Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:42

Thêm vào BST

Báo xấu

49
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án nghiên cứu với mục tiêu tạo được chủng virus cúm tái tổ hợp làm giống gốc cho sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm gia cầm do virus độc lực cao A/H5N1 clade 1.1 và A/H5N1 clade 2.3.2.1c gây nên bằng ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Thu Hằng NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS TÁI TỔ HỢP LÀM VACCINE PHÒNG CHỐNG CÚM A/H5N1 BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NGƯỢC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9 42 01 21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Nguyễn Trung Nam Viện Công nghệ sinh học 2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà Viện Công nghệ sinh học học Hà Nội, 2019
Luận án được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Trung Nam, Viện Công nghệ sinh học 2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận án phiên chính thức Họp tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi: giờ phút, ngày tháng năm 2019 Có thể tìm đọc Luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trang web của Bộ giáo dục và đào tạo (website: http://luanvan.moet.gov.vn)
- Thư viện của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cúm A/H5N1 là bệnh truyền nhiễm cấp tính ở người và gia cầm , do virus cúm A subtype H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Trong nhóm virus cúm A, virus A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI H5N1) thường gây chết gia cầm hàng loạt, có thể lây nhiễm sang người nên luôn là mối nguy hiểm tiềm ẩn trong chăn nuôi gia cầm và sức khỏe cộng đồng. Biện pháp phòng chống bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm hiệu quả là tiêm phòng vaccine. Ở Việt Nam, công tác sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm từ năm 2003 (dịch cúm do virus HPAI H5N1 lần đầu xuất hiện) đến nay vẫn chủ yếu sử dụng chủng virus gốc tái tổ hợp lắp ráp bằng di truyền ngược có nguồn gốc từ nước ngoài. Sự phụ thuộc vào chủng giống nhập ngoại khiến công tác sản xuất vaccine cúm gia cầm ở Việt Nam thiếu tính chủ động và gặp nhiều khó khăn. Để chủ động đối phó với những diễn biến phức tạp của các dịch cúm gia cầm có khả năng bùng phát, Việt Nam cần xây dựng và làm chủ qui trình ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược (Reverse Genetics) để chủ động tạo ra các chủng virus vaccine có hiệu quả bảo hộ cao với những chủng virus đang lưu hành trong nước. Trong số các clade virus cúm HPAI H5N1 đã và đang lưu hành ở Việt Nam, clade 1.1 và clade 2.3.2.1c có tính tương đồng kháng nguyên và đặc tính di truyền với nhiều clade virus gây dịch ở Việt Nam nên đáp ứng yêu cầu của chủng dự tuyển vaccine phòng chống cúm A/H5N1. Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn, luận án tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược”. Mục tiêu nghiên cứu Tạo được chủng virus cúm tái tổ hợp làm giống gốc cho sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm gia cầm do virus độc lực cao A/H5N1 clade 1.1 và A/H5N1 clade 2.3.2.1c gây nên bằng ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược. Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập cDNA của 6 phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) mã hóa các protein khung của virus cúm A/PR/8/34 và tách dòng riêng rẽ từng gen vào plasmid pHW2000. 2. Thiết kế và tách dòng hai gen H5 HA (đã được loại bỏ các amino acid kiềm ở vị trí vùng độc và tránh lại độc) và hai gen N1 NA của chủng A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1) (clade 1.1) và A/duck/Viet Nam/HT 02/2014(H5N1) (clade 2.3.2.1c) vào plasmid pHW2000. 3. Chuyển nhiễm hệ thống 6 + 2 plasmid đơn gen (6 plasmid mang phân đoạn gen khung + 2 plasmid mang gen H5 và N1 của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2.1c) vào tế bào 293T để tái tạo hai loại virus tái tổ hợp rgA/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c. 4. Phân lập và tuyển chọn chủng virus rgA/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c đáp ứng yêu cầu của chủng ứng viên vaccine: Có khả năng thích ứng nhân lên trong trứng gà sạch có phôi với hiệu giá HA cao, có tính ổn định di truyền. 5. Xác định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu (hiệu giá HI) của hai chủng virus ứng viên vaccine rgA/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1
clade 2.3.2.1c ở gà sạch 3 ngày tuổi. Đóng góp mới của luận án 1. Là công trình khoa học đầu tiên chứng minh Việt Nam đã làm chủ công nghệ di truyền ngược để tái tạo hiệu quả chủng virus ứng viên vaccine cúm A. Trong tương lai, trên cơ sở đã nắm vững qui trình công nghệ tạo chủng virus gốc bằng di truyền ngược, có thể kiểm soát kịp thời dịch bệnh cúm A/H5N1 ở gia cầm bằng ứng dụng công nghệ di truyền ngược để lắp ráp nhân tạo nhanh chủng virus ứng viên cho sản xuất vaccine có hiệu quả phòng vệ với các biến chủng virus mới xuất hiện. 2. Đã tối ưu một số yếu tố công nghệ trong qui trình chuyển nhiễm hệ thống 6 + 2 plasmid đơn gen vào tế bào 293T cho tái tạo chủng virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp. 3. Tạo hai chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1 (rgA/H5N1 clade 1.1 và rg A/H5N1 clade 2.3.2.1c) có khả năng thích ứng nhân lên với hiệu suất cao trong trứng gà sạch có phôi (hiệu giá HA ≥ 1: 1024 ở thế hệ P1 P5), có tính ổn định di truyền và kích thích sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tạo kháng thể ở gà sạch 3 ngày tuổi (100% gà tiêm kháng nguyên virus có hiệu giá kháng thể đạt HI ≥ 4 log2 ở tuần 2 và tuần 4 sau tiêm phòng). Cấu trúc luận án Luận án gồm 150 trang, được chia thành các phần: Mở đầu: 4 trang Chương 1. Tổng quan tài liệu: 34 trang Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 25 trang Chương 3. Kết quả nghiên cứu: 50 trang Chương 4. Bàn luận kết quả: 14 trang Kết luận và kiến nghị: 1 trang Các công trình đã công bố của tác giả: 1 trang. Tóm tắt nội dung luận án bằng tiếng Anh: 5 trang Tài liệu tham khảo: 16 trang Luận án có 20 bảng số liệu, 36 hình và 172 tài liệu tham khảo gồm tài liệu tiếng Việt và tài liệu tiếng Anh. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về virus cúm A/H5N1 Virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, có genome RNA sợi đơn, âm (ss()RNA), gồm 8 phân đoạn genome, trong đó 6 phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) mã hóa các protein tạo bộ khung và 2 phân đoạn gen mã hóa protein kháng nguyên (HA, NA) định vị trên bề mặt virion. Nhóm virus cúm A được phân thành nhiều subtype khác nhau dựa trên kháng nguyên HA (Hemagglutinin) và NA (Neuraminidase) với 18 subtype HA (H1 H18) và 11 subtype NA (N1 N11), có khả năng tái tổ hợp để tạo nên hàng trăm subtype khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Trong số các subtype virus cúm A, subtype H5N1 đã được chứng minh có khả năng lây nhiễm từ động vật sang người. Các chủng virus cúm A/H5N1 độc lực cao Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) H5N1 có thể lây nhiễm nhanh trên nhiều loại gia cầm, động vật có vú và người với khả năng đột biến cao và tái tổ hợp di truyền lớn. Protein HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstrom (Å), cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2
(27 kDa) nối với nhau bằng một đoạn oligopeptide ngắn giàu các amino acid kiềm arginine (R) và lysine (K) ở vị trí amino acid 338 – 345/346. Đặc điểm của vị trí giàu các amino acid kiềm giữa HA1 và HA2 quy định tính độc của virus nên được gọi là “vùng độc”: Ở vị trí vùng độc, các chủng virus A/H5N1 độc lực cao chứa một nhóm amino acid kiềm, trong khi các chủng virus A/H5N1 độc lực thấp chỉ chứa 1 amino acid kiềm arginin hoặc lysine (Suzuki et al., 2005). Protein NA có hoạt tính enzyme Neuraminidase, xúc tác phản ứng cắt mối liên kết glycoside giữa thụ thể chứa sialic acid trên bề mặt tế bào chủ và gai glycoprotein trên vỏ virus, giúp virus xâm nhiễm vào tế bào chủ (Yano et al., 2008; da Silva et al., 2015). 1.2. Vaccine phòng chống cúm A/H5N1 ở gia cầm Vaccine cúm A cần được làm mới (thay đổi chủng giống) hàng năm để chắc chắn có hiệu lực phòng vệ với các chủng virus đang lưu hành hay mới xuất hiện. Đây là một trong những trở ngại, thách thức và gây khó khăn cho việc sản xuất vaccine, nhưng là cần thiết để thích ứng với khả năng tiến hóa rất nhanh, dễ xuất hiện biến chủng do sự chuyển dịch kháng nguyên, đột biến và tái tổ hợp gen xảy ra phổ biến ở virus cúm (Pronker et al., 2012). Hướng dẫn của WHO cho phát triển nhanh chủng virus vaccine vừa có đặc tính kháng nguyên (quy định bởi phân đoạn gen HA và NA) giống các chủng virus đang lưu hành, vừa có khả năng nhân lên tạo hạt virus với hiệu suất cao là tái tạo chủng virus tái tổ hợp làm ứng viên vaccine có bộ gen được lắp ráp nhân tạo theo công thức 6 + 2 (6 phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/1934(H1N1) và 2 phân đoạn gen mã hóa protein kháng nguyên HA và NA của virus hoang dại đang lưu hành). 1.3. Di truyền của các clade virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam Quá trình hình thành các clade cúm HPAI H5N1 đã từng gây dịch ở Việt Nam rất phức tạp với các clade xuất hiện phổ biến như sau: Giai đoạn năm 2003 đến 2006: Clade 1 và clade 2.3.2 xuất hiện và gây dịch trên phạm vi toàn quốc. Giai đoạn năm 2007 đến 2013: Xuất hiện chủ yếu các biến chủng thuộc ba clade: 1.1, 2.3.4 và 2.3.2.1. Trong đó: Clade 2.3.4 xuất hiện năm 2007 và gây dịch bệnh trên gia cầm giai đoạn 2007 2010, từ năm 2011 đến 2013 không thấy xuất hiện; clade 1.1 phát sinh từ clade 1, xuất hiện năm 2007 và gây bệnh chủ yếu ở các tỉnh phía Nam, từ năm 2011 phân nhánh thành clade 1.1.1 và clade 1.1.2; clade 2.3.2 xuất hiện lần đầu năm 2005, từ năm 2009 được phân nhánh thành clade 2.3.2.1, sau đó tiếp tục phân thành các nhánh 2.3.2.1 nhóm A (clade 2.3.2.1a), 2.3.2.1 nhóm B (clade 2.3.2.1b) và 2.3.2.1 nhóm C (clade 2.3.2.1c). Trong số các clade thuộc nhánh 2.3.2.1, virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1c gây dịch trên diện rộng (từ Bắc vào Nam). Giai đoạn từ năm 2014 đến nay: Clade 2.3.2.1c tiếp tục lưu hành, clade 2.3.4 phân nhánh thành clade 2.3.4.4 và clade 1.1 có nguy cơ bùng phát trở lại (Chu et al., 2016, Nguyen et al., 2017; Mellor et al., 2018). 1.4. Áp dụng kỹ thuật di truyền ngược trong nghiên cứu phòng chống virus cúm A Kỹ thuật di truyền ngược (Reverse Genetics) được ứng dụng phổ biến trên thế giới trong nghiên cứu tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A từ các cDNA của virus đã được tạo dòng vào plasmid. Ưu điểm của kỹ thuật là cho phép thao tác với genome virus ở mức độ phân tử để tạo hạt virus mang đặc tính mong muốn (Chen et al., 2012; Palese & Shaw, 2007; Neumann et al., 2004). Trong số các hệ thống di truyền ngược được ứng dụng hiệu quả và đáp ứng mục
tiêu trong thời gian ngắn tạo chủng virus vaccine hiệu quả là hệ thống gồm 8 plasmid pHW2000 mang PolIPolII của Hoffmann và đtg (2000). Sự có mặt của phức hợp PolI PolII trên cùng một plasmid cho phép sinh tổng hợp cả mRNA của virus (nhờ PolII) và vRNA (nhờ PolI) trong tế bào động vật từ cùng một phân đoạn cDNA của virus đã được dòng hóa vào plasmid, cho phép hạt virus tái tổ hợp được tái tạo hiệu quả. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Chủng NIBRG14 Chủng NIBRG14 do NIBSC (Vương quốc Anh) cung cấp là nguồn vật liệu cho phân lập 6 phân đoạn gen khung (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) nguồn gốc từ virus A/PR/8/34. Plasmid và chủng khuẩn Plasmid pHW2000 được cung cấp bởi Dr. Erich Hoffmann và Dr. Robert G. Webster (Bệnh viện Nhi St. Jude, Mỹ), là plasmid chứa phức hợp PolIPolII hai chiều. Chủng E. coli DH5α [end A1 rec A1 hsd R17 sup E44 gyp A96 thi1 relA1 lac U169 ( 80 lacZM15)] của hãng Invitrogen (Mỹ) được dùng trong chọn dòng và nhân dòng gen. Cặp mồi sử dụng Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu cho nhân bản và xác định trình tự 8 phân đoạn gen của virus cúm A được thiết kế theo Hoffmann và đtg (2001). Tế bào Tế bào 293T và tế bào MDCK được cung cấp bởi ATCC (American Type Culture Collection, Mỹ). Trứng gà sạch có phôi và gà sạch 3 ngày tuổi Trứng gà sạch có phôi 9 11 ngày tuổi và gà sạch 3 ngày tuổi được cung cấp bởi Trung tâm Giống gia cầm Thụy Phương (Viện Chăn nuôi), đã được kiểm định sạch virus/kháng thể đặc hiệu với virus A/H5N1 và Newcastle. 2.2. Địa điểm nghiên cứu Tất cả các thí nghiệm biến nạp và tái tạo virus A/H5N1 tái tổ hợp bằng di truyền ngược, nhân giống virus, kiểm tra virus đều thực hiện trong phòng thí nghiệm an toàn cấp 2+ của Viện Công nghệ sinh học. Các thao tác tiến hành với virus (cấy truyền, thu nhận, xác định sự có mặt của virus ...) được thực hiện trong box cấy an toàn sinh học cấp 2. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phân lập sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 Tách chiết RNA tổng số của chủng NIBRG14 (mang 6 phân đoạn gen khung từ virus A/PR/8/34 [PR8] bằng kit Tripure Isolation Reagent (Invitrogen, Mỹ). Nhân bản sáu phân đoạn gen khung của virus PR8 từ các mẫu vRNA tổng số bằng phương pháp RT PCR hai bước để chuyển hóa vRNA thành cDNA (bước 1) và PCR khuếch đại cDNA (bước 2) theo phương pháp của Hoffmann và đtg (2001). 2.3.2. Thiết kế gen kháng nguyên HA và NA của virus A/H5N1 clade 1.1 và 2.3.2.1c Hai gen HA và hai gen NA của hai clade virus (clade 1.1 và 2.3.2.1c) được thiết kế có cấu trúc: Tương ứng ở hai đầu gen là hai đoạn nucleotide không mã hóa chứa điểm bắt cặp đặc hiệu của mồi xuôi và mồi ngược trong phản ứng PCR nhân gen; ở giữa là
vùng mã hóa chứa trình tự nucleotide của gen H5 HA và gen N1 NA tương ứng. Đặc biệt, để đảm bảo virus tái tổ hợp lắp ráp bằng di truyền ngược là virus độc lực thấp, hai phân đoạn gen H5 HA của hai clade virus đều được loại vùng độc (loại các nucleotide mã hóa các amino acid kiềm arginine (R) và lysine (K) ở vị trí giữa HA1 và HA2) và tránh lại độc (Hình 2.1) Hình 2.1. Trình tự nucleotide và amino acid của gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c trước và sau khi xử lý loại vùng độc và tránh lại độc 2.3.3. Ghép nối các phân đoạn gen của virus cúm A vào plasmid pHW2000 tạo hệ thống plasmid đơn gen 10 mẫu DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc đã được chọn dòng (6 dòng dương tính với plasmid tái tổ hợp chứa các phân đoạn gen khung + 2 dòng dương tính với gen kháng nguyên H5 và N1 của clade 1.1 + 2 dòng mang gen kháng nguyên H5 và N1 của clade 2.3.2.1c) được tách và tinh sạch, sử dụng kit High Pure Plasmid Isolation (Roche, Đức). Các plasmid tái tổ hợp được cắt bằng enzyme giới hạn, thu nhận gen đích và ghép nối gen vào plasmid pHW2000 theo phương pháp của Hoffmann và đtg (2001). 2.3.4. Chuyển nhiễm hệ thống plasmid đơn gen vào tế bào 293T để tái tạo virus tái tổ hợp rgA/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c Thực hiện 2 công thức chuyển nhiễm 6 + 2 plasmid vào tế bào 293T: (i) 6 plasmid mang 6 phân đoạn gen khung từ chủng A/PR/8/34 kết hợp với 2 plasmid mang gen kháng nguyên H5 và N1 từ clalde 1.1; (ii) 6 plasmid mang 6 phân đoạn gen khung từ chủng A/PR/8/34 kết hợp với 2 plasmid mang gen kháng nguyên H5 và N1 từ clalde 2.3.2.1c. Xác định sự có mặt của virus tái tổ hợp trong dịch nuôi cấy bế bào sau chuyển nhiễm plasmid bằng kỹ thuật RTPCR một bước. Các mẫu có kết quả RTPCR dương tính với sự có mặt của virus tái tổ hợp thế hệ P0 được thu nhận riêng rẽ và ghi ký hiệu là virus rgA/H5N1 clade 1.1 hoặc rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c (t ương ứng). 2.3.5. Nhân giống virus rgA/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c trong trứng gà sạch có phôi Các mẫu virus rgA/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c tái tổ hợp được cấy nhân giống trong trứng gà sạch có phôi 9 11 ngày tuổi. Ủ trứng trong tủ ấm ở 35°C, độ ẩm 60% trong 48h. Thu hoạch dịch niệu trong từng quả trứng (chứa virus tái tổ hợp thế hệ P1) riêng rẽ vào các ống vô trùng. Xác định sự có mặt của virus rgA/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c trong dịch niệu trứng bằng các phương pháp: (i) Xác định hiệu giá HA, (ii) xác định hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) và khả năng tạo plaque trên đĩa nuôi cấy tế bào MDCK trong thí nghiệm plaque assay theo hướng dẫn của WHO (2011).
2.3.6. Phân lập chủng virus rgA/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c Chủng virus rgA/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c được phân lập từ các mẫu virus thế hệ P1 có kết quả kiểm tra hiệu giá HA và hiệu giá virus cao. Thí nghiệm phân lập virus thực hiện theo hướng dẫn của WHO (2011). 2.3.7. Nuôi cấy và thích nghi chủng virus trong trứng gà sạch có phôi và xác định tính ổn định di truyền của chủng virus Chủng virus rgA/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P1 được cấy truyền vào trứng gà sạch có phôi thêm 4 lần tiếp theo để thu nhận virus thế hệ từ P2 P5. Xác định hiệu giá HA, tính đầy đủ về di truyền (thể hiện ở sự có mặt của cả 8 phân đoạn gen trong genome virus) và tính ổn định di truyền gen kháng nguyên (thể hiện ở trình tự các gen kháng nguyên H5 HA và N1 NA không bị biến đổi) của các chủng virus thế hệ P5. 2.3.8. Tạo vaccine trong phòng thí nghiệm từ virus rgA/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c Dịch niệu trứng thu hoạch từ thế hệ P2 đến P5 của hai chủng virus rgA/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c đáp ứng tiêu chí của chủng virus ứng viên vaccine (có khả năng thích ứng nhân lên trong trứng gà sạch có phôi với hiệu giá HA cao, có tính ổn định di truyền gen kháng nguyên H5 và N1) được làm đồng nhất đến cùng hiệu giá HA 1: 1024. Tiến hành vô hoạt virus, tạo hai loại vaccine cúm vô hoạt nhũ dầu từ hai chủng virus. 2.3.9. Xác định khả năng kích thích sinh miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu trên gà sạch 3 ngày tuổi của virus rgA/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c Vaccine từ virus rgA/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c sau khi đã kiểm tra đảm bảo tính an toàn được tiêm phòng cho gà sạch 3 ngày tuổi theo 2 công thức: (i) Tiêm 1 liều 0,5 ml vaccine cho gà 3 ngày tuổi; (ii) tiêm 2 liều: Liều 1 tiêm 0,2 ml vaccine cho gà 3 ngày tuổi, tiêm nhắc lại (liều 2) 0,5 ml vaccine lúc gà 13 ngày tuổi. Mỗi công thức thí nghiệm tiêm 20 gà. Xác định hiệu quả sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu của từng loại vaccine bằng phương pháp xác định hiệu giá HI (hiệu giá ức chế khả năng gây ngưng kết hồng cầu) sau 2 tuần và 4 tuần tiêm phòng. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tách dòng sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 vào plasmid pHW2000 3.1.1. Tách chiết RNA tổng số của chủng NIBRG14 mang sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 Kiểm tra chất lượng các mẫu vRNA tổng số sau tách chiết bằng đo nồng độ và độ tinh sạch trên máy Nanodrop cho kết quả nồng độ vRNA là 30,1 46,2 ng/µl và độ tinh sạch thể hiện ở tỷ số A260/280 khoảng 1,86 1,92. 3.1.2. Khuếch đại, xác định trình tự và chọn dòng sáu phân đoạn gen khung Sáu phân đoạn gen khung (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 [PR8] được nhân bản bằng kỹ thuật RTPCR hai bước theo phương pháp của Hoffmann và đtg (2001): Bước 1 chuyển hóa vRNA → cDNA; bước 2 PCR khuếch đại cDNA → dsDNA. Trong phản ứng ở bước 1, sử dụng Reverse transcriptase v ới m ồi Uni12 để chuyển toàn bộ các phân đoạn ssRNA sợi âm trong genome virus thành các phân đoạn cDNA. Mồi Uni 12 có chiều dài 12 nucleotide (5’AGCAAAAGCAGG 3’), bắt cặp bổ sung với 12 nucleotide bảo thủ có ở tất cả các đầu 3’ của các phân đoạn gen virus. Các phân đoạn cDNA là sản phẩm của bước 1 được sử dụng làm khuôn cho bước 2:
Thực hiện 6 phản ứng PCR khuếch đại 6 gen khung với 6 cặp mồi đặc hiệu cho nhân bản từng gen khung. Quá trình RTPCR hai bước được sơ đồ hóa ở Hình 3.1. Hình 3.1. Khuếch đại sáu phân đoạn gen khung của virus A/PR/8/34 ứng dụng kỹ thuật RTPCR hai bước với mồi Uni12 Kiểm tra sản phẩm của 6 phản ứng RTPCR nhân bản riêng rẽ 6 phân đoạn gen khung bằng điện di trên gel agarose 1,5% (Hình 3.2) cho thấy: 6 phân đoạn gen khung PB2, PB1, PA, NP, M và NS đã được nhân bản thành công từ mẫu vRNA của chủng NIBRG14, với sản phẩm RTPCR của mỗi phân đoạn gen khung đều chứa ít nhất một mẫu nhân bản thành công băng vạch đặc hiệu, sáng, rõ nét, kích thước tương ứng với kích thước tính toán theo lý thuyết của từng gen. Các sản phẩm RTPCR của sáu phân đoạn gen khung được tách dòng vào plasmid pBT, biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α. Sàng lọc các dòng khuẩn mang plasmid pBT tái tổ hợp bằng phương pháp conolyPCR. DNA plasmid của các dòng vi khuẩn dương tính với phản ứng conolyPCR được tách chiết, tinh sạch và xác định trình tự nucleotide gen đích với hai loại mồi là mồi đặc hiệu gen và mồi bắt cặp plasmid. Mỗi phân đoạn gen đều được xác định trình tự nucleotide theo cả chiều xuôi và chiều ngược. Kết quả về trình tự nucletide được so sánh để xác định trình tự đầy đủ và đúng của từng gen. Trên cơ sở về trình tự nucleotide của từng gen đã nhận được, tiến hành so sánh với trình tự nucleotide của phân đoạn gen tương ứng ở virus PR8 trong ngân hàng cơ sở dữ liệu NCBI. Bên cạnh đó, kết quả về trình tự nucleotide được chuyển sang trình tự amino acid suy diễn và so sánh có hay không sự sai khác về trình tự amino acid của từng gen đã tách dòng trong plasmid pBT với trình tự amino acid đầy đủ đảm bảo để thực hiện chức năng của các gen khung từ chủng PR8.
A B C D E F Hình 3.2. Điện di kiểm tra sản phẩm RTPCR nhân bản sáu phân đoạn gen mã hóa các protein khung của virus NIBRG14 Ghi chú: M: Marker 1kb (Fermentas) A. Phân đoạn gen PB2 có 3 mẫu (1, 2, 3) nhân bản băng kích thước tương ứng gen PB2 B. Phân đoạn gen PB1 có 2 mẫu (1, 2) nhân bản băng kích thước tương ứng gen PB1 C. Phân đoạn gen PA có 1 mẫu nhân bản băng đặc hiệu kích thước tương ứng gen PA D. Phân đoạn gen NP có 3 mẫu (1, 2, 3) nhân bản băng kích thước tương ứng gen NP E. Phân đoạn gen M có 2 mẫu (2, 3) nhân bản băng kích thước tương ứng gen M F. Phân đoạn gen NS có 3 mẫu (1, 2, 3) nhân bản băng kích thước tương ứng gen NS Kết quả so sánh về trình tự nucleotide và amino acid làm cơ sở cho chọn dòng plasmid trình bày ở Bảng 3.1 cho thấy: Tương ứng với mỗi phân đoạn gen khung, đều chọn lọc được 1 3 dòng khuẩn mang cDNA có trình tự nucleotide mã hóa trình tự amino acid khộng thay đổi (giống 100%) so với trình tự của sáu gen khung của virus PR8 trong NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore). Số lượng các dòng khuẩn chuyển nạp plasmid tái tổ hợp mang gen quan tâm có trình tự nucleotide không thay đổi so với trình tự gen tương ứng của chủng PR8 như sau: Gen PB2 2 dòng; gen PB1 3 dòng; gen PA 1 dòng; gen NP 2 dòng; gen M 2 dòng và gen NS 2 dòng. Bên cạnh các dòng mang gen đích có trình tự nucleotide không thay đổi so với virus PR8, có một số dòng có trình tự nucleotide xuất hiện đột biến điểm làm thay đổi 1 bp trên gen, dẫn đến sự thay đổi 1 amino acid của protein do gen mã hóa hoặc không thay đổi về trình tự amino acid (trường hợp thay đổi nucleotide nhưng bộ ba nucleotide thay đổi vẫn mã hóa cùng một amino acid). Sự biến đổi này có khả năng xuất phát từ các đột biến điểm xảy ra trong hệ genome của quần thể virus NIBRG14 trong dịch niệu trứng, và là kết quả của sai sót
xảy ra trong sao chép genome của phức hợp polymerase RdRp của virus cúm A (loại virus điển hình về khả năng tiến hóa nhanh, dễ biến đổi di truyền và xuất hiện đột biến điểm trong quá trình sao chép genome do polymerase khi hoạt động có tần số xuất hiện đột biến cao). Bảng 3.1. So sánh trình tự nucleotide và amino acid của sáu phân đoạn gen khung đã phân lập với các gen tương ứng của chủng PR8 Gen Ký hiệu Kích thước Vị trí thay đổi so với trình dòng khuẩn gen tự gen tương ứng của lạc (nucleotide) chủng PR8 Vị trí nucleotide Vị trí amino acid thay đổi thay đổi cl1 T1855C F619L PB2 2341+29 cl2 KTĐ KTĐ cl3 KTĐ KTĐ
cl4 A1574G E525G cl1 KTĐ KTĐ PB1 2341+29 cl2 T290C L97S cl3 KTĐ KTĐ cl4 KTĐ KTĐ
PA cl1 2233+29 G861A, T1879C W627R cl2 KTĐ KTĐ cl1 G567A KTĐ NP 1565+29 cl2 KTĐ KTĐ cl3 KTĐ KTĐ
cl1 KTĐ KTĐ M 1027+29 cl2 C395T T132I cl3 KTĐ KTĐ NS cl1 890+29 KTĐ KTĐ cl2 KTĐ KTĐ KTĐ: Không thay đổi; 29: Các nucleotide thiết kế thêm ở hai đầu của mồi nhân gen Để tạo bộ plasmid tái tổ hợp chứa các phân đoạn gen khung có trình tự nucleotide đầy đủ và không thay đổi so với các trình tự gen khung của virus PR8, luận án lựa chọn tương ứng với mỗi gen khung một dòng DNA plasmid có trình tự nucleotide của gen đích giống 100% so với phân đoạn gen khung tương ứng của virus PR8 trên ngân hàng NCBI để dòng hóa vào plasmid pHW2000. 3.1.3. Ghép nối sáu phân đoạn gen khung vào plasmid pHW2000
Sáu phân đoạn gen khung được cắt thu nhận từ plasmid pBT tái tổ hợp để tách dòng vào plasmid pHW2000 theo phương pháp của Hoffmann và đtg (2001). Sáu plasmid pBT tái tổ hợp được cắt bằng BsmBI hoặc BsaI. Sản phẩm của 6 phản ứng cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 2% (Hình 3.3). Các băng vạch có kích thước đúng với kích thước lý thuyết của từng gen khung trên bản điện di được cắt và thu nhận bằng phương pháp thôi gel, tinh sạch gen. Ghép nối riêng rẽ 6 phân đoạn gen khung vào plasmid pHW2000 đã được cắt mở vòng bằng BsmBI tạo 6 plasmid tái tổ hợp mang 6 phân đoạn gen khung. Kiểm tra sự có mặt của 6 phân đoạn gen khung trong 6 mẫu plasmid pHW2000 tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với hai loại mồi là mồi đặc hiệu cho nhân bản từng phân đoạn gen và mồi bắt cặp trên plasmid. Sản phẩm PCR nhân bản 6 phân đoạn gen bằng mồi đặc hiệu gen đều xuất hiện một băng vạch duy nhất có kích thước đúng kích thước theo tính toán lý thuyết của từng gen (gen PB2: ~ 2350 bp, gen PB1: ~ 2350 bp, gen PA: ~ 2250 bp, gen NP: ~ 1600 bp, gen M: ~ 1050 bp và gen NS: ~ 900 bp). Sáu phản ứng nhân gen bằng mồi bắt cặp plasmid đều có kích thước lớn hơn khoảng 0,2 kb so với sản phẩm phản ứng PCR nhân các phân đoạn gen tương ứng bằng mồi đặc hiệu gen. Kết quả nhận được chứng tỏ 6 phân đoạn gen PB2, PB1, PA, NP, M và NS đã được biến nạp thành công và gắn đúng vị trí trên 6 plasmid pHW2000 (mỗi plasmid mang một phân đoạn cDNA mã hóa protein khung của virus (Hình 3.4). . Hình 3.3. Điện di sản phẩm cắt sáu plasmid mang sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 bằng enzyme giới hạn Ghi chú: M: Marker 1kb (Fermentas); M1: Marker High Ranger 1kb DNA Ladder A. Gen PB2 (PB2K: Plasmid pBTPB2 không cắt với enzyme; PB2C: Sản phẩm cắt pBTPB2) B. Gen PB1 (PB1K: Plasmid pBTPB1 không cắt; PB1C: Sản phẩm cắt plasmid pBTPB1) C. Gen PA (PAC: Sản phẩm cắt plasmid pBTPA; PAK: Plasmid pBTPA không cắt với enzyme) D. Gen NP (NPK: Plasmid pBTNP không cắt với enzyme; NPC: Sản phẩm cắt plasmid pBTNP) E. Gen M (MC: Sản phẩm cắt plasmid pBTM; MK: Plasmid pBTM không cắt với enzyme) F. Gen NS (NSK: Plasmid pBTNS không cắt với enzyme; NSC: Sản phẩm cắt plasmid pBTNS)
. Hình 3.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR của sáu phân đoạn gen khung với mồi đặc hiệu gen và mồi đặc hiệu plasmid pHW2000 M: Marker 1kb (Fermentas); (): Đối chứng âm; 1, 2: Phân đoạn gen M; 3, 4: Phân đoạn gen NP; 5, 6: Phân đoạn gen NS; 7, 8: Phân đoạn gen PA; 9, 10: Phân đoạn gen PB1; 11, 12: Phân đoạn gen PB2 3.2. Thiết kế và tách dòng gen HA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2.1c vào plasmid pHW2000 Trình tự nucleotide của hai phân đoạn gen H5 clade 1.1 và H5 clade 2.3.2.1c đã được thiết kế, tổng hợp nhân tạo và lưu giữ trong plasmid (Hình 3.5). Trình tự nucleotide của hai gen H5 có kích thước: Gen H5 clade 1.1 1825 bp, gen H5 clade 2.3.2.1c 1822 bp. Hai gen H5 đều có đặc điểm: Hai đoạn nucleotide ở hai đầu không mã hóa, là vị trí gắn mồi đặc hiệu chứa điểm nhận biết của enzyme BsmBI; ở giữa là vùng mã hóa amino acid tạo protein HA: Gen HA clade 1.1 1698 bp (1695 bp mã hóa 565 amino acid và 3 bp là bộ ba kết thúc), gen HA clade 2.3.2.1c 1695 bp (1692 bp mã hóa 564 amino acid và 3 bp tương ứng với bộ ba kết thúc).
Hình 3.5. Trình tự nucleotide của gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c không chứa vùng độc A. Trình tự nucleotide; B. Trình tự amino acid Với hai trình tự gen H5 HA đã thiết kế, khi khuếch đại gen bằng phản ứng PCR sẽ tạo sản phẩm có kích thước 1799 bp (1698 bp + 101 bp) tương ứng với gen HA clade 1.1 và 1796 bp (1695 bp + 101 bp) tương ứng với gen HA clade 2.3.2.1c. Đặc biệt, trình tự amino acid của protein H A được mã hóa bởi gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c đã thiết kế đều được loại bỏ vùng độc (loại bớt các amino acid kiềm ở vị trí nhận biết của protease) và tránh hiện tượng lại độc. Cụ thể, trình tự amino acid mã hóa bởi phân đoạn gen H5 clade 1.1 đã thiết kế, vị trí 338344 là QREGTRG, trong khi ở chủng gốc A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1), vị trí 338347 là QREGRRKKRG (chứa 4 amino acid kiềm –RRKK ở vị trí nhận biết của protease). Như vậy, so với chủng gốc, trình tự gen H5 clade 1.1 đã thiết kế làm gen ứng viên cho sản xuất vaccine đã được loại vùng độc: Loại 2 arginine (R), 1 lysine (K) và thay thế 1 lysine (K) bằng threonine (T); và tránh lại độc: Hai arginine (R) ở hai đầu ngay sát vùng độc được thay đổi mã bộ ba AGA thành CGA cũng mã hóa cho arginine nhưng sẽ giúp chủng virus tái tổ hợp không từ dạng độc lực thấp chuyển thành dạng độc lực cao. Trình tự amino acid mã hóa bởi gen HA clade 2.3.2.1c loại vùng độc đã thiết kế, vị trí 338343 là QRETRG, trong khi ở chủng gốc A/duck/Viet Nam/HT02/2014(H5N1), vị trí 338346 là QRERRRK RG (chứa 4 amino acid kiềm RRRK ở vị trí vùng độc) (Hoàng Thị Thu Hằng et al.,
2008). So với chủng virus gốc, gen ứng viên vaccine HA clade 2.3.2.1c đã được loại vùng độc: Loại 3 arginine (R) và thay thế 1 lysine (K) bằng threonine (T); tránh lại độc: 2 arginine (R) ở hai đầu ngay sát vùng độc được thay đổi 1 nucleotide từ AGA thành CGA. Trình tự amino acid suy diễn được dịch mã từ 2 gen H5 HA đã thiết kế cho thấy: Các vị trí quan trọng đảm bảo việc thực hiện chức năng và thể hiện tính kháng nguyên của protein HA đều có và không thay đổi vị trí so với chủng virus gốc , gồm: Vị trí liên kết với thụ thể của tế bào chủ: QSG ở cả 2 clade (amino acid 238240); các vị trí có tính kháng nguyên và sinh đáp ứng miễn dịch mạnh: ANPV ở clade 1.1 và PNPA ở clade 2.3.2.1c (amino acid 99102); SHEASL ở clade 1.1 và NHEASL ở clade 2.3.2.1c (amino acid 140145); PYLGKS ở clade 1.1 và SYQGNS ở clade 2.3.2.1c (amino acid 152157); vị trí glycosyl hóa: NST ở clade 1.1 và DNA ở clade 2.3.2.1c (amino acid 170172). Gen HA clade 1.1 và gen HA clade 2.3.2.1c tổng hợp nhân tạo đã được ghép nối riêng rẽ vào plasmid pHW2000. Kiểm tra sự có mặt của phân đoạn gen HA trong plasmid pHW2000 bằng các phương pháp: PCR với hai cặp mồi (đặc hiệu gen, đặc hiệu plasmid); cắt bằng enzyme giới hạn và xác định trình tự gen. Kết quả kiểm tra thể hiện ở Hình 3.6. A B Hình 3.6. Kiểm tra sự có mặt của gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c trong plasmid pHW2000 Ghi chú. M: Marker 1 kb A. Kiểm tra bằng PCR nhân gen HA với hai loại mồi là mồi đặc hiệu gen và mồi đặc hiệu plasmid; 1, 2: Sản phẩm PCR nhân gen HA clade 1.1; 3, 4: Sản phẩm PCR nhân gen HA clade 2.3.2.1c. B: Cắt kiểm tra bằng cặp enzyme NheI và SmaI; H1.1: Sản phẩm cắt pHW2000HA clade 1.1; H2.3.2.1: Sản phẩm cắt pHW2000HA clade 2.3.2.1c. Kiểm tra sự có mặt của gen đích bằng PCR với hai loại mồi là mồi đặc hiệu gen HA và mồi đặc hiệu plasmid chỉ xuất hiện một băng đặc hiệu duy nhất có kích thước đúng theo lý thuyết: Sản phẩm nhân gen bằng mồi đặc hiệu gen có kích thước khoảng 1800 bp (tương ứng với kích thước gen HA), nhân gen bằng mồi đặc hiệu plasmid có kích thước khoảng 1950 bp (tương ứng với kích thước gen HA và một phần trình tự nucleotide của plasmid pHW2000 ở hai đầu gen HA) (Hình 3.6A). Sản phẩm cắt kiểm tra 2 plasmid tái tổ hợp với cặp enzyme NheI và SmaI trên bản điện di đều xuất hiện 2 băng vạch: Băng thứ nhất có kích thước lớn tương ứng với kích thước plasmid pHW2000 và băng thứ hai kích thước nhỏ hơn tương ứng với kích thước của gen HA (khoảng 1800 bp) (Hình 3.6B). Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen đích cũng chứng minh gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c đã được tạo dòng thành công vào plasmid pHW2000 với kích thước và trình tự nucleotide chính xác 100% so với các trình tự đã thiết kế. DNA plasmid