zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Y Tế - Sức Khoẻ

» Y khoa - Dược

Tối ưu hóa quy trình kỹ thuật PCR phân tích một số exon gen SLC25A13 gây bệnh thiếu citrin

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Báo xấu

3
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bệnh lý thiếu hụt citrin gây ra bởi đột biến di truyền lặn trên NST thường, do đột biến gen SLC25A13 mã hóa tổng hợp protein citrin Nghiên cứu này tập trung vào tối ưu hóa bộ mồi đặc hiệu trong xác định đột biến gen SLC25A13 gây bệnh thiếu hụt citrin.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tối ưu hóa quy trình kỹ thuật PCR phân tích một số exon gen SLC25A13 gây bệnh thiếu citrin

HỘI NGHỊ KHOA HỌC THƯỜNG NIÊN LẦN THỨ XXVI – HÓA SINH Y HỌC HÀ NỘI VÀ CÁC TỈNH PHÍA BẮC TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR PHÂN TÍCH MỘT SỐ EXON GEN SLC25A13 GÂY BỆNH THIẾU CITRIN Nguyễn Thị Phương Thúy1, Tạ Văn Thạo1, Mai Quỳnh Anh1, Nguyễn Thị Lành2, Phạm Ngọc Mai1 TÓM TẮT 4 SUMMARY Bệnh lý thiếu hụt citrin gây ra bởi đột biến di OPTIMIZATION OF PCR TECHNICAL truyền lặn trên NST thường, do đột biến gen PROCESS FOR THE ANALYSIS OF SLC25A13 mã hóa tổng hợp protein citrin [1]. SOME EXON GENES SLC25A13 Bệnh đặc trưng bởi tình trạng vàng da ứ mật, trên CAUSING CITRIN DEFICIENCY lâm sàng, sự thiếu hụt citrin biểu hiện bằng ít DISEASE Citrin deficiency is caused by an autosomal nhất hai kiểu hình dựa vào độ tuổi khởi phát là recessive genetic mutation, due to a mutation in vàng da ứ mật trong gan ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ the SLC25A13 gene encoding citrin protein và tăng citrullin máu type II ở người lớn. Xét synthesis [1]. The disease is characterized by nghiệm phân tích gen SLC25A13 mã hóa protein cholestatic jaundice; clinically, citrine deficiency vận chuyển carnitin có giá trị chẩn đoán xác định manifests itself in at least two phenotypes based bệnh thiếu hụt carnitin nguyên phát bởi kỹ thuật on age of onset: intrahepatic cholestatic jaundice này xác định được chính xác các đột biến trên in infants and young children and increased gen SLC25A13 ảnh hưởng trực tiếp tới việc tổng citrullin. type II blood in adults. The SLC25A13 hợp protein citrin. Ở Việt Nam hiện nay để xác gene analysis test, encoding the carnitine đột biến gen SLC25A13 chủ yếu sử dụng các bộ transport protein, has diagnostic value in mồi được tham khảo từ nghiên cứu trước đây determining primary carnitin deficiency because trên thế giới tuy nhiên vẫn gặp phải sự không đặc this technique accurately identifies mutations in hiệu về mồi dẫn đến khó xác định được đột biến. the SLC25A13 gene that directly affect citrin Nghiên cứu này tập trung vào tối ưu hóa bộ mồi protein synthesis. In Vietnam, currently, to đặc hiệu trong xác định đột biến gen SLC25A13 identify mutations in the SLC25A13 gene, we mainly use primer sets referenced from previous gây bệnh thiếu hụt citrin. research around the world, but still encounter Từ khóa: thiếu hụt citrin, đột biến gen non-specificity in primers, making it difficult to SLC25A13, mồi PCR identify the mutation. This study focuses on the design and optimization of specific primer sets to 1 Trường Đại học Y Hà Nội identify the SLC25A13 gene mutation that 2 Bệnh viện Nhi Trung Ương causes citrin deficiency. Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Thị Phương Thúy Keywords: Citrin deficiency, SLC25A13 Email: phuongthuy@hmu.edu.vn gene mutation, PCR primers Ngày nhận bài: 10-10-2023 Người phản biện khoa học: PGS.TS Phạm Thiện Ngọc Ngày duyệt bài: 18-10-2023 26
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 532 - THÁNG 11 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2023 I. ĐẶT VẤN ĐỀ các xét nghiệm hóa sinh thông thường Vàng da ứ mật (VDƯM) ở trẻ em vẫn là thường không đặc hiệu. Chính vì vậy, cho tới một trong những bệnh lý gan mật phức tạp nay, các kỹ thuật sinh học phân tử đặc biệt là và đa dạng. Một trong những nguyên nhân phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase gây VDƯM ở trẻ em mới được xác định chain reaction – PCR) vẫn là công cụ hữu trong những năm gần đây là bệnh VDƯM do hiệu và đáng tin cậy nhất trong việc chẩn thiếu citrin. Đây là bệnh lý di truyền lặn trên đoán xác định đối với các bệnh nhân nghi NST thường, do đột biến gen SLC25A13 gây ngờ mắc thiếu hụt citrin [4]. Việc xây dựng ra [1]. Gen này được xác định vào năm 1999 được quy trình PCR khuếch đại đặc hiệu các và tới nay đã có hơn 50 kiểu đột biến gen đoạn gen mã hóa tổng hợp protein citrin sẽ trên SLC25A13 được công bố [2]. Chức giúp phát hiện các đột biến gây bệnh thiếu năng của gen SLC25A13 là mã hóa tổng hợp hụt citrin được chính xác hơn. protein citrin - một chất mang quan trọng thuộc hệ protein vận chuyển qua màng. Sự II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU thiếu hụt citrin ảnh hưởng đến quá trình tổng - Thời gian và địa điểm nghiên cứu: hợp protein, đường phân, sinh tổng hợp Trung tâm Xét nghiệm Chemedic - từ tháng nucleotit và nhiều quá trình chuyển hóa khác 10 năm 2022 đến tháng 5 năm 2023. trong cơ thể [3]. Trên lâm sàng, sự thiếu hụt - Đối tượng nghiên cứu: mẫu DNA được citrin biểu hiện bằng ít nhất hai kiểu hình dựa tách từ máu toàn phần của người bình thường vào độ tuổi khởi phát: VDƯM trong gan ở có nồng độ 21 ng/µL; Sử dụng Kit Master trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ (Neonatal intrahepatic mix của hãng Quiagen khi PCR. cholestasis caused by citrin deficiency – - Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu NICCD) và tăng citrullin máu type II ở thực nghiệm trong phòng xét nghiệm. người lớn (Adult onset type II citrullinmia – - Khảo sát các điều kiện: nhiệt độ gắn CTLN2). Ngoài ra, gần đây, một kiểu hình mồi, số chu kỳ nhiệt, thời gian kéo dài và trung gian mới đã được đề xuất, đặc trưng nồng độ mồi trong PCR với các cặp mồi bởi sự chậm phát triển và rối loạn lipid máu được thiết kế đặc hiệu cho 4 đoạn exon trên ở trẻ, gọi tắt là FTTDCD (delayed gen SLC25A13 với thứ tự lần lượt là 1, 3, 6, development and dyslipemia caused by citrin 9 (Bảng 1). Đây là các vị trí gen thường được deficiency). Việc xác định bệnh không phải nghiên cứu với tần suất xuất hiện đột biến là điều dễ dàng bởi các dấu hiệu lâm sàng và cao của gen SLC25A13. Bảng 1. Các cặp mồi dùng khuếch đại gen SLC25A13 sử dụng trong nghiên cứu Đoạn Cover Kích Primer Cover gene gen exon/intron thước F: GGAGAGTACAAGCTTCTGGTC ex7 1 R: ACTGAGTTGCCTTCTTCACCC 130690-131115 426 (130901-131039) F: TTGGGCTGTCAGCAATGTGCC R: CTAGCATGCCTCCAGCCTACT ex11 3 F: CTAGTCATACCTGTGATCTCTCCA 137473-137872 557 (137713-137871) R: GGAGTTGATACCAGTCTCATCAG 27
HỘI NGHỊ KHOA HỌC THƯỜNG NIÊN LẦN THỨ XXVI – HÓA SINH Y HỌC HÀ NỘI VÀ CÁC TỈNH PHÍA BẮC F: CGCGACAGGAAAAAACCACTGCA ex17 6 R: AGAGAGCACGGACAGTCATCTGG 200368-200674 307 (200403-200493) F: GGAGAGTACAAGCTTCTGGTC R: ACTGAGTTGCCTTCTTCACCC ex6 9 F: TTGGGCTGTCAGCAATGTGCC 128704-129213 510 (128965–129111) R: CTAGCATGCCTCCAGCCTACT III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU nhiệt cho mỗi lần chạy và sản phẩm PCR sau 3.1. Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mỗi lần chạy được lưu trữ tại 2-8℃ để điện mồi (Ta) trong PCR phân tích gen di trên cùng một bản gel đảm bảo đồng nhất SLC25A13 điều kiện trong tất cả các phản ứng chỉ khác Sử dụng Kit Master mix trên cùng 1 mẫu nhiệt độ gắn mồi (55℃; 57℃; 58℃; 59℃) DNA khuôn, cùng nồng độ mồi cho mỗi trong mỗi lần chạy. đoạn gen (0.5 µmol/L), cài đặt 40 chu kỳ Hình 1. Khảo sát nhiệt độ gắn mồi trong PCR phân tích gen SLC25A13 Chú thích: 3.2. Kết quả tối ưu hóa số chu kỳ nhiệt + M: marker trong PCR phân tích gen SLC25A13 + Giếng 1 – 16: sản phẩm PCR với nhiệt Sử dụng Kit Master mix trên cùng 1 mẫu độ gắn mồi 55℃, 57℃, 58℃, 59℃ khuếch DNA khuôn, cùng nồng độ mồi cho mỗi đại lần lượt các đoạn gen số 1, 3, 6, 9 ở mỗi đoạn gen (0.5 µmol/L), cài đặt nhiệt độ gắn nhiệt độ. mồi là 59℃ và sản phẩm PCR sau mỗi lần Nhận xét: Ở cả 4 mức nhiệt độ, các đoạn chạy được lưu trữ tại 2-8℃ để điện di trên gen 1, 3, 6 cho các băng sáng rõ nét, gọn và cùng một bản gel đảm bảo đồng nhất điều đúng kích thước. Riêng đoạn gen số 9 chỉ kiện trong tất cả các phản ứng chỉ khác số cho các vạch sáng rõ ở mức nhiệt cao là chu kỳ nhân lên (30; 35; 40; 43) trong mỗi 59℃. lần chạy. 28
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 532 - THÁNG 11 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2023 Hình 2. Khảo sát số chu kỳ nhiệt trong PCR phân tích gen SLC25A13 Chú thích: 3.3. Kết quả tối ưu hóa thời gian kéo + M: marker dài chuỗi trong PCR phân tích gen SLC25A13 + Giếng 1 – 16: sản phẩm PCR với số Sử dụng Kit Master mix trên cùng 1 mẫu chu kỳ nhân lên ở mỗi đoạn gen lần lượt là DNA khuôn, cùng nồng độ mồi cho mỗi 30; 35; 40; 43. đoạn gen (0.5 µmol/L), cài đặt nhiệt độ gắn Nhận xét: Ở tất cả các chu kỳ nhân lên mồi là 59℃, chạy trong 40 chu kỳ nhân lên đều thu đều thu được các đoạn gen đích đúng và sản phẩm PCR sau mỗi lần chạy được lưu với kích thước và không có các sản phẩm trữ tại 2-8℃ để điện di trên cùng một bản gel phụ. Ở 40 chu kỳ thu được sản phẩm là các đảm bảo đồng nhất điều kiện trong tất cả các băng sáng rõ nhất. phản ứng chỉ khác thời gian kéo dài chuỗi (25 giây; 30 giây; 35 giây và 40 giây) trong mỗi lần chạy. Hình 3. Khảo sát thời gian kéo dài chuỗi trong PCR phân tích gen SLC25A13 Chú thích: gian kéo dài chuỗi ở mỗi đoạn gen lần lượt là + M: marker 25; 30; 35; 40 (giây). + Giếng 1 – 16: sản phẩm PCR với thời 29
HỘI NGHỊ KHOA HỌC THƯỜNG NIÊN LẦN THỨ XXVI – HÓA SINH Y HỌC HÀ NỘI VÀ CÁC TỈNH PHÍA BẮC Nhận xét: Với cả 4 mức thời gian khảo Sau khi tối ưu hóa các điều kiện của phản sát đều thu được các đoạn gen đích đúng với ứng PCR trên các đoạn gen 1, 3, 6, 9 của gen kích thước và không có các sản phẩm phụ. Ở SLC25A13, tiến hành chạy PCR trên 11 mức thời gian 35 giây thu được sản phẩm đoạn gen của gen SLC25A13 với quy trình sáng rõ nhất. PCR: Nhiệt độ gắn mồi: 59℃; Số chu kỳ 3.4. Kết quả khảo sát trên 11 đoạn gen nhiệt: 40 chu kỳ; Thời gian kéo dài chuỗi: 35 của gen SLC25A13 giây. Hình 4. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phân tích gen SLC25A13 Chú thích: SLC25A13 kết quả thu được 10/11 băng + M: marker sáng, gọn, đúng kích thước; chỉ có duy nhất + Giếng 1 – 11: sản phẩm PCR khuếch đoạn gen số 7 xuất hiện 2 băng phụ ngoài đại các đoạn gen tương ứng từ đoạn gen số 1 băng chính có kích thước đúng (Hình 4). Kết tới đoạn gen số 11. quả này cho thấy có thể sử dụng mức 59℃ Nhận xét: làm nhiệt độ gắn mồi phù hợp trong PCR - Ở các giếng số 1,2,3,4,5,6,8,9,10,11 khuếch đại các đoạn gen tương ứng với các đoạn gen 1,2,3,4,5,6,8,9,10,11 trên gen SLC25A13. 1,2,3,4,5,6,8,9,10,11 cho các băng có độ sáng Kết quả này tương đối tương đồng với kết cao, rõ nét và không có băng phụ. quả nghiên cứu của Qi-Qi Zhen và cộng sự - Ở giếng số 7, ngoài băng chính với kích (2016) trong việc phát hiện các đoạn đột biến thước 246 bp còn xuất hiện 2 băng phụ với trên exon 5 của gen SLC25A13 đã sử dụng kích thước lần lượt khoảng 300 bp và 800 bp. 60℃ làm nhiệt độ gắn mồi [5]. Đây cũng là mức nhiệt gắn mồi được Zhan-Hui Zhang và IV. BÀN LUẬN cộng sự lựa chọn trong nghiên cứu phát hiện 4.1. Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi (Ta) đột biến xóa đoạn lớn trên exon 1 của gen trong PCR phân tích gen SLC25A13 SLC25A13 vào năm 2017 [6]. Hình 1 cho kết quả khảo sát 4 mức nhiệt 4.2. Tối ưu hóa số chu kỳ nhiệt trong độ gắn mồi lần lượt là 55℃; 57℃; 58℃; PCR phân tích gen SLC25A13 59℃ trong PCR phân tích 4 đoạn gen Kết quả khuếch đại 11 đoạn gen (Hình 4) (1,3,6,9). Dùng mức 59℃ làm nhiệt độ gắn là các băng sáng, gọn, đúng kích thước. Kết mồi để khảo sát trên 11 đoạn gen của gen quả này của tương đồng với kết quả của Qi- 30
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 532 - THÁNG 11 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2023 Qi Zhen và cộng sự vào năm 2016 trong 2. Fu H Y, Zhang S R, Yu H et al (2010). nghiên cứu trên các mẫu máu toàn phần từ Most common SLC25A13 mutation in 400 các bệnh nhân mắc NICCD nhằm phát hiện Chinese infants with intrahepatic cholestasis. các đoạn đột biến trên exon 5 của gen World J Gastroenterol, 16 (18), 2278-2282. SLC25A13 [5]. Tuy nhiên, theo một nghiên 3. Saheki T, Kobayashi K, Iijima M et al cứu khác của Zhan-Hui Zhang và cộng sự (2002). Pathogenesis and pathophysiology of năm 2012, chỉ với 30 chu kỳ nhiệt là đã có citrin (a mitochondrial aspartate glutamate thể khuếch đại thành công các đoạn gen đích carrier) deficiency. Metab Brain Dis, 17 (4), trên gen SLC25A13 từ các mẫu tế bào ối 335-346. nuôi cấy từ thai nhi [7]. Sự khác biệt này có 4. Yamaguchi N, Kobayashi K, Yasuda T et thể đến từ nồng độ DNA khuôn sử dụng al (2002). Screening of SLC25A13 trong mỗi nghiên cứu. mutations in early and late onset patients 4.3. Tối ưu hóa thời gian kéo dài chuỗi with citrin deficiency and in the Japanese trong PCR phân tích gen SLC25A13 population: Identification of two novel Thời gian để enzym Taq polymerase tiến mutations and establishment of multiple hành kéo dài chuỗi thường thay đổi đáng kể DNA diagnosis methods for nine mutations. tùy thuộc vào kích thước sản phẩm khuếch Hum Mutat, 19 (2), 122-130. đại. Trong nghiên cứu này, với cả 4 mức thời 5. Zheng Q Q, Zhang Z H, Zeng H S et al gian khảo sát đều thu được các đoạn gen đích (2016). Identification of a Large SLC25A13 đúng với kích thước và không có các sản Deletion via Sophisticated Molecular phẩm phụ (Hình 3) trừ đoạn gen số 7 (Hình Analyses Using Peripheral Blood 4). Để tiết kiệm thời gian mà vẫn đảm bảo Lymphocytes in an Infant with Neonatal hiệu quả khuếch đại các đoạn gen mong Intrahepatic Cholestasis Caused by Citrin muốn, lựa chọn 35 giây kéo dài chuỗi khi cài Deficiency (NICCD): A Clinical and đặt chương trình chạy PCR. Molecular Study. Biomed Res Int, 2016 4124263. V. KẾT LUẬN 6. Zhang Z H, Lin W X, Zheng Q Q et al Quy trình PCR phân tích gen SLC25A13 (2017). Molecular diagnosis of citrin gây bệnh thiếu citrin được tối ưu như sau: deficiency in an infant with intrahepatic Nhiệt độ gắn mồi: 59℃; Số chu kỳ nhiệt: 40 cholestasis: identification of a 21.7kb gross chu kỳ; Thời gian kéo dài chuỗi: 35 giây. deletion that completely silences the transcriptional and translational expression of TÀI LIỆU THAM KHẢO the affected SLC25A13 allele. Oncotarget, 8 1. Kobayashi K, Sinasac D S, Iijima M et al (50), 87182-87193. (1999). The gene mutated in adult-onset type 7. Zhang Z H, Zhao X J, Song Y Z et al II citrullinaemia encodes a putative (2012). Cloning and sequence analysis of mitochondrial carrier protein. Nat Genet, 22 SLC25A13 transcripts in human amniocytes. (2), 159-163. Transl Pediatr, 1 (2), 85-90. 31

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.