intTypePromotion=3

Tiểu luận Kỹ thuật di truyền: Kỹ thuật Rapd (Random amplified polymorphic DNA)

Chia sẻ: Ngô Thị Thảo Ngân | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:7

0
254
lượt xem
71
download

Tiểu luận Kỹ thuật di truyền: Kỹ thuật Rapd (Random amplified polymorphic DNA)

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tiểu luận Kỹ thuật di truyền với đề tài "Kỹ thuật Rapd (Random amplified polymorphic DNA)" trình bày nội dung sau: giới thiệu, nguyên lý, các ưu nhược điểm của kỹ thuật Rapd, những khác biệt của Rapd với PCR, ứng dụng, những cải tiến của kỹ thuật Rapd.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Tiểu luận Kỹ thuật di truyền: Kỹ thuật Rapd (Random amplified polymorphic DNA)

  1.                               TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM                                    TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG                                                     ­­­­­­­­­­­o0o­­­­­­­­­­­­­                                      MÔN HỌC: KỸ THUẬT DI TRUYỀN       CHỦ ĐỀ: KỸ THUẬT RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA)                                            GVHD: THS. TRẦN THỊ DUNG                                                    NHÓM THỰC HIỆN:                   1.   BÙI MINH TRÍ                                     61203161                  2.   HUỲNH THUẬN PHÁT                      61203109                  3.   NGUYỄN THỊ NGỌC TRINH             61203163 I. Giới thiệu:             _ Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng  những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt  cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với  trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống  nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện như nhau  sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng  bằng nhau.               _ Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp  ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau  giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Một  trong những giới hạn của PCR chuẩn đối với ALP marker là mọi thông  tin về chuỗi mã di truyền đầu tiên phải được biết rõ trước khi chuẩn bị  các primer 23 tương ứng.               _ Vì thế, việc áp dụng nó để nghiên cứu DNA genome của một  giống cây trồng mới sẽ gặp nhiều khó khăn. Vào đầu thập kỷ 90, một  kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên gọi là RAPD 
  2. (Random amplified polymorphic DNA) đã ra đời một cách độc lập tại  hai phòng thí nghiệm khác nhau (William, 1990; Welsh và ctv., 1991).           Hình ảnh một trong các bước thực hiện phương pháp RAPD  (PCR) II. Nguyên lý:            _ Về cơ bản kỹ thuật RAPD được thực hiện theo ba bước: Tách  chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR; điện di trên gel agarose  hoặc gel polyacrylamid; xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần  mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập  dendrogram)            
  3.                                       Hình ảnh của kỹ thuật PCR           _ Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA  được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng một primer chứa một trật tự  nucleotide ngẫu nhiên. Thường primer này chứa từ 9 ­ 12 oligonucleotit,  tối thiểu là 4 bp. Có hàng ngàn loại primer chứa khoảng 10 bp nhưng số  lượng primer dùng trong nghiên cứu này rất hạn chế.            _ Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau  ở hai mạch đơn đối diện của DNA khuôn. Nếu các điểm gắn primer  nằm trong khoảng có thể nhân bản được (thường 200 ­ 2000 nucleotide)  thì đoạn DNA sẽ được nhân lên.          _ Sự có mặt của sản phẩm này được quan sát thông qua điện di  trên gel agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tương đồng hoàn  toàn hay một phần giữa DNA genome với các primer oligonucleotide.  Các primer dùng trong RAPD có kích thước ngắn nên dễ tìm được các  đoạn tương đồng trên các mạch đơn DNA trong genome. Vì thế, nó là  một phương pháp có hiệu quả để xác định tính đa hình về trật tự  nucleotide giữa các cá thể 24.     Ví dụ: tần số tìm thấy sự đa hình RAPD là 0,3 / 1 primer ở cây  Arabidopsis thaliana là 0,5 / 1 primer ở cây đậu tương, 1 / 1 primer ở  ngô. III. Các ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật RAPD: 1. Ưu điểm:              _ Về mặt kỹ thuật:                    + Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không  cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu. 
  4.                    + Thao tác đơn giản.                     + Chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao.                     + Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao.              _ Về mặt kinh tế:                    + Chi phí thực hiện thấp.                     + Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những  kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ  thị phân tử có độ tin cậy cao             _ Chỉ thị RAPD không cần biết trước trình tự nuleotide của đoạn  DNA cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho  đa hình cao, tiến hành chỉ với một lượng nhỏ DNA tính bằng nanogam  và trên một số lượng mẫu thí nghiệm lớn.              _ Đồng thời RAPD không dùng chất phóng xạ để phát hiện đa  hình. Do đó RAPD thường dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ  thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công  tác lai tạo hoặc phân loại.             _ Để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD có thể  tiến hành với các bước như sau:                       + Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR.                       + Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid.                       + Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm  thông dụng (NTSYS­pc, UPGMA cluster.).          Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa đạng sinh học và  nguồn gốc di truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ  thị RAPD cũng được sử dụng cho những mục đích sau: 
  5.                     + Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một  tính trạng nào đó như tính trạng chất lượng sợi ở cây bông, tính trạng  kháng virus ở cà.                       + Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể.                       + In dấu vân tay (DNA fingerprinting).                       + Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (Somaclonal  variation). 2. Nhược điểm:            _ Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền  nhưng chỉ thị RAPD cũng có một số hạn chế như sau:                       + Có tính trội (dominant) do đó khó phân biệt được những  gen lặn hay cá thể dị hợp tử.                       + Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường  không thống nhất.                      + Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu.                       + Độ tin cậy còn tuỳ thuộc vào kỹ thuật cá nhân.               _ Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao.              _ Không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp).               _ Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng  xuất hiện đa hình thấp              _ Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy  không cao. IV. Những khác biệt của RAPD với PCR:        _ Do tính chất ghép cặp ngẫu nhiên nên primer vừa là primer  xuôi vừa là primer ngược.
  6.        _ RAPD không cho băng nhân bản nếu:                      + Không có trình tự nu giống trình tự primer trong genom  của đối tượng nghiên cứu.                      + Có các trình tự này nhưng lại cũng nằm trên một sợi hay  các trình tự nằm ở hai sợi quá xa nhau hay khi ghép cặp các primer  không hướng vào nhau.              _ Phải sử dụng nhiều primer khác nhau mới có thể phát hiện  được những đa hình hay các khác biệt của genom của đối tượng nghiên  cứu.              _ Có thể dùng phối hợp vài primer cùng một phản ứng để tăng  số băng nhân bản. V. Ứng dụng:            _ Ứng dụng của kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD được phát minh  và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ  tin cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do ưu điểm dễ thực  hiện và chi phí thấp.             _ Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD:                        + Đánh giá đa dạng di truyền: Đã được áp dụng trên các  đối tượng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây,  khoai tây, cà chua,… Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện  thí nghiệm, chương trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp  cho sự đa hình cao.                       + Đối với nấm bệnh thực vật thì kỹ thuật RAPD đã được  áp dụng để phân tích đa dạng di truyền của nhiều loại nấm khác nhau  như: Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et de Not, Corynespra  cassiicola, Rhizoctonia solani, ...
  7.                       + Nhận diện chỉ thị phân tử: Ở Việt Nam, nghiên cứu đa  dạng di truyền và mối tương quan giữa kiểu gene và kiểu hình phản ánh  bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam VI.  Những cải tiến của kỹ thuật RAPD:                            + Kỹ thuật thứ nhất: sử dụng cùng lúc 2 primer khác  nhau thay vì sử dụng 1 primer như kỹ thuật RAPD thông thường.  Phương pháp này có thể làm tăng hoặc giảm đi số băng so với khi sử  dụng một primer. Việc lựa chọn, sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau  một cách phù hợp cũng có thể làm tăng tính đa hình của những primer  cho sản phẩm ít đa hình.                             + Kỹ thuật thứ hai: cắt DNA bằng các enzyme giới hạn  trước hoặc sau khi thực hiện phản ứng PCR. Sự cắt này cũng có thể tạo  ra hai kết quả. Một là có thể làm giảm số lượng các băng khó xác định  (complex band), điều đó làm dễ dàng hơn cho việc đánh giá đa dạng di  truyền. Hai là tạo ra sự đa hình ở các mẫu có hạn chế về sự đa hình.  Tuy nhiên việc sử dụng những cải tiến tuỳ thuộc vào chiến lược nhằm  làm tăng số chỉ thị đa hình có thể hoặc đạt được các chỉ thị đồng trội.  Những cải tiến này có hạn chế là làm giảm đi lợi thế của kỹ thuật  RAPD cụ thể là tốc độ, giá thành và sử dụng phức tạp hơn 

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản