Xác định đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 Hydroxylase

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> patients of Mediterranean descent with Wilson<br /> disease, identification of 19 novel mutations , J<br /> Med Genet, 36(11), 833 - 836.<br /> 12. Rossi E, Olynyk JK, Cullen DJ et al<br /> <br /> (2000). Compound heterozygous hemochromatosis genotype predicts increased iron and<br /> erythrocyte indices in women, Clinical Chemistry, 46 (2), 162 - 166.<br /> <br /> Summary<br /> MUTATION ANALYSIS OF ATP7B GENE IN<br /> WILSON DISEASE FAMILY<br /> Wilson disease an autosomal recessive disorder of copper metabolism caused by mutations in<br /> the ATP7B gene that encodes a P-type copper transporting ATPase. The aim of this study was to<br /> screen and detect mutations of the ATP7B gene in a Wilson disease famlily (n = 6). Mutations<br /> were screened and detected by DNA sequencing in 21 exon of ATP7B gene. The results showed<br /> that 6/6 patients had 2 different heterozygous mutations including: ins47_48CGGCG in exon 1<br /> and p.V456L in exon 3 of ATP7B gene.<br /> Keywords:<br /> <br /> XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN VÀ PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH<br /> MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH<br /> THỂ THIẾU 21 - HYDROXYLASE<br /> Ngô Thị Thu Hương1, Trần Vân Khánh1, Nguyễn Viết Tiến2,<br /> Nguyễn Phú Đạt1, Tạ Thành Văn1<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Phụ sản Trung ương<br /> <br /> Tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt enzym 21- hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể<br /> thường do đột biến gen CYP21A2. Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu: (1) xác định đột biến gen<br /> trên bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21- hydroxylase, (2) phát hiện người<br /> lành mang gen bệnh cho các thành viên gia đình có quan hệ huyết thống với bệnh nhân. Nghiên cứu được<br /> tiến hành trên 33 bệnh nhân và 78 thành viên thuộc 33 gia đình của những bệnh nhân tăng sản thượng thận<br /> bẩm sinh; Kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA được sử dụng để xác định đột biến và người lành mang gen<br /> bệnh. Kết quả cho thấy đối với nhóm bệnh nhân, 33/33 (100%) bệnh nhân đã được phát hiện đột biến với 7<br /> dạng đột biến khác nhau, trong đó đột biến 656 A/C > G (IVS2-13A/C > G) chiếm tỉ lệ cao nhất 13/33<br /> (39,5%), tiếp theo là đột biến xóa đoạn chiếm tỉ lệ 7/33 (21,2%); đối với nhóm người lành mang gen bệnh,<br /> 32/33 người bố, 33/33 người mẹ và 5/12 thành viên gia đình khác (anh, chị, em) được xác định là người lành<br /> mang gen bệnh. Kết quả thu được là cơ sở di truyền quan trọng cho chẩn đoán trước sinh và tư vấn di<br /> truyền nhằm làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và có phác đồ điều trị sớm cho các thai nhi ngay từ những tuần đầu.<br /> Từ khóa: tăng sản thượng thận bẩm sinh, đột biến gen CYP21A2, người lành mang gen bệnh<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> 187<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Tăng sản thượng thận bẩm sinh<br /> (congenital adrenal hyperplasia - TSTTBS) thể<br /> thiếu enzym 21 - hydroxylase là bệnh di truyền<br /> lặn trên nhiễm sắc thể số 6. Bệnh gây nên do<br /> đột biến gen CYP21A2 làm rối loạn quá trình<br /> sinh tổng hợp hormon vỏ thượng thận, gây<br /> bệnh cảnh lâm sàng là cơn suy thượng thận<br /> cấp hoặc nam hóa ở trẻ gái, dậy thì sớm giả ở<br /> trẻ trai [1, 2].<br /> Cho đến nay, rất nhiều dạng đột biến đã<br /> được phát hiện như đột biến mất đoạn, đột<br /> biến chuyển đoạn, đột biến lặp đoạn, đột biến<br /> điểm; trong đó đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao<br /> nhất [3]. Bệnh có thể dự phòng bằng phương<br /> pháp tư vấn di truyền như phát hiện người<br /> lành mang gen bệnh, chẩn đoán trước sinh.<br /> Nghiên cứu của Lee và cộng sự ước tính tỷ lệ<br /> người lành mang gen bệnh tăng sản thượng<br /> thận bẩm sinh là 1/83 đối với quần thể người<br /> Trung Quốc [3]. Các báo cáo khác trên thế<br /> giới cho thấy tỷ lệ chung người lành mang gen<br /> bệnh là 1/55 [4, 5]. Ở Việt Nam, khoa Nội tiết<br /> - Chuyển hóa - Di truyền, bệnh viện Nhi Trung<br /> ương là một trong những nơi đang quản lí số<br /> lượng lớn nhất bệnh nhân mắc tăng sản<br /> thượng thận bẩm sinh với khoảng trên 600<br /> bệnh nhân. Tuy nhiên, chưa có một nghiên<br /> cứu nào toàn diện về phát hiện đột biến gen<br /> trên bệnh nhân và phát hiện người lành mang<br /> gen bệnh. Việc phát hiện đột biến và phát hiện<br /> người lành mang gen bệnh sẽ giúp khẳng<br /> định chẩn đoán và cho phép điều trị sớm,<br /> phòng tránh cơn suy thượng thận cấp trong<br /> các trường hợp xét nghiệm về hormon không<br /> Địa chỉ liên hệ: Tạ Thành Văn - Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Số 1 Tôn Thất Tùng, Đống Đa, Hà Nội.<br /> Email: tathanhvan@hmu.edu.vn<br /> Ngày nhận: 04/03/2013<br /> Ngày được chấp thuận: 26/4/2013<br /> <br /> 188<br /> <br /> rõ rang; tư vấn tiền hôn nhân nhằm giảm trẻ<br /> sinh ra bị mắc bệnh và chẩn đoán và điều trị<br /> trước sinh cho thai nhi gái mắc bệnh để phòng<br /> và làm giảm nam hóa chuyển giới gây mơ hồ<br /> giới tính sau sinh. Xuất phát từ ý nghĩa thực<br /> tiễn trên, đề tài được thực hiện với mục tiêu:<br /> (1) xác định đột biến gen trên bệnh nhân tăng<br /> sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21- hydroxylase, (2) phát hiện người lành<br /> mang gen bệnh cho các thành viên gia đình<br /> có quan hệ huyết thống với bệnh nhân.<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 1. Đối tượng<br /> 33 bệnh nhân và 78 thành viên thuộc 33<br /> gia đình của những bệnh nhân tăng sản<br /> thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21hydroxylase bao gồm: bố, mẹ và anh, chị, em<br /> ruột của bệnh nhân. Các bệnh nhân đang được<br /> theo dõi và điều trị tại khoa Nội tiết - Chuyển hóa<br /> - Di truyền bệnh viện Nhi Trung ương.<br /> 2. Phương pháp<br /> 2.1. Kỹ thuật tách chiết DNA<br /> DNA được tách chiết từ bạch cầu máu<br /> ngoại vi theo quy trình phenol/chloroform. Tất<br /> cả mẫu DNA sẽ được tiến hành đo nồng độ và<br /> độ tinh sạch, chỉ có mẫu DNA đạt giá trị OD<br /> 260/280 1.8 - 2 được sử dụng để phân tích<br /> gen [6].<br /> 2.2. Kỹ thuật giải trình tự gen<br /> Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để<br /> khuyếch đại gen CYP21A2. Chu trình nhiệt<br /> phản ứng PCR: 900 - 10 giây, [980 - 10 giây,<br /> 550 - 15 giây, 720 - 2 phút] x 30 chu kỳ.<br /> Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải<br /> trình tự trên máy ABI - 3100 tại trung tâm<br /> nghiên cứu Gen - Protein, trường Đại học Y<br /> Hà Nội. Kết quả được phân tích bằng phần<br /> mềm CLC và so sánh kết quả phân tích gen<br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> của bệnh nhân với kết quả phân tích gen của<br /> các thành viên gia đình.<br /> <br /> của mỗi probe tỷ lệ thuận với số bản copy của<br /> đoạn DNA đích đặc hiệu với probe đó.<br /> <br /> 2.3 Kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation<br /> dependent probe amplification)<br /> <br /> 2.4. Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu<br /> thực hiện theo đúng yêu cầu đạo đức trong<br /> nghiên cứu.<br /> <br /> Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC - Holland)<br /> để phát hiện đột biến xóa đoạn trên bệnh<br /> nhân và người lành mang gen bệnh. Thành<br /> phần của kit gồm các probe để khuyếch đại<br /> gen CYP21A2, mỗi probe tương ứng với một<br /> vùng gen, ngoài ra còn có các probe đặc<br /> trưng cho gen của người cũng được sử dụng<br /> để làm đối chứng và 2 probe cho nhiễm sắc<br /> thể X và Y để xác định giới tính. Sản phẩm<br /> khuếch đại được điện di mao quản trên máy<br /> giải trình tự. Số lượng sản phẩm khuếch đại<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> Bằng kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA,<br /> 33/33 (100%) bệnh nhân đã được phát hiện<br /> có đột biến gen CYP21A2, với 7 dạng đột biến<br /> khác nhau. Đột biến 656 A/C > G (IVS2 - 13A/<br /> C > G) chiếm tỷ lệ cao nhất là 13/33 (39,5%),<br /> tiếp theo là đột biến xóa đoạn chiếm tỷ lệ 7/33<br /> (21,2%), các dạng đột biến còn lại dao động<br /> 3 - 15,3%.<br /> <br /> Bảng 1. Các dạng đột biến gen đã được phát hiện trên bệnh nhân<br /> <br /> STT<br /> <br /> Dạng đột biến<br /> <br /> Thể lâm sàng<br /> <br /> Số bệnh nhân<br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> 13<br /> <br /> 39,5<br /> <br /> Nam hóa đơn thuần<br /> <br /> 1<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> 2<br /> <br /> 6,0<br /> <br /> Nam hóa đơn thuần<br /> <br /> 5<br /> <br /> 15,3<br /> <br /> 1<br /> <br /> 656 A/C > G (IVS2-13A/C > G)<br /> <br /> 2<br /> <br /> I172N/I172N & 656 A/C > G (IVS2<br /> - 13A/C > G)<br /> <br /> 3<br /> <br /> IVS2 - 13A/C > G/R356W<br /> <br /> 4<br /> <br /> I172N/I172N<br /> <br /> 5<br /> <br /> IVS2 - 13A/C> G/R493S<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> 1<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> 6<br /> <br /> R356W/R356W<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> 4<br /> <br /> 12,0<br /> <br /> 7<br /> <br /> Xóa đoạn<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> 7<br /> <br /> 21,2<br /> <br /> 33<br /> <br /> 100<br /> <br /> Tổng số<br /> <br /> - Kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA cũng được sử dụng để phát hiện người lành mang gen<br /> bệnh, kết quả cho thấy 32/33 người bố, 33/33 người mẹ và 5/12 thành viên gia đình (anh, chị,<br /> em) được xác định có đột biến.<br /> - Phân tích phả hệ của 33 gia đình cho thấy cả 33 gia đình đều có con bị bệnh ở cùng 1 thế<br /> hệ, trong đó 28 gia đình có 1 con bị bệnh, 5 gia đình có hai có 2 con bị bệnh (bảng 2).<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> 189<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Bảng 2. Kết quả phát hiện đột biến gen của các thành viên gia đình bệnh nhân<br /> Thành viên<br /> gia đình khác<br /> <br /> Người bố<br /> <br /> Người mẹ<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> Có mang gen đột biến<br /> <br /> 32<br /> <br /> 32/33<br /> <br /> 33<br /> <br /> 33/33<br /> <br /> 5<br /> <br /> 5/12<br /> <br /> Không mang gen đột biến<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1/33<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 7<br /> <br /> 7/12<br /> <br /> 33<br /> <br /> 33/33<br /> <br /> 33<br /> <br /> 33/33<br /> <br /> 12<br /> <br /> 12/12<br /> <br /> Kết quả<br /> <br /> Tổng số<br /> <br /> Hình ảnh minh họa một số dạng đột biến điển hình.<br /> Phả hệ của gia đình mang gen đột biến IVS2 - 13A/C > G<br /> I<br /> <br /> II<br /> III<br /> <br /> Hình 1. Kết quả đột biến 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G) trên gen CYP21A2<br /> Mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid. Hình ảnh giải<br /> trình tự gen theo chiều ngược.<br /> 190<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G), mẹ bệnh nhân có đột<br /> biến dị hợp tử nên là người lành mang gen bệnh, bố bệnh nhân có hình ảnh phân tích gen giống<br /> người bình thường nên không mang gen bệnh.<br /> Phả hệ của gia đình mang đột biến xóa đoạn.<br /> I<br /> <br /> II<br /> <br /> III<br /> <br /> Hình 2. Kết quả đột biến xóa đoạn từ gen C4B đến exon 8 của gen CYP21A2<br /> Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các đỉnh tương<br /> ứng với vị trí exon 1, 3, 4, 6, 8, của gen<br /> CYP21A2; E1P, I2P, E10P là các đỉnh tương<br /> ứng với vị trí exon 1, intron 2, và exon 10 của<br /> gen CYP21A1P; C4A, C4B là đỉnh tương ứng<br /> với gen C4A, C4B; Y là đỉnh tương ứng với<br /> nhiễm sắc thể Y dùng để xác định giới tính.<br /> Kết quả MLPA cho thấy ở bệnh nhân<br /> không thấy xuất hiện các đỉnh tương ứng với<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> gen C4B và các exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen<br /> CYP21A2, vì vậy bệnh nhân có đột biến xóa<br /> đoạn từ gen C4B đến exon 8 của gen<br /> CYP21A2. Chiều cao đỉnh của gen C4B và<br /> các exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2 ở<br /> người bố và người mẹ bệnh nhân chỉ bằng<br /> 1/2 so với chiều cao đỉnh của mẫu đối chứng;<br /> vì vậy bố và mẹ bệnh nhân là người lành<br /> mang gen bệnh.<br /> <br /> 191<br /> <br />