Tóm tắt Luận án tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu phân lập, tinh chế, thiết lập chất chuẩn để định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cleistanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)

Chia sẻ: Trần Văn Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

24
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án “Nghiên cứu phân lập, tinh chế, thiết lập chất chuẩn để định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cleistanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)” là công trình đầu tiên thiết lập hai chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D từ quả cây Chà chôi.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu phân lập, tinh chế, thiết lập chất chuẩn để định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cleistanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN LÂM HỒNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TINH CHẾ, THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ĐỂ ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ LIGNAN TRONG QUẢ CỦA CHI CLEISANTHUS, HỌ THẦU DẦU (EUPHORBIACEAE) TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG VIỆN HÓA SINH BIỂN - VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trần Việt Hùng PGS. TS. Đoàn Thị Mai Hương Phản biện 1: ........................................................................ Phản biện 2: ........................................................................ Phản biện 3: ........................................................................ Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại.................................................................................................... ............................................................................................................... Vào hồi........giờ.......phút.......ngày........tháng.....năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Trong khuôn khổ của dự án “Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học từ thảm thực vật Việt Nam”, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam phối hợp với Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên– Cộng hòa Pháp đã thu hái, định danh khoa học và thử sàng lọc hoạt tính sinh học của dịch chiết ethyl acetat của 2,500 loài thực vật của nước ta, trong đó nổi bật là dịch chiết từ quả cây Cách hoa Đông Dương (C. indochinensis Merr. ex Croiz), Chà chôi (C. tonkinensis Jabl.) và Cách hoa eberhardt (C. eberhardtii Gagn) có phần trăm ức chế mạnh dòng tế bào ung thư biểu mô KB từ 88,40 đến 95,17%. Từ quả của 3 loài trên đã phân lập và xác định cấu trúc được nhiều hợp chất tinh khiết như: cleistantoxin, cleisindoside D…Một điều rất thú vị là, các hợp chất cleistantoxin, cleisindoside D có cấu trúc hoá học gần giống etoposid và teniposid là 2 dẫn chất glycosid của podophyllotoxin đang được sử dụng làm thuốc điều trị ung thư phổi, tinh hoàn, buồng trứng… Nghiên cứu liên quan cấu trúc cleistantoxin, cleisindoside D với tác dụng dược lí, cơ chế gây độc tế bào cho thấy các chất này có khả năng ức chế enzym topoisomerase IIB và enzym caspase và được dự đoán có hoạt tính kháng tế bào ung thư phù hợp với kết quả thử trên in vitro và in vivo, cleistantoxin có hoạt tính kháng ung thư mạnh nhất. Từ các kết quả đó, Đề tài độc lập cấp Nhà nước, mã số ĐTĐLCN.14/16 của Bộ Khoa học và Công nghệ đã tiến hành thử hoạt tính kháng ung thư của cao khô chiết xuất từ quả cây Chà chôi trên chuột Nude cấy tế bào ung thư phổi người với liều 100mg/kg cân nặng, cho thấy 100% chuột còn sống và kéo dài được thời gian sống sau 6 tuần điều trị so với nhóm chứng không được dùng cao. Vì vậy, cao khô đang được tiếp tục nghiên cứu, phát triển thành nguyên liệu thuốc. Để xây dựng tiêu chuẩn cho cao khô này, rất cần có chất chuẩn cleistantoxin và cleisindoside D. Tuy nhiên, 2 chất này đang được nghiên cứu, phát triển thuốc mới nên trên thế giới chưa có chất chuẩn đối chiếu. Vì vậy, cleistantoxin và cleisindoside D phải được thiết lập thành chất chuẩn gốc. Đây là lĩnh vực nghiên cứu mới, hầu như ở Việt Nam còn chưa có công trình nào công bố về thiết lập chuẩn gốc, chủ yếu là thiết lập chuẩn thứ cấp. Xuất phát từ nhu cầu thực tế, luận án “Nghiên cứu phân lập, tinh chế, thiết lập chất chuẩn để định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cleistanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)” là công trình đầu tiên thiết lập hai chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D từ quả cây Chà chôi (có hàm lượng 2 chất này cao nhất) với các mục tiêu sau: - Mục tiêu 1: Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc của cleistantoxin và cleisindoside D từ quả cây Chà chôi làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn và xác định cấu trúc các chất tinh khiết mới phân lập được. 1
- Mục tiêu 2: Thiết lập được hai chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D - Mục tiêu 3: Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính và định lượng một số lignan trong quả cây chi Cách hoa (Cleistanthus). 2. Những đóng góp mới của luận án - Về mặt hoá học Lần đầu tiên đã phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc 8 chất mới từ quả cây Chà chôi là: 7′,8′-dehydrocleistantoxin (CT1), cleistonkiside A (CT2), cleistonkinin A (CT3), cleistonkinin B (CT4), cleistonkiside B (CT5), cleistonkinen (CT6), cleistonkinin E (CT7), cleistonkinin C (CT8). - Về mặt thiết lập chất chuẩn Lần đầu tiên công bố: Tiêu chuẩn chất lượng của nguyên liệu thiết lập chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D theo hướng dẫn của tổ chức y tế thế giới (WHO) và thiết lập chất chuẩn theo hướng dẫn của ISO GUIDE 35 Đóng được 96 ống chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin có giá trị trên COA là 99,3%, độ không đảm bảo đo là 0,1%, nghiên cứu độ ổn định được 18 tháng và 76 ống chất chuẩn gốc định lượng cleisindoside D có giá trị trên COA là 94,2%, độ không đảm bảo đo là 0,4%, nghiên cứu độ ổn định được 12 tháng. Tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc định tính 7’,8’-dehydrocleistantoxin (CT1) và cleisindoside A. Trong đó, có chất 7′,8′- dehydrocleistantoxin là chất mới phân lập được từ quả Chà chôi và phần xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất 7′,8′-dehydrocleistantoxin là công bố hoàn toàn mới của luận án. Đóng ống chuẩn phân giải gồm 4 chất chuẩn: cleisindoside A, cleisindoside D, cleistntoxin và 7’,8’-dehydrocleistantoxin để đánh giá độ phù hợp hệ thống sắc kí. - Về mặt kiểm nghiệm dược liệu và thuốc dược liệu Lần đầu tiên ứng dụng 2 chất chuẩn gốc định lượng và 2 chất chuẩn gốc định tính để xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời cleisindoside D và cleistantoxin và định tính được 4 lignan: cleisindoside A, cleisindoside D, cleistntoxin và 7’,8’-dehydrocleistantoxin trong quả của chi Cách hoa và chưa có công trình nào công bố về kết quả này. 3. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 148 trang, 76 hình và 45 bảng. Bố cục gồm các phần: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan (29 trang); đối tượng nội dung và phương pháp nghiên cứu (14 trang); Kết quả nghiên cứu (80 trang); Bàn luận (22 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình đã công bố liên quan điến luận án (1 trang); Luận án có 96 tài liệu tham khảo và 240 trang phụ lục. 2
NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Đã tổng quan được các nội dung chính liên quan đến luận án gồm có: - Tổng quan về chi Cách hoa (Cleistanthus), tình hình nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính kháng ung thư của chi Cleistanthus trên thế giới và tại Việt Nam. - Tổng quan về nhóm chất lignan: khái niệm, phân loại, một số aryltetralin lignan đang được phát triển thành thuốc điều trị ung thư, một số hoạt chất chính nhóm aryltetralin lignan được phân lập được từ quả cây thuộc chi Cleistanthus và một số phương pháp phân tích hoạt chất nhóm aryltetralin lignan trong thực vật. - Tổng quan về chất chuẩn: khái niệm và phân loại chất chuẩn gồm: chất chuẩn gốc (PCRS) và chất chuẩn thứ cấp (SCRS), tổng quan một số hướng dẫn về thiết lập chất chuẩn. Theo ISO 17034 và ISO GUIDE 35 quy trình thiết lập chất chuẩn gồm các bước: xác định nhu cầu thiết lập chất chuẩn, thu thập nguồn nguyên liệu, chuẩn bị nguyên liệu thiết lập chuẩn, đóng ống chuẩn, đánh giá độ đồng nhất, xác định các đặc tính, xác định giá trị ấn định trên COA, dán nhãn, bảo quản và nghiên cứu độ ổn định. - Tổng quan về xác định các đặc tính của chất chuẩn gốc: Theo hướng dẫn của IP, USP, WHO các chỉ tiêu xác định đặc tính (characterization) của chất chuẩn gốc gồm bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc: cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, bộ phổ IR, NMR, MS, UV…và xác định độ tinh khiết chất chuẩn gốc bằng phương pháp cân bằng khối lượng: xác định tạp chất liên quan và tạp chất phân huỷ bằng các kỹ thuật: HPLC/DAD, xác định tạp chất vô cơ bằng phương pháp cắn sau nung (residue on ignition-ROI) hay tro sulfat, xác định hàm lượng tạp chất bay hơi bằng mất khối lượng do làm khô hoặc phân tích nhiệt lượng TGA; xác định độ tinh khiết trực tiếp bằng kỹ thuật: DSC…. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU  Đối tượng để phân lập, tinh chế cleistantoxin và cleisindoside D làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Hình 2.1. Sơ đồ qui trình chiết xuất cao cồn khô từ quả cây Chà chôi 3
168 g cao cồn khô được chiết xuất theo sơ đồ (Hình 2.1) từ quả Chà chôi hay Cọc rào (Cleistanthus tonkinensis, Jabl;) được thu hái ngày 06/06/2016, tại Đại từ-La Bằng-Thái Nguyên, kí hiệu VN 0308 (LB-TN) để phân lập, tinh chế các chất tinh khiết làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn.  Đối tượng để phân tích định tính, định lượng một số lignan trong quả cây chi Cách hoa (Cleistanthus) Quả Chà chôi hay Cọc rào (Cleistanthus tonkinensis, Jabl.) thu hái ngày 16/06/2018, tại Đại từ-La Bằng-Thái Nguyên, kí hiệu ĐL 2338 (LB-TN). Quả Cách hoa eberhardt (Cleistanthus eberhardtii, Gagn), thu hái ngày 08/06/2018 tại Phú lộc-Thừa Thiên Huế, kí hiệu ĐL 2151 (PL-TTH) Xác định đúng tên loài và lưu giữ mẫu tại Viện Tài nguyên và sinh thái- Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam 2.2. HOÁ CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ - Chất tinh khiết cleistantoxin và cleisindoside D được phân lập từ quả Cách hoa Đông dương. Hai chất này đã được đo phổ xác định cấu trúc cleistantoxin và cleisindoside D (Phòng tổng hợp hữu cơ-Viện Hoá sinh biển- Viện HL KH&CN VN). 2.2.1. Hoá chất - Hoá chất, dung môi để chiết xuất, phân lập, tinh chế đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích. Hoá chất, dung môi chạy HPLC và đo phổ NMR (Merck) 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Thiết bị nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và phân tích của Viện Hoá học và Viện Hoá sinh biển-Viện HL KH & CN VN, Bộ môn Hoá Phân tích - Độc chất, ĐH Dược HN, Viện KNT TƯ, Viện KNT TPHCM. 2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm: - Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc chất cleistantoxin, cleisindoside D từ quả Chà chôi làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn. - Xây dựng bộ dữ liệu phổ nhận dạng các các chất cleistantoxin, cleisindoside D nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ UV, IR, MS, NMR. - Xây dựng phương pháp xác định tạp chất hữu cơ, vô cơ và tạp chất bay hơi của các chất cleistantoxin, cleisindoside D. - Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin, cleisindoside D. - Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin, cleisindoside D - Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cách hoa - Áp dụng phương pháp đã xây dựng bước đầu định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cách hoa. 2.3.1. Phương pháp phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc của chất tinh khiết - Phân lập các chất bằng sắc ký cột cổ điển nhồi silica gel, sephadex LH-20, SK lớp mỏng bán điều chế silica gel 60 GF254 và silica gel 60 RP-18 GF254 (Merck). 4
- Tinh chế các chất tinh khiết bằng: kết tinh và cột cổ điển nhồi hạt Silica gel pha đảo YMC-GEL ODS-A có cỡ hạt 75 μm (YMC). - Xác định độ tinh khiết của các nguyên liệu thiết lập chất chuẩn bằng HPLC/DAD sử dụng phương pháp chuẩn hoá diện tích. - Khẳng định cấu trúc một số chất tinh khiết nhóm lignan làm NLTLCC: bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và 2 chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ lưỡng sắc tròn (CD), góc quay cực riêng ([α]D20). 2.3.2. Thiết lập chất chuẩn gốc Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng - Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng các chất tinh khiết làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn: Phổ 1H NMR, 13C NMR, HR-MS, IR, UV-VIS, nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng ([α]D20)… - Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí và hàm lượng tạp chất liên quan bằng HPLC/DAD, phương pháp xác định hàm lượng tạp chất vô cơ bằng phép thử tro sulfat và tạp chất bay hơi bằng TGA - Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn gốc định lượng Bảng 2.1. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn gốc định lượng Mức chất Phương STT Yêu cầu lượng đề nghị pháp thử 1. Tính chất Dạng thù hình, màu sắc, mùi vị, độ tan DĐVN V Nhiệt độ nóng Nhiệt độ nóng chảy phải phù hợp với điểm chảy 2. DSC chảy trong TL công bố Góc quay cực Giá trị GQC phải phù hợp với GQC trong TL phụ lục 6.4 3. riêng công bố DĐVN V 4. Bộ dữ liệu phổ chuẩn Dữ liệu phổ HR-MS phải có số khối đặc trưng Phổ HR-MS HR-MS và phù hợp với TL đã công bố Dữ liệu phổ NMR phải phù hợp với phổ của chất Phổ NMR NMR tinh khiết trong TL đã công bố Phải có dao động đặc trưng theo cấu trúc hoá học Phổ IR IR của chất tinh khiết trong TL đã công bố Dữ liệu phổ UV-VIS phải có các max trùng với Phổ UV-VIS UV-VIS phổ của chất tinh khiết trong TL đã công bố Độ tinh khiết HPLC/DAD 5. Không được nhỏ hơn 95% sắc kí tính bằng Tạp chất liên chuẩn hoá 6 Không được lớn hơn 5% quan diện tích Tạp chất bay Không được thấp hơn giới hạn cho phép (tuỳ 7. TGA hơi thuộc vào từng nguyên liệu thiết lập chuẩn) 8. Tạp chất vô cơ Không được lớn hơn 0,1% Tro sulfat Độ tinh khiết Không được thấp hơn giới hạn cho phép (tuỳ 9. DSC DSC thuộc vào từng nguyên liệu thiết lập chuẩn) 5
- Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng • Đóng ống chất chuẩn, dán nhãn và bảo quản ống chuẩn, nghiên cứu độ ổn định của chất chuẩn theo hướng dẫn ISO GUIDE 35 • Đánh giá độ đồng nhất trong quá trình đóng ống • Xác định giá trị ấn định trên COA từ 3 PTN: Xác định độ tinh khiết sắc kí bằng HPLC/DAD và hàm lượng tạp chất bay hơi bằng TGA tại 3 PTN đạt tiêu chuẩn GLP hoặc ISO 17025. Mỗi PTN nhận 6 ống chất chuẩn lấy ngẫu nhiên cùng tiêu chuẩn cơ sở để tiến hành phân tích. Tập hợp các kết quả của ba PTN tham gia (n = 18), đánh giá kết quả bằng test ANOVA một yếu tố, so sánh 2 giá trị Ftn và Flt. Khi Ftn > Flt kết quả trung bình của 3 phòng thí nghiệm khác nhau có ý nghĩa, giá trị độ tinh khiết sắc kí và hàm lượng tạp chất bay hơi được lấy từ kết quả trung bình của 3 PTN. • Xác định giá trị ấn định công bố trên phiếu kiểm nghiệm COA bằng phương pháp cân bằng khối lượng (mass-balance): Độ tinh khiết = Độ tinh khiết sắc kí × (100- % tạp bay hơi - % tạp vô cơ)/100 • Xác định độ không đảm bảo đo: Độ không đảm bảo đo của hàm lượng tạp chất liên quan bằng HPLC/DAD và tạp chất bay hơi bằng TGA. Mỗi chất chuẩn được gửi đến 3 PKN, mỗi phòng 6 ống, tiến hành phân tích 6 mẫu cho từng chỉ tiêu độ tinh khiết sắc kí và hàm lượng tạp chất bay hơi. txS Độ không đảm đo chuẩn của mỗi PKN : us = √N Trong đó: N : Số lần lặp lại thí nghiệm t : Giá trị tra bảng test Student S : Độ lệch chuẩn Độ không đảm bảo đo kết hợp của 3 PKN (U combined-Uc) Uc = √u2s1 + u2s2 + u2s3 Độ không đảm bảo đo lan truyền của kết quả tro sulfat theo công thức: UKhối lượng Tro sulfat = Uchế phẩm = √u2s1 + u2s2 2 UTro sulfat 2 Uchế phẩm = HLTro sulfat x √( UHàm lượng tro sulfat ) + ( ) mTro sulfat mchế phẩm Tiến hành phép thử tro sulfat 2 lần lấy giá trị trung bình, nên: Uc kết hợp của tro sulfat = √u2thử 1 + u2thử 2 6
Độ không đảm bảo đo mở rộng được tính cho tổng cả kết quả của 3 phép thử tạp chất liên quan, tạp chất bay hơi và tro sulfat theo công thức: 𝐔𝐦𝐫 = √𝐮𝟐𝐜𝟏 + 𝐮𝟐𝐜𝟐 + 𝐮𝟐𝐜â𝐧 Giá trị công bố trên chứng chỉ phân tích: X  2 . Umr Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn định tính Bảng 2.2. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn định tính Mức chất Phương STT Yêu cầu lượng đề nghị pháp thử 1. Tính chất Dạng thù hình, màu sắc, mùi vị, độ tan DĐVN V Nhiệt độ nóng Nhiệt độ nóng chảy phải phù hợp với điểm chảy 2. DSC chảy trong TL công bố Góc quay cực Giá trị GQC phải phù hợp với GQC trong TL phụ lục 6.4 3. riêng công bố DĐVN V 4. Bộ dữ liệu phổ chuẩn Dữ liệu phổ HR-MS phải có số khối đặc trưng Phổ HR-MS HR-MS và phù hợp với TL đã công bố Dữ liệu phổ NMR phải phù hợp với phổ của chất Phổ NMR NMR tinh khiết trong TL đã công bố Phải có dao động đặc trưng theo cấu trúc hoá học Phổ IR IR của chất tinh khiết trong TL đã công bố Dữ liệu phổ UV-VIS phải có các max đặc trưng Phổ UV-VIS và phù hợp với phổ của chất tinh khiết trong TL UV-VIS đã công bố Độ tinh khiết HPLC/DAD 5. Không được nhỏ hơn 90% sắc kí tính bằng Tạp chất liên chuẩn hoá 6 Không được lớn hơn 10% quan diện tích 2.3.3. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng đồng thời một số lignan trong quả của chi Cách hoa. Xác định độ ẩm của bột quả của chi Cleistanthus Xác định độ ẩm của dược liệu bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô (Phụ lục 9.6, DĐVN V). Xây dựng phương pháp định tính đồng thời một số lignan trong quả của chi Cách hoa bằng HPLC/DAD - Khảo sát chương trình sắc kí: pha tĩnh, pha động, chương trình gradient, bước sóng phát hiện Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời cleistantoxin và cleisindoside D trong quả Chà chôi bằng HPLC/DAD - Xây dựng qui trình chiết xuất đồng thời cleistantoxin và cleisindoside D trong quả cây Chà chôi: khảo sát dung môi, kĩ thuật chiết, thời gian chiết… - Tính hàm lượng hoạt chất ST x Cc x DT x 100% HL% = SC x M x (100 − X) x 100 x 1000 7
Thẩm định phương pháp phân tích bằng HPLC/DAD. Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH: độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng và giới hạn định lượng (LOQ). Áp dụng Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời một số lignan trong quả cây chi Cách hoa bằng HPLC/DAD Quả cây Chà chôi và cây Cách hoa eberhardt. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. PHÂN LẬP, TINH CHẾ VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CLEISTANTOXIN VÀ CLEISINDOSIDE D Qua khảo sát hàm lượng một số hoạt chất trong cao khô có hoạt tính kháng ung thư trên chuột Nude và trong quả của chi Cách hoa (Cleistanthus), tìm thấy 2 hoạt chất chính là cleistantoxin, cleisindoside D (glycosid của cleistantoxin) có hoạt tính sinh học, hàm lượng cao nhất và là những chất đặc trưng của chi này. Vì vậy, lựa chọn hai chất tinh khiết này để thiết lập chất chuẩn định lượng. Bên cạnh đó, tìm thấy trong quả Chà chôi có hàm lượng cleistantoxin, cleisindoside D cao nhất, nên sử dụng nguồn thực vật này để phân lập, tinh chế cleistantoxin, cleisindoside D làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn. 3.1.1. Phân lập thô cleistantoxin và cleisindoside D trên cột silica gel Để phân lập được 2 chất cleistantoxin và cleisindoside D làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn sử dụng cột thuỷ tinh trung tính (80x10 cm) nhồi silica gel 60 (40-63 m). Dùng hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2 sau đó thêm MeOH với tỉ lệ tăng dần từ 2, 5, 10...100%. Kiểm tra các bình giống nhau bằng SKLM, gom các bình giống nhau vào thành một phân đoạn, thu được 23 phân đoạn (Phụ lục 1.2). Các phân đoạn được chấm lên bản mỏng cùng với chất tinh khiết cleistantoxin và cleisindoside D để tìm các phân đoạn có chứa cleistantoxin và cleisindoside D (Hình 3.1 và 3.2). Trên SKĐ nhận thấy phân đoạn PĐ 7, 8, 9, 10 xuất hiện 1 vết có màu khi soi đèn UV 254 nm và hiện màu thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc, tương ứng với vết của chất cleistantoxin tinh khiết (Hình 3.1), gom các PĐ7, 8, 9, 10 có chứa chất cleistantoxin, đem cô chân không được 10,6916 g cắn A (a): Phát hiện tại 254 nm (c): Hiện màu TT valinin/H2SO4 đặc Hình 3.1. SKĐ phát hiện cleistantoxin trong các phân đoạn từ PĐ1-14 8
Trên SKĐ nhận thấy PĐ 16, 17, 18 xuất hiện 1 vết có màu khi soi đèn UV 254 nm và hiện màu thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc tương ứng với vết của chất cleisindoside D tinh khiết (Hình 3.2). Vì vậy, các PĐ16, 17, 18, được gom lại đem cô quay chân không thu được 52,9519 g cắn D. (a): Phát hiện tại 254 nm (c): Hiện màu TT valinin/H2SO4 đặc Hình 3.2. SKĐ phát hiện cleisindoside D trong các phân đoạn từ PĐ12-23 3.1.2. Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc cleistantoxin 10,6916 g cắn A thu được có chứa cleistantoxin được tiếp tục phân lập, tinh chế theo sơ đồ sau: Hình 3.1. Sơ đồ phân lập, tinh chế cleistantoxin thành NL thiết lập chuẩn Chất tinh chế được tiến hành đo phổ HR-MS, CD, 1D và 2D-NMR trùng khớp với dữ liệu phổ của chất cleistantoxin phân lập từ loài C. indochinensis, cho phép xác định chất tinh chế được chính là hợp chất (7R,8R,7′R,8′R)-7-hydroxy-6-methoxy- 3′,4′:4,5-bis(methylenedioxy)-2,7′-cyclolignan-9′,9-olide có tên là cleistantoxin. 3.1.3. Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc cleisindoside D 52,9519 g cắn D thu được có chứa cleisindoside D được tiếp tục phân lập, tinh chế theo sơ đồ sau: 9
Hình 3.2.Sơ đồ phân lập, tinh chế cleisindoside D thành NLTLCC Đo phổ HRESI-MS, CD, 1D và 2D-NMR chất tinh chế được trùng khớp với dữ liệu phổ của chất là 6-methoxy-7-(β-D-glucopyranosyloxy)-3',4':4,5- bis(methylenedioxy)-2,7'-cyclolignan-9',9-olide chính là cleisindoside D. Trong quá trình phân lập cleistantoxin và cleisindoside D làm chất chuẩn gốc định lượng, đã phân lập thêm được 0,5235 g CT1 (chất mới), 0,5481 g cleisindoside A, lượng chỉ đủ làm chất chuẩn định tính. Vì vậy, cần khẳng định cấu trúc của cleisindoside A và xác định cấu trúc chất CT1 làm chuẩn định tính. 3.1.4. Khẳng định cấu trúc của cleisindoside A làm chất chuẩn định tính Khi tinh chế cleisindoside D trên cột C18, tách riêng được vài lọ kết tinh dưới dạng chất rắn màu trắng, tiến hành đo phổ HR-MS, 1D, 2D-NMR và so với tài liệu tham khảo, chất phân lập được xác định là hợp chất cleisindoside A, do lượng chất phân lập được ít nên sử dụng làm chất chuẩn định tính. 3.1.5. Phân lập và xác định cấu trúc các chất mới từ quả Chà chôi Trong quá trình phân lập, tinh chế cleistantoxin, cleisindoside D, luận án đã phân lập, tinh chế được 8 chất. Tiến hành đo phổ NMR, HR-MS, IR, UV-VIS, CD, nhiệt nóng chảy (Mp), góc quay cực riêng ([α]D20)… đã xác định cấu trúc 8 chất lần đầu tiên phân lập từ tự nhiên và đặt tên là: 7’,8’-dehydrocleistantoxin (CT1), cleistonkiside A (CT2), cleistonkinin A (CT3), cleistonkinin B (CT4), cleistonkiside B (CT5), cleistonkinen (CT6), cleistonkinin E (CT7), cleistonkinin C (CT8). Đây là đóng góp lớn của luận án trong nghiên cứu các 10
hợp chất từ tự nhiên, là công trình lần đầu tiên đã công bố phân lập được 8 hợp chất mới nhóm aryltetralin lignan được phân lập từ quả Chà chôi. Trong đó, phân lập được khoảng 0,5 g CT1 làm nguyên liệu thiết lập chuẩn định tính. Vì vậy phần xác định cấu trúc của CT1 là dữ liệu để xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn định tính. Cleistantoxin Cleisindoside D Cleisindoside A 7’,8’-dehydrocleistantoxin (Chuẩn định lượng) (Chuẩn định lượng) (Chuẩn định tính) (CT1- Chuẩn định tính) CT2 CT3 CT4 CT5 (Cleistonkiside A) (Cleistonkinin A) (Cleistonkinin B) (Cleistonkiside D) CT6 CT7 CT8 (Cleistonkinen) (Cleistonkinin E) (Cleistonkinin C) Hình 4.1. Công thức cấu tạo của các chất chuẩn và chất mới phân lập được quả Chà chôi 3.2. THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC 3.2.1. Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng cleistantoxin và cleisindoside D Kết quả khẳng định cấu trúc các chất cleistantoxin và cleisindoside D bằng 1D và 2D-NMR, HR-MS, IR, UV-VIS, CD…cho thấy bộ phổ của 2 chất phân lập được trùng với bộ dữ liệu đã công bố của 2 chất cleistantoxin và cleisindoside D. Từ đó, xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D gồm: tính chất, nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, bộ phổ 1H, 13C-NMR, HR-MS, IR và UV-VIS dựa trên các tài liệu đã công bố và các kết quả thực nghiệm của luận án (phụ lục 1.3 và 1.4). Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí của cleistantoxin và cleisindoside D bằng HPLC/DAD. - Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí và tạp chất liên quan của cleistantoxin và cleisindoside D Cột: Inertsil® ODS-3 (250 x 4,6 mm; 5 m) 11
Chương trình sắc kí trình bày ở bảng 3.12. Bảng 3.12. Chương trình sắc kí định lượng TCLQ Chương trình gradient của Chương trình gradient của cleistantoxin cleisindoside D % %H2O % ACN %H2O Thời gian (phút) Thời gian (phút) ACN 0 30 70 0 27 73 20 50 50 40 50 50 50 70 30 45 73 27 55 30 70 50 27 73 Thời gian phân tích 60 phút Thời gian phân tích 55 phút Tốc độ dòng 1,5 ml/phút Tốc độ dòng 1,0 ml/phút Thể tích tiêm: 30 µL Thể tích tiêm: 20 µL Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng - Thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí và tạp chất liên quan của cleistantoxin và cleisindosid D theo hướng dẫn của ICH. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D Bảng 3.21. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin Chỉ tiêu và tiêu Phương Yêu cầu chuẩn áp dụng pháp thử Bột kết tinh màu trắng, dễ tan trong 1. Tính chất dicloromethan, ACN và aceton, rất khó tan Phương pháp thử độ tan trong MeOH, ethanol 960 và nước Mao quản Nhiệt độ 199OC đến 202OC 2. hoặc quét nóng chảy nhiệt vi sai Xác định góc Góc quay [𝛼]20𝐷 = -130,0 đến -135,0 O O 3. quay cực cực riêng (dung dịch 0,5% trong chloroform) riêng Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch thử 0,02 Phổ hấp thụ Phổ UV- mg/ml ACN có hai cực đại hấp thụ ở buớc sóng tử ngoại khả VIS 203 và 286 nm  2 nm kiến. Phổ IR trong khoảng số sóng từ 4000 đến 400 Phổ hồng cm-1 có các đỉnh đặc trưng trong khoảng: là Phổ hồng ngoại (IR) 3565, 3466, 2931, 1773, 1617, 1483, 1297, ngoại 1230, 1142, 1047  20 cm-1 4.. Định Phổ cộng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR có các Phổ 1H- tính hưởng từ độ chuyển dịch hoá học đặc trưng: 6,72; 6,66; NMR hạt nhân 6,64; 6,22; 5,91; 5,88; 5,87; 5,86; 4,99; 4,59; (CDCl3, 500 1 H-NMR 4,47; 4,12; 4,02; 2,84; 2,71  0,5 ppm MHz) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR có các Phổ cộng độ chuyển dịch đặc trưng: 38,7; 43,9; 44,6; Phổ 13C- hưởng từ 59,8; 70,4; 71,8; 101,2; 100,9; 104,1; 107,6; NMR hạt nhân 111,1; 124,1; 124,7; 132,9; 133,0; 134,9; (CDCl3, 125 13 C-NMR MHz) 141,5; 146,5; 147,2; 149,4; 174,2  0,5 ppm 12
Phổ HR- m/z 421,0888 [M+Na]+ (tính toán lí thuyết cho MS công thức phân tử C21H18O8Na, 421,0899) Phổ HR-MS Tạp chất Phương pháp 5. Không lớn hơn 1,0% bay hơi TGA Phương pháp 6. Tro sulfat Không lớn hơn 0,1% tro sulfat Tạp chất Từng tạp đơn: Không lớn hơn 0,1% Phương pháp 7. liên quan Tổng tạp: Không lớn hơn 0,5% HPLC Độ tinh (Tính bằng 8. khiết sắc Độ tinh khiết sắc ký không được nhỏ hơn chuẩn hoá 99,5% diện tích) kí Độ tinh Độ tinh khiết DSC của nguyên liệu thiết lập Quét nhiệt vi 9. khiết DSC chuẩn không được nhỏ hơn 99,0% sai Bảng 3.22. Tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn gốc định lượng cleisindoside D Chỉ tiêu và tiêu Phương pháp Yêu cầu chuẩn áp dụng thử Bột kết tinh màu trắng, dễ tan trong Phương pháp 1. Tính chất dicloromethan, ACN và aceton, MeOH. thử độ tan Nhiệt độ Quét nhiệt vi 2. 225 C đến 228 C o o nóng chảy sai Góc quay [𝛼]20 𝐷 = -150,0 đến -157,0 o Xác định góc 3. cực riêng (dung dịch 0,5% trong methanol) quay cực riêng Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch thử 0,02 Phổ hấp thụ tử Phổ UV-VIS mg/ml trong ACN-H2O (1-1) có hai cực đại ngoại khả kiến. hấp thụ ở bước sóng 203 và 286 nm  2 nm. Phổ hồng Phổ IR có các đỉnh đặc trưng trong khoảng: ngoại IR 1035; 1073; 1235; 1475; 1619; 1772; 2932; Phổ hồng ngoại (KBr) 3419 cm-1 + 20 cm-1 Phổ cộng Phổ 1H-NMR có các độ chuyển dịch đặc trưng: 4. hưởng từ hạt 2,70; 3,04; 3,18; 3,28; 3,39; 3,41; 3,67; 3,99; Phổ 1H-NMR Định nhân 1H- 4,07; 4,34; 4,45; 4,64; 5,28 5,83; 5,84; 5,89; tính NMR 5,93; 6,26; 6,65; 6,69  0,5 ppm Phổ 13C-NMR có các độ chuyển dịch đặc Phổ cộng trưng: 38,4; 44,0; 45,5; 59,9; 61,5; 69,8; 72; hưởng từ hạt 73,5; 75,2; 76,0; 76,3; 99,4; 100,9; 101,5; 13 nhân 13C- 104,8; 107,6; 110,7; 122; 123,8; 132,8; 135,3; Phổ C-NMR NMR 136,8; 142,1; 146,6; 147,3; 149,9; 174,2  0,5 ppm Phổ HR-MS Mảnh đặc trưng m/z = 583,1409 (M+Na)+ Phổ HR-MS Tạp chất bay Phương pháp 5. Không lớn hơn 5,0% hơi TGA 6. Tro sulfat Không lớn hơn 0,1% Tro sulfat Tạp chất liên Từng tạp đơn: Không lớn hơn 3,0% 7. HPLC (Tính quan Tổng tạp: Không lớn hơn 5,0% bằng chuẩn hoá Độ tinh khiết 8. Không được nhỏ hơn 95,0% diện tích) sắc kí Độ tinh khiết Độ tinh khiết DSC của chất chuẩn không được Quét nhiệt vi 9. DSC nhỏ hơn 95,0% sai 13
Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và clesindoside D Đã đóng được 96 ống chất chuẩn gốc cleistantoxin, xác định giá trị trên COA là 99,3%, độ không đảm bảo đo là 0,1% và nghiên cứu độ ổn định được 18 tháng và 76 ống chất chuẩn gốc cleisindoside D, xác định giá trị trên COA là 94,2%, độ không đảm bảo đo là 0,4% và nghiên cứu độ ổn định được 12 tháng. Hàm lượng ghi trên ống chuẩn bằng giá trị ấn định  2.Umr (Hình 3.46). 99,3  0,2 % (a) 94,2  0,8 % (b) Hình 3.46. Hàm lượng công bố trên ống chuẩn cleistantoxin (a) và cleisindoside D (b) 3.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn định tính cleisindoside A và 7’,8’-dehydrocleistantoxin (chất mới-CT1) Bảng 3.34. Tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn định tính cleisindoside A Chỉ tiêu và tiêu Phương pháp Yêu cầu chuẩn áp dụng thử Bột kết tinh màu trắng, dễ tan trong dicloromethan, Phương pháp 1. Tính chất ACN MeOH và aceton, rất khó tan trong nước thử độ tan Nhiệt độ Quét nhiệt vi 2. 230OC đến 233OC nóng chảy sai Xác định góc 3. Góc quay [𝛼]20 𝐷 = -48,0 O đến -53,0 O quay cực cực riêng (dung dịch 0,5% trong chloroform) riêng Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch thử 0,02 mg/ml Phổ hấp thụ Phổ UV- ACN trong khoảng từ 200 đến 400 nm có hai cực tử ngoại khả VIS đại hấp thụ ở buớc sóng 203, 251 và 344  2 nm kiến. Phổ IR trong khoảng số sóng từ 4000 đến 400 cm-1 có Phổ hồng các đỉnh đặc trưng trong khoảng: 3444, 2910, 1773, Phổ hồng ngoại (IR) ngoại 1626, 1491, 1244, 1382, 1080, 1034  20 cm-1 Phổ H-NMR có các độ chuyển dịch hoá học đặc 1 4. Phổ cộng trưng: 7,04; 6,75; 6,54; 6,50; 6,37; 6,01; 6,02; Phổ 1H-NMR hưởng từ Định 5,95; 5,94; 5,02; 4,97; 4,89; 4,89; 4,63; 4,52 ; 4,36; (DMSO, 500 tính hạt nhân 4,32; 4,25; 3,76; 3,46; 3,39; 3,12; 3,11; 3,03; 3,01; 1 MHz) H-NMR 2,85  0,5 ppm Phổ cộng Phổ 13C-NMR có các độ chuyển dịch đặc trưng: 43,1; 13 hưởng từ 60,9; 70,8; 73,4; 101,6; 102,5; 104,7; 108,3 110,5; 119,6; Phổ C-NMR hạt nhân 123,8; 126,3; 128,4; 130,4; 139,9; 142,5; 145,6; 147,2; (DMSO, 125 MHz), 13 C-NMR 147,7; 148,5; 168,4  0,5 ppm Phổ Có mảnh m/z là 553,1323 [M+Na]+ tính toán cho Phổ HRESI- HRESI-MS công thức phân tử C26H26NaO12 MS Tạp chất Từng tạp đơn: Không lớn hơn 5,0% HPLC 5. liên quan Tổng tạp: Không lớn hơn 10,0% (Tính bằng Độ tinh Độ tinh khiết sắc ký của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn hoá 6. khiết sắc kí chuẩn không được nhỏ hơn 90,0% diện tích) 14
Bảng 3.35. Tiêu chuẩn chất lượng của chuẩn định tính 7’,8’-dehydrocleistantoxin Chỉ tiêu và tiêu Phương pháp Yêu cầu chuẩn áp dụng thử Bột kết tinh màu trắng, dễ tan trong Phương pháp 1. Tính chất dicloromethan, ACN và aceton, rất khó tan thử độ tan trong MeOH và nước Nhiệt độ 327OC đến 330OC 2. Quét nhiệt vi sai nóng chảy 3. Góc quay [𝛼]20 𝐷 = + 85,0 đến + 90,0 O O Xác định góc cực riêng (dung dịch 0,042% trong chloroform) quay cực riêng Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch thử 0,02 Phổ UV- mg/ml ACN có hai cực đại hấp thụ ở buớc sóng Phổ hấp thụ tử VIS ngoại khả kiến. 203 và 286  2 nm Phổ IR có các đỉnh đặc trưng: 3547, 2912, 1745, Phổ hồng 1656, 1602, 1489, 1440, 1396, 1346, 1240, 1195, Phổ hồng ngoại ngoại (IR) 1114, 1051, 1004, 929, 854, 821 + 20 cm-1 Phổ 1H-NMR có các độ chuyển dịch hoá học 4. Phổ 1H- đặc trưng: 6,87; 6,64; 6,59; 6,07; 5,96; 5,95; Phổ 1H-NMR Định NMR 5,29; 5,12; 4,64; 4,12; 3,91; 3,38  0,5 ppm tính Phổ 13C-NMR có các độ chuyển dịch đặc trưng: 38,22; 44,16; 45,60; 60,14; 71,99; 76,33; Phổ 13C- 101,15; 101,15; 105,16; 107,86; 110,79; Phổ 13C-NMR NMR 121,61; 123,95; 132,85; 135,7; 136,8; 142,00; 146,79; 147,39; 150,25; 173,97  0,5 ppm Phổ HRESI- m/z 419,0749 [M+Na]+ Phổ HR-MS MS 5. Tạp chất Từng tạp đơn: Không lớn hơn 5,0% HPLC liên quan Tổng tạp: Không lớn hơn 10,0% (Tính bằng 6. Độ tinh Độ tinh khiết sắc ký của chất chuẩn không được chuẩn hoá diện khiết sắc kí nhỏ hơn 90,0% tích) TÓM LẠI: Đã thiết lập được 2 chất chuẩn gốc định lượng là cleisindoside D (đóng 76 ống chuẩn khối lượng 10 mg, độ tinh khiết là 94,2%) và cleistantoxin (đóng 96 ống chuẩn khối lượng 10 mg, độ tinh khiết là 99,3%) Đã chuẩn bị được 2 nguyên liệu thiết lập chuẩn gốc định tính là cleisindoside A độ tinh khiết sắc kí là 95,8% và 7’,8’-dehydrocleistantoxin 94,4%. Vì vậy, cần tiến hành xây dựng phương pháp định tính cleisindoside A, cleisindoside D, cleistantoxin, 7’,8’-dehydrocleistantoxin và định lượng đồng thời cleisindoside D, cleistantoxin trong quả của chi Cách hoa 3.3. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ LIGNAN TRONG QUẢ CỦA CHI CÁCH HOA (CLEISTANTHUS) 3.3.1. Xây dựng phương pháp định tính đồng thời 4 lignan trong quả của chi Cách hoa bằng HPLC/DAD. Lựa chọn điều kiện sắc kí - Lựa chọn cột sắc kí: Inertsil® ODS-3 C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) - Pha động: ACN : Nước 15
- Chương trình gradient như bảng 3.28 Bảng 3.28. Chương trình gradient tách hỗn hợp 4 chất STT Thời gian (phút) A B Tốc độ dòng 1. 0 30 70 1,0 mL/phút 2. 12 38 62 1,5 mL/phút 3. 13 38 62 1,0 mL/phút 4. 30 50 50 1,0 mL/phút 5. 31 30 70 1,0 mL/phút 6. Thời gian phân tích 35 phút - Bước sóng: 286 nm - Thể tích tiêm: 20 µL Đã định tính được 4 chất cleisindoside A, cleisindoside D, cleistantoxin và 7’,8’-dehydrocleistantoxin trên SKĐ của mẫu thử quả Chà chôi và trong quả Cách hoa eberhardt không có chất 7’,8’-dehydrocleistantoxin Quả cây Chà chôi Quả cây Cách hoa eberhardt Hình 3.61. SKĐ định tính trong quả một số loài thuộc chi Cách hoa 3.3.2. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời cleisindoside D và cleistantoxin trong quả Chà chôi bằng HPLC/DAD. Xây dựng qui trình chiết xuất cleisindoside D và cleistantoxin Hình 3.47. Qui trình chiết cleisindosid D và cleistantoxin trong dược liệu 16
Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời cleisindosid D, cleistantoxin bằng HPLC/DAD Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH với các chỉ tiêu sau: độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính (r=0,9997>0,998), độ lặp lại, độ tái lặp (RSD%
định. Kết quả có tính thực tiễn, vì có thể áp dụng qui trình này để phân lập, tinh chế cleistantoxin làm NLTLCC ở các lô khác có qui mô lớn hơn. 4.1.3. Phân lập, tinh chế, khẳng định cấu trúc cleisindoside D làm chất chuẩn gốc định lượng Dựa trên độ tan của cleisindoside D tan tốt trong CH2Cl2 và MeOH (Bảng 3.22), cắn D được phân lập trên cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (90:10) thu các PĐ chứa cleisindoside D thu được cắn E có hàm lượng cleisindoside D là 85,8%. Để tinh chế cleisindoside D từ cắn E và loại bớt các glycoside gắn 2 đến 3 phân tử đường, luận án đã lựa chọn sắc kí rây phân tử hạt sephadex LH-20 với hệ dung môi MeOH 100%, thu được cắn F chứa cleisindoside D có độ tinh khiết SK là 94,0% nhưng vẫn có màu vàng nên cần tiếp tục tinh chế. Lựa chọn sắc kí pha đảo cột C18 với hệ dung môi aceton-H2O (2-8) loại bỏ các glycoside cấu trúc gần giống cleisindoside D, thu được các PĐ chứa cleisindoside D. Sau đó, kết tinh lại bằng hệ CH2Cl2: n-butanol, cleisindoside D thu được có độ tinh khiết SK 97,6%. Qui trình phân lập, tinh chế cleisindoside D khá công phu, thu được lượng lớn (3,6562 g) có độ tinh khiết SK 97,6% so với nghiên cứu thành phần hoá học trước đó và qui trình tinh chế là đóng góp hoàn toàn mới của luận án 4.1.4. Khẳng định cấu trúc cleisindoside A làm NLTLCC định tính Trong quá trình tinh chế cleisindoside D trên cột C18, tách riêng được vài lọ kết tinh dưới dạng chất rắn màu trắng, tiến hành đo phổ HRESI-MS, 1D, 2D-NMR và so sánh với tài liệu tham khảo, xác định là hợp chất phân lập được là cleisindoside A. Cleisindoside A phân lập được với lượng 548,1 mg chỉ đủ lượng làm chuẩn định tính. Luận án đóng nguyên liệu trong lọ thuỷ tinh trung tính, màu nâu để tiếp tục phân lập, tinh chế cleisindoside A lô khác với lượng lớn hơn để tiếp tục nghiên cứu thiết lập chuẩn gốc định lượng cleisindoside A. 4.1.5. Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc các chất tinh khiết mới từ quả cây Chà chôi. Trong quá trình phân lập, tinh chế cleistantoxin, cleisindoside D làm chất chuẩn gốc định lượng, luận án đã phân lập, tinh chế được 8 chất mới CT1-CT8. Tiến hành đo phổ NMR, HRESI-MS, IR, UV-VIS, CD… cho thấy 8 hợp chất này đều thuộc lớp chất aryl-tetralin lignan, đây là lớp chất thường thấy trong các loài thuộc chi Cleistanthus và đặt tên là: 7’,8’-dehydrocleistantoxin (CT1), cleistonkiside A (CT2), cleistonkinin A (CT3), cleistonkinin B (CT4), cleistonkiside B (CT5), cleistonkinen (CT6), cleistonkinin E (CT7), cleistonkinin C (CT8). Đây là công trình đầu tiên công bố về thành phần hóa học của quả Chà chôi. Trong 8 chất mới phân lập được thì, nổi bật là chất CT1 (7’,8’- dehydrocleistantoxin) được phân lập với lượng chất lớn nhất khoảng 500 mg nên được sử dụng làm chất chuẩn định tính. Phần xác định cấu trúc của chất mới CT1 này là rất quan trọng để xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng cho chất chuẩn định tính 7’,8’-dehydrocleistantoxin. Luận án góp thêm vào bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn định tính mới 7’,8’-dehydrocleistantoxin từ 1 chất tinh khiết mới phân lập. 4.2. THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC 4.2.1. Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D 18