Xác định đột biến trên một số exon trọng điểm của gen RB1 ở bệnh nhân ung thư võng mạc

Chia sẻ: Trang Trang | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

84
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Phát hiện đột biến gen RB1 trên các bệnh nhân ung thư võng mạc là tiền đề quan trọng giúp phát hiện người lành mang bệnh và chẩn đoán trước sinh nhằm giảm tỷ lệ tử vong, tỷ lệ mù lòa ở trẻ. Đột biến trên gen RB1 thường là đột biến điểm và gặp nhiều ở một số exon trọng điểm trong đó có exon 10, 14, 20. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: xác định đột biến gen RB1 trên exon 10, 14, 20. 49 bệnh nhân ung thư võng mạc được lựa chọn nghiên cứu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xác định đột biến trên một số exon trọng điểm của gen RB1 ở bệnh nhân ung thư võng mạc

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN MỘT SỐ EXON TRỌNG ĐIỂM CỦA GEN RB1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÕNG MẠC Vũ Đức Anh1, Trần Huy Thịnh1, Phạm Trọng Văn1,2, Phạm Hồng Vân2, Tạ Thành Văn1, Trần Vân Khánh1 1 Trường Đại học Y Hà Nội; 2Bệnh viện Mắt Trung ương Ung thư võng mạc là một trong những khối u ác tính thường gặp nhất tại ổ mắt ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ, bệnh gây nên do đột biến gen RB1 làm mất hoặc giảm chức năng của protein RB1. Ở nước đang phát triển như Việt Nam, phần lớn các trường hợp đều phát hiện muộn và trẻ thường phải khoét bỏ nhãn cầu, thậm chí đe dọa tính mạng của trẻ. Phát hiện đột biến gen RB1 trên các bệnh nhân ung thư võng mạc là tiền đề quan trọng giúp phát hiện người lành mang bệnh và chẩn đoán trước sinh nhằm giảm tỷ lệ tử vong, tỷ lệ mù lòa ở trẻ. Đột biến trên gen RB1 thường là đột biến điểm và gặp nhiều ở một số exon trọng điểm trong đó có exon 10, 14, 20. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: xác định đột biến gen RB1 trên exon 10, 14, 20. 49 bệnh nhân ung thư võng mạc được lựa chọn nghiên cứu. Kỹ thuật giải trình tự gen được áp dụng để xác định đột biến điểm trên exon 10, 14 và 20. 5/49 (10,2%) bệnh nhân đã được phát hiện đột biến, trong đó 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Trp680Cys và 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Glu692Val_Leu693Ile trên exon 20, 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Tyr452Phe trên exon 14, và 1 bệnh nhân phát hiện 2 đột biến: p.Tyr452Phe và p.Val455Glu trên exon 14. Bệnh nhân còn lại phát hiện đột biến p.Thr345Arg frameshift X6 trên exon 10. Tất cả các đột biến đều là đột biến dị hợp và là đột biến chưa từng được công bố. Từ khóa: Ung thư võng mạc, gen RB1, đột biến gen I. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư võng mạc là một bệnh lý ác tính Gần 40% đột biến gen RB1 tái diễn và tập thường gặp nhất tại ổ mắt ở trẻ sơ sinh và trẻ trung tại 16 điểm bao gồm 12 đột biến vô nhỏ, với tần suất thường gặp từ 1/15.0001/18.000 trẻ được sinh ra, bệnh liên quan tới nghĩa (nonsense), 02 đột biến sai nghĩa đột biến ở gen RB1 [1 - 3]. Đột biến gây bệnh trên gen RB1 làm giảm hoặc thậm chí mất Những đột biến còn lại nằm rải rác dọc gen chức năng của protein pRB, từ đó dẫn tới mất kiểm soát quá trình nhân lên của tế bào, dẫn 14, 17, 18, 20 và 23 [2 - 6]. Việc phát hiện ra tới mất khả năng kiểm soát phân bào và hình và triển khai các kỹ thuật sinh học phân tử thành khối u tại võng mạc [4]. phục vụ cho chẩn đoán trước sinh, đồng thời Các nghiên cứu đã công bố có trên 900 đột biến gen RB1 là cơ sở dữ liệu quan trọng cho tư vấn di truyền và cho biết đặc điểm giữa mối quan hệ kiểu gen và kiểu hình của bệnh. Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội (missense), 03 đột biến vị trí nối (splicing). RB1 và tỷ lệ gặp cao nhất ở các exon 9, 10, đột biến gen RB1 là cơ sở cho việc phát triển quản lý tốt những người mang gen nhằm giảm tỷ lệ biến chứng và tỷ lệ tử vong ở trẻ [7 - 9]. Ung thư võng mạc là một bệnh lý hiếm gặp, tuy nhiên số lượng bệnh nhân tới khám và điều trị tại Bệnh viện Mắt Trung ương ngày càng tăng. Năm 2005 chỉ có 14 bệnh nhân Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn được phát hiện và chẩn đoán trong vòng 1 Ngày nhận: 18/9/2018 năm, tuy nhiên tới năm 2013 con số đó đã Ngày được chấp thuận: 11/10/2018 tăng lên 52 trẻ tới khám và điều trị [10]. TCNCYH 115 (6) - 2018 1 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Ở Việt Nam, các nghiên cứu liên quan đến ung thư võng mạc còn rất ít, chủ yếu là các 72oC/30 giây], 72oC/5 phút. Bảo quản mẫu ở 10oC. nghiên cứu về lĩnh vực lâm sàng nên các Kỹ thuật giải trình tự gen: các sản phẩm nghiên cứu về gen liên quan tới ung thư võng PCR sẽ được tiến hành giải trình tự trực tiếp mạc còn chưa nhiều, thông tin còn hạn chế. trên máy ABI 3100 Genetic Analyzer. Kết quả Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành được thu thập và xử lý bằng phần mềm ABI nghiên cứu đề tài nhằm mục tiêu xác định đột PRISM biến trên một số exon trọng điểm của gen RB1 Sequencing Analysis 5.2 và BLAST NCBI. ở bệnh nhân ung thư võng mạc. Trình tự được so sánh trên ngân hàng gen: II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP DNA (NG_009009.1) bằng phần mềm CLC. TM 3100 – Avant Data Collection, DNA 3. Đạo đức nghiên cứu 1. Đối tượng 49 bệnh nhân được chẩn đoán ung thư Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ theo đạo đức nghiên cứu trong Y học. Bệnh nhân và võng mạc tại Bệnh viện Mắt Trung ương dựa gia đình bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham trên lâm sàng và chẩn đoán hình ảnh hoặc gia vào nghiên cứu và có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham có kết quả giải phẫu bệnh là ung thư võng mạc, bệnh nhân và gia đình đồng ý tham gia nghiên cứu. gia. Bệnh nhân và gia đình được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để giúp cho các bác 2. Phương pháp sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp. Các thông tin cá nhân được - Lấy mẫu bệnh phẩm: 2ml máu tĩnh mạch đảm bảo bí mật. chống đông bằng EDTA. - Tách chiết DNA từ máu ngoại vi: DNA tổng số được tách chiết từ máu toàn phần bằng phenol-chloroform-isopropanol (25:24:1). III. KẾT QUẢ 1. Kết quả xác định khuếch đại exon 10, 14 và 20 của gen RB1 khuếch đại exon 10, 14 và 20 của gen RB1 Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho exon 10, 14 và 20 của gen RB1 để khuếch đại DNA sau với 3 cặp mồi được thiết kế. tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân. Hình 1 là - Kỹ thuật PCR: PCR được sử dụng để - Thành phần phản ứng PCR (thể tích 20µl) gồm: nước cất PCR 11,9 µl; buffer 10X 2,0 µl; 2,5 mM dNTP, 0,5 µM mồi xuôi và ngược, 0,5U Taq polymerase, 3,0µl DNA. o Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94 C/5 phút, 35 chu kỳ [94oC/30 giây, 55oC/30 giây, 2 hình ảnh PCR đại diện khuếch đại exon 10 của gen RB1. Sản phẩm PCR thu được chỉ có 1 băng đặc hiệu, rõ nét, kích thước 291 bp không có sản phẩm phụ. Sản phẩm khuếch đại PCR đảm bảo cho phản ứng giải trình tự tiếp theo để phát hiện đột biến điểm (hình 1). TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC MK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (+) (-) 291 bp Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon 10 của gen RB1 (+) mẫu đối chứng dương; (-) mẫu chứng âm; (1-9) mẫu bệnh nhân; (MK) Marker (100bp). 2. Kết quả xác định đột biến gen RB1 Sản phẩm PCR được giải trình tự gen để xác định đột biến. Kết quả cho thấy 5/49 (10,2%) bệnh nhân phát hiện đột biến, trong đó 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Trp680Cys và 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Glu692Val_Leu693Ile trên exon 20, 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Tyr452Phe trên exon 14 và 1 bệnh nhân khác phát hiện 2 đột biến p.Tyr452Phe và p.Val455Glu trên exon 14. Bệnh nhân còn lại phát hiện đột biến p.Thr345Arg frameshift X6 trên exon 10. Bảng 1. Kết quả xác định đột biến trên 3 exon 10, 14, 20 gen RB1 Mã Đột biến Thay đổi protein Thể đột biến Exon Loại đột biến Chú thích RB29 c.2041 G > T p.Trp680Cys Dị hợp 20 Missense New RB53 c.1357 A > T p.Tyr452Phe Dị hợp 14 Missense New RB57 c.1357 A > T c.1366 T > A p.Tyr452Phe p.Val455Glu Dị hợp Dị hợp 14 14 Missense Missense New New RB68 c.2077_2079 AAC > TTA p.Glu692Val_ Leu693Ile Dị hợp 20 Missense New RB79 c.1033delCT p.Thr345Arg frameshift X6 Dị hợp 10 Deletion New bệnh nhân Missense: đột biến sai nghĩa; Deletion: đột biến mất nucleotid; New: đột biến mới chưa được công bố. TCNCYH 115 (6) - 2018 3 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC c.1357A > T p.Tyr452Phe c.1357A Người bình thường Bệnh nhân RB57 c.1366T > A p.Val455Glu c.1366T Người bình thường Bệnh nhân RB57 Hình 2. Hình ảnh giải trình tự đột biến exon 14 của bệnh nhân mã số RB57 Kết quả trên cho thấy bệnh nhân RB57 phát hiện 02 đột biến dị hợp tử trên cùng exon 14. Cả 02 đột biến này đều là dạng đột biến sai nghĩa. Đột biến tại vị trí c.1357 A > T làm biến đổi acid amin Tyrosin vị trí 452 thành Phenylalanin, đột biến tại vị trí c.1366 T > A làm thay đổi acid amin Valin vị trí 455 thành Glutamat. c.1033 C c.1033del CT p.Thr345ArgframeshiftX6 Người bình thường Bệnh nhân RB79 Hình 3. Hình ảnh giải trình tự đột biến exon 14 của bệnh nhân mã số RB79 Giải trình tự phát hiện bệnh nhân RB79 có đột biến mất đoạn c.1033delCT làm mất 2 nucleotid C và T. Đột biến tại vị trí này làm thay đổi acid amin thứ 345 từ Threonin thành Arginin dẫn tới tạo mã kết thúc sớm (stop codon) sau 6 codon kế tiếp. IV. BÀN LUẬN phát hiện muộn, khi bệnh đã lan rộng hay di Ung thư võng mạc là một bênh lý di truyền căn, phải loại bỏ nhãn cầu, nạo vét hốc mắt, hiếm gặp, bệnh thường để lại nhiều biến làm mất thị lực và đe dọa đến tính mạng của chứng về mắt, phần lớn các trường hợp được trẻ. Đa phần các bệnh nhân đều đến khám 4 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC muộn với tình trạng biến chứng phải khoét bỏ sai nghĩa (missense), 03 đột biến vị trí nối nhãn cầu và tiên lượng tử vong cao gây hậu (splicing). Những đột biến còn lại nằm rải rác quả nặng nề cho gia đình và xã hội. Việc phát dọc gen RB1 và tỷ lệ gặp cao nhất ở các exon hiện ra đột biến gen RB1 là cơ sở cho việc 9, 10, 14, 17, 18, 20 và 23 [2; 3]. Vì vậy, phát triển và triển khai các kỹ thuật sinh học nghiên cứu của chúng tôi tiến hành lựa chọn phân tử phục vụ cho chẩn đoán trước sinh, ngẫu nhiên 3 trong số các exon có tỷ lệ gặp đồng thời quản lý tốt những người mang gen đột biến cao để xác định đột biến là exon 10, bệnh nhằm giảm tỷ lệ mù lòa và thương tật ở 14, 20. trẻ. Các nghiên cứu về các đột biến gene Tỷ lệ phát hiện đột biến trong nghiên cứu cũng đã và đang được tiến hành, cung cấp của chúng tôi trên 3 exon (exon 10, 14, 20) những thông tin dữ liệu cho ngân hàng gene chiếm 10,2% (5/49) tương đồng với nghiên RB1 (http://rb1-lsdb.d-lohmann.de/) và công cứu tại Trung Quốc (8,2%, n = 85), hay nghiên bố có trên 900 đột biến gen RB1 là cơ sở dữ cứu tại Tây Ban Nha, Colombia, Cuba (10,3%, liệu quan trọng cho tư vấn di truyền và cho n =107), tuy nhiên thấp hơn so với nghiên cứu biết đặc điểm giữa mối quan hệ kiểu gen và tại Singapore năm 2017 là 23,7% (n = 59), có kiểu hình của bệnh. Gần 40% đột biến gen sự khác nhau đó có thể do sự khác biệt về địa RB1 tái diễn và tập trung tại 16 điểm bao gồm lý và chủng tộc [11 - 13]. 12 đột biến vô nghĩa (nonsense), 02 đột biến Hình 4. Phân bố đột biến phát hiện được ở 49 bệnh nhân trên toàn bộ 27 exon gen RB1 Nghiên cứu phát hiện một đột biến mất khả năng gây bệnh, nhưng rất có thể đột biến đoạn c.1033delCT dẫn tới lệch toàn bộ trình c.1033delCT là đột biến tiềm năng gây ung tự khung sau đột biến tại exon 10. Đột biến tại thư võng mạc ở bệnh nhân RB79. vị trí này làm thay đổi acid amin thứ 345 từ Các đột biến còn lại chủ yếu là đột biến sai nghĩa (missense) chiếm tỷ lệ 5/6 (83,3%), Threonin thành Arginin dẫn tới tạo mã kết thúc sớm (stop codon) sau 6 codon kế tiếp. Đột biến điểm gây tạo mã kết thúc này xảy ra ngay trong đó có 03 đột biến dị hợp tử trên cùng exon 14. Đột biến tại vị trí c.1357 A > T làm tại vùng N-terminal, từ đó không thể tiếp tục biến đổi acid amin Tyrosin vị trí 452 thành dịch mã tạo thành các vùng có chức năng Phenylalanin gặp ở 2 bệnh nhân, 2 acid amin này đều thuộc nhóm acid amin chưa gốc nhân quan trọng của protein pRB. Tuy chưa tiến hành được các thử nghiệm RNA hay invivo để xác định mức độ ảnh hưởng của đột biến tới TCNCYH 115 (6) - 2018 thơm, sự ảnh hưởng có thể không rõ và cần phải kiểm chứng thêm. Còn đột biến tại vị trí 5