Tối ưu hóa quy trình tổng hợp carboxymethyl beta cyclodextrin

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH TỔNG HỢP<br /> CARBOXYMETHYL BETA-CYCLODEXTRIN<br /> Nguyễn Thị Minh Phương*, Nguyễn Thị Kiều Hảo*, Nguyễn Đức Tuấn*, Trần Quốc Thanh*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu-Mục tiêu: Beta-cyclodextrin (-CD) và các dẫn chất được sử dụng phổ biến trong c{c phương ph{p<br /> sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao quản (CE), .l|m t{c nh}n đối quang phân tách<br /> c{c dược chất l| đồng phân quang học. So với một số lượng lớn c{c dược chất quang hoạt rất đa dạng về cấu trúc<br /> và tính chất đang có mặt trên thị trường hiện nay thì số lượng các tác nhân quang hoạt được thương mại hóa còn<br /> ít, giá thành cao. Tiếp nối các công trình trước đ}y đã tổng hợp được các dẫn chất methyl, methoxycarbonyl và<br /> các dẫn chất n|y đã đƣợc ứng dụng l|m t{c nh}n đối quang tách thành công một số dƣợc chất quang<br /> hoạt bằng CE. Với mong muốn tiếp tục phát triển và góp phần l|m đa dạng hóa tác nh}n đối quang để phân tách<br /> c{c đồng phân quang học bằng CE, đề t|i: “TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH TỔNG HỢP CARBOXYMETHYL<br /> BETA CYCLODEXTRIN” đã được thực hiện với mục tiêu xây dựng quy trình tổng hợp tối ưu về hiệu suất ở<br /> quy mô phòng thí nghiệm và phù hợp với điều kiện trong nước dẫn chất carboxymethyl từ β-cyclodextrin.<br /> Đối tượng nghiên cứu: carboxymethyl- β-CD.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Thực hiện phản ứng của β-CD với tác nhân acid 2-cloroacetic để thu được các<br /> dẫn chất carboxymethyl- β-CD. Phân lập và tinh chế sản phẩm bằng phương ph{p thay đổi dung môi v| phương<br /> pháp kết tinh lại. Dẫn chất tổng hợp được x{c định độ tinh khiết qua việc x{c định điểm chảy v| góc quay cực<br /> riêng. Cấu trúc được x{c định qua dữ liệu thu được từ phổ IR, NMR, MS. C{c điều kiện của phản ứng được khảo<br /> s{t để quy hoạch và tối ưu hóa bằng phần mềm Modde 5.0 với mô hình Box-Behnken.<br /> Kết quả: Đã tổng hợp được carboxymethyl- β-CD với hiệu suất 78,01%, DS = 8.<br /> Kết luận: Thành công của đề tài tạo tiền đề cho hướng tiếp tục nghiên cứu ứng dụng sản phẩm làm tác nhân<br /> đối quang, ph}n t{ch đồng phân quang học các nguyên liệu và thành phẩm dược chất quang hoạt bằng phương<br /> ph{p điện di mao quản.<br /> Từ khóa: carboxymethyl- β-cyclodextrin, tổng hợp, dẫn chất β-cyclodextrin<br /> <br /> ABSTRACT<br /> OPTIMIZATION OF THE SYNTHESIS OF CARBOXYMETHYL-Β-CYCLODEXTRIN<br /> Nguyen Thi Minh Phuong, Nguyen Thi Kieu Hao, Nguyen Duc Tuan, Tran Quoc Thanh<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018:216 - 220<br /> Background-Objectives: Beta-cyclodextrin (β-CD) and its derivatives are commonly used as the chiral<br /> selectors for analysis of enantiomer drugs by HPLC and capillary electrophoresis (CE). Recently, the requirement<br /> for quality control of chiral drugs is increasingly while the number of commercial chiral selectors is limited and<br /> sold with high price. Some beta-cyclodextrin derivatives as methyl--CD and methoxycarbonyl--CD were<br /> successfully synthesized by our group. Which were successfully applied for separation of some enantiomer drugs<br /> by CE, too. With the desire to develop the selective chiral selectors, this study was carried out to optimize the<br /> synthesis of carboxymethy-β-cyclodextrin from β-cyclodextrin.<br /> *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Thị Minh Phƣơng ĐT: 0909810668<br /> <br /> 216<br /> <br /> Email: minhphuongvn80@yahoo.com<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Subjects and Methods: The subjects of this study was carboxymethyl derivatives of -cyclodextrin, which<br /> was synthesized from β-CD with 2-cloroacetic acid agents. Purity of the synthesized product was checked by<br /> melting point and specific rotation measurements, and its structures was elucidated by IR, MS, and NMR<br /> spectra. Influences of reaction temperature, reaction duration and reactant ratio on the substitution degree and the<br /> yield of MC-β-CD were discussed. The synthetic process was optimized by Modde 5.0 software using BoxBehnken model to achieve the highest yield.<br /> Results: Carboxymethyl-β-CD was synthesized with the yield of 78.01%, and DS (degree of substitution)<br /> values was 8.<br /> Conclusion: The successful synthesis of carboxymethyl-β-CD derivative was provides a theoretical and<br /> experimental basis for further scale-up research. In the future, we are going to developing the application of this<br /> selector for separation of enantiomer drugs by capillary electrophoresis.<br /> Keywords: carboxymethyl-β-betacyclodextrin, synthesis, β-betacyclodextrin derivative<br /> phát triển và góp phần l|m đ dạng hóa tác<br /> MỞ ĐẦU<br /> nh}n đối qu ng để ph}n t{ch c{c đồng phân<br /> Beta-cyclodextrin (-CD) và các dẫn chất của<br /> quang học bằng CE, đề t|i: “TỐI ƢU HÓA QUY<br /> chúng đƣợc sử dụng phổ biến trong c{c phƣơng<br /> TRÌNH TỔNG HỢP CARBOXYMETHYL<br /> pháp sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao<br /> BETA CYCLODEXTRIN” đã đƣợc thực hiện<br /> HPLC , điện di mao quản (CE), .làm tác nhân<br /> với mục tiêu xây dựng quy trình tổng hợp tối ƣu<br /> đối qu ng t{ch đồng phân quang học(2,5-8,10), đặc<br /> về hiệu suất ở quy mô phòng thí nghiệm và phù<br /> biệt đƣợc ứng dụng trong kiểm nghiệm các<br /> hợp với điều kiện trong nƣớc các dẫn chất<br /> thuốc chứa hoạt chất có tính quang hoạt. Để<br /> carboxymethyl từ β-cyclodextrin.<br /> ph}n t{ch c{c dƣợc chất quang hoạt cần tác nhân<br /> NGUYÊN LIỆU - PHƢƠNG PHÁP<br /> đối quang phù hợp với tính chất củ dƣợc chất,<br /> NGHIÊN CỨU<br /> đ i khi để ph}n t{ch đƣợc các dạng đồng phân<br /> của một chất còn cần phải phối hợp nhiều tác<br /> Nguyên liệu<br /> nhân quang hoạt với nhau. Các thuốc có hoạt<br /> Beta cyclodextrin và acid 2-cloroacetic<br /> chất là dạng đồng phân riêng lẻ xuất hiện ngày<br /> (Himedia).<br /> càng nhiều trên thị trƣờng dƣợc phẩm trong và<br /> Trang thiết bị<br /> ngo|i nƣớc do có hoạt tính mạnh và ít tác dụng<br /> M{y đo phổ IR Shimazdu (Nhật , m{y đo<br /> phụ hơn dạng racemic củ chúng nhƣ: Sphổ NMR ruker 500 MHz Đức), máy LC-MS<br /> amlodipin, levofloxacin, levocetirizin, Sruker 500 MHz Đức , m{y đo góc qu y cực<br /> omeprazol, . So với một số lƣợng lớn c{c dƣợc<br /> HORIBA-SEO+PA 300 (Nhật).<br /> chất quang hoạt rất đ dạng về cấu trúc và tính<br /> chất đ ng có mặt trên thị trƣờng hiện nay thì số<br /> lƣợng các tác nhân quang hoạt đƣợc thƣơng mại<br /> hóa còn ít, giá thành cao. Chính vì vậy, xu hƣớng<br /> của các nhà nghiên cứu ở c{c nƣớc hiện nay là<br /> tổng hợp nhiều t{c nh}n t{ch đồng phân chuyên<br /> biệt có tính chọn lọc cao và có giá trị kinh tế(1,4,9).<br /> Tiếp nối c{c c ng trình trƣớc đ}y đã tổng hợp<br /> đƣợc các dẫn chất methyl, methoxycarbonyl và<br /> các dẫn chất n|y đã đƣợc ứng dụng làm tác nhân<br /> đối quang tách thành công một số dƣợc chất<br /> quang hoạt bằng CE. Với mong muốn tiếp tục<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Phản ứng tổng hợp carboxymethyl--CD(1,3)<br /> OCH2COO <br /> <br /> OH<br /> <br /> O<br /> <br /> O<br /> <br /> O<br /> <br /> + Cl<br /> <br /> HO<br /> OH O<br /> <br /> NaOH, t<br /> OH<br /> <br /> O<br /> OOCH2CO<br /> <br /> O<br /> <br /> <br /> <br /> O<br /> 7<br /> <br /> -Cyclodextrin<br /> <br /> o<br /> <br /> OCH2COO <br /> <br /> 7<br /> <br /> Carboxymethyl--Cyclodextrin<br /> <br /> Sử dụng phƣơng ph{p th y đổi dung môi và<br /> phƣơng ph{p kết tinh lại để phân lập và tinh chế<br /> sản phẩm thu đƣợc từ phản ứng.<br /> <br /> 217<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Các dẫn chất tổng hợp đƣợc x{c định độ tinh<br /> khiết qua việc x{c định điểm chảy, góc quay cực<br /> riêng và sắc ký lớp mỏng (TLC). Cấu trúc đƣợc<br /> x{c định qua dữ liệu thu đƣợc từ phổ hồng<br /> ngoại (IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)<br /> và khối phổ (MS).<br /> Khảo sát sự ảnh hƣởng của các yếu tố đến<br /> hiệu suất phản ứng nhƣ: thời gian phản ứng,<br /> nhiệt độ phản ứng, tỉ lệ mol của MCA và β-CD,<br /> khảo sát khoảng giới hạn ảnh hƣởng và tiến<br /> hành tối ƣu hó bằng của phần mềm Modde 5.0<br /> với mô hình Box-Behnken.<br /> <br /> chảy của sản phẩm đo đƣợc là 256-266 oC, năng<br /> suất quay cực: [ ]D  110<br /> 20<br /> <br /> Sản phẩm thu đƣợc qua phản ứng đem đo<br /> IR, NMR v| MS để xác định cấu trúc<br /> <br /> Dữ liệu phổ IR của sản phẩm<br /> -1<br /> <br /> Số sóng (cm )<br /> 3317<br /> 2925<br /> 1593<br /> 1014<br /> <br /> Dữ liệu phổ 1H-NMR (D2O, 500MHz) của sản<br /> phẩm<br /> Độ dịch chuyển<br /> hóa học δ (ppm)<br /> 5,15-5,39<br /> 3,53-4,39<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Tổng hợp carboxymethyl--CD<br /> Cho vào bình cầu 1 g β-CD (0,88 mmol),<br /> thêm 3 g n tri hydroxyd đã đƣợc hòa tan trong 7<br /> ml nƣớc, đun hồi lƣu ở 80 oC trong 1 giờ 30 phút.<br /> Thêm 3 g acid monocloroacetic (MCA) (31,75<br /> mmol) (đã hò t n trong 3 ml nƣớc vào hỗn hợp<br /> phản ứng, tiếp tục đun ở 120 oC, tiến h|nh chấm<br /> sắc ký lớp mỏng theo dõi sự tạo th|nh củ sản<br /> phẩm theo thời gian.<br /> Điều chỉnh pH hỗn hợp sau phản ứng đến<br /> pH = 6. Thêm 150 ml methanol vào dung dịch<br /> sau phản ứng, lọc thu lấy tủa. Tủ đƣợc hòa lại<br /> trong 4 ml nƣớc cất, tủa lại trong 80 ml<br /> methanol. Rửa sản phẩm bằng methanol 3 lần,<br /> mỗi lần 5 ml. Sản phẩm đƣợc sấy chân không ở<br /> 60 oC. Từ lƣợng sản phẩm thu đƣợc tính hiệu<br /> suất là 46,2%.<br /> <br /> Tính chất sản phẩm<br /> Chất bột trắng, rất dễ hút ẩm, tan trong<br /> nƣớc, không tan trong methanol, ethanol, aceton,<br /> ether. Thực hiện sắc ký lớp mỏng của vết<br /> nguyên liệu và sản phẩm với hệ dung môi làm<br /> ph động là IPA-EtOAc-nƣớc (5 : 4 : 1) và<br /> butanol- ethanol - nƣớc (3 : 2 : 3,5), kết quả cho<br /> thấy sản phẩm sau tinh chế chỉ cho một vết trên<br /> bản sắc ký, không có vết nào trùng với vết<br /> nguyên liệu, chứng tỏ phản ứng đã tạo thành<br /> chất mới, tuy nhiên vết sản phẩm kéo vệt dài<br /> nên có thể cho rằng sản phẩm tạo thành gồm các<br /> dẫn chất có độ thế khác nhau. Nhiệt độ nóng<br /> <br /> 218<br /> <br /> Cường độ, hình dạng Nhóm chức<br /> Mạnh, tù<br /> O-H (alcol)<br /> Trung bình, nhọn<br /> C-H (alkan)<br /> Mạnh, nhọn<br /> C=O (acid)<br /> Mạnh, nhọn<br /> C-O-C (ether)<br /> <br /> Số proton Số đỉnh Vị trí proton<br /> 7H<br /> 58H<br /> <br /> m<br /> m<br /> <br /> H1<br /> H2-H6, Hb<br /> <br /> Dữ liệu phổ MS của sản phẩm<br /> ST<br /> T<br /> <br /> m/z<br /> <br /> z Mảnh<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> <br /> 764,1940<br /> 735,1880<br /> 706,1862<br /> 677,1830<br /> <br /> 2 [MNa2]<br /> +<br /> 2 [MNa2]<br /> +<br /> 2 [MNa2]<br /> +<br /> 2 [MNa2]<br /> <br /> +<br /> <br /> Khối<br /> lượng<br /> phân tử<br /> 1482.388<br /> 1424.376<br /> 1366.372<br /> 1308.366<br /> <br /> Công thức phân tử<br /> tương ứng<br /> (C6H10O5)7(CH2COOH)6<br /> (C6H10O5)7(CH2COOH)5<br /> (C6H10O5)7(CH2COOH)4<br /> (C6H10O5)7(CH2COOH)3<br /> <br /> Tối ƣu hóa quy trình tổng hợp để đạt hiệu suất<br /> cao nhất<br /> <br /> Ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hiệu suất<br /> phản ứng<br /> Hiệu suất phản ứng tăng dần từ 3 giờ đến<br /> 6 giờ, dich phản ứng lúc này chuyển từ màu<br /> nâu sang vàng. Khi tiếp tục phản ứng từ 6 giờ<br /> đến 8 giờ thì hiệu suất phản ứng hầu nhƣ<br /> kh ng th y đổi.<br /> <br /> Hình 1: Ảnh hưởng của thời gian lên hiệu suất phản<br /> ứng<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản<br /> ứng<br /> Tiến hành khảo sát ở nhiệt độ 50 - 90 C, khi<br /> tăng nhiệt độ từ 50 C đến 60 C, hiệu suất tăng,<br /> khi nhiệt độ tăng từ 60 C đến 90 C, hiệu suất<br /> phản ứng giảm mạnh.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> hợp là thời gian 7 giờ, nhiệt độ 59 C và tỷ lệ<br /> (mol/mol) giữa MCA và β-CD là 26,7 với hiệu<br /> suất dự đo{n l| 79,50 % Tiến hành thực<br /> nghiệm phản ứng tổng hợp carboxymethyl-βCD ở điều kiện trên ba lần thu đƣợc sản phẩm<br /> với hiệu suất trung bình là 78,01 %.<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> <br /> Hình 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu suất phản<br /> ứng<br /> <br /> Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa MCA và β-CD đến<br /> hiệu suất phản ứng<br /> Khi tỷ lệ (mol/mol) giữa MCA và β-CD tăng<br /> từ 15 đến 25, hiệu suất tăng, khi tỷ lệ này tăng từ<br /> 25 đến 35, hiệu suất phản ứng giảm.<br /> <br /> β-CD là một dạng polymer có nhiều trung<br /> tâm bất đối trong phân tử, nên rất khó khống<br /> chế điều kiện phản ứng để tạo thành một sản<br /> phẩm thế duy nhất sau phản ứng. Sản phẩm thu<br /> đƣợc thƣờng là liên hợp các dẫn chất có độ thế<br /> khác nhau. Thực tế, phần lớn các sản phẩm dẫn<br /> chất β-CD thƣơng mại không công bố độ tinh<br /> khiết mà chỉ công bố độ thế trung bình, phân tử<br /> lƣợng trung bình.<br /> Theo dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm<br /> thu đƣợc, proton trong nhóm thế<br /> c rboxymethyl đƣợc ký hiệu là Hb. Proton<br /> trong nhóm R-O-CH3 có độ dịch chuyển 3.2–<br /> 3.8 ppm, nên Hb trong nhóm carboxymethyl<br /> khi gắn với oxy RO−CH2−COOH sẽ có độ<br /> dịch chuyển về phí trƣờng thấp khoảng 4<br /> ppm, nên sẽ chồng lên các tín hiệu H2-H6<br /> trong phổ.<br /> Tính DS của sản phẩm theo dữ liệu Phổ<br /> H-NMR: số proton Hb của phân tử<br /> carboxymethyl-β-CD là 58 – 42 = 16. Vì mỗi<br /> nhóm thế −CH2COOH có 2 proton, nên số<br /> nhóm thế −CH2COOH có trong phân tử<br /> carboxymethyl-β-CD (hay DS) là 16/2 = 8.<br /> 1<br /> <br /> Hình 3: Ảnh hưởng của tỷ lệ (mol/mol) giữa MCA<br /> và β-CD lên hiệu suất phản ứng<br /> <br /> Tối ưu hóa điều kiện phản ứng<br /> Dùng phần mềm Modde 5.0 với mô hình<br /> Box-Behnken bố trí thí nghiệm với 3 thông số:<br /> thời gian phản ứng (4-8 giờ), nhiệt độ phản<br /> ứng (50-70 C) và tỷ lệ (mol/mol) giữa MCA và<br /> β-CD (20-30), ma trận quy hoạch thực nghiệm<br /> gồm 15 thí nghiệm. Tiến hành các thí nghiệm<br /> và xử lý kết quả bằng phần mềm Modde 5.0<br /> tìm đƣợc điều kiện tối ƣu cho phản ứng tổng<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Theo dữ liệu phổ MS của sản phẩm thu<br /> đƣợc, công thức của carboxymethyl-β-CD có<br /> thể viết thành: (C6H10O5)7(CH2COOH)n . Trong<br /> đó, n l| số nhóm carboxymethyl trên phân tử<br /> carboxymethyl-β-CD. Dễ dàng suy ra khối<br /> lƣợng của phân tử carboxymethyl-β-CD với<br /> nhóm thế khác nhau: Mn = Mβ-CD +<br /> n*MCH2COOH = 1134 + n*58 (Mn là phân tử<br /> lƣợng của sản phẩm có n nhóm thế).<br /> Nhƣ vậy từ các dữ liệu thu đƣợc từ IR,<br /> MNR v| MS có đủ cơ sở để kết luận sản phẩm<br /> thu đƣợc là dẫn chất carboxymethyl-β-CD.<br /> <br /> 219<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Đề t|i đã x}y dựng đƣợc quy trình tối ƣu để<br /> tổng hợp carboxymethyl-β-CD với điều kiện<br /> phản ứng: thời gian 7 giờ, nhiệt độ 59 C và tỷ lệ<br /> (mol/mol) giữa MCA và β-CD l| 26,7; thu đƣợc<br /> sản phẩm có DS = 8 và hiệu suất 78,01%.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1.<br /> 2.<br /> 3.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> Brandt L (1987). Ethers of beta-cyclodextrin and a process for<br /> their preparation. US Patent, US 463805.<br /> Gyula O, Tibor C, Mária S (2014). Cyclodetrins in<br /> chromatography. Eur. Chem. Bull., 3 (1): 2-12.<br /> Jacques R, Trinadha R, Joseph P (1994). Distribution of<br /> substituents in carboxymethyl ethers of cyclomaltoheptanose.<br /> Carbohydrat Research, 258: 281-285.<br /> Jindrich JP, Bengt L, Pia S, Kazuaki H (1995). Regioselectivity of<br /> alkylation of cyclomaltoheptaose (β-cyclodextrin) and synthesis<br /> of its mono-2-O- methyl,-ethyl,-allyl, and-propyl derivatives.<br /> Carbohydrate Research, 266: 75-80.<br /> József S (2004). Past, present, and future of cyclodextrin research.<br /> Pure and Applied Chemistry, 76: 1829-1830.<br /> <br /> 220<br /> <br /> 6.<br /> <br /> 7.<br /> 8.<br /> <br /> 9.<br /> 10.<br /> <br /> Julianna S, Katalin G (1994). Use of cyclodextrins and<br /> cyclodextrin derivatives in high- performance liquid<br /> chromatography and capillary electrophoresis. Journal of<br /> Chromatography A, 668: 509-517.<br /> Manoj MN, Dinesh MS, Parag VJ (2012). The Cyclodextrins: A<br /> Review. Journal of Current Pharmaceutical Research: 1-6.<br /> Salvatore F. (1996). Identification of chiral drug isomers by<br /> capillary Electrophoresis. Journal of chromatography A., 735: 77121<br /> Takeo K (1976). Synthesis of Heptakis (2-O-methyl-βcyclodextrin. Die Starke, 28 (7): 226-227.<br /> Verleysen K, Sabah S, Scriba G, Sandra P (1999).<br /> Enantioseparation of Aspartyl Dipeptides by CE: Comparison<br /> between 18-Crown-6-Tetracarboxylic Acid and Carboxymethyl13-Cyclodextrin as Chiral Selector. Chromatographia, 49: 215-218.<br /> <br /> Ngày nhận bài báo:<br /> <br /> 18/10/2017<br /> <br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo:<br /> <br /> 01/11/2017<br /> <br /> Ng|y b|i b{o được đăng:<br /> <br /> 15/03/2018<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br />