuẩn lạc Porphyromonas gingivalis nuôi cấy thành công từ mẫu mảng bám duớ̛ i nướu của bẹn ̂ h nhân thứ 21 có chẩn đoán viêm nha chu mạn tính thể nạn ̆ g. Khuẩn lạc hình tròn, dạng lồi, tiêu huyết β, mạt̆ láng, kích thuớ̛ c 1 - 2mm và có màu đen đạc̆ trun̛ g. Sau khi định danh thành công bằng Maldi-Tof, mẫu đuợ̛ c gửi thực ̂ PCR với primer đạc̆ hiẹu hiẹn ̂ , kết quả giải trình tự khẳng định chủng Porphyromonas gingivalis cần tìm. Kết luận: Porphyromonas gingivalis có vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của viêm nha chu. Nuôi cấy thành công Porphyromonas gingivalis tạo nguồn vi khuẩn có độc lực phục vụ cho các thử nghiệm với vi khuẩn nha chu. Từ khoá: Viêm nha chu, Porphyromonas gingivalis, nuôi cấy, định danh, Maldi-Tof ABSTRACT ISOLATION AND IDENTIFICATION OF PORPHYROMONAS GINGIVALIS FROM SUB-GINGIVAL PLAQUE SAMPLES OF PATIENTS WITH PERIODONTITIS Tran Thi Phuong Thao, Luong Thi My Ngan, Pham Anh Vu Thuy * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 22 - No 5- 2018: 178 – 183 Objective: To isolate and identify Porphyromonas gingivalis from subgingival plaques samples of patients with periodontitis Methods: Subgingival plaque samples were collected from patients with moderate to severe chronic periodontitis, and anaerobic culture was performed. Porphyromonas gingivalis were identified by using Maldi-Tof and confirmed by PCR. Results: Porphyromonas gingivalis was successfully isolated from sub-gingival plaque of 21th patient. It grew anaerobically on media containing lyses blood with dark pigmentation. These 1 - 2mm colonies were rounded, smooth and convex. After identifying by Maldi-Tof, quantitative PCR was performed using species- specific primers. Sequencing result confirmed the positive culture result. Conclusion: Porphyromonas gingivalis is one of the dominant pathogenic bacteria in periodontal pockets of * Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh **Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật và Chuyển hoá sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. *** Bộ môn Nha chu, Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Tác giả liên lạc: PGS. TS. Phạm Anh Vũ Thụy ĐT: 0916 810 874 Email: pavthuy@ump.edu.vn 178 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học patients with chronic periodontitis. Successful isolation of this organism provides virulent strain for periodontal research. Key words: Porphyromonas gingivalis, isolation, identify, Maldi-Tof. ĐẶT VẤN ĐỀ đến nay tại Việt Nam, do đó, mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập vi khuẩn Porphyromonas gingivalis là một trong những Porphyromonas gingivalis từ mảng bám dưới nướu yếu tố nguyên nhân chính trong sinh bệnh học của bệnh nhân viêm nha chu mạn mức độ từ và tiến triển tình trạng viêm của bệnh nha chu. trung bình tới nặng, sử dụng phương pháp Đây là vi khuẩn gram âm, không di động, không Maldi-Tof để định danh, từ đó xác định quy phân giải đường (asaccharolytic). Vi khuẩn kỵ trình và lưu trữ mẫu vi khuẩn cho các nghiên khí này tạo ra một quần thể màu đen trên đĩa cứu liên quan trong tương lai. thạch máu và đòi hỏi bắt buộc phải có sắt để phát triển. Porphyromonas gingivalis được cho là PHƯƠNGPHÁP-VẬTLIỆUNGHIÊNCỨU sản xuất các yếu tố độc lực có thể xuyên qua Đối tượng nghiên cứu nướu và gây phá huỷ mô trực tiếp hay gián tiếp, Bệnh nhân viêm nha chu mạn mức độ từ thông qua quá trình viêm. Các yếu tố độc lực của trung bình tới nặng theo tiêu chuẩn phân loại Porphyromonas gingivalis bao gồm nhung mao, của Hiệp hội nha chu Hoa Kỳ năm 2015(2) đến hemagglutinin, vỏ nang, lipopolysaccharide, các khám và điều trị tại Khoa Răng Hàm Mặt, Đại túi màng ngoài, và các hoạt động enzyme hoá(1). học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Các đối tượng Nếu việc phát hiện và định lượng vi khuẩn không sử dụng thuốc kháng sinh, kháng viêm, Porphyromonas gingivalis đã dần được thay thế thuốc tránh thai trước khi tham gia nghiên cứu 6 bằng các phương pháp hiện đại như PCR - tháng và không có thói quen hút thuốc lá. Thu không đòi hỏi tế bào sống nhưng có khả năng thập mẫu mảng bám cho tới khi nuôi cấy xuất nhận biết nhiều loại vi khuẩn bệnh nguyên khác hiện khuẩn lạc Porphyromonas gingivalis. nhau, thì nuôi cấy vi khuẩn vẫn giữ vai trò thiết Quy trình thực hiện yếu trong việc cung cấp nguồn vi khuẩn để thực hiện các nghiên cứu so sánh tỉ lệ vi khuẩn ở mẫu Chuẩn bị môi trường vận chuyển và nuôi bệnh nhân viêm nha chu so với bệnh nhân khoẻ cấy: 2ml Wilkins Chalgren Anaerobic broth base mạnh(13), các thử nghiệm về đặc điểm miễn dịch (Hime – dia - M863) vào ống ly tâm eppendorf. và tính chất enzyme(5), về phương pháp nuôi Bổ sung 5% thạch máu cừu và đổ 15ml môi cấy(6) hay hoạt chất điều trị(14). Các nghiên cứu trường vào đĩa petri. này đòi hỏi vi khuẩn sống và trao đổi chất, từ đó Lấy mẫu thể hiện đặc tính sinh học tương ứng với mục Quy trình lấy mẫu được thực hiện theo đích thử nghiệm, do đó, việc giữ vi khuẩn sinh phương pháp của Doan Nguyen và cs(6): giấy vô trưởng và phát triển trong môi trường thích hợp trùng đưa vào các túi nha chu từ 5mm trở lên, là cần thiết. giữ trong 30s, và chuyển vào các ống eppendorf Porphyromonas gingivalis có vai trò quan chứa môi trường vận chuyển, đưa vào túi chứa trọng trong sinh bệnh học của viêm nha chu và gói hút oxy và chuyển nhanh tới phòng thí vi khuẩn nuôi cấy trực tiếp từ bệnh nhân viêm nghiệm cấy mẫu. nha chu cũng được cho có độc lực mạnh hơn và Nuôi cấy có giá trị trong các thử nghiệm in vitro so với Vortex mẫu trong 45s, phần huyền phù vi chủng vi khuẩn sẵn có từ phòng thí nghiệm(15). khuẩn được pha loãng bậc 10 trong dung dịch Trong khi việc phân lập và định danh vi khuẩn vận chuyển, sử dụng que trải cấy dung dịch mẫu này chưa được thực hiện thành công từ trước vào đĩa thạch. Sau khi ủ ở 37oC từ 7 - 10 ngày, 179 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 khuẩn lạc có kiểu hình và màu sắc đặc trưng trình tự với đoạn mồi đặc hiệu bằng kỹ thuật được cấy chuyền, làm thuần, định danh bằng PCR để khẳng định kết quả. Cuối cùng, chủng vi phương pháp Maldi-Tof. Sau khi xác định chủng khuẩn được lưu trữ trong môi trường chứa Porphyromonas gingivalis, mẫu khuẩn lạc được glycerol ở điều kiện âm sâu. giữ trong dung dịch TE (Tris-EDTA) và gửi giải Hình 1. Quy trình nuôi cấy vi khuẩn Porphyromonas gingivalis 180 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ khuẩn lạc được gửi định danh bằng phương pháp Maldi-Tof. Kết quả hiển thị vi khuẩn Mẫu mảng bám sau khi ủ xuất hiện khuẩn Porphyromonas gingivalis cần tìm. Mẫu sau đó lạc có nghi ngờ sự hiện diện vi khuẩn được gửi giải trình tự với PCR với đoạn mồi đặc Porphyromonas gingivalis của bệnh nhân thứ 21. hiệu. So sánh kết quả với ngân hàng gen khẳng Khuẩn lạc có hình tròn, màu đen bóng, dạng lồi, định chủng Porphyromonas gingivalis. tiêu huyết β, kích thước khoảng 1 - 2mm, kết quả nhuộm gram màu đỏ. Sau khi làm thuần, mẫu Hình 2. Hệ vi khuẩn nuôi cấy từ mẫu mảng bám Hình 3. Khuẩn lạc màu đen, tròn láng, thể lồi trên sau 10 ngày đĩa thạch máu sau khi làm thuần AAAAGTACTCTTCGGCTCTATGTAGGTGCTGCATGG TTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCGGCTTAAG TGCCATAACGAGCGCAACCCACATCGGTAGTTGCTA ACAGTTTTCGCTGAGGACTCTACCGAGACTGCCGTC GTAAGGCGTGAGGAAGGTGGGGATGACGTACCC (177) Hình 4. Kết quả định danh vi khuẩn Porphyromonas Hình 5. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp PCR. gingivalis bằng phương pháp Maldi-Tof. 181 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 BÀN LUẬN Porphyromonas gingivalis trên môi trường thạch máu. Viêm nha chu là bệnh lý viêm mạn tính, đa Khả năng xâm chiếm và tăng sinh của bệnh yếu tố dẫn tới sự phá huỷ mô nâng đỡ răng và nguyên trong một môi trường vật chủ đặc biệt là là nguyên nhân chính của hiện tượng mất điều kiện tiên quyết cho quá trình nhiễm khuẩn. răng. Các tổn thương viêm nha chu được Sự phát triển này phụ thuộc vào việc lấy được chứng minh liên quan tới hệ vi khuẩn dưới những dưỡng chất thiết yếu, mà trong đó, sắt nướu, chứa chủ yếu các loài vi khuẩn gram đóng vai trò quan trọng cho sự hình thành và âm, trong đó vi khuẩn màu đen Porphyromonas tiến triển của nhiễm khuẩn. Ở vật chủ là người, gingivalis được cho là bệnh nguyên chính(8). Để phần lớn sắt có trong tế bào, và ở dưới dạng phân tích các vi khuẩn trong các túi nha chu hemoglobin, protein hemin hay ferritin. Một đặc hiệu, mảng bám dưới nướu hoặc mẫu dịch lượng nhỏ sắt ngoại bào thường kết hợp với các nướu là phù hợp nhất(16). Một trong những protein vận chuyển như transferrin trong huyết cách thu thập mảng bám dưới nướu là dung thanh và lactoferrin trên bề mặt niêm mạc. Do sự một côn giấy vô khuẩn đưa vào túi nha chu. phong phú của chất này trong cơ thể vật chủ, các Nhiều nghiên cứu sử dụng các dung dịch vận hoạt chất chứa heme là một nguồn sắt quan chuyển và nuôi cấy mẫu khác nhau. Do tính trọng cho quá trình xâm nhiễm của vi sinh vật. chất cần sắt để phát triển, môi trường nuôi cấy Các bệnh nguyên sống nội bào có thể sử dụng cần có hemin và menadione để hỗ trợ việc heme trực tiếp. Tuy nhiên, đối với các vi khuẩn phân lập Porphyromonas gingivalis. Nuôi cấy bệnh nguyên ngoại bào, heme phải được giải không chọn lọc được cho là phương pháp hiệu phóng khỏi tế bào, điều này gây ra các dạng tổn quả nhất để bộc lộ tất cả các thành phần bệnh thương mô điển hình khi có hoạt động giải nguyên chính của hệ vi khuẩn nha chu, nhằm phóng vật liệu nội bào xảy ra. Heme và nhận biết sự hiện diện của các bệnh nguyên hemoglonin bị ràng buộc bởi protein huyết nha chu ít gặp, và xác định độ nhạy kháng tương, haptoglobin và hemopexin. Các vi sinh khuẩn của các bệnh nguyên này. Do vật phải thực hiện cơ chế để loại bỏ phần tử Porphyromonas gingivalis là một vi khuẩn kỵ heme hoặc sắt vô cơ ra các protein gắn sắt của khí bắt buộc, nên quá trình nuôi cấy phân lập vật chủ. Khả năng sử dụng hemin và các hợp loại vi khuẩn này đòi hỏi tiêu chuẩn khắt khe chất chứa hemin để tạo ra dưỡng chất sắt đã trong việc duy trì môi trường không có oxy. được ghi nhận ở nhiều vi khuẩn gây bệnh, bao Hệ thống bình chứa cùng túi tạo môi trường gồm Porphyromonas gingivalis(10).Theo Gibbons và kỵ khí là phương pháp nuôi cấy kỵ khí phổ cs(7), sự phát triển của vi khuẩn tỉ lệ với nồng độ biến nhất trong các phòng thí nghiệm lâm hemin từ 0,05 tới 1,0 ug/ml môi trường, đồng sàng(6). So với các vi khuẩn hiếu khí, các vi thời họ cũng khẳng định vai trò của vitamin K khuẩn kỵ khí bắt buộc như Porphyromonas hay menadion trong việc hỗ trợ sự sinh trưởng gingivalis đòi hỏi thời gian nuôi cấy dài, và của các chủng vi khuẩn kị khí. Đó là lý do vì sao môi trường nuôi cấy không có oxy ở nhiệt độ hemin và menadion có mặt hầu hết trong các tối ưu (35 - 37oC). Các chủng vi khuẩn có sẵn loại môi trường nuôi cấy Porphyromonas từ phòng thí nghiệm rút ngắn thời gian nuôi gingivalis. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử cấy, thay đổi từ 2 - 4 ngày, nhưng đối với các dụng môi trường Wilkins Chalgren Anaerobic mẫu mảng bám/dịch nướu, thời gian để nuôi Broth Base, ngoài việc là môi trường giàu dinh cấy vi khuẩn Porphyromonas gingivalis thay đổi dưỡng với các thành phần như cao nấm men, từ 5 - 7 ngày(6), 14 ngày(3) cho tới 3 tuần(13). peptone, L-arginine, casein và các muối, hemin Nghiên cứu của chúng tôi cần thời gian từ 7 - và menadione cũng được bổ sung với nồng độ 10 ngày để quan sát sự xuất hiện của 182 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học lần lượt là 0,005 và 0,0005g/l. Do thiếu chuyển đổi thông tin dưới dạng phổ. Công nghệ superoxide dismutase và catalase, Porphyromonas khối phổ giúp định danh vi khuẩn chính xác và gingivalis bắt buộc không có mặt oxy để phát thời gian đưa ra kết quả nhanh, bảo quản kết quả triển, do đó, sử dụng các hệ thống kỵ khí, như và chia sẻ thông tin kỹ thuật số dễ dàng hơn. Đối GasPak đã đề xuất nhằm hỗ trợ việc sinh trưởng với Porphyromonas gingivalis, theo tác giả Rams của các vi khuẩn này(6). Trong nghiên cứu này, và cs(11), việc định danh nhanh chóng kiểu hình chúng tôi sử dụng bình GasPak (Merk) và túi tạo của vi khuẩn này trong mẫu mảng bám dưới môi trường kỵ khí AnaeroPack (Mitsubishi Gas nướu chính xác 100% với kỹ thuật Maldi-Tof. Sở Chemical Co-Japan) và ủ ở nhiệt độ 37oC. Tuy dĩ chúng tôi lựa chọn Maldi-Tof là phương pháp nhiên, đến mẫu bệnh nhân thứ 21, khuẩn lạc định danh vi khuẩn nuôi cấy vì đây là phương Porphyromonas gingivalis mới xuất hiện. Điều này pháp dựa trên proteomic nhanh, tin cậy và có giá liên quan tới tỉ lệ Porphyromonas gingivalis có thành hợp lý. Trong bài tổng quan của tác giả trong mẫu mảng bám dưới nướu và khả năng Clark và cs(4), phương pháp Maldi-Tof có tầm sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy(9). quan trọng đặc biệt đối với việc xác định thông Để xác định vi khuẩn Porphyromonas thường các mầm bệnh cần thời gian ủ lâu dài để gingivalis, bên cạnh việc dựa trên hình dáng và phân lập và không hoạt hóa sinh học như các vi màu sắc đặc trưng của quần thể, người ta tiến khuẩn kỵ khí và khẳng định rằng, thông qua hành nhuộm gram, phân tích sinh hoá, và sử việc sử dụng Maldi-Tof MS, các chủng dụng các phương pháp hiện đại hơn như PCR, Porphyromonas có thể được phân biệt. Không Maldi-Tof. Phương pháp sinh hoá đòi hỏi các thử những thế, bên cạnh độ chính xác lên tới 97% nghiệm trên môi trường nuôi cấy lỏng, do đó đối cho 227 chủng và 9 loài Bacteroides, 84 dòng vi với một số vi khuẩn có khả năng sinh trưởng khuẩn kỵ khí trong khoang miệng cũng được thấp như Porphyromonas gingivalis có thể cho kết phân tích trong một nghiên cứu được thiết kế để quả không chính xác. Bên cạnh đó, thời gian ủ tinh giản việc xác định các vi khuẩn từ bệnh kéo dài để có thể đọc được kết quả cũng là một nhân mắc bệnh lý nha chu. Công nghệ này có bất lợi của phương pháp này(12). Maldi (Matrix- thể phân biệt giữa hai loài Prevotella là Prevotella assisted laser desorption ionization) là phương intermedia và Prevotella nigrescens, một công việc pháp ion hóa mẫu hấp thụ dựa trên sự hỗ trợ tốn kém và tốn thời gian khi phân tích gen16S của các chất nền và năng lượng laser. Nguồn rRNA. Tuy nhiên, qua các kết quả thu được, các Maldi sử dụng các chất nền hỗ trợ để ion hóa tác giả đã kết luận rằng việc mở rộng và tối ưu mẫu dưới tác dụng của năng lượng laser lớn. hoá cơ sở dữ liệu là cần thiết. Trong nghiên cứu Mẫu xét nghiệm được tinh sạch bằng nhiều này, chúng tôi gửi mẫu vi khuẩn phân tích với phương pháp, sau đó trộn với chất nền chứa các hệ thống Bruker BioTyper và nhận các giá trị log phân tử hữu cơ nhỏ có khả năng hấp thụ năng là 1,954; 2,139; 2,17 và 2,154. Theo hướng dẫn của lượng ánh sáng ở những bước sóng nhất định, ở hệ thống, giá trị log (điểm) ≥ 2,00 có thể được coi đây có thể là axit yếu như sinapinic. Chuyển hỗn là một xác suất tốt để nhận dạng vi khuẩn thử hợp này lên khay và làm bay hơi, tạo ra các hạt nghiệm ở cấp độ loài. tinh thể bám với peptid. Nhờ nguồn laser năng KẾT LUẬN lượng cực lớn chiếu vào, các chất nền sẽ hấp thu Porphyromonas gingivalis là vi khuẩn có vai năng lượng và bật ra các ion. Các ion có thể tích trò quan trọng trong sinh bệnh học của bệnh điện dương hay âm tuỳ vào bản chất. Các lý nha chu và tồn tại trong nhiều bệnh lý toàn protein và peptid tích điện dương trong khi các thân khác. Nuôi cấy thành công vi khuẩn oligonucleotid và saccaride tích điện âm. Thời Porphyromonas gingivalis từ mảng bám dưới gian bay của ion (Time of flight) được đo và 183 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 nướu của bệnh nhân viêm nha chu trong 8. Hajishengallis G, Darveau RP, Curtis MA (2012), “The keystone- pathogen hypothesis”. Nature Reviews Microbi- ology; 10: 717– nghiên cứu này là phương pháp không xâm 725. lấn, kết hợp với sự hỗ trợ định danh bằng 9. Hajishengallis G, Liang S, Payne MA, Hashim A, Jotwani R, Eskan MA et al (2011), “Low-abundance biofilm species Maldi-Tof tạo nguồn vi khuẩn có độc lực phục orchestrates inflammatory periodontal disease through the vụ cho các thí nghiệm nghiên cứu khác nhau commensal microbiota and complement”. Cell Host Microbe; 10: trong tương lai tại Việt Nam. 497– 506. 10. Otto BR, Verweij-van Vught AMJJ, MacLaren DM (1992), TÀI LIỆU THAM KHẢO “Transferrins and heme-compounds as iron sources for pathogenic bacteria”. Boca Raton (FL): CRC Press; 217- 233. 1. Africa C (2012), “The Microbial Aetiology of Periodontal 11. Rams TE, Sautter JD, Getreu A, van Winkelhoff AJ (2016), Diseases” in Periodontal Diseases — A Clinician’s Guide, J. “Phenotypic identification of Porphyromonas gingi- valis Manakil, Ed., chapter 1, InTech. validated with matrix-assisted laser desorption/ionization time- 2. American Academy of Periodontology (2015), “American of-flight mass spectrometry”. Microbial Pathogenesis; 94: 112-116. Academy of Periodontology Task Force Report on the Update to 12. Slots, J, and HS Reynolds (1982), “Long-wave UV light the 1999 Classification of Periodontal Diseases and Conditions”. fluorescence for identification of black-pigmented Bac- teroides Journal of Periodontology; 86(7): 835-838. spp”. Journal of Clinical Microbiology; 16: 1148-1151. 3. Boutaga K, van Winkelhoff AJ, Vandenbroucke-Grauls CMJE, 13. Van Winkelhoff AJ, Loos BG, Van der Reijden WA, Van der Savelkoul PHM (2003), “Comparison of Real- Time PCR and Velden U (2002), “Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus Culture for Detection of Porphyromonas gingivalis in Subgingival and other putative periodontal pathogens in subjects with and Plaque Samples”. Journal of Clinical Microbiology; 41(11): 4950– without periodontal destruction”. Journal of Clinical 4954.. 4. Clark AE, Kaleta EJ, Arora A, Wolk DM (2013), “Matrix- Periodontology; 29: 1023–1028. Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass 14. Wright TL, Ellen RP, Lacroix JM et al (1997). Effects of Spectrometry: a Fundamental Shift in the Routine Practice of metronidazole on Porphyromonas gingivalis biofilms. Journal of Clinical Microbiology”. Clinical Microbiology Reviews; 26(3): 547– Periodontal Research; 32: 473–477. 603. 15. Yang LC, Hu SW, Yan M, Yang JJ, Tsou SH, Lin YY (2015), 5. Darveau RP, Belton CM, Reife RA, Lamont RJ (1998), “Local “Antimicrobial activity of platelet-rich plasma and other plasma Chemokine Paralysis, a Novel Pathogenic Mecha- nism for preparations against periodontal pathogens”. Journal of Porphyromonas gingivalis". Infection and Immunity; 66(4): 1660– Periodontology; 86: 310–318. 1665. 16. Yoshida A, Ansai T (2012), “Microbiological diagnosis for 6. Doan N, Contreras A, Flynn J, Morrison J, Slots J (1999), periodontal disease” in Periodontal Diseases—A Clinician’s “Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering Guide, J. Manakil, Ed., chapter 2, InTech. periodontal pathogenic bacteria”. Journal of Clinical Microbiology; 37: 171-174. Ngày nhận bài báo: 10/06/2018 7. Gibbons RJ, Macdonald JB (1960), “Hemin and vitamin K compounds as required factors for the cultivation of certain Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/06/2018 strains of Bacteroides melaninogenicus”. Journal of Bacteriology; Ngày bài báo được đăng: 20/09/2018 80(2):164–170. 184