PCR lý thuyết

Chia sẻ: Nguyen Lan | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:49

Thêm vào BST

Báo xấu

103
lượt xem 19
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kary Mullis mô tả 1983 (Cetus Corporation) 1985: Xuất hiện trên tạp chí “Science” Đạt Nobel Prize hóa học 1993 Polymerase Chain Reaction (PCR) là phản ứng khuếch đại một đoạn ADN bằng enzym polymerase, thực hiện trong ống nghiệm, có độ nhạy rất cao.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: PCR lý thuyết

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG TS. BS Đỗ Thị Thanh Thủy
MỤC TIÊU BÀI GIẢNG 1. Trình bày được nguyên tắc PCR 2. Trình bày được cách chống ngoại nhiễm trong PCR 3. Trình bày được ứng dụng của PCR
PCR POLYMERASE CHAIN REACTION  Kary Mullis mô tả 1983 (Cetus Corporation)  1985: Xuất hiện trên tạp chí “Science”  Đạt Nobel Prize hóa học 1993  Polymerase Chain Reaction (PCR) là phản ứng khuếch đại một đoạn ADN bằng enzym polymerase, thực hiện trong ống nghiệm, có độ nhạy rất cao.
PCR POLYMERASE CHAIN REACTION
PCR NGUYÊN TẮC PHẢN ỨNG Amplicon 35-40 chu kì nhiệt Số copies = 2n.y n: Số cycle y: số copies ban đầu
PCR POLYMERASE CHAIN REACTION 100 Denaturation 90 Biến tính 80 92-96oC Extension Lập lại ≥ 30 lần Temperature (° C) 70 (chu kỳ) 60 Kéo dài 72oC 50 40 Annealing 30 Bắt cặp 45-55oC 20 10 1 2 3 4 5 6 Time (minutes)
GĐ BIẾN TÍNH (92-96oC) 5’ 3’ DNA đích 3’ 5’ 95oC 5’ 3’ 3’ 5’
GĐ BẮT CẶP (45-55oC) A B ~55oC Primers 5’ 3’ B 5’ 5’ A 3’ 5’
GĐ KÉO DÀI (72oC) 72oC 5’ 3’ Taq polymerase 5’ 5’ 3’ 5’ 72oC 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Cycle 1
MỘT CHU KỲ NHIỆT Giai đoạn biến tính (92-96oC) Giai đoạn bắt cặp (45-55oC) Giai đoạn kéo dài (72oC)
PCR POLYMERASE CHAIN REACTION
ĐỘNG HỌC CỦA PCR
THÀNH PHẦN TRONG PCR 5’ 3’ DNA đích 3’ 5’ A B Nucleotide tự do primers Mg2+ Mg 2+ Dd đệm chứa Mg2+ Taq DNA Mg 2+ Mg2+ magnesium Mg 2+ polymerase
NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR 1. DNA đích (đoạn DNA quan tâm) Từ máu, chất tiết (đàm, dịch màng phổi, dịch khớp…, tóc, phết niêm mạc má, phết cổ tử cung…), [C] ≤ 1 µg (0,1-1 µg) Đoạn DNA 1kb đến 10kb (thường
Tm=11x2+9x4=58oC 5’ATTCCGATCGCTAATCGATG3’ 5’ATTCCGATCGCTAATCGATGGC TCCTGTGCA TTTCGCCACTAGAG3’ 3’TAAGGCTAGCGATTAGCTACCG AGGACACGTAAAGCGGTGATCTC5’ 3’CACGTAAAGCGGTGATCTC5’ Tm=9x2+10x4=58oC
NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR 3. DNA polymerase: enzym chịu nhiệt, xúc tác tổng hợp sợi DNA mới, kỹ thuật đơn giản, đặc hiệu. [C]: 1-2.5 units Nhiều loại men chịu nhiệt, tùy mục đích - Ly trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt: Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus thermophilus (rTth), Thermus lithoralis (Vent)… - Tổng hợp bằng công nghệ tái tổ hợp như Ampli Taq, Vent (exo). - Tổng hợp men polymerase chịu nhiệt có hoạt tính sửa sai (proofreading) khi tổng hợp chuỗi nucleic acid bổ sung (3-5 exonuclease) như Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu.
NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR 4. dNTP (deoxy ribonucleotid): dATP, dGTP, dCTP, dTTP [C]: 20-200µM 5. Ion Mg++ - cofactor của enzyme MgCl2: 1.5 mM (0.75-4 mM) 6. Dung dịch đệm pH 8.3-8.8
THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR 1. Máy luân nhiệt (THERMOCYCLER) (I) Thổi liên tục những luồng khí nóng sinh ra từ một đèn phát nhiệt vào buồng ủ, hay luồng khí lạnh sinh ra từ một dàn lạnh của máy làm lạnh (LightCycler – Roche).
THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR (II) Dựa theo hiệu ứng Peltier ngược. Hai thanh kim loại nối với hai cực của nguồn điện và được điều chỉnh tự động để chiều dòng điện đi qua có thể thay đổi: bên này nóng, bên kia lạnh. Khi thay đổi chiều dòng điện thì nhiệt độ của hai thanh cũng thay đổi ngược lại: bên này lạnh, bên kia nóng