Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR và phân tích đặc điểm di truyền phân tử của virus BK ở bệnh nhân ghép thận

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:99

Thêm vào BST

Báo xấu

51
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm xây dựng quy trình xác định tải lượng BK virus trong máu và nước tiểu của bệnh nhân ghép thận bằng kỹ thuật real-time PCR. Xác định tỷ lệ lưu hành và kiểu gen BKV, kết hợp phân tích các đặc điểm di truyền phân tử của BKV ở những bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR và phân tích đặc điểm di truyền phân tử của virus BK ở bệnh nhân ghép thận

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC LÊ THỊ BẢO QUYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV-DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC LÊ THỊ BẢO QUYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV-DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN Chuyên ngành Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Cán bộ hướng dẫn: TS. Hoàng Xuân Sử TS. Mai Thị Đàm Linh Hà Nội - 2020
LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin trân trọng gửi tới TS. Hoàng Xuân Sử, người thầy đã truyền cảm hứng nghiên cứu khoa học cũng như tận tình giúp đỡ, giảng giải và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn nghiên cứu này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Mai Thị Đàm Linh, người thầy đã hướng dẫn và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đinh Thị Thu Hằng cùng các cán bộ nhân viên trong phòng thí nghiệm “Vi sinh và các Mầm bệnh Sinh học – Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân y đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy, các cô trong bộ môn Vi sinh vật cùng các thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. Hà Nội, 18 tháng 2 năm 2020 Học viên Lê Thị Bảo Quyên
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT aa Axit amin AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome Bp Base pair BKV BK virus BKVN BK virus nephropathy CMV Cytomegalo virus Ct Cycle Threshold DNA Deoxyribonucleic acid Enzyme - Linked - immunosorbent Assay ELISA (Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme) Etbr Ethidium Bromide EBV Epstein-Barr Virus HBV Hepatitis B virus HSV Herpes Simplex Herpes INF Intravenous Nutritional Fluid F/R Forward/ Reverase IPTG Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside IVD In vitro diagnostic JCV JC virus Kb Kilobase pairs LB Luria-Bertani NPV Negative predictive value
PCR Polymerase Chain Reaction TNF Tumor Necrosis Factors PPV Positive predictive value RCF Relative centrifugal force RFLP Restriction fragment length polymorphism ROC Receiver operating characteristic Rpm Revolutions per minute Super Optimal broth Catabolite repression SOC (Môi trường dinh dưỡng tối ưu) TBE Tris-boric-EDTA UV Ultra violet (Tử ngoại)
DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1. Các bộ kit tách chiết, các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ................30 Bảng 2. 2. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .....................................31 Bảng 2. 3. Thành phần và điều kiện Nested PCR khuếch đại gen VP1....................35 Bảng 2. 4. Thí nghiệm đánh giá độ nhạy mẫu bệnh phẩm........................................42 Bảng 3. 1. Thành phần phản ứng real-time PCR ......................................................51 Bảng 3. 2. Đánh giá độ đặc hiệu ...............................................................................52 Bảng 3. 3. Khảo sát độ nhạy của kỹ thuật real-time PCR trên mẫu bệnh phẩm .......56 Bảng 3. 4. Đánh giá độ ổn định của mẫu chuẩn nồng độ 101-103 IU/µl ...................58 Bảng 3. 5. Tỷ lệ nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận ...............................................61 Bảng 3. 6. So sánh giữa ba nhóm bệnh nhân dựa vào giá trị ngưỡng.......................65 Bảng 3. 7. Đánh giá vai trò BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng ở bệnh nhân ghép thận..66 Bảng 3. 8. Sự phân bố các phân nhóm của BKV ......................................................69 Bảng 3. 9. Vị trí SNP khác nhau giữa kiểu gen BKV-I và BKV-IV ........................70 Bảng 3. 10. Xác định vị trí SNP BKV-I trong vùng gen VP1 (1630-1956) .............71 Bảng 3. 11. Đa dạng SNP ở kiểu gen BKV-IV .........................................................72 Bảng 3. 12. Trình tự axit amin ở những vị trí SNP trong phân nhóm IV .................73 Bảng 3. 13. So sánh trình BKV phân lập theo cặp từ mẫu máu ...............................74 Bảng 3. 14. Sự phân bố kiểu gen BKV theo các chỉ số lâm sàng .............................77
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1. 1. Cấu trúc virion BKV .................................................................................7 Hình 1. 2. Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của BKV .............................................9 Hình 1. 3. Các tế bào decoy trong nước tiểu . ...........................................................17 Hình 2. 1. Vector pGEM T easy ...............................................................................29 Hình 3. 1. Khuếch đại đoạn chèn cho tách dòng.......................................................45 Hình 3. 2. Kết quả sàng lọc plasmid tái tổ hợp trên môi trường ...............................46 Hình 3. 3. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme và AvaII .................................47 Hình 3. 4. Kết quả so sánh trình tự đoạn chèn với trình tự trên Ngân hàng gen Quốc tế bằng phần mềm Blast ............................................................................................48 Hình 3. 5. Kiểm tra lại trình tự mồi và probe cho real-time PCR .............................49 Hình 3. 6. Tối ưu nồng độ probe ...............................................................................50 Hình 3. 7. Tối ưu nồng độ mồi ..................................................................................50 Hình 3. 8. So sánh sự tương quan giữa bộ mẫu chuẩn WHO và LDA .....................53 Hình 3. 9. Xác định khoảng định lượng của bộ mẫu chuẩn ......................................56 Hình 3. 10. Ngưỡng phát hiện BKV-DNA trên mẫu bệnh phẩm .............................57 Hình 3. 11. So sánh sự tương quan giữa hai bộ kit ...................................................58 Hình 3. 12. Phân tích sự khác biệt giữa hai bộ kit ....................................................59 Hình 3. 13. Đường cong ROC BKV-DNA trong máu nhằm phát hiện BKVN........63 Hình 3. 14. Đường cong ROC BKV-DNA trong nước tiểu nhằm phát hiện BKVN63 Hình 3. 15. Cây phát sinh loài trên vùng gen VP1-BKV (1630-1956) .....................68
MỤC LỤC MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3 1.1. Dịch tễ học ................................................................................................ 3 1.2. Tổng quan về BKV .................................................................................. 5 1.2.1. Lịch sử phát hiện BKV ............................................................................... 5 1.2.2. Đặc điểm sinh học ..................................................................................... 6 1.3. Mối quan hệ giữa BKV và bệnh lý ghép thận ..................................... 11 1.3.1. Mối tương quan giữa nồng độ BKV-DNA và bệnh lý ghép thận ............. 11 1.3.2. Độc lực kiểu gen BKV và bệnh lý ghép thận ............................................ 13 1.4. Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán BKV .................................. 16 1.4.1. Tế bào học................................................................................................ 16 1.4.2. Sinh thiết thận .......................................................................................... 17 1.4.3. Chẩn đoán sinh học phân tử .................................................................... 17 1.5. Tình hình nghiên cứu BKV ................................................................... 19 1.5.1. Tình hình nghiên cứu phát triển kit ......................................................... 19 1.5.2. Tình hình nghiên cứu hiện trạng nhiễm BKV .......................................... 21 1.6. Phương pháp xây dựng cây chủng loại phát sinh ............................... 22 1.6.1. Định nghĩa ............................................................................................... 22 1.6.2. Đặc điểm của các phương pháp xây dựng cây chủng loại ...................... 23 1.6.3. Ứng dụng cây chủng loại phát sinh trong xác định genotype BKV ........ 25 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 27 2.1. Nguyên liệu ................................................................................................. 27 2.1.1. Mẫu nghiên cứu ........................................................................................ 27 2.1.2. Các vật liệu ............................................................................................... 27 2.1.3. Hóa chất ................................................................................................... 29 2.2. Thiết bị chính ............................................................................................. 31 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 33
2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu ..................................................................................... 33 2.3.2. Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR .......................................................................................................... 34 2.3.3. Phân tích đặc điểm di truyền BKV ở bệnh nhân ghép thận .................... 43 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 45 3.1. Xây dựng quy trình định lượng BKV-DNA bằng real-time PCR ........ 45 3.1.1. Tách dòng vùng gen VP1 .......................................................................... 45 3.1.2. Thiết lập bộ mẫu chuẩn ............................................................................ 48 3.1.3. Thiết kế mồi và probe cho real-time PCR ................................................ 49 3.1.4. Tối ưu kỹ thuật real-time PCR.................................................................. 49 3.1.5. Đánh giá kỹ thuật real-time PCR ............................................................. 52 3.1.6. Quy trình xác định tải lượng virus BK trong máu và nước tiểu ở bệnh nhân ghép thận ........................................................................................ 60 3.2. Xác định vai trò BKV-DNA với bệnh thận do BKV .............................. 61 3.2.1. Xác định tỷ lệ lưu hành BKV ở bệnh nhân ghép thận bằng kỹ thuật real-time PCR61 3.2.2. Xác định giá trị ngưỡng BKV-DNA dự đoán BKVN ................................ 62 3.2.3. Đánh giá vai trò BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng ............................... 66 3.3. Phân tích đặc điểm di truyền phân tử BKV............................................ 67 3.3.1. Xác định kiểu gen BKV lưu hành tại Việt Nam ........................................ 67 3.3.2. Phân tích các vị trí SNP-BKV trên vùng gen VP1 ở bệnh nhân ghép thận70 3.3.3. Đánh giá vai trò của kiểu gen BKV với bệnh thận do BKV ..................... 77 KẾT LUẬN ....................................................................................................... 79 KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................ 81
MỞ ĐẦU Ghép thận là phương pháp điều trị thay thế hiệu quả nhất hiện nay cho những bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối. Ở nước ta, ước tính khoảng 80.000 bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối, 90% bệnh nhân suy thận mạn dẫn đến tử vong do không được điều trị và khoảng 4.000 bệnh nhân có nhu cầu ghép thận mỗi năm. Cho đến nay nhiều cơ sở y tế trong cả nước đã triển khai thành công kỹ thuật này, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cũng như hiệu quả kinh tế cho những bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối. Với sự ra đời của các loại thuốc ức chế miễn dịch thế hệ mới kèm theo là sự tái hoạt động mạnh của BK virus (BKV) được khẳng định là nguyên nhân quan trọng hàng đầu dẫn đến rối loạn chức năng thận ghép, thậm chí mất mô ghép ở bệnh nhân sau ghép thận. Một số nghiên cứu tiến cứu theo dõi ở những người nhận thận ghép cho thấy sự xuất hiện rất sớm BKV trong máu và nước tiểu, thậm chí trong những giờ đầu sau ghép, với tỷ lệ mắc cao nhất xảy ra khoảng từ 1-3 tháng sau ghép. Tỷ lệ BKVN (BK Virus Nephropathy: bệnh thận do BKV) ước tính khoảng 1- 10% trong năm đầu sau ghép thận, trong đó 50% trường hợp BKVN bị thải ghép hoàn toàn [8]. Hiện nay, vấn đề theo dõi và giám sát nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận tại nước ta chưa nhận được sự quan tâm đúng mức trong các cơ sở y tế có khả năng thực hiện ghép thận. Chẩn đoán BKVN ban đầu thường gặp nhiều khó khăn do biểu hiện lâm sàng không đặc hiệu, nghèo triệu chứng, do đó dễ bỏ sót chẩn đoán hoặc nhầm với giai đoạn thải ghép cấp. Sinh thiết thận được coi là tiêu chuẩn vàng trong xác định BKVN, nhưng đây lại là phương pháp xâm lấn, đòi hỏi trang thiết bị đồng bộ và đào tạo chuyên sâu. Trong khi đó, việc xác định, theo dõi, giám sát tải lượng BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR trong máu của bệnh nhân ghép thận đã được công nhận là công cụ rất có giá trị tiên đoán BKVN [8]. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu phát triển kỹ thuật phân tử về BKV được công bố ở Việt Nam. Một số cơ sở y tế đã sử dụng các kit thương mại như Realstar BKV PCR Kit (Altona 1
Diagnostics, Germany), Artus® BK Virus RG PCR Kit (Qiagen, Germany) … xác định tải lượng BKV-DNA, tuy nhiên giá thành các kit này rất cao và đòi hỏi đầu tư trang thiết bị đồng bộ, đồng thời còn chưa đề cập đến khía cạnh các kit này có thể không phù hợp với một số chủng BKV lưu hành ở Việt Nam. Một số nghiên cứu đề nghị rằng tải lượng BKV trong nước tiểu >107 copy/ml hay trong máu >104 copy/ml là giá trị cho phép chẩn đoán sớm BKVN [35]. Tuy nhiên con số chính xác về giá trị ngưỡng cho phép phát hiện BKVN phụ thuộc vào độ nhạy kỹ thuật real-time PCR cũng như sự tương tác giữa virus và người bệnh ở những khu vực địa lý khác nhau. Mặt khác, BKV genotype I-IV cũng như các biến thể khác của virus đã được tìm thấy ở những bệnh nhân BKVN [7]. Giải trình tự vùng gen VP1 từ mẫu sinh thiết thận từ bệnh nhân viêm thận kẽ sau ghép nhấn mạnh sự tồn tại của các “điểm nóng” đa hình, với trình tự không ổn định theo thời gian ở hầu hết các trường hợp được theo dõi [18]. Các nghiên cứu in vitro gần đây về các phân nhóm biến thể cho thấy sự thay thế axit amin có thể làm thay đổi khả năng tương tác của virus với các tế bào chủ, do đó thay đổi độc lực của virus với người bệnh [18]. Như vậy, sự đa dạng về đặc điểm di truyền BKV rất cần thiết để tìm kiếm mối quan hệ tiềm năng giữa kiểu gen của BK virus và bệnh cảnh lâm sàng sau ghép thận. Cho đến nay, ở nước ta mới chỉ có một vài công bố về ca lâm sàng nhiễm BKV ở bệnh nhân sau ghép thận. Nhận thấy tính cấp thiết của tình hình trên, chúng tôi thực hiện đề tài với hai mục tiêu: 1. Xây dựng quy trình xác định tải lượng BK virus trong máu và nước tiểu của bệnh nhân ghép thận bằng kỹ thuật real-time PCR. 2. Xác định tỷ lệ lưu hành và kiểu gen BKV, kết hợp phân tích các đặc điểm di truyền phân tử của BKV ở những bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam. 2
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Dịch tễ học BK virus là tác nhân gây nhiễm trùng phổ biến ở người nhưng không gây ra triệu chứng lâm sàng, với tỷ lệ huyết thanh dương tính ở người trưởng thành là 80%. Các nghiên cứu dịch tễ học đã được thực hiện ở nhiều quốc gia khác nhau trên thế giới, như Anh (tỷ lệ huyết thanh dương tính ở trẻ em, 83%), Phần Lan (60%), Đức (71%), Ý (83%) [60]. Nhiễm trùng tiên phát thường xảy ra trong thời thơ ấu, sau đó virus thiết lập trạng thái tiềm ẩn ở các tế bào biểu mô thận và biểu mô niệu đạo, với khoảng 60-90% người trưởng thành có kháng thể kháng BKV trong máu. Ở những người khỏe mạnh hay bệnh nhân có khả năng miễn dịch, hiện tượng tái hoạt động của BKV và xuất hiện BKV trong nước tiểu rất hiếm khi xảy ra [38]. Sự tái hoạt động của BKV được kích hoạt khi phản ứng miễn dịch trung gian qua tế bào suy giảm, điển hình ở các cá nhân bị suy giảm miễn dịch như AIDS, phụ nữ có thai, bệnh nhân bị tiểu đường và đặc biệt là những trường hợp ghép tạng. Sau khi nhân lên, BKV đi vào các mao mạch, xuất hiện trong nước tiểu và tấn công bộ phận ghép, dẫn đến các tổn thương khác nhau. Khi sự nhân lên của BKV bắt đầu xảy ra ở vùng vỏ thận thì có sự liên quan rõ rệt với sự hoại tử của tế bào biểu mô ống thận và nồng độ creatinine huyết thanh tăng [42]. Người ta cho rằng cơ chế dẫn đến rối loạn chức năng mô ghép thận đồng loại là do rò rỉ và sự chảy ngược nước tiểu từ các ống thận bị tổn thương vào các khoang kẽ và các mao mạch quanh ống thận. Do đó tổn thương và hoại tử ống thận cấp là đặc điểm quan trọng của bệnh thận do BKV và là một yếu tố xác định BKVN [38]. Sự tổn thương thận mạn tính do BKV dẫn đến xơ hóa mô kẽ của thận không thể hồi phục và teo ống thận. Khoảng 1/3 số bệnh nhân xuất hiện BKV trong nước tiểu sẽ phát triển BKV trong máu và nếu không được can thiệp kịp thời sẽ phát triển thành BKVN (tỷ lệ dao động từ 1 đến 10%) [71]. Sự tái hoạt động của BKV ở bệnh nhân ghép thận lần đầu tiên được chứng minh qua sự phát tán virus trong nước tiểu, với tỷ lệ từ 20% đến 60% bệnh nhân. Dữ liệu từ Mạng lưới chia sẻ nội tạng Hoa Kỳ (The United 3
Network for Organ Sharing) cho thấy tổn thương về thận ghép liên quan đến BKV là 7,5% (70/938) trong năm 2009 và 5,7% (36/632) vào năm 2010 [68]. Một số yếu tố nguy cơ nhiễm BKV trước ghép bao gồm giới tính nữ, mô ghép từ người cho chết não, những chấn thương gây thiếu máu cục bộ, kháng thể đặc hiệu BKV cao ở người cho thận, sự không phù hợp HLA cũng như người cho là người Mỹ gốc Phi [8]. Mức độ ức chế miễn dịch là yếu tố nguy cơ quan trọng nhất ở những bệnh nhân ghép thận dẫn tới nhiễm BKV cũng như phát triển BKVN, tuy nhiên chưa có những tiêu chuẩn liều lượng ức chế miễn dịch liên quan chắc chắn đến sự xuất hiện của BK trong nước tiểu. Bên cạnh đó, những giả thuyết cho rằng kháng thể trong huyết thanh của người cho có thể là nguyên nhân chính làm tăng nguy cơ nhiễm BKV cũng như BKVN ở bệnh nhân sau ghép thận còn gây nhiều tranh cãi. Kết quả nghiên cứu của Shah và cộng sự (2000) [75], cho thấy những trường hợp mà BKV âm tính trong huyết thanh người nhận nhưng dương tính với huyết thanh người cho có nguy cơ phát triển BKVN cao nhất (43%). Trong khi đó, Bohl và cộng sự (2005) [25], lại ghi nhận nhóm có nguy cơ cao nhất phát triển BKVN (50%) là nhóm huyết thanh dương tính với BKV ở cả người cho và người nhận. Mặt khác, trong cả hai nghiên cứu, đều đồng nhất kết quả nhiễm BKV thấp nhất (10%) khi huyết thanh đồng thời của người cho và người nhận âm tính với BKV. Hơn nữa, Bohl và cộng sự cũng chỉ ra sự vắng mặt của HLA-C7 ở người nhận có liên quan đến tăng nguy cơ nhiễm trùng [25]. Các yếu tố nguy cơ sau ghép dẫn tới BKVN bao gồm tổn thương niệu quản, đái tháo đường, độ trễ chức năng thận ghép, nhiễm cytomegalovirus, điều trị thải ghép cấp tính bằng các loại thuốc ức chế calcineurin hoặc steroid. Ngoài ra, những bệnh nhân có HLA và ABO không tương thích với người cho hoặc tổn thương niệu quản do đặt stent niệu quản có thể dẫn tới nguy cơ bị BKVN cao hơn [8]. Một số báo cáo cũng cho thấy sự xuất hiện của BKV trong máu hoặc nước tiểu có thể phát hiện ở những bệnh nhân ghép tạng khác [6], [49], như ghép tim, phổi và gan, nhưng nhìn chung sự có mặt của BKV trong máu hoặc nước tiểu không 4
liên quan đến chức năng thận suy giảm ở những bệnh nhân này [60], [71]. Ở những bệnh nhân ghép tế bào gốc, sự tái hoạt động của BKV gắn liền với tình trạng viêm bàng quang xuất huyết với các triệu chứng như khó tiểu, tiểu ra máu. Tỷ lệ nhiễm BKV trong nước tiểu dao động từ 50%-100% ở người nhận ghép tủy xương và ghép tế bào gốc tạo máu trong vòng 2 tháng sau cấy ghép [18]. BKV cũng được báo cáo là nguyên nhân gây ra hẹp niệu quản, hội chứng thận hư, viêm bàng quang, viêm phổi, hội chứng tan máu và bệnh đa hồng cầu liên quan đến polyomavirus. BKV cũng có thể liên quan đến bệnh lupus ban đỏ hệ thống bằng cách tạo ra các kháng thể chống lại DNA và histones cũng như liên quan đến các khối u và ung thư [38]. Hẹp niệu quản liên quan đến BKV đã được báo cáo ở những người nhận ghép thận cũng như những người ghép tế bào gốc tạo máu. Barasa.N và cộng sự (2010) [63], đã ghi nhận trường hợp ghép tế bào gốc tạo máu xuất hiện một loạt các biến chứng sau ghép bao gồm hẹp niệu quản, viêm bàng quang xuất huyết và hội chứng thận ứ nước. Bệnh nhân này được chỉ định xét nghiệm máu với sự xuất hiện của herpes simplex virus (HSV) sau 21 ngày ghép, và BKV sau 28 ngày. Mặt khác, sự lan rộng nhiễm trùng nội mô do BKV được ghi nhận là có liên quan đến những tổn thương tế bào nội mô, dẫn đến tổn thương mao mạch, phù nề và tăng sinh khối u trên cả hai bên thận. Báo cáo của Bratt G và cộng sự (1999) [26], về một trường hợp bệnh nhân bị viêm võng mạc đang trong giai đoạn AIDS tiến triển, ghi nhận BKV liên quan chặt chẽ tới viêm phổi. Hai trường hợp tử vong do viêm phổi khác đã được báo cáo, trong đó 1 bệnh nhân sau ghép tế bào gốc tạo máu và một bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu lympho mãn tính trong giai đoạn hóa trị liệu [4], [89]. 1.2. Tổng quan về BKV 1.2.1. Lịch sử phát hiện BKV BKV được phát hiện lần đầu vào năm 1971, tại phòng thí nghiệm nghiên cứu virus thuộc Lodon, Anh. Trong một nghiên cứu dịch tễ học về nhiễm cytomegalovirus ở những người nhận ghép thận, Sylvia Gardner đã quan sát thấy 5
những mụn cóc sinh dục chứa hạt virus tương tự như papillomavirus ở một bệnh nhân nam người Sudan. Những báo cáo tương tự về tình trạng mụn cóc xuất hiện nhiều ở những bệnh nhân ghép thận cũng đã được công bố trước đó, tuy nhiên, yếu tố quan trọng trong lâm sàng của bệnh nhân này là hiện tượng hẹp niệu quản, dẫn tới phải can thiệp phẫu thuật. Sau khi tiêm nước tiểu của bệnh nhân vào tế bào thận khỉ rhesus và các tế bào thận trong phôi thai người, xuất hiện bệnh học tế bào nhưng không phải do papillomavirus. Do đó, virus này được xác định là virus mới, đặt tên là BK theo tên viết tắt của bệnh nhân được phân lập lần đầu tiên [70]. 1.2.2. Đặc điểm sinh học 1.2.2.1. Phân loại BKV thuộc họ Polyomaviridae, chi Polyomavirus. BKV cùng họ với JC virus (JCV) cũng như virus Simian 40 (SV40). BKV, JCV và SV40 là ba virus thuộc họ polyomavirus, có tính tương đồng cao ở trình tự DNA và promassimotein. Sự tương đồng trong trình tự gen giữa BKV – JCV và BKV - SV40 lần lượt là 72% và 69%. Cả ba virus đều mã hóa cho 6 loại protein. Sự tương đồng axit amin trong vùng sớm là 88% giữa BKV - JCV, 81% giữa BKV - SV40 và 79% giữa JCV - SV40. Ở khu vực mã hóa muộn (các protein cấu trúc), sự tương đồng là 86% giữa BKV- JCV, 85% giữa BKV - SV40 và 82% giữa JCV - SV40 [9]. 1.2.2.2. Cấu trúc virion BKV không có vỏ bao ngoài nhưng có vỏ capsid hình khối đa diện với 20 mặt tam giác đều, đường kính dao động từ 40-44 nm. Capsid gồm các protein cấu trúc VP1, VP2 và VP3, bao quanh phân tử DNA kép mạch vòng được gắn kết cùng với protein histone. Protein capsid được sắp xếp trong một cấu trúc đa diện 7 mặt có chứa 360 phân tử VP1, sắp xếp thành 72 patamers. Mỗi patamer liên kết với bên trong bằng một phân tử protein capsid VP2 hoặc VP3. Do đó, VP1 là protein duy nhất bộc lộ bên ngoài virion, chịu trách nhiệm gắn kết virus với thụ thể tế bào chủ cũng như thúc đẩy quá trình xâm nhập [3]. Trong những nghiên cứu gần đây, khi quan sát BKV dưới kính hiển vi điện tử, các nhà khoa học thấy những điểm tương 6
tác giữa protein VP2, VP3 với protein histone và hệ gen. Nhiều giả thuyết đặt ra, VP2 và VP3 là cầu nối giữa VP1 và cấu trúc chromatin [43]. Kích thước bộ gen BKV khoảng 5,3 kb, chứa các gen mã hóa cho protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3), các protein giúp cho quá trình nhân lên của virus (LTA: Large T antigen, STA: Small T antigen, agnoprotein) và vùng không mã hóa (NCCR: Non coding control region). NCCR là một vùng biến thể cao, có chứa các vị trí liên kết khác nhau với các nhân tố điều hòa của tế bào chủ, do đó được xem là vùng điều hòa biến thể (HVRR: Hypervariable Regulatory Region) [23]. Khung đọc mở nằm ở trung tâm của bộ gen, thúc đẩy việc sao chép diễn ra theo hai chiều. Trong quá trình nhân lên, LTA tạo thành một phức hợp đa phân liên kết với vị trí khởi đầu sao chép (Ori) và hoạt động như một helicase để tạo điều kiện cho việc sao chép vùng mã hóa muộn [86]. LTA cũng là một yếu tố điều hòa quan trọng, thúc đẩy tế bào chủ đến pha S của chu trình tế bào bằng cách liên kết với các protein ức chế khối u Rb, p107, p130 và p53 [39]. Bên cạnh đó, STA liên quan đến khả năng nhân lên của virus, sự vận hành chu trình tế bào và biến nạp. Các protein capsid VP1, VP2, VP3 được tạo ra trong tế bào chất, vận chuyển vào nhân thông qua các tín hiệu định hướng nhân liên kết với proteins. Một khi các protein capsid xâm nhập vào nhân, sự lan truyền của virus sẽ diễn ra [57]. Hình 1. 1. Cấu trúc virion BKV [3] 1.2.2.3. Con đường lây nhiễm Con đường lây nhiễm BKV vẫn chưa được xác định rõ ràng [51]. Nhiều bằng chứng cho thấy đường hô hấp và tiêu hóa là hai con đường lây truyền chính. 7
Các con đường lây nhiễm khác như truyền máu, đường sinh dục, ghép tạng (đặc biệt là ghép thận đồng loại) và từ mẹ sang con cũng đã được báo cáo [3]. Nhiễm trùng tiên phát thường hiếm khi xuất hiện các triệu chứng bệnh hoặc chỉ xuất hiện triệu chứng viêm đường hô hấp nhẹ. Điều này cho thấy BKV thâm nhập đường máu thông qua nhiễm trùng ở amidan. Sau khi thâm nhập vào các tế bào máu ngoại vi, virus sẽ lan truyền sang các mô khác nhau, điển hình là thận [70]. Trong lần nhiễm trùng tiên phát, BKV tồn tại dai dẳng trong các tế bào ống thận và sự tái hoạt động không triệu chứng xảy ra khi virus được bài tiết trong nước tiểu. Trong khi đó, ở những người khỏe mạnh hay bệnh nhân có khả năng miễn dịch, hiện tượng tái hoạt động của BKV và sự xuất hiện của BKV trong nước tiểu rất hiếm khi xảy ra. BKV cũng được tìm thấy trong tế bào bạch cầu, não, hạch bạch huyết với các bằng chứng về sự xuất hiện BKV-DNA. Sự phát tán BKV trong nước tiểu phổ biến hơn ở những bệnh nhân ghép thận so với người khỏe mạnh. Tuy nhiên, cơ chế về sự tồn tại dai dẳng của BKV và những điều kiện dẫn tới sự tái hoạt động của BKV ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch vẫn chưa được nghiên cứu rõ ràng [51]. 1.2.2.4. Chu trình nhân lên Quá trình nhân lên của BKV được bắt đầu bằng sự kiện kháng nguyên VP1 gắn với acid sialic hoặc GD1b/GT1b trên màng tế bào chủ [27]. Sau khi phức hợp gắn kết, BKV thâm nhập tế bào bằng con đường nhập bào (endocytosis) và được vận chuyển tới lưới nội chất nhờ các microtubule [29]. Thông qua VP2, VP3 và con đường importin, BKV tiếp cận nhân và giải phóng DNA vào tế bào vật chủ. Tuy nhiên, genome của BKV xâm nhập vào trong nhân của tế bào vật chủ nhưng không tích hợp vào hệ gen người. Mặt khác, nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng tích hợp genome BKV vào hệ gen ở động vật gặm nhấm dẫn đến sự hình thành và phát triển các khối u [3]. Hơn nữa, những hiểu biết về cơ chế tương tác giữa BKV-DNA với hệ gen động vật gặm nhấm để hình thành khối u còn nhiều hạn chế. Sau khi giải phóng DNA vào nhân, nhờ phức hệ enzyme của tế bào chủ, quá trình phiên mã sớm diễn ra nhằm tạo ra các protein hỗ trợ quá trình sao chép của virus (STA, LTA). Tiếp theo, các protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3) được hình thành từ tế bào chất và 8
vận chuyển vào nhân thông qua các tín hiệu định hướng nhân liên kết với proteins. Một khi các proteins capsid xâm nhập vào nhân, sự lan truyền của virus sẽ diễn ra. Hình 1. 2. Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của BKV [3] 1.2.2.5. Đáp ứng miễn dịch • Đáp ứng miễn dịch tự nhiên Phần lớn các nghiên cứu về mối tương tác giữa BKV với hệ thống miễn dịch tự nhiên tập trung vào thiết lập sự tái hoạt động của BKV và BKVN ở những bệnh nhân ghép thận (KTRs: Kidney transplant recipients). Womer và cộng sự đã chỉ ra rằng có sự giảm số lượng tế bào tua (DC: Dendritic cells) trong máu ngoại vi ở bệnh nhân BKVN. Các nghiên cứu sâu hơn đã xác định các bệnh nhân có số lượng DC thấp hơn trước khi ghép có nguy cơ bị BKVN cao hơn [88]. DC cũng thực hiện một 9
vai trò quan trọng trong việc kích hoạt đáp ứng miễn dịch thích ứng, đặc biệt là biệt hóa thành các tế bào T đặc hiệu BKV [31]. Các tế bào giết tự nhiên (NKs: Natural Killer Cells) cũng có vai trò trong việc kiểm soát lây nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận. Các thụ thể giống với kháng thể của tế bào NK (KIR) có vai trò trong đề kháng miễn dịch đối với BKV. Các nghiên cứu mới đây đã chỉ ra rằng chiến lược giám sát miễn dịch của BKV có thể thông qua việc ức chế quá trình nhận diện của các tế bào NK. Các yếu tố trung gian khác của hệ miễn dịch tự nhiên cũng đóng góp vào việc kiểm soát BKV, như defensins thể hiện hoạt tính chống nhiễm trùng với đa số các virus, nấm và vi khuẩn. Nghiên cứu của Dugna và cộng sự đã chỉ ra Defensins 5 của người (HD5) ức chế sự bám của BKV vào tế bào chủ bằng cách kết tụ virus [28]. HD5 thường được tìm thấy trong đường niệu sinh dục, cũng chính là vị trí khu trú của BKV và HD5 có thể bất hoạt BKV theo kiểu phụ thuộc huyết thanh, thực hiện một vai trò quan trọng trong việc điều tiết sự tái hoạt động không triệu chứng nhiễm virus trong đường tiết niệu sinh dục. Yếu tố trung gian trong hệ miễn dịch tự nhiên cũng có khả năng tác động lên việc làm mất mô ghép ở bệnh nhân ghép thận do nhiễm BKV. Hơn nữa, người ta cũng chỉ ra rằng nhiễm BKV thúc đẩy sự xơ hóa mô ghép ở bệnh nhân BKVN với bằng chứng là sự tăng biểu hiện collagens nền, các yếu tố tăng trưởng khối u beta (TGF-β), MMP2 và -9, cũng như là tín hiệu của quá trình chuyển đổi biểu mô (EMT) trong mẫu sinh thiết thận [3]. • Đáp ứng miễn dịch thích ứng Đáp ứng dịch thể Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống BKV thường diễn ra không lâu sau khi tiếp xúc với kháng nguyên của virus. BKV thường lây nhiễm từ thời thơ ấu, dẫn đến các đáp ứng kháng thể trung hòa đặc hiệu BKV. Nghiên cứu của Egli và cộng sự (2009) [30] trên nhóm người khỏe mạnh chỉ ra rằng kháng thể IgG đặc hiệu BKV xuất hiện ở 87% những người trẻ tuổi (20-29) và 71% ở nhóm người tuổi trung niên (50-59). Tương tự, Randhawa và cộng sự (2002) [70], đã phát hiện 80% người cho 10
thận có kháng thể IgG và 22% có kháng thể IgA đặc hiệu BKV. Các báo cáo cũng chứng minh sự có mặt của các kháng thể đặc hiệu BKV không đủ để bảo vệ cơ thể trước sự tái hoạt động mạnh mẽ của BKV và các bệnh liên quan. Mặt khác, các đột biến kháng nguyên của virus có thể giúp virus trốn thoát khỏi sự trung hòa qua trung gian kháng thể. Đáp ứng miễn dịch tế bào Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh vai trò quan trọng của tế bào T trong việc kiểm soát sự lây nhiễm BKV. Các phân tích tế bào T-CD4 và T-CD8 đặc hiệu với BKV ở trong máu ngoại vi và các tập hợp tế bào từ mẫu sinh thiết thận của bệnh nhân BKVN cho thấy đáp ứng của tế bào T diễn ra rất mạnh và liên quan chặt chẽ tới tải lượng cao của BKV. T-CD4 có thể kiểm soát sự tái kích hoạt BKV kể cả trong hệ miễn dịch thiếu hụt tế bào T-CD8. Các thuốc ức chế miễn dịch ngăn cản thải ghép ở bệnh nhân ghép thận có thể gây giảm biểu hiện các cytokine, như IFN-γ và TNF. Một trong những trở ngại chính trong nghiên cứu tế bào T đặc hiệu BKV là tỉ lệ thấp các tế bào tiền thân trong máu ngoại vi ở cả người cho và người ghép thận. Các nghiên cứu chỉ ra rằng sự tái lập tế bào T đặc hiệu (T-CD4 và T-CD8 ) với BKV liên quan tới khả năng kiểm soát tải lượng BKV trong máu và trong nước tiểu tốt hơn. Do đó việc theo dõi tỷ lệ tế bào T đặc hiệu với BKV sau ghép có thể đưa gia chiến lược giúp tiên lượng nguy cơ sự tái hoạt động của BKV và BKVN [3]. 1.3. Mối quan hệ giữa BKV và bệnh lý ghép thận 1.3.1. Mối tương quan giữa nồng độ BKV-DNA và bệnh lý ghép thận Trước thời kỳ sử dụng thuốc ức chế miễn dịch chống thải ghép là cyclosporine, hẹp niệu quản là biến chứng thường gặp hơn là BKVN sau ghép thận. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện việc sử dụng các thuốc ức chế miễn dịch chống thải ghép làm gia tăng nhiễm BKV ở người ghép thận. Một số nghiên cứu tiến cứu đã chỉ ra rằng BKV dương tính cả trong huyết thanh và nước tiểu thậm chí ngay sau giờ đầu tiên, và tỷ lệ cao nhất từ 1 đến 3 tháng sau ghép thận. Điều này cho thấy giả thuyết về nguồn gốc của BKV có thể xuất hiện từ người cho thận chứ không chỉ đơn thuần là sự tái hoạt động của BKV ở bệnh nhân ghép thận. BKV được công 11