Thuyết trình Kỹ thuật di truyền: Thư viện bộ gen và ngân hàng cDNA

Chia sẻ: Ngô Thị Thảo Ngân | Ngày: | Loại File: PPTX | Số trang:38

Thêm vào BST

Báo xấu

270
lượt xem 51
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Thuyết trình Kỹ thuật di truyền: "Thư viện bộ gen và ngân hàng cDNA" gồm 2 nội dung chính. Cụ thể trình bày về khái niệm và quá trình thành lập thư viện bộ gen và thư viện cDNA. Hy vọng đây là tài liệu tham khảo hữu ích cho bạn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thuyết trình Kỹ thuật di truyền: Thư viện bộ gen và ngân hàng cDNA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MH. KỸ THUẬT DI TRUYỀN THƯ VIỆN BỘ GEN VÀ THƯ VIỆN cDNA GVHD: TS. Trần Thị Dung
NỘI DUNG CHÍNH THƯ VIỆN THƯ VIỆN BỘ GEN cDNA
THƯ VIỆN BỘ GEN KHÁI NIỆM QUÁ TRÌNH THÀNH LẬP
KHÁI NIỆM • Chia nhỏ DNA bộ gen và Thư viện gen chèn chúng vào tế bào chủ. (Ngân hàng gen) • Chứa tất cả DNA bộ gen của sinh vật .
QUÁ TRÌNH THÀNH LẬP TÁCH CHIẾT DNA ĐƯA VÀO TẾ BÀO CẮT TẠO DÒNG GẮN VECTOR SÀNG LỌC
TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH DNA » Lấy mẫu vật (nuôi cấy vi sinh vật, nghiền mẫu mô động vật, thực vật ở nhiệt độ thấp). » Phá vỡ màng tế bào và màng nhân. » Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là protein.(chiết xuất bằng phenol). » Cô đặc DNA lại bằng ethanol hay isopropanol lạnh. » Rửa lại DNA bằng ethanol lạnh và đem bảo quản DNA trong dung dịch TE (ở nhiệt độ thấp).
PHÂN CẮT DNA BỘ GEN • Sử dụng enzyme cắt giới hạn RT (Reverse Transcriptase) • Mỗi loại enzyme cắt tại một vị trí đặc hiệu trên DNA và vector chuyển gen. => Tạo ra 2 thư viện gen khác nhau khi cắt bằng 2 loại enzyme RT.
• Sử dụng enzyme Alkaline phosphatase • Enzyme được dùng để : ü Loại nhóm 5’ phosphate của DNA hay RNA trước khi đánh dấu phóng xạ. ü Loại nhóm 5’ phosphate của DNA hay RNA. Không bị nối vòng khi cắt bằng RT ü T4 polinucleotide kinase và alkaline phosphatase thường được sử dụng đồng thời trên vector và đoạn DNA cần gắn xen trong kỉ thuật tạo dòng.
TẠO DNA TÁI TỔ HỢP • Sử dụng enzyme nối Ligase E.Coli DNA ligase ENZYME T4 DNA ligase LIGASE T4 RNA ligase T4 POLYNUCLEOTIDE KINASE
ĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ • Mục đích: – Sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao .Tuỳ thuộc loại tế bào chủ , người ta sử dụng một kĩ thuật chuyển thích hợp. – Tách chiết plasmid cho thí nghiệm tạo dòng.
ĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ • Loại tế bào chủ 1. E. coli 2. Eukaryote
ĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ • Phương pháp thực hiện: – Hóa biến nạp: CaCl2 + sốc nhiệt – Điện biến nạp: dòng điện cao thế cục bộ
TẠO DÒNG • Tế bào được nuôi cấy tạo thành những dòng mới chứa DNA tái tổ hợp. • Môi trường nuôi cấy tạo dòng thường là: – M9 (Thành phần dinh dưỡng xác định) – LB (Thành phần dinh dưỡng chưa xác định) • Chuẩn bị cho giai đoạn sàng lọc
SÀNG LỌC THƯ VIỆN ĐỂ NHẬN TRÌNH TỰ ĐÍCH • Sau khi thư viện gen được tạo ra. Các phương pháp thông dụng được sử dụng để nhận dạng: – Lai DNA với mẫu dò DNA đánh dấu sau đó sàng lọc để chọn dấu mẫu dò bằng phép chụp ảnh phóng xạ. – Sàng lọc để chọn sản phẩm protein bằng phương pháp miễn dịch, thử hoạt tính protein, hoặc thử nghiệm bổ trợ (di truyền) chức năng.
THƯ VIỆN cDNA KHÁI NIỆM PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ ỨNG DỤNG VÀ THÀNH TỰU
KHÁI NIỆM cDNA DNA bổ trợ (complementary DNA) DNA tổng hợp từ mRNA với xúc tác của enzyme RT (reverse transcriptase)
KHÁI NIỆM • Tập hợp các cADN tổng hợp từ các mARN. Thư viện cDNA (Ngân hàng cDNA) • Thiết lập trên vector (plasmid hoặc phage lambda) • Đối tượng áp dụng: eukaryote