Phát hiện đột biến gen ATP7B trên gia đình bệnh nhân Wilson

TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN ATP7B<br /> TRÊN GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN WILSON<br /> Phan Tôn Hoàng, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn, Lê Văn Hưng<br /> Nguyễn Ngọc Hùng, Nguyễn Đức Hinh, Trần Vân Khánh<br /> Trư ng h YH N<br /> <br /> n nh tr n n tr n nh th thư ng g n n t n g n TP nn tr n<br /> tr ng tr ng tr nh h tr nh h th h n h th tr ng tr ng ơ th Ngh n ư th h n<br /> ụ t h th n t n g n TP tr n nh nh n ư h n n nh n tr ng ng tg<br /> nh n TP ư h h ng 21 h h 21 n g n n h PC ư g tr nh<br /> t g n nh t n t h th nh nh n ư h th n 2 t n ng h t tr n<br /> g n TP g n 4 -4 C C tr n n1 45 tr n n<br /> <br /> Từ khóa: gen ATP7B, bệnh Wilson, đột biến gen<br /> <br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ chứng lâm sàng của gan, não, vòng Kayser - Fleischer<br /> ở mắt và các xét nghiệm hóa sinh trong máu (nồng độ<br /> Bệnh Wilson hay bệnh rối loạn chuyển hóa đồng, là đồng trong nước tiểu 24 giờ, hàm lượng ceruloplasmin<br /> một bệnh lý liên quan đến tổn thương gen. Đây là bệnh huyết thanh, nồng độ đồng trong gan) [6]. Đột biến điểm<br /> di truyền lặn trên nhiễm sắc thể (NST) thường, đồng là đột biến thường gặp trên gen ATP7B và chủ yếu sử<br /> tích tụ ở một số cơ quan trong cơ thể, đặc biệt là gan dụng kỹ thuật giải trình tự gen để phát hiện đột biến, tuy<br /> và não, gây nhiều biến chứng. Trên thế giới, tần suất nhiên do đột biến nằm rải rác khắp chiều dài gen ATP7B<br /> mắc bệnh dao động trong khoảng 1/30.000 ÷ 1/100.000 nên cần phải giải trình tự toàn bộ gen ATP7B với 21<br /> người [1]. Ở Việt Nam, các nghiên cứu lâm sàng chủ exon mới phát hiện được đột biến nên khá tốn kém và<br /> yếu tập trung vào đặc điểm lâm sàng [2]. Năm 2010, mất thời gian. Các nghiên cứu ở mức độ sinh học phân<br /> lần đầu tiên chúng tôi phát hiện hai trường hợp bệnh tử là cần thiết đề xác định chính xác các đột biến gây<br /> nhân có đột biến gen Arg778Leu [3]. Các nghiên cứu bệnh giúp cho công tác điều trị và xác định người lành<br /> sau đó là xác định đột biến ở một số vùng đột biến mang gen bệnh để có những tư vấn di truyền thích hợp.<br /> trọng điểm và hoàn thiện quy trình xác định đột biến gen Bởi vậy đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu: Phát hiện<br /> ATP7B. Năm 2011,trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân được chẩn đoán<br /> thuộc trường Đại học Y Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu mắc bệnh Wilson.<br /> phát hiện đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson [4; 5].<br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> Về sinh bệnh học phân tử, nguyên nhân gây bệnh<br /> Wilson là do thiếu hụt enzym ATPase typ P (P - ATPase),<br /> 1. Đối tượng<br /> được mã hóa bởi gen ATP7B trên NST 13q14.3. Enzym<br /> P - ATPase đóng vai trò vận chuyển đồng qua màng tế Nhóm bệnh: 7 bệnh nhân trong một gia đình, được<br /> bào. Sự thiếu hụt hoặc giảm hoạt tính của enzym dẫn chẩn đoán mắc bệnh Wilson dựa vào triệu chứng lâm<br /> đến giảm sự bài tiết đồng từ tế bào gan vào mật và gây sàng và xét nghiệm hóa sinh máu.<br /> ứ đọng đồng tại gan. Khi lượng đồng trong gan tăng Nhóm chứng: 1 người bình thường, tiền sử gia đình<br /> quá mức, đồng sẽ theo hệ thống tuần hoàn tới các cơ không có người mắc bệnh di truyền.<br /> quan như: não, mắt, thận và gây các tổn thương cho 2. Phương pháp<br /> các cơ quan này. 2.1. Quy trình lấy mẫu: Bệnh nhân sẽ được lấy 2ml<br /> Chẩn đoán bệnh Wilson có thể dựa trên các triệu máu tĩnh mạch chống đông trong EDTA. Quy trình đảm<br /> bảo tuyệt đối vô trùng.<br /> h n h Tr n H Th nh nH nh trư ng 2.2. Quy trình tách chiết DNA tổng số: Quy trình<br /> h YH N tách chiết DNA tổng số được tiến hành theo quy trình<br /> h th nh h phenol/chloroform. Nồng độ và độ tinh sạch DNA được<br /> Ng nh n 24 2014 kiểm tra nhờ phương pháp quang phổ (OD 260/280).<br /> Ng h th n 1 11 2014<br /> <br /> 30<br />  TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> 2.3. Quy trình giải trình tự gen xác định đột biến phần mềm ABI PRISM TM 3100 – Avant Data Collection,<br /> + Kỹ thuật PCR: Toàn bộ 21 exon của gen ATP7B DNA Sequencing Analysis 5.2 và BLAST NCBI.<br /> được khuếch đại với các cặp mồi đặc hiệu. 3. Đạo đức nghiên cứu<br /> Quy trình của phản ứng PCR có thể tích là 20μl chứa các Bệnh nhân và người nhà hoàn toàn tự nguyện tham<br /> thành phần: 20ng cDNA, 50ng mỗi primer, 200μmol/L gia vào nghiên cứu và có quyền rút lui khỏi nghiên cứu<br /> dNTPs, 2 đơn vị enzym Taq polymerase (do hãng khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu.<br /> Qiagen cung cấp), và 2μL GeneAmp 10xBuffer (gồm Bệnh nhân và người nhà bệnh nhân sẽ được thông báo<br /> 10mmol/L Tris- HCl μl 10 X buffer, pH 8,2 và 50 mmol/L về kết quả xét nghiệm gen để giúp cho các bác sỹ tư<br /> KCl). Chu trình nhiệt của phản ứng như sau: Đầu tiên vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp.<br /> là giai đoạn biến tính ở 96°C trong 5 phút, tiếp theo là Các thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật.<br /> 35 chu kỳ gồm biến tính ở 96°C trong 1 phút; gắn mồi<br /> ở 60°C trong 1 phút và bước kéo dài 72°C trong 3 phút, III. KẾT QUẢ<br /> cuối cùng là giai đoạn hoàn chỉnh ở 72°C trong 5 phút<br /> và bảo quản tạm thời sản phẩm PCR ở 4°C. 21 cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để khuyếch đại<br /> + Kỹ thuật giải trình tự gen: sản phẩm PCR được tinh<br /> gen ATP7B trên bệnh nhân mã số W7.00. Kích thước<br /> sạch từ gel sử dụng Kit của QIAGEN. Sản phẩm sau<br /> của các sản phẩm PCR trong khoảng 100÷200 bp. Hình<br /> tinh sạch được giải trình tự trực tiếp trên máy ABI 3100<br /> 1 minh họa sản phẩm PCR exon 3 của gen ATP7B.<br /> Genetic Analyzer. Kết quả được thu thập và xử lý bằng<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Hình ảnh đai diện sản phẩm PCR khuếch đại exon 3 của gen ATP7B.<br /> C: mẫu đối chứng, 1 - 7: mẫu bệnh nhân, MarkerФ174<br /> <br /> Sản phẩm khuếch đại exon 3 thu được là đặc hiệu, rõ nét và đảm bảo cho phản ứng sequencing tiếp theo để<br /> phát hiện đột biến điểm.<br /> Sản phẩm PCR của toàn bộ 21 exon gen ATP7B của bệnh nhân mã số W7.00 được tinh sạch và được tiến<br /> hành giải trình tự gen. Kết quả cho thấy có 2 đột biến điểm dị hợp tử ins47-48CGGCG ở exon 1 và c.1523G>C<br /> (p.Val456Leu)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Hình ảnh giải trình tự gen ATP7B exon 1 và exon 3 của bệnh nhân mã số W7.00<br /> <br /> 31<br /> TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> Chú thích: Mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid và acid amin thay đổi<br /> <br /> Đột biến dị hợp tử thêm 5 nucleotid CGGCG sau vị trí 47 tại exon 1 (NM-000053, GeneBank) làm thay đổi khung<br /> dịch mã. Đây là đột biến mới chưa được công bố tại ngân hàng dữ liệu về bệnh Wilson (wilsondiseas.med.ualberta.<br /> ca). Đột biến dị hợp tử thứ hai là thay thế G > C ở vị trí 1523 (c.1523G > C, NM_000053, GeneBank) tại exon 3 làm<br /> cho bộ ba tại vị trí 456 mã hóa Valine chuyển thành Leucin (p.Val456Leu).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Phả hệ của gia đình bệnh nhân Wilson mã số W7.00<br /> Phả hệ gia đình gồm 5 thế hệ, bệnh nhân được phát hiện đột biến gen ATP7B là thế hệ thứ tư (IV.1). Phả hệ có<br /> 7 người mắc bệnh theo chẩn đoán lâm sàng (III - 1, III - 3, III - 5, II - 8, IV - 1, IV - 3, IV - 4), 15 người bình thường<br /> (I.1, I.2, II.1, II.2, II.3, II.4, III.2, III.4, III.6, III.7, III.9, III.10, IV.2, IV.5, V.1.<br /> <br /> <br /> IV. BÀN LUẬN trường hợp bệnh nhân có đột biến dị hợp tử tức là chỉ<br /> có một alen bị đột biến mất chức năng và alen còn lại<br /> Cho đến nay, khoảng hơn 500 đột biến đã được vẫn có chức năng bình thường, thì thường không ảnh<br /> tìm thấy trên bệnh nhân mắc bệnh Wilson [7; 8]. Mỗi hưởng đến kiểu hình. Tuy nhiên nếu kết hợp 2 đột biến<br /> quốc gia, mỗi chủng tộc người khác nhau có các loại dị hợp tử sẽ tạo ra sự “cộng hưởng” ảnh hưởng tới sự<br /> đột biến khác nhau. Đột biến p.His1069Glu là đột biến hình thành của protein P - ATPase gây nên bệnh lý và<br /> thường gặp nhất trong quần thể nguời da trắng, chiếm là nguyên nhân ảnh hưởng đến nồng độ ceruloplasmin<br /> khoảng 37% đến 63% tổng số đột biến. Trên quần thể huyết thanh.<br /> người Trung Quốc, đột biến p.Arg778Leu chiếm 34 ÷ Đột biến thay thế, p.Val456Leu đã được công bố<br /> 38% tống số đột biến [9; 10]. Protein ATP7B mang đầy là đột biến không gây bệnh (non disease variant). Tuy<br /> đủ các đặc điểm đặc trưng cho một protein thuộc họ nhiên, đột biến này luôn xuất hiện cùng với các đột<br /> protein P - APTase với 5 vùng chức năng chính: Vùng biến khác, đây có thể là yếu tố làm tăng thêm mức độ<br /> MBSs (vị trí bám cho các nguyên tử đồng), vùng N nặng của bệnh, thể hiện qua sự tụt giảm của nồng độ<br /> (vùng bám ATP), vùng P (vùng phosphor hóa), vùng A ceruloplasmin huyết thanh. Đột biến này chỉ xuất hiện<br /> (vùng khử phosphor) và vùng xuyên màng (nằm trên 8 ở bệnh nhân Wilson, không có ở người bình thường,<br /> exon: exon 6 ÷ exon 12 và exon 19, exon 20) [1]. điều đó chứng tỏ đây là một biến dị hay SNP (single<br /> Đột biến thêm nucleotid c.47 - 48insCGGCG nằm nucleotide polymorphism) đặc trưng của quần thể<br /> trên exon 1 của gen ATP7B, đây là vùng nằm ngay người mắc bệnh Wilson [11].<br /> trước vị trí bám của phân tử đồng, đột biến này gây Bệnh nhân Wilson có thể nhận một alen bệnh của<br /> lệch khung dịch mã và tạo ra mã kết thúc sớm dẫn đến người bố hoặc một alen bệnh của người mẹ hoặc cả<br /> protein P - ATPase sẽ không được tổng hợp. Với những hai alen bệnh của người bố hoặc của người mẹ. Bố, mẹ<br /> <br /> 32<br />  TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> của bệnh nhân có thể mang gen đồng hợp lặn hoặc gen nghiệp khoa học cấp Bộ Y tế năm 2012 - 2013 và sự<br /> dị hợp. Các anh chị em của bệnh nhân có thể mang gen giúp đỡ của các nghiên cứu viên tại Trung tâm Nghiên<br /> bệnh hoặc không. Những người mang gen bệnh đều có cứu Gen - Protein, trường Đại học Y Hà Nội.<br /> khả năng di truyền cho con cháu. Một điểm khác biệt<br /> so với nhiều bệnh di truyền khác là người mang gen dị TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> hợp tử cũng biểu hiện bệnh và thường kèm theo dạng<br /> đột biến khác [1; 12]. 1. Bull P, Thomas G R, Forbes J, Rommens J M,<br /> Theo nhận định trên, phả hệ gia đình bệnh nhân<br /> Cox D W (1993). The Wilson disease gene is a putative<br /> Wilson cho thấy: để những người con ở thế hệ IV mắc<br /> copper transporting P-type ATPase similar to the<br /> bệnh, thì chồng của bệnh nhân (III.2, III.4) phải là những<br /> Menkes disease gene. N t r n t 5, 327 - 337.<br /> người mang gen bệnh. Tương tự, cặp vợ chồng ở thế<br /> 2. Lê Đức Hinh (1989 - 1990). Một số đặc điểm bệnh<br /> hệ II(II.2, II.4) phải là những người mang gen bệnh theo<br /> Wilson ở Việt Nam. ng tr nh ngh n h<br /> đúng quy luật Menden. Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu có<br /> h 3, 316 - 334.<br /> một giả thuyết khác để lý giải tính di truyền trong phả hệ<br /> gia đình bệnh nhân số W7.00: đó là dựa vào tính chất 3. Đỗ Thanh Hương, Nguyễn Văn Liệu, Phan Tuấn<br /> của cá thể dị hợp (heterozygous). Khái niệm này đôi khi Nghĩa, Nguyễn Thị Vân Anh (2010). Đột biến gen<br /> đã bị nhầm lẫn với người lành mang gen bệnh (Carrier). R778L ở bệnh nhân Wilson Việt Nam. T h Nh h<br /> Cá thể dị hợp trong y sinh học di truyền là hiện tượng 3, 231 - 235.<br /> ở các alen lặn chứa hai đột biến dị hợp tử, nằm ở vị trí 4. Hồ Cẩm Tú, Tạ Minh Hiếu, Trần Vân Khánh, Tạ<br /> (locus) có khả năng gây bệnh lý di truyền. Ở những cá Thành Văn (2011). Xây dựng quy trình xác định đột<br /> thể này, hai đột biến dị hợp tử của cùng một gen nhưng biến gen ATP7B gây bệnh Wilson. T h Ngh n<br /> thuộc hai alen khác nhau (nghĩa là hai allen cùng mang Yh 74(3), 26 - 29.<br /> đột biến nhưng nằm ở vị trí khác nhau) [13]. Đặc điểm 5. Nguyễn Thị Mai Hương, Ngô Diễm Ngọc, Nguyên<br /> này cho thấy tính đa dạng về di truyền của các bệnh lý Phương Mai, và cộng sự (2013). Xác định đột biến<br /> di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường. Bệnh hình gen ATP7B trên vùng hot-spots ở bệnh nhân Wilson.<br /> thành sau nhiều lần trao đổi chéo – hoán vị gen. T h Yh tN 407(2), 132 - 135.<br /> So với các các thể mang đột biến đồng hợp tử gen 6. Cumings JN (1951), The effects of B.A.L. in<br /> lặn, ở các cá thể dị hợp tử, bệnh xuất hiện muộn hơn hepatolenticular degeneration. r n 74(1), 10 – 22.<br /> và biểu hiện lâm sàng cũng nhẹ hơn. Khái niệm này 7. Peter Ferenci (2006), Regional distribution of<br /> giải thích rõ hơn sự xuất hiện bệnh ở thế hệ thứ III và IV mutations of the ATP7B gene in patients with Wilson<br /> của phả hệ gia đình số W7.00. Các bệnh nhân thế hệ disease: impact on genetic testing, H n t 120,<br /> IV có thể mang gen chứa đồng thời hai đột biến dị hợp 151 - 159.<br /> tử trên cùng một allen (do trao đổi chéo – hoán vị gen)<br /> 8. Aftab Ala, Ann P Walker, Keyoumars Ashkan, et al<br /> được nhận từ người mẹ (thế hệ III). Những người mẹ<br /> (2007). n n t 369, 397 – 408.<br /> này nhận 2 đột biến dị hợp từ người mẹ của mình (thế<br /> hệ II) - là người có thể mang đặc điểm cá thể dị hợp. 9. Danadevil Kuppala, Jie Deng, George J. Brewer,<br /> Điều này cần được kiểm chứng về lâm sàng ở những (2009). Wilson Disease Mutations in the American<br /> người thuộc thế thệ II. Population: Identification of Five Novrl Mutation in<br /> ATP7B, Th nH t g rn 1, 1 - 4.<br /> V. KẾT LUẬN 10. Lei Wan, Chang - Hai Tsai, Yuhsin Tsai (2006).<br /> Mutation analysis of Taiwanese Wilson disease<br /> Nghiên cứu đã phát hiện được 2 dạng đột biến điểm patients. h n h r h<br /> C n t n 345, 734 - 738.<br /> dị hợp tử: ins47 - 48CGGCG trên exon 1 và p.V456L<br /> trên exon 3 ở 7 bệnh nhân Wilson trong một gia đình. 11. Liu HP, Lin WY, Wang WF, Tsai FJ (2013). Genetic<br /> variability in copper-transporting P-type adenosine<br /> Lời cảm ơn triphosphatase (ATP7B) is associated with Alzheimer’s<br /> disease in a Chinese population. g H t<br /> Nghiên cứu được thực hiện tại với sự hỗ trợ kinh g nt 27(2), 319 - 327<br /> phí của đề tài cấp Bộ: Nghiên cứu ứng dụng các kỹ 12. G. Loudianos, V. Dessi, M. Lovicu, A. and A. Cao<br /> thuật sinh học phân tử để xác định đột biến gen ATP7B (1999). Mutation analysis in patients of Mediterranean<br /> gây bệnh Wilson ở Việt Nam, kinh phí từ ngân sách Sự descent with Wilson disease, identification of 19 novel<br /> <br /> <br /> 33<br /> TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> mutations, n t 36(11), 833 – 836. predicts increased iron and erythrocyte indices in<br /> 13. Rossi E, Olynyk JK, Cullen DJ, Powell LW (2000). women, C n Ch tr 46 (2), 162 – 166.<br /> Compound heterozygous hemochromatosis genotype<br /> <br /> <br /> Summary<br /> MUTATION ANALYSIS OF ATP7B GENE IN A FAMILY WITH WILSON DISEASE<br /> Wilson disease is an autosomal recessive disorder of copper metabolism caused by mutations in the ATP7B<br /> gene that encodes a P-type copper transporting ATPase. The aim of this study was to screen and detect mutations<br /> of the ATP7B gene in a family with Wilson disease (n = 7). 21 exon of ATP7B gene was directly sequenced to detect<br /> mutation. The results showed that 7/7 patients had 2 different heterozygous mutations including: ins47_48CGGCG<br /> in exon 1 and p.V456L in exon 3 of ATP7B gene.<br /> <br /> Keywords: Wilson disease, ATP7B gene<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 34<br />