Xác định đột biến gen CYP21A2 trên bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21- hydroxylase thể mất muối

Chia sẻ: Nguyễn Tuấn Anh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

50
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu (1) Xác định tỉ lệ bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể mất muối (2) xác định đột biến trên bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt enzym 21- hydroxylase thể bệnh mất muối. Phương pháp: 40 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh được chẩn đoán và được xác định đột biến gen CYP21A2; áp dụng kỹ thuật MLPA và giải trình tự gen.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xác định đột biến gen CYP21A2 trên bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21- hydroxylase thể mất muối

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP21A2 TRÊN BỆNH NHÂN TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH THIẾU 21-HYDROXYLASE THỂ MẤT MUỐI Vũ Chí Dũng1,2, Trần Huy Thịnh1, Nguyễn Thanh Bình1,2, Tạ Thành Văn1 Trần Vân Khánh1 1 Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Nhi Trung ương Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21-OH là bệnh lý di truyền lặn nhiễm sắc thể thường xảy ra do giảm hoặc mất chức năng của enzyme 21-Hydroxylase, được mã hóa bởi gen CYP21A2. Bệnh được chia thành 3 thể bệnh lâm sàng chính là thể mất muối, thể nam hóa đơn thuần và thể không cổ điển, trong đó thể mất muối chiếm tỉ lệ cao nhất. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu (1) Xác định tỉ lệ bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể mất muối (2) xác định đột biến trên bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt enzym 21- hydroxylase thể bệnh mất muối. Phương pháp: 40 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh được chẩn đoán và được xác định đột biến gen CYP21A2; áp dụng kỹ thuật MLPA và giải trình tự gen. Kết quả xác định được 30/40 (75%) bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh với thể mất muối. Nghiên cứu phát hiện được 8 kiểu gen, trong đó kiểu gen phổ biến nhất là Del/Del (33,33%), tiếp đến là I2g/I2g (20%), các kiểu gen còn lại có tỉ lệ thấp hơn từ 3,3-13,3%. Đột biến đồng hợp tử chiếm 66,6%, đột biến dị hợp tử chiếm 33,3%. Allele đột biến chiếm tỉ lệ cao nhất là Del (46%), tiếp theo là I2g (29%) và p.R356W (20%), p.L307FfsX6 (3%) và p.Q318X (2%). Từ khóa: tăng sản thượng thận bẩm sinh thể mất muối, CYP21A2, MLPA, giải trình tự gen I. ĐẶT VẤN ĐỀ mất muối chiếm 75% các ca mắc thể cổ điển Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu [4], ở thể này bệnh nhân thiếu hụt hoàn toàn 21-hydroxylase xảy ra do một phần hoặc hoàn hoạt độ enzym 21-Hydroxylase gây nguy hiểm toàn của enzym 21-hydroxylase tham gia tổng đến tính mạng và tử vong do mất nước, hạ hợp cortisol từ cholesterol ở tuyến thượng natri máu. Trẻ trai mắc thể cổ điển không có thận. Mức độ nặng và biểu hiện lâm sàng của triệu chứng khi sinh ngoại trừ xạm da kín đáo bệnh phụ thuộc vào hoạt độ 21-Hydroxylase và dương vật có thể có kích thước lớn hơn. còn lại của bệnh nhân [1; 2]. Tăng sản thượng Do vậy, tuổi chẩn đoán ở trẻ trai thể cổ điển thận bẩm sinh được phân loại thành hai thể mất muối khác nhau tùy theo mức độ thiếu hụt bệnh chính là thể cổ điển (thể nặng) và thể aldosterone. Các trẻ trai mắc thể mất muối không cổ điển (thể nhẹ). Thể cổ điển được thường xuất hiện triệu chứng từ 7 - 14 ngày chia ra thành thể mất muối (salt wasting) và sau sinh với các biểu hiện nôn, sụt cân, li bì, nam hóa đơn thuần (simple virilizing) phản mất nước, hạ natri, tăng kali huyết thanh và ánh mức độ thiếu hụt aldosterone [3; 4]. Thể sốc gây nguy hiểm đến tính mạng. Các trẻ gái mắc thể mất muối nếu không được điều trị Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu sớm sau sinh có thể xuất hiện các triệu chứng Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, suy thượng thận cấp, mất muối trong giai Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn đoạn sơ sinh. Ngày nhận: 10/10/2018 Ngày được chấp thuận: 12/12/2018 TCNCYH 117 (1) - 2019 Các nghiên cứu trên thế giới đã phát hiện 39 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC được một số dạng đột biến liên quan đến tăng khuếch đại bằng phản ứng PCR với các cặp sản thượng thận bẩm sinh, trong đó phát hiện mồi đặc hiệu theo quy trình đã được mô tả allele đột biến có tỉ lệ cao nhất ở các bệnh trước đây [5]. nhân thể mất muối bao gồm đột biến xóa đoạn - Thành phần phản ứng: thể tích 20 µl gồm: 100 - 150 ng DNA, 5 pmol primer, 200 (Del), đột biến vùng Intron 2 (I2g) và đột biến điểm p.R356W [5; 6]. Nghiên cứu của Krone và cộng sự phát hiện trên 91,3% các allele µmol/l dNTP, 2 đơn vị enzym Taq polymerase và 2 µl GeneAmp 10 x buffer. của bệnh nhân thể mất muối có các đột biến - Chu trình nhiệt: 94oC/5phút, [94oC/1phút, xóa đoạn, I2g, I172N, R356W và Q318X. Việc xác định đột biến có ý nghĩa trong sàng lọc sơ 60oC/1phút, 72oC/1phút] x 35 chu kỳ, 72oC/ 2phút, giữ ở 15oC. Sản phẩm PCR được điện sinh, chẩn đoán sớm bệnh và đưa ra phác đồ di trên gel agarose 1%, 90V trong 30 phút. điều trị kịp thời cho bệnh nhân. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: 1. Xác định tỉ lệ bệnh nhân mang thể mất muối trên các bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh. 2. Xác định đột biến trên bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt enzym 21- hydroxylase thể bệnh mất muối. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng 40 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu enzym 21-hydroxylase, bệnh nhân được chẩn đoán và phân loại thể bệnh lâm - Sản phẩm PCR sau khi điện di trên gel agarose được tinh sạch bằng Gel purification Kit trước khi tiến hành giải trình tự gen. Để giải trình tự được toàn bộ gen CYP21A2, sử dụng các mồi như đã mô tả ở bảng 2.1. Quy trình được thực hiện theo phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, Hoa Kỳ). Kết quả giải trình tự gen được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench. Mẫu DNA của bệnh nhân được so sánh với mẫu DNA đối chứng và trình tự của CYP21A2 trên GeneBank (Accession number NM_0005002) 2.3 Kỹ thuật MLPA sàng bởi các bác sĩ tại khoa Khoa Nội tiết Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung để phát hiện đột biến xóa đoạn trên bệnh ương. nhân và người lành mang gen bệnh. Thành 2. Phương pháp 2.1. Kỹ thuật tách chiết DNA DNA được tách chiết từ bạch cầu máu ngoại vi theo quy trình phenol/chloroform. Tất cả các mẫu DNA sẽ được tiến hành đo nồng độ và độ tinh sạch, chỉ có mẫu DNA đạt giá trị ≥ 1,8 mới đạt yêu cầu về tinh sạch và được sử dụng để phân tích. 40 Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC- Holland) phần của kit gồm các đầu dò (probe) để khuyếch đại gen CYP21A2, mỗi đầu dò tương ứng với một vùng gen, ngoài ra còn có các đầu dò đặc trưng cho gen của người cũng được sử dụng để làm đối chứng và 2 đầu dò cho nhiễm sắc thể X và Y để xác định giới tính. Sản phẩm khuếch đại sẽ được điện di mao quản trên máy giải trình tự. Số lượng sản phẩm khuếch đại của mỗi đầu dò sẽ tỷ lệ 2.2. Kỹ thuật giải trình tự gen thuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặc Toàn bộ chiều dài gen CYP21A2 được hiệu với đầu dò đó. TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 3. Đạo đức nghiên cứu III. KẾT QUẢ Nghiên cứu tuân thủ tuyệt đối các quy định Kết quả phân tích phát hiện 30/40 (75%) về đạo đức trong nghiên cứu y sinh. Bệnh bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào mắc thể mất muối. Đột biến gen CYP21A2 được phát hiện trên tất cả các bệnh nhân thể nghiên cứu. Bệnh nhân hoàn toàn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân sẽ được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để giúp cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa mất muối. Trong đó đột biến đồng hợp tử chiếm 66,6%, đột biến dị hợp tử chiếm 33,3%. Nghiên cứu phát hiện được 8 kiểu gen, trong đó kiểu gen phổ biến nhất là Del/Del chọn phác đồ điều trị phù hợp. Các thông tin (33,33%), tiếp đến là I2g/I2g (20%), các kiểu cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật. gen còn lại có tỉ lệ thấp hơn từ 3,3 - 13,3% (hình 1). Bảng 1. Kết quả phát hiện đột biến gen CYP21A2 của bệnh nhân Kiểu gen Đồng/Dị hợp tử n % Del/Del Homozygous 10 33,3 I2g/I2g Homozygous 6 20,0 p.R356W/p.R356W Homozygous 4 13,3 Del/I2g Heterozygous 4 13,3 Del/p.R356W Heterozygous 2 6,7 Del/p.L307FfsX6 Heterozygous 2 6,7 I2g/p.R356W Heterozygous 1 3,3 I2g/p.Q318X+p.R356W Heterozygous 1 3,3 30 100% Tổng cộng Đồng hợp tử 66,6% Dị hợp tử 33,3% Biểu đồ 1. Tỉ lệ các allele đột biến TCNCYH 117 (1) - 2019 41 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Biểu đồ 1 mô tả các allele đột biến phát hiện được trong nghiên cứu và tỉ lệ tương ứng. Allele có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là Del (46%), tiếp theo là I2g (29%) và p.R356W (20%), p.L307FfsX6 (3%) và p.Q318X (2%). g.655A/C > G IVS2-13A/C > G g.655A/C Bệnh nhân Người bình thường Hình 1. Kết quả giải trình tự gen CYP21A2 - Hình ảnh đột biến đồng hợp tử IVS2 - 13A/G > C (I2g) Kết quả giải trình tự của bệnh nhân trong hình 1 cho thấy bệnh nhân có đột biến tại vị trí g.655 (A/C > G), vị trí này nằm trên Intron 2 và nằm tại vùng cắt nối intron-exon (splice site). Đột biến gây ảnh hưởng đến quá trình phiên mã, làm mất chức năng của protein 21-Hydroxylase. IV. BÀN LUẬN cứu hồi cứu số liệu 100 năm tại Thụy Điển Nghiên cứu này đã phát hiện 30/40 (75%) cho thấy trong tổng số 606 bệnh nhân tăng bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh có sản thượng thận bẩm sinh thì thể cổ điển kiểu hình mất muối. Krone và cộng sự (2000) chiếm 75,4% (457 bệnh nhân); thể không cổ nghiên cứu trên 155 bệnh nhân tăng sản điển là 12,7% và chưa rõ kiểu hình là 11,9%. thượng thận bẩm sinh phát hiện thể mất muối Trong số 457 bệnh nhân kiểu hình thể cổ điển chiếm 59,4% (92/155) tổng số bệnh nhân; thể thì thể mất muối chiếm 61,1% (279 bệnh nam hóa đơn thuần chiếm 33,5% (52/155) và nhân) [7]. Sự khác nhau về phân bố kiểu hình thể không cổ điển 7,1% (11/155) [3]. Một số có thể do yếu tố chủng tộc, ngoài ra có giả nghiên cứu khác phát hiện thấy tỉ lệ thể không thiết là các bệnh nhân mắc thể không cổ điển cổ điển cao hơn: 63,2% các bệnh nhân Tây xuất hiện các triệu chứng lâm sàng muộn và Ban Nha; 54,7% các bệnh nhân Hy Lạp và không điển hình do vậy ít tìm đến các cơ sở y 24,6% các bệnh nhân Ý mắc thể không cổ tế hơn. điển [6]. Dolzan V và cộng sự (2005) đã công Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử bố kết quả lâm sàng cho 348 bệnh nhân ở các dụng các kỹ thuật MLPA, và giải trình tự gen nước Trung Âu bao gồm: Áo, Cộng hòa Séc, để phát hiện các đột biến của gen CYP21A2. Hungary, Slovakia và Slonenia và nhận thấy Với kỹ thuật MLPA chúng ta có thể phát hiện 63,5% các bệnh nhân có kiểu hìnhmất muối; các xóa đoạn, lặp đoạn dị hợp tử, còn kỹ thuật 26,4% có kiểu hình nam hóa đơn thuần và giải trình tự sẽ phát hiện được các đột biến 10,1% có kiểu hình không cổ điển. Nghiên điểm. Các dạng đột biến được phát hiện bao 42 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC gồm: Del, I2g, p.R356W, p.L307fsX6, Q316X. kiểu gen còn lại có tỉ lệ từ 3,3-13,3%. Đột biến Nghiên cứu đã phát hiện được 8 kiểu gen, đồng hợp tử chiếm 66,6%, đột biến dị hợp tử Del/Del chiếm 33,3%. Allele đột biến có tỉ lệ xuất hiện (33,33%), đứng thứ hai là I2g/I2g (20%), tiếp cao nhất là Del (46%), tiếp theo là I2g (29%) đó là các kiểu gen p.R356W/p.R356W, Del/ và p.R356W (20%), p.L307FfsX6 (3%) và I2g, Del/p.R356W. Các kiểu gen này đều trùng p.Q318X (2%). kiểu gen thường gặp nhất là hơp với các kiểu gen được dự đoán trong các nghiên cứu in silico và in vitro nghiên cứu Lời cám ơn mức độ ảnh hưởng của đột biến lên chức Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ năng của 21-hydroxylase, trong đó các đột kinh phí bởi Đề tài cấp Bộ Y tế: “Nghiên cứu biến nặng như I2g và R356W gây mất hoàn quy trình phát hiện người mang gen bệnh và toàn chức năng của 21-OH do vậy gây nên chẩn đoán trước sinh bệnh tăng sản thượng thể mất muối, các kiểu gen dị hợp tử với thận bẩm sinh bằng kỹ thuật sinh học phân tử” p.I172N, p.401L, V281L sẽ bảo tồn được 1 và sự giúp đỡ của các cán bộ của Trung tâm phần hoạt độ của 21-OH do đó gây ra thể nghiên cứu Gen- Protein, Bộ môn Nhi, Trường bệnh nhẹ hơn như nam hóa đơn thuần hoặc Đại học Y Hà Nội; Khoa Nội tiết - Chuyển hóa thể không cổ điển [3]. Nghiên cứu của Krone - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương. và cộng sự cũng cho thấy đột biến xóa đoạn, I2g, I172N, R356W và Q318X xuất hiện trên TÀI LIỆU THAM KHẢO 91,3% các allele của bệnh nhân thể mất muối. 1. White P.C (2000). Congenital Adrenal Hyperplasia due to 21-Hydroxylase Defi- Kết quả này có ý nghĩa trong dự báo kiểu hình của các bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh, giúp định hướng chẩn đoán và đưa ra phác đồ điều trị phù hợp. Nghiên cứu này đã áp dụng kỹ thuật MLPA và giải trình tự gen để xác định đột biến gen CYP21A2 trên 40 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu enzym 21-hydroxylase. ciency. Endocr Rev, 21(3), 245 - 291. 2. Gonçalves J., Friães A., Moura L (2007). Congenital adrenal hyperplasia: focus on the molecular basis of 21-hydroxylase deficiency. Expert Rev Mol Med, 9(11), 1 - 23. 3. Krone N., Braun A., Roscher A.A et al (2000). Predicting phenotype in steroid 21- Việc xác định đột biến có ý nghĩa trong sàng lọc sơ sinh, chẩn đoán sớm bệnh và đưa ra hydroxylase deficiency? Comprehensive ge- phác đồ điều trị kịp thời cho bệnh nhân [8 12]. tients from southern Germany. J Clin Endocri- V. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã phát hiện được đột biến điểm gen CYP21A2 trên 30/40 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21-OH thể mất muối. Trong số 8 kiểu gen được phát hiện, kiểu gen có tỉ lệ cao nhất là Del/Del (33,33%), đứng thứ hai là I2g/I2g (20%), các TCNCYH 117 (1) - 2019 notyping in 155 unrelated, well defined panol Metab, 85(3), 1059 - 1065. 4. New M.I. (2003). Inborn errors of adrenal steroidogenesis. Mol Cell Endocrinol, 211 (1-2), 75 - 84. 5. Lee H.H., Chao H.T., Lee Y.J et al (1998). Identification of four novel mutations in the CYP21 gene in congenital adrenal hyperplasia in the Chinese. Hum Genet, 103(3), 304 – 310. 43