Phương pháp định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang trên tiêu bản mô học

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỨC ĐỘ PHẢN ỨNG<br /> MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG TRÊN TIÊU BẢN MÔ HỌC<br /> Tưởng Phi Vương*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: xây dựng phương pháp đánh giá định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh<br /> quang tiêu bản mô da người trên cơ sở kỹ thuật số phân tích ảnh chụp tiêu bản. Phương pháp:<br /> tính tỷ lệ diện tích vùng có tín hiệu huỳnh quang và tính cường độ sáng của từng ảnh thu<br /> bằng phần mềm ImageJ. Sử dụng test Spearson để tính tỷ số tương quan r các cặp số liệu.<br /> Kết quả: cả hai phương pháp đánh giá định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang<br /> đều thể hiện tính chính xác, đơn giản, dễ áp dụng, dễ phổ biến và thống nhất cao, sử dụng<br /> công cụ phần mềm hoàn toàn miễn phí, cũng như cho phép xử lý số liệu nghiên cứu bằng các<br /> thuật toán thống kê.<br /> * Từ khóa: Mô da; Miễn dịch huỳnh quang; Desmoglein-1.<br /> <br /> Quantitative-Analyzing Results of Immunofluoresence Stain on<br /> Histological Slide<br /> Summary<br /> Objectives: To create and estimate effectiveness of quantitative methods for estimating<br /> immunofluorescence reactions based on digital analysis of skin tissue slide photo from<br /> confocal laser scanning microscopy. Methods: Immunofluorescence reactions on cryostat<br /> sectioned and paraffin-slide of human skin were carried out with anti- desmoglein-1 antibody.<br /> The total of all immunofluorescence positive areas and mean of grey level in the digital photo<br /> were calculated automatically by using ImageJ PC software. Spearson test was used to analyze the<br /> correlation of this result. Results: Both quantitative methods in evaluation of immunofluorescence<br /> results are simple and easy to use with high level of validation and free image processing<br /> software. Beside, the immunofluorescence evaluation method based on photo grey level could help<br /> investigators more choices when statistically analyzing results of immunofluorescence reactions.<br /> * Keywords: Immunofluorescence quantitative methods; Skin tissue; Desmoglein-1.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Cùng với những thành tựu của khoa<br /> học kỹ thuật trong lĩnh vực y tế, sự ra đời<br /> của kính hiển vi đồng tiêu quét laser nhận<br /> được sự quan tâm của các nhà nghiên<br /> <br /> cứu, là công cụ hỗ trợ đắc lực cho nghiên<br /> cứu mô bệnh học bằng phương pháp miễn<br /> dịch huỳnh quang. Kết quả phản ứng miễn<br /> dịch huỳnh quang được biểu hiện trên ảnh<br /> chụp tiêu bản bằng kính hiển vi đồng tiêu<br /> quét laser với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.<br /> <br /> * Viện 69, Bộ Tư Lệnh Bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh<br /> Người phản hồi (Corresponding): Tưởng Phi Vương (tphivuong@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/08/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017<br /> <br /> 80<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> Tuy nhiên, việc đánh giá mức độ phản ứng<br /> miễn dịch huỳnh quang trên những ảnh này<br /> mới chỉ mang tính định tính (có - không,<br /> yếu - mạnh) và chưa thực sự khách quan.<br /> Điều này cho thấy cần phải xây dựng<br /> phương pháp đánh giá định lượng mức<br /> độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang để<br /> làm tăng tính chính xác và khách quan,<br /> tin cậy của kết quả nghiên cứu. Phần mềm<br /> phân tích ảnh kỹ thuật số miễn phí chuyên<br /> dụng cho nghiên cứu y sinh ImageJ của<br /> Viện Y học Quốc gia Mỹ cho phép chúng<br /> tôi thực hiện ý tưởng nghiên cứu này.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> Mẫu mô da người bình thường kích<br /> thước 1 x 1 cm, cố định bằng dung dịch<br /> formaldehyd 4% trong 24 giờ ở nhiệt độ<br /> phòng.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Chuẩn bị mẫu mô da:<br /> - Pha mẫu mô da thành hai phần, một<br /> phần để cắt lạnh và phần còn lại đúc<br /> paraphin.<br /> - Tiến hành cắt tiêu bản (cắt lạnh và<br /> cắt từ block paraphin) dày 4 µm (12 tiêu<br /> bản mỗi loại), gắn lên lam kính bằng dung<br /> dịch dán albumin pha glycerin.<br /> - Tiêu bản cắt từ block paraphin được<br /> tẩy paraphin, sau đó bộc lộ kháng nguyên<br /> bằng lò vi sóng (trong đệm citrate 10 mM,<br /> pH = 6, điện áp lò vi sóng 600 W, thời gian<br /> 30 phút).<br /> <br /> * Nhuộm miễn dịch huỳnh quang cả<br /> hai loại tiêu bản theo quy trình sau:<br /> - Rửa tiêu bản nhanh bằng đệm PBS.<br /> - Khử huỳnh quang không đặc hiệu bằng<br /> NaBH 4 0,01% trong đệm PBS, 3 lần,<br /> 5 phút/lần.<br /> - Rửa tiêu bản bằng đệm PBS, 3 lần,<br /> 2 phút/lần.<br /> - Bão hòa với huyết thanh dê 10% trong<br /> PBS (30 phút, nhiệt độ phòng).<br /> - Ủ với kháng thể trực tiếp (kháng<br /> Desmoglein) đ pha lo ng 50 lần (60 phút,<br /> nhiệt độ phòng).<br /> - Rửa nhanh bằng BSA/PBS 0,1%, 3 lần,<br /> 2 phút/lần.<br /> - Ủ với kháng thể gián tiếp gắn huỳnh<br /> quang (AF488) nồng độ 1:200 trong hộp<br /> kín, đậy bằng giấy bạc (60 phút, nhiệt độ<br /> phòng).<br /> - Rửa nhanh bằng BSA/PBS 0,1%, 3 lần,<br /> 2 phút/lần.<br /> - Rửa nhanh bằng PBS, 2 lần, 2 phút/lần.<br /> - Gắn glyxerol (glycerin: PBS = 9:1 theo<br /> tỷ lệ thể tích).<br /> - Để khô 10 phút ở nhiệt độ phòng trong<br /> hộp kín tránh ánh áng.<br /> - Soi tiêu bản nhuộm miễn dịch huỳnh<br /> quang bằng kính LSM 700 (Carl Zeiss,<br /> Đức) với nguồn lade Ex.488 nm, cường<br /> độ 5%, master gain 600, độ phóng đại<br /> 630 lần, pihole 56 µm. Chụp ảnh ở cùng<br /> một chế độ: ảnh 8 bít, độ phân giải 512 x<br /> 512 pixels tại vị trí vi trường có phản ứng<br /> miễn dịch huỳnh quang rộng nhất. Lưu ảnh<br /> thu được dưới dạng *jpg.<br /> 81<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> * Đánh giá kết quả phản ứng miễn dịch<br /> huỳnh quang bằng phần mềm ImageJ<br /> dựa trên tính toán diện tích vùng có tín<br /> hiệu huỳnh quang (hình 1):<br /> <br /> Hình 2: Tính cường độ sáng trung bình<br /> của ảnh tiêu bản bằng phần mềm ImageJ.<br /> Bước 1: Nhấn open để mở từng ảnh.<br /> <br /> Hình 1: Tính diện tích vùng có tín hiệu<br /> huỳnh quang bằng phần mềm ImageJ.<br /> Bước 1: Nhấn open để mở từng ảnh.<br /> Bước 2: Nhấn image: chọn type, chọn<br /> RGB stack, trên ảnh mở chọn ảnh green.<br /> Bước 3: Nhấn image: chọn adjust, chọn<br /> brightness/contrast, lọc bỏ grey level < 40,<br /> xong nhấn apply.<br /> Bước 4: Nhấn image: chọn adjust, chọn<br /> threshold, chọn dark background, red nhấn<br /> set: chọn lower threshold level: 40.<br /> Bước 5: Nhấn analyze: chọn set<br /> measurements, chọn area, chọn area<br /> fraction, chọn limit to threshold.<br /> Bước 6: Nhấn analyze: chọn measure.<br /> Trên màn hình sẽ hiển thị bảng kết quả<br /> * Đánh giá kết quả phản ứng miễn dịch<br /> huỳnh quang bằng phần mềm ImageJ<br /> dựa trên tính toán cường độ sáng của ảnh<br /> tiêu bản (hình 2):<br /> 82<br /> <br /> Bước 2: Nhấn image: chọn type, chọn<br /> RGB stack, trên ảnh mở chọn ảnh green.<br /> Bước 3: Nhấn image: chọn adjust, chọn<br /> brightness/contrast, lọc bỏ grey level < 40,<br /> xong nhấn apply.<br /> Bước 4: Nhấn analyze: chọn histogram,<br /> trên màn hình sẽ hiện ra đồ thị histogram<br /> với thông số mean phía dưới.<br /> Sau khi thu được kết quả tính diện tích<br /> và cường độ sáng trung bình của ảnh,<br /> tiến hành lập bảng 2 x 2 cho mỗi nhóm<br /> (nhóm tiêu bản cắt lạnh và nhóm tiêu bản<br /> paraphin) như sau:<br /> Mẫu<br /> <br /> Tỷ lệ<br /> diện tích<br /> <br /> Cƣờng độ sáng<br /> của ảnh<br /> <br /> 1<br /> …<br /> <br /> * Xử lý thống kê:<br /> Sử dụng test Spearson để tính tỷ số<br /> tương quan r kết quả tính diện tích và tính<br /> cường độ sáng của ảnh.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> <br /> b<br /> <br /> c<br /> <br /> d<br /> <br /> Hình 3: Kết quả bộc lộ kháng nguyên desmoglein trên tiêu bản cắt lạnh (a, c) và<br /> tiêu bản paraphin (b, d). Nhuộm miễn dịch huỳnh quang gian tiếp với kháng thể<br /> gắn huỳnh quang AF488.<br /> (Hình a, b: x100; Hình c, d: x630).<br /> Dấu ấn kháng nguyên desmoglein của<br /> liên kết desmosom trên tiêu bản cắt lạnh<br /> và tiêu bản paraphin đều cho kết quả<br /> dương tính. Hình ảnh dấu ấn kháng<br /> nguyên phát hiện thấy ở ranh giới giữa<br /> các tế bào (vùng liên kết giữa hai tế bào<br /> cạnh nhau bằng liên kết desmosome).<br /> Tập hợp các dấu ấn kháng nguyên này<br /> tạo thành dạng mạng lưới đặc trưng.<br /> <br /> Dấu ấn kháng nguyên được bộc lộ ở<br /> tất cả các lớp trên thượng bì nhưng với<br /> cường độ mạnh nhất tại vị trí giữa các<br /> tế bào lớp gai. Trên màng đáy không<br /> thấy xuất hiện dấu ấn kháng nguyên<br /> desmoglein-1. Trong khi giữa các lá vảy<br /> sừng vẫn xuất hiện những dấu ấn kháng<br /> nguyên này.<br /> 83<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> Sử dụng phần mềm ImageJ để tính tỷ<br /> lệ diện tích vùng có tín hiệu huỳnh quang<br /> và cường độ sáng đối với mỗi ảnh chụp<br /> của nhóm tiêu bản cắt lạnh và nhóm tiêu<br /> bản paraphin rồi lập đồ thị tương quan<br /> giữa kết quả như sau:<br /> <br /> Có mối tương quan tuyến tính (r ≈ 1)<br /> giữa kết quả tính tỷ lệ diện tích huỳnh<br /> quang và cường độ sáng tương ứng<br /> của ảnh tiêu bản cắt lạnh cũng như tiêu<br /> bản đúc paraphin với độ tin cậy cao<br /> (p < 0,00001). Nói cách khác, kết quả thu<br /> được từ hai phương pháp đánh giá mức<br /> độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang này<br /> tương đồng nhau.<br /> BÀN LUẬN<br /> <br /> Đồ thị 1: Mối tương quan giữa kết quả tính<br /> tỷ lệ diện tích huỳnh quang và cường độ<br /> sáng của ảnh tiêu bản cắt lạnh.<br /> 3.5<br /> y = 1.0527x - 0.34<br /> <br /> Tỉ lệ diện tích<br /> <br /> 3<br /> <br /> R2 = 0.9909<br /> <br /> 2.5<br /> 2<br /> 1.5<br /> 1<br /> 0.5<br /> 0<br /> 0<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> Cường độ sáng trung bình<br /> <br /> Đồ thị 2: Mối tương quan giữa kết quả<br /> tính tỷ lệ diện tích huỳnh quang và<br /> cường độ sáng trung bình của ảnh<br /> tiêu bản đúc paraphin.<br /> 84<br /> <br /> Phương pháp đánh giá phản ứng miễn<br /> dịch huỳnh quang trên tiêu bản mô dựa<br /> trên tính toán diện tích vùng có tín hiệu<br /> huỳnh quang bằng phần mềm ImageJ đ<br /> được nhiều nghiên cứu sử dụng như:<br /> trong đánh giá diện tích vùng cơ tim bị tổn<br /> thương ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim [3]<br /> hay nghiên cứu đánh giá mức độ xơ hóa<br /> gan bằng cách tính diện tích vùng xơ sau<br /> khi sử dụng các thuốc nhuộm collagen [1].<br /> Cũng trên cơ sở nguyên tắc tính diện tích<br /> của các nghiên cứu này, chúng tôi vận<br /> dụng để tính diện tích vùng nhuộm miễn<br /> dịch huỳnh quang trên tiêu bản mô, từ đó<br /> gián tiếp đánh giá mức độ phản ứng miễn<br /> dịch huỳnh quang. Phương pháp này được<br /> chọn để đối chứng cho đánh giá phản<br /> ứng miễn dịch huỳnh quang mà chúng tôi<br /> nghiên cứu xây dựng.<br /> Phương pháp đánh giá phản ứng miễn<br /> dịch huỳnh quang thông qua chỉ số cường<br /> độ sáng ảnh, cho đến nay chưa thấy<br /> nghiên cứu nào sử dụng. Ý tưởng sử<br /> dụng cường độ sáng của ảnh kỹ thuật số<br /> xuất phát từ đặc điểm của ảnh tiêu bản<br /> nhuộm huỳnh quang chỉ hiển thị vùng tín<br /> hiệu huỳnh quang trên nền tối của tiêu bản.<br /> Do đó, cường độ sáng của ảnh thu được<br /> phản ánh trực tiếp cường độ huỳnh quang<br /> <br />