Phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh

Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH VÀ CHẨN ĐOÁN  <br /> TRƯỚC SINH BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH <br /> Nguyễn Thị Băng Sương* <br /> <br /> TÓM TẮT <br /> Mở đầu: Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS – Congentinal Adrenal Hyperplasia, viết tắt là CAH) <br /> là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường. 90‐95% các ca bệnh là do thiếu hụt enzyme 21‐hydroxylase (21‐<br /> OH). Sự thiếu hụt enzyme 21‐OH xảy ra do các đột biến trên gen CYP21A2 mã hóa tổng hợp enzyme steroid <br /> 21‐hydroxylase. <br /> Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong phát hiện người lành mang gen đột biến và chẩn đoán <br /> trước sinh bệnh TSTTBS.  <br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Hai gia đình có con bị đột biến gen CYP21A2. Gia đình 1 phân <br /> tích gen từ mẫu máu của người mẹ và dịch ối thai nhi. Gia đình 2 phân tích gen từ mẫu máu của bố mẹ và mẫu <br /> ối của thai nhi. Sử dụng kỹ thuật giải trình tự và MLPA để xác định tình trạng mang gen bệnh của các đối <br /> tượng nghiên cứu. <br /> Kết  quả:  Gia đình 1 mẹ và thai nhi đều mang đột biến gen dị hợp tử thay thế Arginin bằng Cystein tại <br /> codon 426. Gia đình 2 có bố mang gen đột biến dị hợp tử mất đoạn từ exon 1 đến exon 8; mẹ mang đột biến dị <br /> hợp tử mất đoạn từ exon 1 đến exon 3; thai nhi nam mang đột biến dị hợp tử mất đoạn từ exon 1 đến exon 8.  <br /> Kết luận: Ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự và MLPA để xác định đột biến gen CYP21A2, đây <br /> là cơ sở vững chắc để phòng bệnh bằng chẩn đoán và điều trị trước sinh. <br /> Từ khoá: Bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, đột biến gen CYP21A2, mất đoạn, đột biến điểm, giải trình <br /> tự gen, MLPA. <br /> <br /> ABSTRACT <br /> DETECTION OF CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA MUTANT CARRIER  <br /> AND PRENATAL DIAGNOSIS <br /> Nguyen Thi Bang Suong* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 150 ‐ 156 <br /> Introduction:  Congenital  adrenal  hyperplasia  (CAH)  is  an  autosomal  recessiveinherited  genetic <br /> disorder. The most frequent cause is the deficiency of steroid 21‐hydroxylase (21‐OH) due to mutations in <br /> the CYP21A2 gene.  <br /> Objective: Identify mutations in CYP21A2 gene by sequencing and MLPA technique. <br /> Patients  and  Methods:  Tow  families  with  children  getting  CAH  disease.  We  analysed  DNA  extracted <br /> from blood and amniotic fluid samples of parents and fetus in these two families.  <br /> Results:  Analyzing  mutations  from  mother  and  fetus  of  family  1  revealed  that  they  both  carried  a <br /> heterozygous  of  missense  mutant  R426C  in  exon  10.  Results  from  family  2  showed  that  the  father  carried <br /> heterozygous  deletion  from  exon  1  to  exon  8  of  CYP21A2  gen;  the  mother  carried  heterozygous  deletion  from <br /> exon 1 to exon 3; the male fetus carried homologous deletion form exon 1 to exon 3 and heterozygous deletion <br /> from exon 4 to exon 8.  <br /> Conclusion: Successfully detect carriers and mutants in fetus by sequencing and MLPA techniques.  <br /> Keywords: Congenital adrenal hyperplasia, CYP21A2 mutants, deletions, point mutants, sequencing, MLPA. <br /> * Bộ môn Hóa Sinh, Trung Tâm Y Sinh Học Phân Tử, Khoa Y ‐ Đại học Y Dược TPHCM<br /> Tác giả liên lạc: TS. BS. Nguyễn thị Băng Sương   ĐT: 0914007038, Email: suongnguyenmd@gmail.com <br /> <br /> 150<br /> <br /> Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ <br /> Tăng  sản  thượng  thận  bẩm  sinh  (TSTTBS  – <br /> Congentinal  Adrenal  Hyperplasia,  viết  tắt  là <br /> CAH) hay còn gọi là hội chứng sinh dục‐thượng <br /> thận,  là  bệnh  di  truyền  lặn  trên  nhiễm  sắc  thể <br /> thường,  được  đặc  trưng  bởi  sự  thiếu  hụt  hoạt <br /> động của các enzyme tổng hợp hormone cortisol <br /> từ  cholesteron  của  vỏ  thượng  thận.  Thiếu  hụt <br /> enzyme  21‐hydroxylase  (21‐OH)  là  thể  thường <br /> gặp nhất, chiếm 90‐95% các ca bệnh, với tần suất <br /> khoảng 1:10.000 đến 1:15.000 trẻ sơ sinh(3). Trong <br /> khi đó, khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền <br /> Bệnh  viện  Nhi  Trung  ương  cho  biết  số  lượng <br /> bệnh  nhân  mới  được  chẩn  đoán  tăng  lên  hằng <br /> năm,  trung  bình  40‐70  trẻ  mới  mắc/  năm.  Kết <br /> quả sàng lọc sơ sinh trên 24.459 bé sinh tại Bệnh <br /> viện Từ Dũ – TP. Hồ Chí Minh từ năm 2002 đến <br /> tháng 06/2008 cho thấy tỷ lệ các bé bị TSTTBS là <br /> 1/8153 bé sinh sống(8).  <br /> Sự  thiếu  hụt  hoạt  động  của  enzyme  21‐OH <br /> dẫn đến sự thiếu hụt cortisol và/hoặc thiếu hụt <br /> aldosterone  cũng  như  thừa  androgen  thượng <br /> thận(3). Tùy mức độ thiếu hụt enzyme 21‐OH mà <br /> bệnh biểu hiện trên lâm sàng thành 3 thể: thể cổ <br /> điển  mất  muối  (Salt‐wasting‐SW),  thể  cổ  điển <br /> nam hóa đơn thuần (Simplevirilizing‐SV) và thể <br /> không  cổ  điển  (non‐classic).  Triệu  chứng  lâm <br /> sàng của thể cổ điển tùy thuộc vào mức độ thiếu <br /> hụt hoạt động của enzyme. Nếu enzyme 21‐OH <br /> thiếu hụt không hoàn toàn sẽ dẫn đến biểu hiện <br /> lâm sàng chủ yếu là hội chứng nam hóa thai nữ <br /> và dậy thì sớm ở trẻ trai. Sự thiếu hoàn toàn hay <br /> gần  như  hoàn  toàn  enzyme  21‐OH  dẫn  đến <br /> TSTTBS thể mất muối, có đến ¾ trường hợp thể <br /> mất muối có cơn suy thượng thận cấp vào ngày <br /> 5 đến ngày 14 sau sinh(2).  <br /> Sự  thiếu  hụt  enzyme  21‐OH  xảy  ra  do  các <br /> đột  biến  trên  gen  CYP21A2  mã  hóa  tổng  hợp <br /> enzyme  steroid  21‐hydroxylase.  Trên  90%  các <br /> đột biến này là do sự bắt chéo không đồng đều <br /> giữa  gen  CYP21A2  và  giả  gen  CYP21P(3).  Gen <br /> CYP21A2  và  giả  gen  CYP21P  nằm  trên  nhiễm <br /> sắc  thể  số  6p21.3  trong  phức  hợp  hòa  hợp  mô <br /> chủ  yếu  (Major  human  histocompatibility <br /> <br /> Sản Phụ Khoa<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> complex – HLA) có chiều dài xấp xỉ 30 kb. Mỗi <br /> gen CYP21A2 và CYP21P chứa 10 exons, trình tự <br /> tương đồng giữa hai gen trên các exon là 98% và <br /> trên các intron là 96%(10). Giả gen CYP21P không <br /> có chức năng vì một số đột biến ở vùng tận cùng <br /> 5’  của  gen  làm  cho  quá  trình  phiên  mã  không <br /> được thực hiện. Do tỷ lệ tương đồng trình tự cao <br /> giữa hai gen nên dẫn đến hiện tượng dễ xảy ra <br /> nhiều sai sót trong quá trình trao đổi chéo nhiễm <br /> sắc thể qua phân bào giảm nhiễm, các trình tự ở <br /> vùng  giả  gen  CYP21P  chuyển  sang  gen <br /> CYP21A2 gây nên 95% các đột biến trên gen. 5% <br /> còn  lại  là  do  tự  gen  CYP21A2  bị  đột  biến.  Đến <br /> nay  có  khoảng  hơn  100  kiểu  đột  biến  gen <br /> CYP21A2 đã được phát hiện, trong đó chủ yếu là <br /> các đột biến điểm, còn lại là đột biến xóa đoạn, <br /> thêm đoạn, lặp đoạn và đột biến chuyển đoạn(8). <br /> Kiểu  đột  biến  có  liên  quan  chặt  chẽ  đến  kiểu <br /> hình của bệnh nhân(11). Các đột biến lớn như đột <br /> biến  xóa  đoạn,  chuyển  đoạn  gen  lớn,  đảo  gen <br /> hay đột biến vô nghĩa có thể làm mất hoàn toàn <br /> hoạt  tính  của  enzyme  21‐OH  gây  ra  thể  mất <br /> muối. Các đột biến làm mất một phần hoạt tính <br /> của  enzyme  21‐OH  như  đột  biến  sai  nghĩa <br /> I172N,  P30L,  V281  gặp  ở  thể  bệnh  không  điển <br /> hình. <br /> Việc chẩn đoán sớm trẻ mang gen CYP21A2 <br /> bị đột biến giúp xác định chính xác giới tính và <br /> kiểu  bệnh  của  trẻ.  Điều  này  liên  quan  chặt  chẽ <br /> đến  điều  trị  trước  sinh,  nếu  thai  nhi  bị  bệnh  là <br /> nữ và người mẹ muốn bé được ra đời, thai phụ <br /> sẽ được chỉ định sử dụng dexamethason để trẻ <br /> sinh ra có bộ phận sinh dục bình thường. Ngoài <br /> ra, việc chẩn đoán, sàng lọc sơ sinh còn giúp các <br /> bác sỹ có phác đồ điều trị thích hợp ngay khi bé <br /> ra đời, tránh những biến chứng trên trẻ sơ sinh. <br /> Theo nghiên cứu của các tác giả, việc sàng lọc sơ <br /> sinh chẩn đoán sớm trẻ mắc bệnh TSTTBS có tỷ <br /> số chi phí/lợi ích là 1/3(8). Xuất phát từ thực tiễn <br /> đó, chúng tôi tiến hành đề tài với mục tiêu“Ứng <br /> dụng  kỹ  thuật  sinh  học  phân  tử  trong  phát  hiện <br /> người  lành  mang  gen  đột  biến  và  chẩn  đoán  trước <br /> sinh bệnh TSTTBS”. <br /> <br /> 151<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> Chẩn đoán trước sinh: 02 mẫu dịch ối từ thai <br /> nhi của hai bà mẹ hai gia đình này để tiến hành <br /> chẩn đoán trước sinh.  <br /> <br /> lớn trên gen CYP21A2. Kit gồm 5 probe cho gen <br /> CYP21A2 (Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8); 3 probe cho <br /> gen CYP21A1P (E1P, I2P, E10P); 2 probe cho bổ <br /> thể  C4A  và  C4B;  22  probe  đặc  trưng  cho  gen <br /> người làm đối chứng); 2 probe cho nhiễm sắc thể <br /> X  và  Y.  Sản  phẩm  sau  khuếch  đại  được  phân <br /> tách  đoạn  trên  hệ  thống  điện  di  mao  quản <br /> GenomeLab  GeXP  (Beckman  Coulter).  Kết  quả <br /> sau khi chạy điện di sẽ được phân tích tự động <br /> để tìm đột biến nhờ vào phần mềm GeneMarker <br /> version 1.6 (Softgenetics). <br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu <br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU <br /> <br /> Kỹ thuật tách chiết DNA từ 200 μl máu ngoại <br /> vi và dịch ối thai nhi <br /> ‐ Ly trích DNA từ máu ngoại vi: Tiến hành lấy <br /> 2 ml máu tĩnh mạch của bố và mẹ trong gia đình <br /> có tiền sử con được xác định mắc bệnh TSTTBS. <br /> Máu  tươi  được  chống  đông  bằng  EDTA,  được <br /> tách  DNA  trong  vòng  24  giờ.  Quy  trình  tách <br /> chiết  DNA  từ  200μl  máu  ngoại  vi  được  tiến <br /> hành  theo  bộ  kit  QIAamp  DNA  Blood  mini  kit <br /> (Qiagen).  <br /> <br /> Gia đình bệnh nhân CAH 01 <br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU <br /> Đối tượng nghiên cứu <br /> Chẩn  đoán  người  lành  mang  gen  bệnh:  Bố <br /> mẹ  của  02  gia  đình  cótiền  sử  con  được  chẩn <br /> đoán mắc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, <br /> hai người con này được phân tích gen CYP21A2 <br /> và đã phát hiện được đột biến. <br /> <br /> Phân tích kiểu gen CYP21A2 của mẹ bệnh nhân <br /> Ở gia đình này có người con mắc bệnh tăng <br /> sản thượng thận bẩm sinh và đã được phân tích <br /> gen  CYP21A2,  kết  quả  phân  tích  gen  đã  được <br /> chúng  tôi  công  bố  trong  nghiên  cứu  trước,  cho <br /> thấy bệnh nhân bị đột biến điểm đồng hợp tử tại <br /> vị trí c.1276 C>T. Tiếp tục phân tích kiểu gen của <br /> người mẹ chứng tôi nhận thấy kết quả như sau: <br /> <br /> ‐ Ly trích DNA thai nhi từ mẫu dịch ối: lấy 1 ml <br /> dịch  ối  cho  vào  ống  tube  2  ml,  quay  ly  tâm <br /> 10.000  vòng/phút,  thu  cặn.  Hòa  tan  cặn  trong <br /> 200 nước tinh khiết và tiến hành tách DNA dịch <br /> ối bằng QiAgen Kit tương tự như quy trình tách <br /> mẫu máu ngoại vi.  <br /> <br /> Xác định đột biến điểm của gen CYP21A2 <br /> Sử  dụng  các  cặp  mồi  đặc  hiệu  để  khuếch <br /> đại hai trình tự từ exon 1 đến exon 3 và exon 3 <br /> đến  exon  9  của  gen  CYP21A2.  Sản  phẩm  PCR <br /> được  điện  di  trên  gel  agarose  nồng  độ  1%  để <br /> kiểm  tra  sự  tồn  tại  của  sản  phẩm  khuếch <br /> đại.Sau  đó  tinh  sạch  sản  phẩm  PCR  và  giải <br /> trình  tự  gen  theo  phương  pháp  Sanger  trên <br /> máy  ABI  3500.  Phân  tích  kết  quả,  so  sánh  với <br /> trình  tự  chuẩn  trên  NCBI  để  chẩn  đoán  tình <br /> trạng đột biến của các exon. <br /> Xác  định  đột  biến  mất  đoạn  gen  CYP21A2 <br /> bằng kỹ thuật MLPA <br /> Sử dụng kit MLPA P050 (MRC‐ Holland) để <br /> sàng lọc các đột biến mất đoạn và chuyển đoạn <br /> <br /> 152<br /> <br />  <br /> Hình 1: Kết quả phân tích gen CYP21A2 của mẹ <br /> bệnh nhân CAH 01 <br /> Nhận xét: Hình ảnh giải trình tự cho thấy tại <br /> nucleotid  c.1276  xuất  hiện  sóng  đôi,  1  đỉnh  thể <br /> hiện nucleotid C (giống trình tự của genbank) và <br /> 1  đỉnh  thể  hiện  nucleotid  T  (giống  trình  tự  của <br /> bệnh nhân ‐ là người con trai mắc bệnh của bà). <br /> Điều này chứng tỏ người mẹ của bệnh nhân bị <br /> đột biến dị hợp tử tại vị trí c.1276 C>T. <br /> <br /> Phân tích kiểu gen CYP21A2 của thai nhi  <br /> Mẹ bệnh nhân CAH 01 tiếp tục mang thai và <br /> được  chẩn  đoán  trước  sinh,  kết  quả  phân  tích <br /> kiểu gen thai nhi như sau: <br /> <br /> Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 <br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> kết quả của người mẹ. Điều này chứng tỏ thai nhi <br /> bị đột biến dị hợp tử tại vị trí c.1276 C>T. <br /> <br /> Gia đình bệnh nhân CAH 02 <br /> Đối với gia đình CAH 02, bệnh nhân CAH <br /> 02  bị  đột  biến  mất  đoạn  gen  (hình  3)  nên <br /> chúng tôi tiến hành phản ứng MLPA để phân <br /> tích kiểu gen của các thành viên trong gia đình <br /> bệnh nhân.  <br /> <br />  <br /> Hình 2: Kết quả phân tích gen CYP21A2 ở thai nhi <br /> của gia đình CAH 01 <br /> Nhận  xét:  Hình ảnh giải trình tự cho thấy tại <br /> nucleotid c.1276 xuất hiện sóng đôi tương tự như <br /> <br /> Kết quả phân tích gen của bệnh nhân và bố mẹ <br /> Ex3<br /> <br /> Ex1 Ex6<br /> Ex4<br /> <br /> Ex8<br /> <br /> Bệnh nhân<br /> CAH 02<br /> <br /> Ex3<br /> <br /> Ex1<br /> Ex4<br /> <br /> Ex6<br /> <br /> Ex8<br /> <br /> Bố bệnh<br /> nhân CAH 02<br /> <br /> Ex3<br /> <br /> Ex4<br /> Ex1<br /> <br /> Mẹ bệnh<br /> nhân CAH 02<br /> <br /> Ex6<br /> <br /> Ex8<br /> <br /> Y<br /> <br />  <br /> Hình 3. Kết quả MLPA của bệnh nhân CAH 02 và bố mẹ bệnh nhân <br /> Màu nhạt (bên trái): mẫu đối chứng. Màu đậm (bên phải): mẫu bệnh nhân CAH 02. <br /> <br /> Nhận xét:  <br /> <br /> Sản Phụ Khoa<br /> <br /> ‐ Đối với mẫu bệnh nhân: Tại các đỉnh tương <br /> tứng  với  exon  1  và  exon  3  của  gen  CYP21A2, <br /> mẫu  người  bình  thường  xuất  hiện  đỉnh  nhưng <br /> <br /> 153<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> mẫu bệnh nhân không xuất hiện đỉnh, chứng tỏ <br /> rằng bệnh nhân bị đột biến mất đoạn đồng hợp <br /> tử từ exon 1  đến  exon  3  của  gen  CYP21A2.  Xét <br /> các  đỉnh  của  exon  4,  6,  8,  chiều  cao  đỉnh  của <br /> bệnh  nhân  chỉ  bằng  ½  so  với  mẫu  người  bình <br /> thường,  chứng  tỏ  rằng  bệnh  nhân  bị  đột  biến <br /> mất đoạn dị hợp tử từ exon 4 đến exon 8. <br /> ‐  Đối  với  mẫu  của  người  bố:  Chiều  cao  các <br /> đỉnh của exon 1,3, 4, 6, 8 của người bố chỉ bằng <br /> ½ so với mẫu người bình thường, chứng tỏ rằng <br /> <br /> người bố bị đột biến mất đoạn dị hợp tử từ exon <br /> 1 đến exon 8. <br /> ‐  Đối  với  mẫu  người  mẹ:  Chiều  cao  đỉnh <br /> exon  1  và  exon  3  của  người  mẹ  bằng  ½  so  với <br /> người bình thường, trong khi các đỉnh của exon <br /> 4, 6, 8 bằng với mẫu người bình thường. Chúng <br /> tỏ người mẹ bị đột biến mất đoạn dị hợp tử từ <br /> exon  1‐3.  Tại  đỉnh  tương  ứng  với  NST  Y,  mẫu <br /> người mẹ không xuất hiện đỉnh. <br /> <br /> Kết quả phân tích gen của thai nhi (em của CAH 02) <br /> Ex1<br /> Ex3<br /> <br /> Ex4<br /> Ex6<br /> <br /> Ex8<br /> <br />  <br /> Hình 4: Kết quả phân tích kiểu gen của thai nhi. Màu nhạt (bên trái): mẫu đối chứng. Màu đậm (bên phải): mẫu <br /> bệnh nhân CAH 02. <br /> các  chỉ  tiêu  sinh  hóa  như  tăng  nồng  độ  17CS, <br /> Nhận xét: Chiều cao các đỉnh của exon 1, 3, <br /> progesterone,  kali,  giảm  nồng  độ  17‐OHCS, <br /> 4, 6, 8 của thai nhi chỉ bằng ½ so với mẫu người <br /> FSH,  LH  và  natri(9).  Năm  1998,  lần  đầu  tiên  tại <br /> bình thường, chứng tỏ rằng thai nhi bị đột biến <br /> Việt  Nam  phương  pháp  PCR  được  áp  dụng <br /> mất đoạn dị hợp tử từ exon 1 đến exon 8. <br /> nhằm  xác  định  đột  biến  gen  CYP21A2  trên  43 <br /> BÀN LUẬN  <br /> bệnh  nhân  mắc  bệnh  TSTTBS(11).  Để  xác  định <br /> Ở Việt Nam, trước năm 1998, bệnh TSTTBS <br /> chính  xác  nhất  các  đột  biến  gen  CYP21A2  gây <br /> chủ yếu được chẩn đoán dựa vào các dấu  hiệu <br /> bệnh  TSTTBS,  giải  trình  tự  gen  và  kỹ  thuật <br /> lâm sàng và cận lâm sàng, cùng với xét nghiệm <br /> MLPA là hai tiêu chuẩn vàng nhằm xác định tất <br /> <br /> 154<br /> <br /> Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em <br /> <br />