intTypePromotion=3

Xác định đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 Hydroxylase

Chia sẻ: Văng Thị Bảo Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

0
14
lượt xem
0
download

Xác định đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 Hydroxylase

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Xác định đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 Hydroxylase trình bày Tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt enzym 21- hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường do đột biến gen CYP21A2,... Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Xác định đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 Hydroxylase

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> patients of Mediterranean descent with Wilson<br /> disease, identification of 19 novel mutations , J<br /> Med Genet, 36(11), 833 - 836.<br /> 12. Rossi E, Olynyk JK, Cullen DJ et al<br /> <br /> (2000). Compound heterozygous hemochromatosis genotype predicts increased iron and<br /> erythrocyte indices in women, Clinical Chemistry, 46 (2), 162 - 166.<br /> <br /> Summary<br /> MUTATION ANALYSIS OF ATP7B GENE IN<br /> WILSON DISEASE FAMILY<br /> Wilson disease an autosomal recessive disorder of copper metabolism caused by mutations in<br /> the ATP7B gene that encodes a P-type copper transporting ATPase. The aim of this study was to<br /> screen and detect mutations of the ATP7B gene in a Wilson disease famlily (n = 6). Mutations<br /> were screened and detected by DNA sequencing in 21 exon of ATP7B gene. The results showed<br /> that 6/6 patients had 2 different heterozygous mutations including: ins47_48CGGCG in exon 1<br /> and p.V456L in exon 3 of ATP7B gene.<br /> Keywords:<br /> <br /> XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN VÀ PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH<br /> MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH<br /> THỂ THIẾU 21 - HYDROXYLASE<br /> Ngô Thị Thu Hương1, Trần Vân Khánh1, Nguyễn Viết Tiến2,<br /> Nguyễn Phú Đạt1, Tạ Thành Văn1<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Phụ sản Trung ương<br /> <br /> Tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt enzym 21- hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể<br /> thường do đột biến gen CYP21A2. Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu: (1) xác định đột biến gen<br /> trên bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21- hydroxylase, (2) phát hiện người<br /> lành mang gen bệnh cho các thành viên gia đình có quan hệ huyết thống với bệnh nhân. Nghiên cứu được<br /> tiến hành trên 33 bệnh nhân và 78 thành viên thuộc 33 gia đình của những bệnh nhân tăng sản thượng thận<br /> bẩm sinh; Kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA được sử dụng để xác định đột biến và người lành mang gen<br /> bệnh. Kết quả cho thấy đối với nhóm bệnh nhân, 33/33 (100%) bệnh nhân đã được phát hiện đột biến với 7<br /> dạng đột biến khác nhau, trong đó đột biến 656 A/C > G (IVS2-13A/C > G) chiếm tỉ lệ cao nhất 13/33<br /> (39,5%), tiếp theo là đột biến xóa đoạn chiếm tỉ lệ 7/33 (21,2%); đối với nhóm người lành mang gen bệnh,<br /> 32/33 người bố, 33/33 người mẹ và 5/12 thành viên gia đình khác (anh, chị, em) được xác định là người lành<br /> mang gen bệnh. Kết quả thu được là cơ sở di truyền quan trọng cho chẩn đoán trước sinh và tư vấn di<br /> truyền nhằm làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và có phác đồ điều trị sớm cho các thai nhi ngay từ những tuần đầu.<br /> Từ khóa: tăng sản thượng thận bẩm sinh, đột biến gen CYP21A2, người lành mang gen bệnh<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> 187<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Tăng sản thượng thận bẩm sinh<br /> (congenital adrenal hyperplasia - TSTTBS) thể<br /> thiếu enzym 21 - hydroxylase là bệnh di truyền<br /> lặn trên nhiễm sắc thể số 6. Bệnh gây nên do<br /> đột biến gen CYP21A2 làm rối loạn quá trình<br /> sinh tổng hợp hormon vỏ thượng thận, gây<br /> bệnh cảnh lâm sàng là cơn suy thượng thận<br /> cấp hoặc nam hóa ở trẻ gái, dậy thì sớm giả ở<br /> trẻ trai [1, 2].<br /> Cho đến nay, rất nhiều dạng đột biến đã<br /> được phát hiện như đột biến mất đoạn, đột<br /> biến chuyển đoạn, đột biến lặp đoạn, đột biến<br /> điểm; trong đó đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao<br /> nhất [3]. Bệnh có thể dự phòng bằng phương<br /> pháp tư vấn di truyền như phát hiện người<br /> lành mang gen bệnh, chẩn đoán trước sinh.<br /> Nghiên cứu của Lee và cộng sự ước tính tỷ lệ<br /> người lành mang gen bệnh tăng sản thượng<br /> thận bẩm sinh là 1/83 đối với quần thể người<br /> Trung Quốc [3]. Các báo cáo khác trên thế<br /> giới cho thấy tỷ lệ chung người lành mang gen<br /> bệnh là 1/55 [4, 5]. Ở Việt Nam, khoa Nội tiết<br /> - Chuyển hóa - Di truyền, bệnh viện Nhi Trung<br /> ương là một trong những nơi đang quản lí số<br /> lượng lớn nhất bệnh nhân mắc tăng sản<br /> thượng thận bẩm sinh với khoảng trên 600<br /> bệnh nhân. Tuy nhiên, chưa có một nghiên<br /> cứu nào toàn diện về phát hiện đột biến gen<br /> trên bệnh nhân và phát hiện người lành mang<br /> gen bệnh. Việc phát hiện đột biến và phát hiện<br /> người lành mang gen bệnh sẽ giúp khẳng<br /> định chẩn đoán và cho phép điều trị sớm,<br /> phòng tránh cơn suy thượng thận cấp trong<br /> các trường hợp xét nghiệm về hormon không<br /> Địa chỉ liên hệ: Tạ Thành Văn - Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Số 1 Tôn Thất Tùng, Đống Đa, Hà Nội.<br /> Email: tathanhvan@hmu.edu.vn<br /> Ngày nhận: 04/03/2013<br /> Ngày được chấp thuận: 26/4/2013<br /> <br /> 188<br /> <br /> rõ rang; tư vấn tiền hôn nhân nhằm giảm trẻ<br /> sinh ra bị mắc bệnh và chẩn đoán và điều trị<br /> trước sinh cho thai nhi gái mắc bệnh để phòng<br /> và làm giảm nam hóa chuyển giới gây mơ hồ<br /> giới tính sau sinh. Xuất phát từ ý nghĩa thực<br /> tiễn trên, đề tài được thực hiện với mục tiêu:<br /> (1) xác định đột biến gen trên bệnh nhân tăng<br /> sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21- hydroxylase, (2) phát hiện người lành<br /> mang gen bệnh cho các thành viên gia đình<br /> có quan hệ huyết thống với bệnh nhân.<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 1. Đối tượng<br /> 33 bệnh nhân và 78 thành viên thuộc 33<br /> gia đình của những bệnh nhân tăng sản<br /> thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21hydroxylase bao gồm: bố, mẹ và anh, chị, em<br /> ruột của bệnh nhân. Các bệnh nhân đang được<br /> theo dõi và điều trị tại khoa Nội tiết - Chuyển hóa<br /> - Di truyền bệnh viện Nhi Trung ương.<br /> 2. Phương pháp<br /> 2.1. Kỹ thuật tách chiết DNA<br /> DNA được tách chiết từ bạch cầu máu<br /> ngoại vi theo quy trình phenol/chloroform. Tất<br /> cả mẫu DNA sẽ được tiến hành đo nồng độ và<br /> độ tinh sạch, chỉ có mẫu DNA đạt giá trị OD<br /> 260/280 1.8 - 2 được sử dụng để phân tích<br /> gen [6].<br /> 2.2. Kỹ thuật giải trình tự gen<br /> Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để<br /> khuyếch đại gen CYP21A2. Chu trình nhiệt<br /> phản ứng PCR: 900 - 10 giây, [980 - 10 giây,<br /> 550 - 15 giây, 720 - 2 phút] x 30 chu kỳ.<br /> Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải<br /> trình tự trên máy ABI - 3100 tại trung tâm<br /> nghiên cứu Gen - Protein, trường Đại học Y<br /> Hà Nội. Kết quả được phân tích bằng phần<br /> mềm CLC và so sánh kết quả phân tích gen<br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> của bệnh nhân với kết quả phân tích gen của<br /> các thành viên gia đình.<br /> <br /> của mỗi probe tỷ lệ thuận với số bản copy của<br /> đoạn DNA đích đặc hiệu với probe đó.<br /> <br /> 2.3 Kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation<br /> dependent probe amplification)<br /> <br /> 2.4. Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu<br /> thực hiện theo đúng yêu cầu đạo đức trong<br /> nghiên cứu.<br /> <br /> Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC - Holland)<br /> để phát hiện đột biến xóa đoạn trên bệnh<br /> nhân và người lành mang gen bệnh. Thành<br /> phần của kit gồm các probe để khuyếch đại<br /> gen CYP21A2, mỗi probe tương ứng với một<br /> vùng gen, ngoài ra còn có các probe đặc<br /> trưng cho gen của người cũng được sử dụng<br /> để làm đối chứng và 2 probe cho nhiễm sắc<br /> thể X và Y để xác định giới tính. Sản phẩm<br /> khuếch đại được điện di mao quản trên máy<br /> giải trình tự. Số lượng sản phẩm khuếch đại<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> Bằng kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA,<br /> 33/33 (100%) bệnh nhân đã được phát hiện<br /> có đột biến gen CYP21A2, với 7 dạng đột biến<br /> khác nhau. Đột biến 656 A/C > G (IVS2 - 13A/<br /> C > G) chiếm tỷ lệ cao nhất là 13/33 (39,5%),<br /> tiếp theo là đột biến xóa đoạn chiếm tỷ lệ 7/33<br /> (21,2%), các dạng đột biến còn lại dao động<br /> 3 - 15,3%.<br /> <br /> Bảng 1. Các dạng đột biến gen đã được phát hiện trên bệnh nhân<br /> <br /> STT<br /> <br /> Dạng đột biến<br /> <br /> Thể lâm sàng<br /> <br /> Số bệnh nhân<br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> 13<br /> <br /> 39,5<br /> <br /> Nam hóa đơn thuần<br /> <br /> 1<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> 2<br /> <br /> 6,0<br /> <br /> Nam hóa đơn thuần<br /> <br /> 5<br /> <br /> 15,3<br /> <br /> 1<br /> <br /> 656 A/C > G (IVS2-13A/C > G)<br /> <br /> 2<br /> <br /> I172N/I172N & 656 A/C > G (IVS2<br /> - 13A/C > G)<br /> <br /> 3<br /> <br /> IVS2 - 13A/C > G/R356W<br /> <br /> 4<br /> <br /> I172N/I172N<br /> <br /> 5<br /> <br /> IVS2 - 13A/C> G/R493S<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> 1<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> 6<br /> <br /> R356W/R356W<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> 4<br /> <br /> 12,0<br /> <br /> 7<br /> <br /> Xóa đoạn<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> 7<br /> <br /> 21,2<br /> <br /> 33<br /> <br /> 100<br /> <br /> Tổng số<br /> <br /> - Kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA cũng được sử dụng để phát hiện người lành mang gen<br /> bệnh, kết quả cho thấy 32/33 người bố, 33/33 người mẹ và 5/12 thành viên gia đình (anh, chị,<br /> em) được xác định có đột biến.<br /> - Phân tích phả hệ của 33 gia đình cho thấy cả 33 gia đình đều có con bị bệnh ở cùng 1 thế<br /> hệ, trong đó 28 gia đình có 1 con bị bệnh, 5 gia đình có hai có 2 con bị bệnh (bảng 2).<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> 189<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Bảng 2. Kết quả phát hiện đột biến gen của các thành viên gia đình bệnh nhân<br /> Thành viên<br /> gia đình khác<br /> <br /> Người bố<br /> <br /> Người mẹ<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> Có mang gen đột biến<br /> <br /> 32<br /> <br /> 32/33<br /> <br /> 33<br /> <br /> 33/33<br /> <br /> 5<br /> <br /> 5/12<br /> <br /> Không mang gen đột biến<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1/33<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 7<br /> <br /> 7/12<br /> <br /> 33<br /> <br /> 33/33<br /> <br /> 33<br /> <br /> 33/33<br /> <br /> 12<br /> <br /> 12/12<br /> <br /> Kết quả<br /> <br /> Tổng số<br /> <br /> Hình ảnh minh họa một số dạng đột biến điển hình.<br /> Phả hệ của gia đình mang gen đột biến IVS2 - 13A/C > G<br /> I<br /> <br /> II<br /> III<br /> <br /> Hình 1. Kết quả đột biến 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G) trên gen CYP21A2<br /> Mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid. Hình ảnh giải<br /> trình tự gen theo chiều ngược.<br /> 190<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G), mẹ bệnh nhân có đột<br /> biến dị hợp tử nên là người lành mang gen bệnh, bố bệnh nhân có hình ảnh phân tích gen giống<br /> người bình thường nên không mang gen bệnh.<br /> Phả hệ của gia đình mang đột biến xóa đoạn.<br /> I<br /> <br /> II<br /> <br /> III<br /> <br /> Hình 2. Kết quả đột biến xóa đoạn từ gen C4B đến exon 8 của gen CYP21A2<br /> Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các đỉnh tương<br /> ứng với vị trí exon 1, 3, 4, 6, 8, của gen<br /> CYP21A2; E1P, I2P, E10P là các đỉnh tương<br /> ứng với vị trí exon 1, intron 2, và exon 10 của<br /> gen CYP21A1P; C4A, C4B là đỉnh tương ứng<br /> với gen C4A, C4B; Y là đỉnh tương ứng với<br /> nhiễm sắc thể Y dùng để xác định giới tính.<br /> Kết quả MLPA cho thấy ở bệnh nhân<br /> không thấy xuất hiện các đỉnh tương ứng với<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> gen C4B và các exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen<br /> CYP21A2, vì vậy bệnh nhân có đột biến xóa<br /> đoạn từ gen C4B đến exon 8 của gen<br /> CYP21A2. Chiều cao đỉnh của gen C4B và<br /> các exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2 ở<br /> người bố và người mẹ bệnh nhân chỉ bằng<br /> 1/2 so với chiều cao đỉnh của mẫu đối chứng;<br /> vì vậy bố và mẹ bệnh nhân là người lành<br /> mang gen bệnh.<br /> <br /> 191<br /> <br />

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản