Tiểu luận kỹ thuật gen

Chia sẻ: Hoang Thuy | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

99
lượt xem 19
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kỹ thuật gen gồm nhều giai đoạn nhằm biến đổi cấu trúc gen, tạo gen mới, đưa các gen tái tổ hợp vào tế bào chủ để thu nhận các prôtêin tái tổ hợp, hoặc nghiên cứu cấu trúc bộ gen, lập bản đồ gen.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tiểu luận kỹ thuật gen

Chuyên công ngh sinh h c ---------------------------------------------------Ph m Vi t Hà Cao H c K18 II . NGUYÊN LÍ K THU T GEN 1. Các bư c ch y u c a k thu t gen K thu t gen g m nh u giai o n nh m bi n i c u trúc gen, t o gen m i, ưa các gen tái t h p vào t bào ch thu nh n các prôtêin tái t h p, ho c nghiên c u c u trúc b gen, gen. K thu t gen g m các bư c cơ b n sau: l pb n a. Chu n b gen c n tách dòng Gen c n tách dòng ( o n ADN insert), có th ư c chu n b b ng phương pháp tách chi t (ADN, ARN) t sinh v t mang ngu n gen t nhiên ho c t ng h p nhân t o. Tách chi t (ADN, ARN) t sinh v t mang ngu n gen t nhiên; tách chi t plasmid t vi khu n. Tinh s ch và ch n l c thu ư c các gen c n tách dòng. S d ng k thu t nhân gen PCR nhân gen c n thi t lên m t s lư ng l n các b n sao, m b o m t lư ng ADN (ARN) c n thi t. T ng h p o n ADN nhân t o trên cơ s ã bi t các trình t c hi u ( ho c trình t axitamin trong chu i polipeppit). Dùng k thu t t ng h p nhân t o o n oligonuclêotit m ch ơn và nhân gen PCR t o s lư ng các o n ADN nhân t o l n. b. T o vectơ tái t h p D a vào c i m c a gen c n tách dòng l a ch n lo i vectơ và enzim gi i h n phù h p. G m + C t ADN c a t bào cho ch a gen c n chuy n và ADN c a plasmid cùng m t lo i enzim c t gi i h n, enzim này s c t hai m ch ơn c a phân t ADN v trí nuclêôtit xác nh (trình t nh n bi t) t o ra các u dính có trình t nuclêôtit b sung. + Tr n ADN c a t bào cho v i ADN plasmid ã c t h , các u dính b t c p b sung v i nhau nh enzim n i ligaza t o liên k t photpho ieste làm li n m ch ADN. Plasmid mang gen l g i là ADN tái t h p. Hình . Sơ các bư c ch y u c a k thu t gen -------------------------------------------------- Trang 1 ----------------------------------------------------------
Chuyên công ngh sinh h c ---------------------------------------------------Ph m Vi t Hà Cao H c K18 c. Bi n n p vectơ tái t h p vào t bào ch S d ng các phương pháp bi n n p khác nhau ( s c nhi t, xung i n, b n gen…) ưa các vectơ tái t h p vào t bào ch . T o môi trư ng thích h p vectơ tái t h p t n t i và ư c nhân lên cùng t bào ch . d. Sàng l c các dòng t bào mang vectơ tái t h p Sàng l c dòng tái t h p là quá trình ki m tra ch n l c và tách riêng các dòng tái t h p có ho t tính. e. Nuôi c y t bào tái t h p thu s n ph m t bào tái t h p ư c nuôi trong các bình lên men, v i i u ki n thích h p v dinh dư ng, nhi t , pH… các t bào tăng sinh kh i nhanh, t o các s n ph m prôtêin tái t h p m c cao nh t. Th c hi n công ngh tách chi t prôtêin tái t h p, tinh s ch thu ch ph m. 2. Nguyên t c ch n vectơ tách dòng Ch n vectơ tách dòng thích h p có vai trò quy t nh s thành công trong tách dòng m b o tách dònh gen thành công, khi ch n vectơ tách dòng c n chú ý nguyên t c gen. sau: +D a vào kích thư c và b n ch t o n ADN c n tách dòng làm căn c ch n vectơ. - N u ADN cài có ngu n g c t gen cu sinh v t nhân sơ vectơ tách dòng có th ch n là plasmid, phage, cosmid… - N u ADN cài có ngu n g c t gen cu sinh v t nhân th c vectơ tách dòng có th ch n là, phage, nhi m s th nhân t o n m men… + S tương ng các v trí c hi u c a các enzim gi i h n gi a o n cài ADN và vectơ tách dòng. Nghĩa là, o n cài ADN và vectơ tách dòng ph i có các v trí c t c hi u c a cùng m t lo i enzim gi i h n. + Vectơ tách dòng ph i thích h p v i lo i t bào ch , có kh năng tái b n trong t bào ch , t o s lư ng b n sao l n ( 50b n/1t bào), nhưng không gây nh hư ng n ho t ng c a t bào ch . +Gen ch th trong vectơ tách dòng càng d nh n bi t càng t t d dàng ch n l c các vectơ tái t h p. Các i m c t c a enzim gi i h n thư ng n m trong các gen ch th , giúp cho s nh n bi t và sàng l c d dàng. + Vectơ tách dòng ph i có hi u qu tách dòng cao, t o nên t l vectơ tái t h p cao. 3. Nguyên t c t o vectơ tái t h p T o vectơ tái t h p là th c hi n k thu t g n n i gen c n tách dòng vào vectơ tách dòng. T o vectơ tái t h p th c hi n theo các bư c sau : + Chu n b nguyên li u : Gen c n tách dòng (ADN insert) tinh s ch c n ư c nhân lên b ng PCR ( 20- 25 chu kỳ) t o m t hàm lư ng c n thi t s n ph m PCR. Vectơ tách dòng thích h p nhw pBR 322, pUC 18… + Th c hi n ph n ng n i gen c n tách dòng v i vectơ : chu n b thành ph n ph n ng phù h p v i m i lo i vectơ tách dòng. Ví d : vectơ tách dòng là pUC 18 h n h p ph n ng g m : 1,0 µl m ph n ng ; 0,5µl ATP 10 mM ; 1,0 µl enzym T4 ADN ligase ; 1,0 µl vectơpUC 18 ; 5,0 µl s n ph m PCR tách dòng ; 1,5 µl H2O. -------------------------------------------------- Trang 2 ----------------------------------------------------------
Chuyên công ngh sinh h c ---------------------------------------------------Ph m Vi t Hà Cao H c K18 160C. Sau ó, ti n + H n h p các thành ph n ph n ng ư c qua êm nhi t hành i n di v i thang ADN chu n ki m tra k t qu t o vectơ tái t h p. Vectơ tái t hơph ã t o ư c c n gi trong t l nh sâu -800C n -850C ti p t c các nghiên c u ti p theo. 4. M t s k thu t bi n n p vectơ tái t h p vào t bào ch Bi n n p vectơ tái t h p và t bào v t ch ư c th c hi n b ng nhi u k thu t khác nhau : b n gen, vi tiêm, xung i n, s c nhi t, s d ng PEG… 4.1. Bi n n p vectơ tái t h p vào t bào E. coli b ng k thu t s c nhi t a. Chu n b t bào kh bi n T bào E.coli (LE 392, MC 1061, BL 21…) ư c nuôi c y trên môi trư ng th ch LB (5% cao n m men, 10% trypton, 10% NaCl). L y 1 khu n l c E. coli vào 5ml môi trư ng LB l ng , nuôi 370C, l c v i t c 200 vòng/ phút trong 12- 16 gi i. L y 1ml d ch VK + 99ml môi trư ng LB nuôi l c 2-3 gi , khi OD600 t 0,4 -0,6 l y d ch nuôi c y lên á trong 1,0 - 1,5 gi , sau ó li tâm l nh thu c n t bào t c 4500 - 5000 vòng trong 8-10 phút. Hoà c n t bào trong 100ml CaCl2 100mM l nh, trên khay á 15 phút r i li tâm l nh thu c n t bào. C n t bào hoà trong 40 ml CaCl2 100mM l nh, 1 gi trên á, sau ó li tâm trong 4000 vòng trong 10 phút, thêm 500 µl CaCl2 100mM l nh, có thu c n t bào v i t c ch a 15% glycerol vào c n t bào thu ư c các t bào kh bi n. L y vào m i ng eppendorf -750C n -800C 50 µl t bào kh bi n, gi trong t l nh sâu nhi t th c h i n b i n n p . b. K thu t bi n n p -750C n -800C L y 50 µl t bào kh bi n ang gi trong ng eppendorf nhi t trên á kho ng 15 phút, sau ó thêm 0,5 ng ADN aot nh ng 3-4 l n và trên á kho ng 15-20 phút. 420C trong 2 phút, t nhanh trên á 2 phút. L y m u t vào b n nhi t có nhi t Sau ó thêm kho ng 1000 µl môi trư ng LB l nh, nuôi trong 370C máy l c trong 30-60 phút. L y 100 µl d ch t bào ã s c nhi t, tr i lên h p Petri môi trư ng LB 2% agarose có b 50 µg/ml, IPTG và X-gal. h p petri 370C trong 12- 16 gi , sung ampicilin v i n ng ki m tra các khu n l c phát tri n trên h p petri. Thu nh n khu n tr ng, c y vào trong môi trư ng l ng ki m tra k t qu . Bi n n p E.coli b ng k thu t s c nhi t có hi u qu kho ng 1/10000. sàng l c các t bào mang vectơ tái t h p, chuy n sang ng th ch nghiêng gi ch ng gi ng. 4.2. Bi n n p vectơ tái t h p vào t bào n m men b ng k thu t xung i n a. Chu n b t bào C y 1 khu n l c n m men vào 5 ml môi trư ng YPD ( 1% cao n m men, 2% pepton, 2% glucose), nuôi 280C v i t c l c 250 vòng/ phút trong 1 ngày êm. L y 30 µl dung d ch nuooi c y vào 100 ml YPD, l c 16-18 gi , o OD600 xác nh m t t bào (OD =1,3 - 1,5). m u trên á 5-10 phút, li tâm v i t c 4500 - 5000 vòng trong 5 phút, l y c n t bào hoà trong 100ml nư c kh ion l nh, li tâm thu c n t bào. Hoà t bào trong 20 ml sorbitol 1M, li tâm 4500 vòng trong 5 phút thu c n t bào. Hoà c n t bào v i 0,2 ml sorbitol, chia u m i -750C n -800C. ng eppendorf 50 µl d ch t bào kh bi n gi trong t l nh sâu nhi t b. K thu t xung i n L y 50 µl d ch t bào kh bi n trong ng eppendorf gi trong t l nh sâu thêm vào 10- 15 µg ADN plasmid tái t h p, tr n u và chuy n vào cuvet xung i n 0,2 cm. Th c hi n xung i n 0,25 µF, 200 , 1,5 kV trong 4-5 ph n nghìn giây. B sung 1 ml sorbitol 1M l nh, -------------------------------------------------- Trang 3 ----------------------------------------------------------
Chuyên công ngh sinh h c ---------------------------------------------------Ph m Vi t Hà Cao H c K18 o u chuy n sang ng m i, c y lên môi trư ng th ch ĩa ki m tra k t qu bi n n p. Hi u qu bi n n p b ng xung i n tương i cao (kho ng 1%). 5. K thu t ch n l c các dòng t bào tái t h p Dòng t bào tái t h p là dòng các t bào mang vectơ tái t h p, ư c nuôi môi trư ng thích h p t o thành các khu n l c. Phương pháp ch n l c t bào tái t h p theo nhi u k thu t khác nhau : 5.1. Ch n l c dòng t bào tái t h p b ng ch th kháng sinh ây là phương pháp ơn gi n và d s d ng. Do hi u qu bi n n p thư ng r t th p, vì v y sau khi bi n n p c n ph i ch n l c úng các t bào mang vectơ tái t h p. D a vào gen kháng ch t kháng sinh trong vectơ tái t h p, chu n b môi trư ng dinh dư ng có b sung ch t kháng sinh tương ng nuôi c y các t bào sau bi n n p. Trong môi trư ng có ch t kháng sinh, các t bào ch a vectơ tái t h p có gen kháng ch t kháng sinh t n t i và phát tri n ư c, nh ng t bào không có vectơ tái t h p không phát tri n ư c. Phương pháp dùng ch th kháng sinh thư ng có hi u qu không cao, do 1 s t bào không mang vectơ tái t h p nhưng do xu t hi n các t bi n kháng ch t kháng sinh, nên v n có th phát tri n ư c. m b o hi u qu sàng l c chu n xác, thư ng k t h p s d ng ch th hai lo i kháng sinh, ho c ng th i s d ng gen ch th kháng sinh cùng v i gen ch th màu, ch th enzym... 5.2. Ch n l c dòng t bào tái t h p b ng gen ch th màu S d ng gen ch th màu k t h p v i gen ch th khánh sinh là phương phápch n l c dòng tái t h p có hi u qu cao. Trong k thu t sàng l c th tái t h p t bào vi khu n, gen LacZ k t h p v i IPTG và X- gal làm gen ch t màu ư c s d ng tương i ph bi n, d nh n bi t dòng tái t h p nh màu s c khu n l c. Gen LacZ mã hoá enzym β- galactosidase c a vi khu n E.coli có ch t c m ng IPTG (isopropyl thiogalactoside- ch t ng ng c a lactose) β- galactosidase ư c t ng h p trong t bào E.coli. N u môi trư ng có m t X-gal (5-bromo -4-cloro-3-indolyl - β-D- galactopyranoside), enzym β- galactosidase có kh năng thu phân X-gal t 1 h p ch t không màu thành màu xanh. Do ó môi trư ng nuôi c y vi khu n sau khi bi n n p có b sung thêm m t ít X-gal và ch t c m ng IPTG, các t bào vi khu n có gen LacZ nguyên v n (không t o ADN tái t h p) t ng h p enzym β- galactosidase thu phân X-gal các t bào này phát tri n thành khu n l c có màu xanh. N u gen cài ADN ư c xen vào gi a gen LacZ (vectơ tái t h p) làm cho gen LacZ m t ho t tính, enzym β- galactosidase không ư c t ng h p, t bào vi khu n phát tri n thành các khu n l c có màu tr ng . L a ch n các khu n l c có màu tr ng c y truy n vào môi trư ng dinh dư ng có th chthu ư c dòng t bào mang vectơ tái t h p. 5.3. Ch n l c dòng t bào tái t h p b ng phương pháp lai phân t ây là phương pháp ch n l c dòng tái t h p có chính xác cao, nhưng ph c t p và t n kém, ph i có thi t b chuyên dùng…Phương pháp lai axit nuclêic (ADN, ARN)v i m u dò ánh d u phóng x ho c huỳnh quang (m u dò là các o n oligo nuclêôtit ư c ánh d u phóng x , ho c huỳnh quang). Các bư c th c hi n g m : +Sau khi bi n n p các t bào vi khu n ( ho c n m men) ư c nuôi c y t h p petri trên môi trư ng có 2% agar, m i t bào phát tri n thành m t khu n l c. t m t màng lai lên trên h p petri -------------------------------------------------- Trang 4 ----------------------------------------------------------
Chuyên công ngh sinh h c ---------------------------------------------------Ph m Vi t Hà Cao H c K18 + L y màng lai ã in d u các khu n l c vi khu n sau bi n n p, em lai phân t v i m u dò ámh d u phóng x (ho c huỳnh quang), m u dò ph i có trình t tương ng v i o n c hi u c a gen tái t h p. + nhi t thích h p t o ph n ng lai. R a màng lai lo i b các m u dò không ư c lai và th c hi n k thu t phóng x t ghi. + K t qu hi n hình phóng x cho th y nh ng v trí có ph n ng lai s có các ch m en trên phim nh y phóng x , ho c các v t màu khi hi n hình huỳnh quang. L a ch n các khu n l c các v trí tương ng trong h p petri ư c các dòng tái t h p. - -------------------------------------------------- Trang 5 ----------------------------------------------------------