1/ Phương pháp nhuộm Gram còn gọi là phương pháp nhuộm phân biệt :
Vì giúp ta phân biệt vi khuẩn thành 2 nhóm lớn: vi khuẩn G+ (gram-positive) bắt màu tím và vi
khuẩn G- (gram-negative) bắt màu hồng. Ngoài ra nó còn giúp ta quan sát rõ và phân biệt về
hình dáng, cấu tạo, cách phân bố của các loại vi khuẩn khác nhau.
2/ Mô tả sự khác nhau giữa vách tế bào G+ và G- :
Vách tế bào G+ : rất dày gồm một lớp peptidoglycan còn được gọi là murein chiếm 80%-90%
thành phần vách tế bào.
Peptidoglycan là loại polime xốp, không tan, khá cứng và bền vững bao quanh tế bào như một
mạng lưới. Cấu trúc cơ bản của peptidoglycan gồm 3 thành phần: N-acetylglucosamine (NAG),
acid N-acetylmuramic (NAM) và tetrapeptide gồm cả loại L và D acid amine.
Ðể tạo thành mạng lưới cứng, tetrapeptide trên mỗi chuỗi peptidoglycan liên kết chéo với
tetrapeptide trên chuỗi khác.
Bên trong lớp peptidoglycan là acid teichoic - hợp chất polymer của ribitol-phosphate và glycerol
phosphate - một thành phần đặc trưng của tế bào vi khuẩn G+ vừa liên kết với peptydoglycan vừa
liên kết với màng sinh chất. Phần liên kết với peptidoglycan gọi là acid lipoteichoic.
Hiện nay đã biết được nhiều kiểu peptidoglycan ở các loài khác nhau gọi là cầu trung gian.
Vách tế bào G-: có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp. Trong cùng là một lớp peptidoglycan mỏng, cách
một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp
lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide.
Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong,
còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8-10 nm gồm 3 thành phần:
+ Lipid A.
+ Polysaccharide lõi.
+ Kháng nguyên O.
Màng ngoài còn có thêm các protein:
+ Protein cơ chất: porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một
số loại phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ…
+ Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua màng ngoài
như: nucleotide, vitamin B12,…
+ Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài.
3/ Mô tả và giải thích sự bắt màu của vi khuẩn G+ và G- qua từng giai đoạn nhuộm màu :
Bước 1: nhuộm tím tinh thể (crystal violet) trong 1 phút.
G+ và G- đều có màu tím do màu thấm vào lớp peptidoglycan của G+ và màng ngoài của G-.
Bước 2: thêm dung dịch Lugol, để 1 phút.
G+ và G- có màu tím đậm hơn do iot tạo phức chất màu với tím tinh thể và cố định màu.
Bước 3: Tẩy bằng cồn 96o (15-30 giây).
G+ cồn làm cho các lỗ peptidoglycan co lại do đó phức chất tím tinh thể - iot bị giữ lại trong tế
bào.
G- do cồn làm tan lớp màng ngoài có màu, bản chất là lipid dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím tinh
thể - iot, do đó trong giai đoạn này G- sẽ mất màu.
Bước 4: nhộm tiếp Safranin hay Fuchsin Ziehl.
G+ vẫn giữ màu tím do không bắt màu Safranin hay Fuchsin Ziehl còn G- bắt màu hồng.
Kết luận: với phương pháp nhuộm Gram như trên, G+ giữ lại màu tím, G- giữ lại màu hồng.
4/ Cách cố định tiêu bản :
Mục đích là giết chết vi khuẩn và giữ vi khuẩn cố định trên kính không bị trôi trong quá trình
nhuộm. Các cách cố định tiêu bản:
_ Bằng ngọn lửa: hơ nhanh tiêu bản qua ngọn lửa đèn cồn .
_ Bằng cồn: cho cồn 96o vào tiêu bản và để cồn bay hơi hết.
_ Ðể tiêu bản khô tự nhiên.
5/ Các yếu tố làm sai lệch kết quả nhuộm :
* Sai xót trong thao tác nhuộm Gram, do thực hiện chưa chính xác một vài giai đoạn sau:
+ Cố định tiêu bản bằng ngọn lửa không đúng sẽ làm cho màng tế bào bị biến tính dẫn đến sai
lệch kết quả nhuộm.
+ Nhuộm tím tinh thể quá lâu ở G- làm màu thấm vào lớp peptidoglycan bên trong, nên khi tẩy
bằng cồn không thể làm sạch màu tím dẫn đến việc G- bắt màu như G+.
* Do thời gian nuôi cấy, tuổi của vi khuẩn: nuôi cấy vi khuẩn nhiều lần làm mất dần tính chất điển
hình của chúng, vì vậy khi nhuộm sẽ không chính xác.
* Cấu trúc lớp peptidoglycan của nhiều loài vi khuẩn không phải lúc nào cũng giống nhau hoàn
toàn, độ dày có thể sai khác vì vậy khi thực hiện phương pháp nhuộm phải chú ý đến thời gian
nhuộm hoá chất cho thích hợp với từng loài.
Gram (vi t t t G) là tên c a nhà vi khu n h c ng i Đan M ch.Ông này đã dùng thuócế ắ ủ ẩ ọ ườ ạ
nhu m đê nhuu m màu và phân bi t hai nhóm vi khu n có c u t o khác nhau ( Chộ ộ ệ ẩ ấ ạ ủ
y u là khác nhau thành ?t bào ? :?: ) vi khu n ?G(+) sau khi nhu m màu soi trênế ở ế Ở ẩ ộ
kính hi n vi chúng b t màu tím-xanh,còn G(-) b t màu h ng. Đây là ph ng phápể ắ ắ ồ ươ
nhu m màu ph bi n đ n nay v n còn đ c s d ng. Đ nh n đ n Christian Gramộ ổ ế ế ẫ ượ ử ụ ể ớ ơ ế
nên ng i ta đ t tên c a ph ng pháp ?nhu m màu này là nhu m Gram.ườ ặ ủ ươ ộ ộ
Thành t bào vi khu n Gram âm có c u trúc:ế ẩ ấ
- Peptidoglican là thành ph n th y u, ko ch a axit teicoicầ ứ ế ứ
- Màng ngoài c u trúc: protein và l p đôi photpholipit có kh m protein đ c bi t -> b oấ ớ ả ặ ệ ả
v vi khu n ch ng s th m y u t hóa h c bên ngoài, ngăn ch n s xâm nh p c aệ ẩ ố ự ấ ế ố ọ ặ ự ậ ủ
lizozim
- Kho ng không gian ch a đ c t , các enzim -> phá h y kháng sinh tr c khi tác đ ngả ứ ộ ố ủ ướ ộ
lên màng sinh ch tấ
- C u trúc nhi u l p -> b o vấ ề ớ ả ệ
_do c u tao các l p màng nên tiên mao c a gram (+) thì g c có 2 vòng khuyên còn viấ ớ ủ ố
khu n gram (-) g c có 4 vòng khuyênẩ ố
_v axitamin gram(+) có 3-4 lo i còn gram (-) có 17-18 lo iề ạ ạ
_t l ARN:ADN gram (+) là 8:1 còn gram (-) là 1:1ỉ ệ ở
_Gram (+) không có khoang chu ch t còn gram (-) có khoang chu ch tấ ấ
-Đ u tiên ng i ta nh thu c tím tinh th (Crystal Violet) thì G+ không có l p v nh yầ ườ ỏ ố ể ớ ỏ ầ
b o v nên có màu tím ,G- thì có nên không b t màu thu c tímả ệ ắ ố
-Sau đó r a b ng dd c n cho trôi l p v nh y điử ằ ồ ớ ỏ ầ
-Nh dd Fushin thi vi khu n G+ có thành t bào dày h n nên có màu tim tím đo đ ,cònỏ ẩ ế ơ ỏ
G- có thành t bào m ng h n nên b t màu đ c a dd thu c nhu mế ỏ ơ ắ ỏ ủ ố ộ