Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật hóa học: Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở vật liệu carbon có cấu trúc nano và ứng dụng trong cảm biến sinh học

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

3
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở vật liệu carbon có cấu trúc nano và ứng dụng trong cảm biến sinh học" với mục đích tổng hợp được một số vật liệu mới, vật liệu có cấu trúc nano trên cơ sở cacbon (như graphen/graphen oxit, chấm graphen lượng tử...) kết hợp với các vật liệu hạt nano kim loại/oxit kim loại, có hoạt tính xúc tác tương tự enzym HRP (Enzym Horseradish Peroxidase)... Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật hóa học: Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở vật liệu carbon có cấu trúc nano và ứng dụng trong cảm biến sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Nguyễn Đức Nghĩa NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU TRÊN CƠ SỞ NANOCOMPOSITE CARBON ỨNG DỤNG TRONG CẢM BIẾN GLUCOSE Ngành: Kỹ thuật hóa học Mã số: 9520301 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC HÀ NỘI – 2024
Công trình được hoàn thành tại: Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Trần Vĩnh Hoàng 2. PGS.TS. Huỳnh Đăng Chính Phản biện 1: PGS. TS. Nguyễn Xuân Viết Phản biện 2: PGS.TS. Mai Anh Tuấn Phản biện 3: PGS.TS. Trương Thị Ngọc Liên Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Đại học Bách khoa Hà Nội họp tại Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi 8 giờ 30 phút, ngày 03 tháng 01 năm 2024 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Thư viện Tạ Quang Bửu – Đại học Bách khoa Hà Nội 2. Thư viện Quốc gia Việt Nam
MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cảm biến sinh học đang là một trong những lĩnh vực nghiên cứu nhận được sự quan tâm, lựa chọn đặc biệt của các nhà khoa học, các hãng chế tạo thiết bị phân tích sinh hóa vì triển vọng ứng dụng rất lớn của chúng trong phân tích, kiểm tra các chỉ dấu sinh học trong chăm sóc sức khỏe, theo dõi, phát hiện sớm bệnh tật, quan trắc và kiểm soát môi trường, kiểm tra an toàn thực phẩm... với những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống như phân tích nhanh, đơn giản, tiện lợi và độ chính xác cao. Xu hướng chính hiện nay là ứng dụng các vật liệu nano, vật liệu lai tạo và tích hợp được các tính chất lý-hóa và sinh học của các vật liệu (hoạt tính xúc tác, tính chất quang/từ/điện) vào trong cảm biến sinh học để tăng độ nhạy, giảm thời gian xét nghiệm, tăng độ chọn lọc, nâng cao giới hạn phát hiện. Do đó, nghiên cứu chế tạo một số loại vật liệu carbon có cấu trúc nano ứng dụng trong các cảm biến sinh học có độ nhạy cao, phát hiện nhanh, có thể tiến hành xét nghiệm hàng loạt là hướng nghiên cứu mới mẻ không chỉ ở Việt Nam mà là hướng nghiên cứu của rất nhiều phòng thí nghiệm trên khắp thế giới để chế tạo các vật liệu mới, vật liệu lai tạo đa tính chất. Ngoài ra, hướng nghiên cứu này sẽ mang lại giá trị to lớn trong y học cũng như đời sống giúp nâng cao chất lượng cuộc sống. Chính vì vậy tôi chọn đề tài “Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở vật liệu carbon có cấu trúc nano và ứng dụng trong cảm biến sinh học” là đề tài nghiên cứu sinh. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Tổng hợp được một số vật liệu mới, vật liệu có cấu trúc nano trên cơ sở cacbon (như graphen/graphen oxit, chấm graphen lượng tử...) kết hợp với các vật liệu hạt nano kim loại/oxit kim loại, có hoạt tính xúc tác tương tự enzym HRP (Enzym Horseradish Peroxidase). 1
- Thiết kế, cấu trúc cảm biến phát hiện hydrogen peroxit (H2O2) trên cơ sở các vật liệu đã tổng hợp, kết hợp và lựa chọn vật liệu thích hợp để tiến tới chế tạo cảm biến sinh học. - Thiết kế, chế tạo cảm biến sinh học trên cơ sở các vật liệu đã tổng hợp kết hợp với các enzym đặc chủng để xác định nồng độ glucose trong dung dịch và mẫu thực (Mẫu máu…). 3. Nội dung nghiên cứu - Tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng vật liệu AgNPs/GQDs trong chế tạo cảm biến sinh học so màu phát hiện glucose. - Tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng vật liệu Fe3O4 bọc carbon (FeC) trong chế tạo cảm biến sinh học so màu phát hiện glucose. - Tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng vật liệu FN-GQDs trong chế tạo cảm biến sinh học so màu phát hiện glucose. 4. Phương pháp nghiên cứu - Dựa trên nền tảng hóa lý thuyết; hóa lý và hóa sinh để phân tích các đặc trưng của hệ: các phản ứng hóa-sinh trên bề mặt-liên bề mặt trong quá trình phản ứng sinh hóa; quá trình phản ứng- chuyển đổi tín hiệu. Từ đó tìm ra các điều kiện tối ưu (như nhiệt độ, pH, thời gian, thành phần mồi trường…) cho các bước gắn đầu dò, phản ứng sinh hóa để góp phần tăng độ ổn định, tăng độ nhạy và độ chọn lọc của cảm biến. - Luận án tiến hành thức nghiệm để tổng hợp vật liệu, phân tích đặc trưng của vật liệu, đánh giá tính chất vật liệu và sử dụng vật liệu để chế tạo cảm biến cũng như khảo sát đánh giá khả năng hoạt động và các tính chất chủ yếu của cảm biến. - Các phương pháp hóa lý để phân tích đặc trưng, nghiên cứu tính chất các vật liệu, phân tích cấu trúc và dạng thù hình của bề mặt cảm biến như, SEM/TEM, IR, XRD… Phương pháp quang phổ UV-vis để nghiên 2
cứu tính chất, nồng độ các dung dịch nano, nano Ag, dung dịch graphene oxit, graphen chức năng hóa… 5. Ý nghĩa thực tiễn của luận án Việc nghiên cứu, chế tạo thành công một số vật liệu trên cơ sở cacbon cấu trúc nano có hoạt tính xúc tác và ứng dụng chúng trong chế tạo cảm biến sinh học có ý nghĩa không chỉ trong y học mà còn làm tiên đề trong ứng dụng chuẩn đoán nhanh các độc tố trong thực phẩm, trong nước uống, nước sinh hoạt…Nghiên cứu này tiến tới áp dụng trong y tế sẽ giúp việc chuẩn đoán một số chỉ số của bệnh nhân trở lên nhanh chóng, thuận tiện. Người bệnh có thể dễ dàng kiểm soát các chỉ số sinh học trong máu mà không phải đến bệnh viện qua đó có biện pháp ngăn ngừa, phòng bệnh sớm. Khi triển khai các kết quả của nghiên cứu về cảm biến phát hiện các chất độc hại sẽ đưa lại các bộ kit xét nghiệm an toàn thực phẩm, an toàn môi trường giúp chúng ta kiểm soát tốt hơn thực phẩm, nước uống, nước sinh hoạt...góp phần bảo vệ sức khỏe và môi trường. Chương 1: Tổng quan 1.1 Cảm biến sinh học 1.1.1 Định nghĩa và cấu tạo cảm biến sinh học Hiệp hội quốc tế về hóa học ứng dụng – IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) năm 1999 đã định nghĩa: Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm một phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi tín hiệu (transducer). Chất được gắn trên bộ phận chuyển đổi được gọi là “phần tử dò/phần tử nhận biết sinh học”, chất cần phân tích trong mẫu được gọi là “phần tử đích”. Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học là dựa trên các phản ứng đặc hiệu: kháng nguyên/kháng thể (cảm biến miễn dịch), lai hóa DNA-DNA (cảm biến DNA) hoặc enzym/cơ chất (cảm biến enzym)… Trên cơ sở các phản ứng đặc hiệu này, phần tử nhận biết sinh học giữ vai trò dò tìm đối 3
tượng đích trong mẫu phân tích và phần tử chuyển đổi giữ vai trò chuyển đổi tương tác sinh học thành tín hiệu điện hóa, quang, nhiệt… sau đó đưa qua bộ phận xử lý tín hiệu và hiển thị kết quả đo (hình 1.1). Hình 1.1 Nguyên cấu tạo của cảm biến sinh học Có nhiều dạng chuyển đổi tín hiệu như chuyển đổi điện hóa, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi cơ… 1.2 Cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose Những năm gần đây, cảm biến glucose đang là một trong những lĩnh vực nghiên cứu nhận được sự quan tâm, lựa chọn đặc biệt của các nhà khoa học, các hãng chế tạo thiết bị phân tích sinh hóa vì những triển vọng ứng dụng rất lớn của chúng trong phân tích, kiểm tra các chỉ dấu glucose trong chăm sóc sức khỏe, theo dõi, phát hiện sớm bệnh tiểu đường (với nguy cơ và xu hướng phát triển của bệnh này như đề cập ở trên) với những ưu điểm vượt trội như phân tích nhanh, đơn giản, dễ sử dụng so với việc đến bệnh viện để thực hiện các việc kiểm tra, xét nghiệm. Các kết quả trên có được là nhờ ứng dụng các vật liệu tiên tiến (vật liệu lai tạo, vật liệu nano…) và tích hợp các tính chất sinh-hóa-lý của các vật liệu (hoạt tính xúc tác, tính chất quang, tính chất điện…) để tăng cường hoạt tính của các phần tử sinh học, tăng độ nhạy, giảm thời gian xét nghiệm, giới hạn phát hiện thấp, giảm chi phí phân tích...Quan trọng hơn nữa, sử dụng các vật liệu tiên tiến nói trên sẽ kéo dài được thời gian sử dụng của cảm biến sinh học vì các phần tử sinh học (như enzyme) có thời gian sống không dài, lại yêu cầu hoạt động trong những điều kiện khá nghiêm ngặt (pH, nhiệt độ…). Nhìn chung, cảm biến glucose có hai loại, loại thứ nhất có sử dụng đầu dò là enzyme glucose oxidase (GOx) để xác định nồng độ glucose trong mẫu thì được gọi là cảm biến sinh học. Loại thứ hai không cần đầu dò, tiến hành phản úng hóa học để xác định nồng độ glucose thì không được xếp vào cảm biến sinh học. Trong luận án này chúng tôi chế tạo loại cảm biến thứ nhất để 4
xác định nồng độ glucose trong các mẫu sinh học (máu, nước tiểu, nước bọt hoặc mồ hôi). 1.3 Các Vật liệu nano tiên tiến trên nền cacbon được nghiên cứu trong luận án 1.3.1 Vật liệu chấm lượng tử cacbon (Cacbon Quantum Dots- GQDs) Chấm cacbon lượng tử hoặc có tên khác là chấm graphen lượng tử hay còn gọi graphen quantum dots (GQDs)/hoặc cacbon quantum dots (GQDs) là hạt nano cacbon nhỏ (kích thước nhỏ hơn 10 nm) với bề mặt đã thụ động hóa. GQDs là một loại cấu trúc mới của vật liệu nano cacbon huỳnh quang (hình 1.14), GQDs có các thuộc tính hấp dẫn của sự ổn định cao, dẫn điện tốt, độc tính thấp, thân thiện với môi trường, các tuyến đường tổng hợp đơn giản cũng như tính chất quang học so sánh với các chấm lượng tử. Chấm lượng tử Cacbon đã được nghiên cứu rộng rãi đặc biệt là do tính chất phát xạ mạnh và khả năng phát huỳnh quang của chúng, cho phép các ứng dụng của chúng trong y sinh học, thiết bị quang điện tử, xúc tác, và cảm biến. Hình 1.20 Sơ đồ cấu trúc của các vật liệu nano cacbon 1.3.2 Vật liệu nano bạc (silver nanoparticles-AgNPs) Hạt nano bạc (AgNPs) là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm. Do có diện tích bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion. Do thể hiện tính kháng khuẩn tốt nên nano bạc thường được sử dụng để làm chất khử trùng, kháng khuẩn, khử mùi… Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt. Hiện tượng này tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với các màu sắc phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano. Do các thuộc tính quang học của dung dịch chứa hạt nano phụ thuộc vào hình dạng, kích thước và nồng độ của hạt, nên ta có thể sử dụng UV-VIS để xác định các thuộc tính trên. Do hạt nao bạc có kích thước nhỏ hơn 20 nm chỉ có 5
một bề mặt plasmon duy nhất nên trong phổ UV-VIS của chúng chỉ xuất hiện 1 đỉnh duy nhất. Người ta xử dụng tính chất này để xác định hình dạng của hạt nano bạc. Trong luận án này chúng tôi sử dụng tính chất này của AgNPs và kết hợp với tính chất hóa học của bạc để phát triển nên cảm biến xác định nồng độ hydrogen peroxide và glucose theo phương pháp so màu. 1.3.3 Vật liệu nano Fe3O4 Các hạt nano sắt oxit là vật liệu nano bền, với ứng dụng mạnh trong y sinh nhờ tính chất từ tính đặc biệt của chúng ở kích thước nano. Hạt nano oxit sắt dễ dàng tổng hợp trong sự hiện diện của từ trường bên ngoài, nhưng cũng phân tán lại dễ dàng khi loại từ trường đó. Với thuộc tính từ này (tính siêu thuận từ) , các hạt nano oxit sắt được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong y sinh, bao gồm : tách sinh học và tinh chế, cảm biến sinh học, truyền, chụp cộng hưởng từ (MRI),điều trị tăng thân nhiệt. Vào năm 2007, người ta đã phát hiện ra rằng các hạt nano sắt từ (Fe3O4) cho thấy các hoạt tính giống như enzyme peroxidase tự nhiên, với hoạt tính xúc tác tương tự như enzyme peroxidase (HRP). Đây là lần đầu tiên các hạt nano vô cơ được coi là một enzyme nhân tạo thay thế trong các ứng dụng y sinh. Sự kiện này khởi xướng cho việc phát hiện ra một loạt vật liệu nano với các hoạt tính giống như enzyme, bao gồm kim loại, oxit kim loại và hợp chất cacbon-kim loại vật liệu nano có đặc tính xúc tác tương tự như peroxidase. Chương 2: Thực nghiệm 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và dụng cụ 2.1.1 Hóa chất, vật liệu ˉ Chitosan được chiết tách, xử lý, tinh chế và đã được xác định các thông số như độ deaxetyl; khối lượng phân tử bởi các nghiên cứu trước đây ở Bộ môn Hóa Vô cơ – Đại cương. ˉ Các hóa chất dùng trong nghiên cứu này gồm: 6
ˉ Axit citric monohydrate (C6H8O7.H2O) (A.R, Trung Quốc); Thioure (SC(NH2)2) (A.R, Trung Quốc); Urea (CH4N2O) (A.R, Trung Quốc); AgNO3 tinh thể (Sigma Aldrich -Đức); Muối sắt (3) clorua (FeCl3.6H2O), (A.R, Trung Quốc); Muối Morh ((NH4)2Fe(SO4)2.6H2O) (A.R, Trung Quốc); NaOH (A.R, Trung Quốc); HCl (A.R, Trung Quốc); Viên đệm PBS (Sigma Aldrich - Đức); Glucose (C6H12O6) (A.R, Sigma Aldrich -Đức); Saccarose (C12H22O11) (A.R, Sigma Aldrich -Đức); Axit ascorbic (C6H8O6) (A.R, Sigma Aldrich -Đức); Latose (C6H8O6) (A.R, Sigma Aldrich -Đức); Glactose (C6H8O6) (A.R, Sigma Aldrich -Đức); Fructose (C6H8O6) (A.R, Sigma Aldrich -Đức); Axit Acetic acid (CH3COOH) (A.R, Trung Quốc); Muối natri axetat (CH3COONa) (A.R, Trung Quốc); Hydrogen peroxide (H2O2) dung dịch 30% (A.R, Trung Quốc); Glucose oxidase (GOx, 149800 U/g) (Sigma Aldrich-Đức); 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) (C16H20N2) (Sigma Aldrich -Đức); Nước cất 1 lần được dùng để chế tạo vật liệu và pha chế các dung dịch. 2.1.2 Dụng cụ và thiết bị ˉ Máy ly tâm tốc độ cao Tommy (Nhật), (tốc độ tối đa 15.000 vòng/phút); Máy ly tâm mini Cubee (tốc độ tối da 4.000 vòng/phút); Bể điều nhiệt Laudra (Pháp); Tủ sấy có đặt lịch trình Memmert; Cân phân tích, cân kỹ thuật; Bếp từ gia nhiệt; Bình thủy nhiệt (autoclave); Bộ micro pipet ; Các dụng cụ thủy tinh khác như cốc, ống đong, bình tam giác… 2.2 Tổng hợp vật liệu AgNPs/GQDs và ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học 2.2.1 Tổng hợp vật liệu AgNPs/GQDs 2.2.1.1 Tổng hợp cacbon dots bằng phương pháp từ dưới lên (bottom-up) 1 mmol acid citric (0,21 g) và 0,23 g thiourea (3 mmol) hòa tan trong 5 mL nước. Cho hỗn hợp trên vào autoclave và tiến hành gia nhiệt ở 160 oC trong vòng 4h. Làm nguội tự nhiên về nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong vòng 30 phút để thu được chất rắn là bột nano cacbon (GQDs). Sấy khô ở 80 oC trong 10h để thu được 7
GQDs ở dạng bột màu nâu đen, đem phân tán trong nước cất thu được dung dịch GQDs. 2.2.1.2 Chế tạo vật liệu nano Ag/Cacbon dots (AgNPs/GQDs) Lấy 100 µL dung dịch GQDs đem pha vào 3 mL nước cất, sau đó dùng NaOH 0,1 M để điều chỉnh pH dung dịch về pH9 rồi cho 20 μL dung dịch AgNO3 0,1 M vào dung dịch trên. Hỗn hợp sau đó được gia nhiệt đến 90 oC trong 3 giờ để khử Ag+ thành nano bạc (AgNPs); để nguội hỗn hợp đến nhiệt độ phòng thu được dung dịch chứa vật liệu nano bạc được bền hóa bởi chấm lượng tử graphen (AgNP/GQDs); bảo quản ở 4 oC để sử dụng. Dung dịch đầu dò được chuẩn bị bằng cách pha dung dịch AgNP/GQDs ở trên với nước cất theo tỷ lệ 1:10 (dung dịch có pH 7). 2.2.2 Chế tạo cảm biến glucose trên cơ sở vật liệu AgNPs/GQDs 100 μL dung dịch glucose với các nồng độ khác nhau (từ 0,5 mM đến 8 mM) pha trong đệm PBS (pH=7) được lấy vào ống eppendorf, tiếp đó 100 μL dung dịch GOx (nồng độ 2 mg.mL-1 pha trong đệm PBS nồng độ 0.001 M) được thêm vào trong ống. Hỗn hợp được khuấy trộn bằng máy votex trong 10 giây, sau đó đem ủ ở 37 oC bằng bể ổn nhiệt trong 30 phút. Tiếp theo, 1 mL dung dịch AgNPs/GQDs được thêm vào ống, hỗn hợp được trộn đều rồi ủ ở nhiệt độ 40 oC trong bể ổn nhiệt trong vòng 15 phút, sau đó lấy ra để nguội đến nhiệt độ phòng rồi chuyển vào cuvet để đo độ hấp thụ A ở bước sóng 425nm. 2.2.3 Ứng dụng cảm biến glucose trên cơ sở vật liệu AgNPs/GQDs cho mẫu thực Mẫu nước tiểu được lấy từ các tình nguyện viên, sau đó đem pha loãng với dung dịch đệm PBS nồng độ 0,001M với tỷ lệ 1:4 về thể tích. Lấy 100 μL dung dịch nước tiểu pha loãng với vai trò như mẫu glucose rồi tiến hành các bước như với dung dịch glucose ở mục 2.2.2 8
2.3 Tổng hợp vật liệu Fe3O4 bọc cacbon (Fe/C) và ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học 2.3.1. Tổng hợp vật liệu Fe/C 8.63 g muối (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O và 11,89 g muối Fe3O4Cl3.6H2O được cân vào cốc, thêm nước cất để hòa tan thành dung dịch trong suốt. Hỗn hợp được gia nhiệt lên 80oC và khuấy nhẹ. Tiếp đó, cho từ từ dung dịch NaOH 2M vào hỗn hợp trên cho đến khi pH8 và giữ ổn định ở pH này trong 60 phút. Để nguội, ly tâm lấy kết tủa và rửa lại bằng nước cất và etanol thu được hạt nano Fe3O4 màu đen. Nano Fe3O4 thu được trộn với glucose (5 g; 10 g; 15g; 25g; 30g; 35g; 50g; tương ứng với FeC11; FeC12; FeC13; FeC15; FeC17; FeC1-10) thêm 100 ml nước cất để hòa tan glucose. Hỗn hợp được siêu âm để phân tán Fe3O4, sau đó cho vào autoclave và đem thủy nhiệt ở 140oC trong 8 giờ. Để nguội autoclave, lọc hỗn hợp thu được kết tủa màu đen. Đem rửa kết tủa bằng nước cất và etanol, sấy khô và nghiền mịn thu được hạt nanocomposite Fe3O4 bọc cacbon (ký hiệu là Fe3O4@C). Xúc tác được phân tán trong nước với nồng độ 2 mg.ml-1 để sử dụng. 2.3.2.3 Chế tạo cảm biến xác định nồng độ glucose trên cơ sở vật liệu Fe/C Cho 100 μl dung dịch đệm PBS (0,01 M); 100 μl dung dịch glucose (nồng độ khác nhau) và 50 μl Gox (2 mg.ml-1) vào ống eppendorf. Hỗn hợp được lắc đều rồi ủ ở nhiệt độ 40 oC trong 30 phút. Sau đó, cho thêm 20 μl dung dịch Fe/C (2 mg.ml-1) ; 20 μl dung dịch TMB (20 mg.ml-1) và 1 ml dung dịch đệm axetat (pH4) vào ống eppendorf tương ứng. Cuối cùng, hỗn hợp được ủ trong 40 oC trong 30 phút rồi chuyển đến cuvet để đo phổ UV-Vis. 2.4 Tổng hợp vật liệu FeOOH/ chấm cacbon lượng tử pha tạp nitơ (FN-GQDs) ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học 2.4.1 Tổng hợp vật liệu FN-GQDs Cho 3,39 g (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O và 4,69 g FeCl3.6H2O vào 50mL nước cất và gia nhiệt tới 40 oC. Thêm từ từ dung dịch NH3 10% vào cho tới khi pH = 8,5. Khuấy và bảo ôn nhiệt ở 40oC trong 30 phút, rồi thu các hạt Fe3O4 bằng nam châm vĩnh cửu và rửa sản phẩm 5 – 7 lần cho tới khi nước rửa có pH = 7; tiếp đến, hòa tan 8g chitosan trong 9
400 mL axit axetic 1% tới khi thu được dung dịch chitosan dạng keo, nhớt. Sau đó, trộn nano sắt từ tổng hợp được từ bước trên vào dung dịch chitosan, khuấy đều đến khi thu được dung dịch đồng nhất. Chuyển dung dịch trên vào ống teflon, đưa vào bình phản ứng thủy nhiệt (autoclave) và thủy nhiệt 8 giờ tại 180oC trong tủ sấy. Hỗn hợp thu được đem li tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 20.Cuối cùng thu được dung dịch, bao gồm Fe (III), các chấm cacbon lượng tử pha tạp nitơ. Dung dịch Fe (III)/chấm cacbon lượng tử pha tạp nitơ thu được đem tăng pH bằng dung dịch NaOH 1M đến pH = 7 – 8 ở nhiệt độ phòng, hình thành hạt FeOOH/ chấm cacbon lượng tử pha tạp nitơ (FN- GQDs) dưới dạng kết tủa lơ lửng trong dung dịch. Hạt FN-GQDs được thu lại bằng cách ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 30 phút, sau đó được rửa lại bằng nước cất. Hạt FN – GQDs sau đó được sấy ở 60 oC và bảo quản ở nhiệt độ phòng. 2.4.3 Chế tạo cảm biến glucose trên cơ sở vật liệu FN-GQDs GOx dạng bột, được pha trong dung dịch đệm PBS với nồng độ 2 mg/mL. 100 µL GOx 2 mg/mL được trộn đều và phản ứng với 250 µL glucose trong đệm PBS trong 30 phút với nhiệt độ 37 oC. Tiếp theo, thêm 100 µL TMB 20 mg/mL, 100µL FN-GQDs 2 mg/mL và 1000 µL đệm axetat với pH tối ưu vào các ống eppendorf đã phản ứng. Dung dịch sau đó được ổn nhiệt ở 40oC trong 30 phút. Cuối cùng, các dung dịch được đưa vào cuvet đo quang hấp thụ tại bước sóng 652 nm. Chương 3: Kết quả và thảo luận 3.1 Đặc trưng và ứng dụng vật liệu AgNPs/GQDs trong chế tạo cảm biến sinh học xét nghiệm glucose theo phương pháp so màu 3.1.1 Đặc trưng vật liệu AgNPs/GQDs Khi thêm dung dịch AgNO3 và tiến hành phản ứng khử ion Ag+ với các hạt GQDs đóng vai trò là chất khử đồng thời là chất ổn định thì phổ UV-Vis (hình 3.1A, đường b) có mặt của pic hấp thụ đặc trưng ở bước sóng 425m của hạt nano bạc (AgNPs). Vì trong dung dịch không bổ sung chất khử, hơn nữa dung dịch phản ứng có mặt NaOH với pH = 10
9, nhưng khi cho AgNO3 vào không thấy kết tủa Ag2O xuất hiện, chứng tỏ các nhóm chức –NH- , -COOH, -CHO và -NH2 có mặt trên các hạt GQDs đã hấp phụ và khử ion Ag+ thành AgNPs bám xung quanh các hạt GQDs. Như vậy trong phản ứng này, GQDs vừa đóng vai trò là tác nhân khử đồng thời là chất ổn định cho các hạt nano bạc (AgNPs). Hình 3.1A cho thấy trên phổ UV-Vis của dung dịch AgNPs/GQDs (đường b) có pic hấp thụ mới với đỉnh pic ở 420 nm đặc trưng của nano bạc (AgNPs) so với phổ UV-Vis của GQDs (đường a). Chứng tỏ trong dung dịch AgNPs/GQDs đã hình thành các hạt AgNPs với nồng độ cao (cường độ pic mạnh). Hình 3.6 (A) Phổ UV-Vis của (a) GQDs, và (b) AgNPs/GQDs; (B) Phổ XRD của (a) GQDs và (b) AgNPs/GQDs. Phổ XRD của GQDs cho thấy dạng gần như vô định hình của GQDs (hình 3. 1B, đường a), với pic nhiễu xạ yếu tại 2θ = 270 đặc trưng cho pic nhiễu xạ (002) dạng lớp của graphen. Vị trí và cường độ pic nhiễu xạ này của GQDs thường phụ thuộc rất lớn vào sự hiện diện của các nhóm hydroxyl, epoxy/ ether, cacbonyl và carboxylic những tác nhân có xu hướng gia tăng khoảng cách giữa các tấm cacbon [5]. Đối với phổ nhiễu xạ XRD của mẫu AgNPs/GQDs (hình 3.1B, đường b) cho thấy các pic đặc trưng tại 2θ = 37.50, 43.10 và 64.80 trùng với pic nhiễu xạ của nano bạc (AgNPs) ((PCPDF card số 40783) [6] ứng với các chỉ số Miller là (111), (200) và (220). Không có pic lạ xuất hiện chứng tỏ AgNPs tạo thành trên nền GQDs là các tinh thể bạc đơn pha với các pic đặc trưng của Ag. Hơn nữa pic (002) của GQDs không quan sát thấy do pic này quá yếu so với các pic của AgNPs. Kết hợp với phổ UV-Vis chứng tỏ rằng phương pháp đề xuất đã thành công trong việc tổng hợp vật liệu lai tạo AgNPs/GQDs. 11
(C) (A) Hình 3.7 (A) Ảnh TEM của AgNPs/GQDs; (B) Màu của dung dịch GQDs và dung dịch AgNPs/CDQs; (C) Phân bố kích thước hạt phân tích theo phương pháp tán xạ laser (DLS) của mẫu AgNPs/GQDs) Hình 3.3B thể hiện màu sắc của dung dịch GQDs gần như trong suốt và AgNPs/GQDs có màu vàng đặc trưng của AgNPs. Còn ảnh TEM của AgNPs/GQDs (hình 3. 3A) cho thấy các hạt GQDs to lên do được bồi đắp bởi AgNPs xung quanh, kích thước trung bình cỡ 30 - 40 nm, các hạt AgNPs/GQDs nằm rời rạc, không bị kết đám là do vai trò của GQDs ngăn cản chúng kết tụ lại, điều này rất quan trọng trong việc ứng dụng và bảo quản dung dịch AgNPs/GQDs. Ngoài ra, phổ DLS (hình 3.3C) cho thấy các hạt AgNPs hình thành đã bám vào các hạt GQDs tạo ra một vùng phân bố duy nhất. (A) (B ) Hình 3.8 ( A) Phổ tán xạ năng lượng (EDX) của (a) GQDs và (b) AgNPs/GQDs; (B) Phổ FT-IR của a) GQDs và (b) AgNPs/CDQs Phổ EDX của GQDs cho thấy các nguyên tố C, O, N là ba thành phần chính của GQD (hình 3.4A, đường a). Trong khi đó, phổ EDX của AgNPs/GQDs (hình 3.4A, đường b) cho thấy ngoài các pic đặc trưng cho C, N, O nêu trên, chúng ta có thể quan sát thấy các đỉnh mới xuất hiện, tương ứng với Ag. Phổ EDX cung cấp bằng chứng cho việc hình thành kim loại bạc trên nền GQDs: giá trị mức năng lượng ứng với các 12
đỉnh ở 2,99 và 3,17 keV là do hình thành AgNP. Những kết quả này khẳng định rằng AgNPs đã được hình thành một cách có hiệu quả trên bề mặt GQDs. Hình 3.4B cho thấy phổ FT-IR của GQDs (đường a) và vật liệu lai tạo AgNPs/GQDs (đường b). Hình 1F (đường a) cho thấy các dải hấp thụ từ 3100 đến 3500 cm-1 thuộc các dao động υO-H và υN-H, điều quan trọng là tạo thuận lợi cho tính ưa nước và ổn định của GQD ở trong dung dịch nước. Các dải hấp thụ ở 1641 cm-1 được cho là υC = O, cho thấy rằng axit carboxylic có thể được sử dụng làm tâm liên kết với ion Ag+. Những kết quả trên chỉ ra rằng GQDs có nhiều amino (-NH2), cacboxyl (-COOH) và hydroxy (-OH) trên bề mặt và các cạnh của GQDs và chúng tạo ra khả năng ưa nước tuyệt vời của GQDs. So với phổ FT-IR của GQDs thì ở phổ của AgNPs/GQDs các dải hấp thụ của nhóm O-H ở 1064 cm-1. Kết quả này chỉ ra rằng Ag+ có thể đã được khử để tạo nên hạt AgNP bởi các nhóm O-H trên bề mặt của CQD và kết quả là các nhóm O-H được chuyển đổi thành các nhóm COOH sau phản ứng [7]. Các kết quả đã khẳng định việc chuẩn bị thành công các AgNP bằng các chấm lượng tử graphen (GQDs) làm chất khử và chất ổn định. 3.1.2 Ứng dụng vật liệu AgNPs/GQDs trong chế tạo cảm biến sinh học phát hiện glucose bằng phương pháp so màu 3.1.3.1 Cảm biến glucose trên cơ sở vật liệu AgNPs/GQDs Trên cơ sở cảm biến H2O2 với độ nhạy cao, độ chọn lọc tốt, chúng tôi thiết kế cảm biến phát hiện glucose trên cơ sở cơ chế như sau: GQDs Hình 3.16 Cơ chế hoạt động của cảm biến glucose trên cơ sở AgNPs/GQDs 13
Hình 3.12A cho thấy phổ UV-Vis của các mẫu chứa nồng độ glucose khác nhau, khi nồng độ glucose tăng từ 0.5 mM đến 8 mM, mật độ quang học của dung dịch AgNP/GQDs ở 425 nm (OD425) giảm từ 0.61 xuống 0.31. Đường chuẩn để phát hiện glucose được biểu diễn trong hình 3.4B cho thấy mối quan hệ A/A0(%) với nồng độ glucose trong mẫu được biễu diễn theo phương trình tuyến tính: A/A0(%) = (7.06087 ± 0.40925) .CGluucose (mM) (3.05473 ± 1.49321) với R2 = 0.97695. Giới hạn phát hiện (LOD) được ước tính là 30 M dựa trên ba lần độ lệch chuẩn của các phép thử của mẫu trắng. Hình 3.17 (A) Phổ UV-vis của cảm biến glucose với nồng độ glucose khác nhau (hình chèn: màu sắc của các dung dịch cảm biến tương tứng); (B) Đường chuẩn xác định nồng độ glucose trong dung dịch Dải tuyến tính của cảm biến từ 0,5 mM đến 8 mM và giá trị LOD (30 M) thấp hơn giá trị nồng độ glucose trong mẫu nước tiểu có dương tính đối với bệnh tiểu đường (2,8 - 5,6 mM). Do đó, bộ cảm biến glucose màu chuẩn phát triển có tiềm năng rất lớn để áp dụng vào kiểm tra glucose hàng ngày. Ngoài ra, các kết quả trên đã chỉ ra rằng vật liệu cấu trúc nano AgNP/GQD được tổng hợp không chỉ có hiệu quả xúc tác giống các peroxidase mà còn cho thấy những lợi thế lớn về chi phí chế tạo thấp và sự ổn định hơn so với với các enzym peroxidase. Hơn nữa, như Hình 3.13A, khi nồng độ glucose tăng từ 0,5 mM đến 8 mM, ở 357 nm có thể là do đỉnh điểm plasmon của GQD tự do trong dung dịch xuất hiện rõ ràng hơn. Kết quả trên khẳng định lại cơ chế đã đề xuất ở trên, và là điểm khác biệt so với các cảm biến trên cơ sở hạt nano Ag đã báo cáo trước đây [8, 9]. 14
3.1.3.2 Ứng dụng vật liệu AgNPs/GQDs trong chế tạo cảm biến xác định nồng độ glucose trong mẫu nước tiểu Hình 3.19 Phương pháp thêm chuẩn để xác định nồng độ glucose trong mẫu nước tiểu người: (A) Phổ UV-Vis của cảm biến với: (a) mẫu trắng (không có nước tiểu; (b) mẫu nước tiểu pha loãng (1:4); (c)-(e) mẫu nước tiểu pha loãng bổ sung 1mM, 2mM và 3mM glucose; (B) Đường chuẩn của phương pháp thêm chuẩn của cảm biến xác định nồng độ glucose trong mẫu nước tiểu Mẫu nước tiểu người trước hết đem pha loãng vì nước tiểu người có thể chứa nhiều muối hòa tan và các cặn thải. Trong báo cáo nghiên cứu trước đây của chúng tôi về các mẫu nước tiểu ở người [10], chúng tôi thấy rằng tỷ lệ pha loãng càng cao cho tín hiệu tốt hơn tỷ lệ pha loãng thấp. Tuy nhiên, do giới hạn về độ nhạy của cảm biến, tỷ lệ pha loãng tối ưu là 1: 4. Phương pháp bổ sung tiêu chuẩn (Method of Standard Addition) được sử dụng để phân tích nồng độ glucose trong mẫu nước tiểu của người sử dụng bộ cảm biến được đề xuất. Theo đó, ngoài mẫu nước tiểu pha loãng với tỷ lệ nêu trên thì dung dịch được bổ sung thêm glucose với các nồng độ khác nhau được dùng như mẫu glucose cho cảm biến đã đề cập ở trên. Hình 3.15A cho thấy phổ UV-Vis của cảm biến glucose khi không có mẫu nước tiểu (i) và có mẫu nước tiểu pha loãng (2i) đã có sự giảm đáng kể ở cường độ pic hấp thụ tại bước sóng 425 nm. Với 3 mẫu nước tiểu pha loãng có bổ sung glucose cho thấy cường độ pic hấp thụ tiếp tục giảm sâu hơn theo chiều tăng của nồng độ glucose thêm vào. Đường chuẩn để xác định nồng độ glucose sử dụng phương pháp bổ sung tiêu chuẩn với mẫu nước tiểu người được mô tả trong hình 3.15B. Từ những dữ liệu này, nồng độ glucose trong mẫu nước tiểu của người đã được xác định là 3,68 mM. Vì vậy, nó có thể kết luận rằng mẫu nước 15
tiểu ở người trên là của một bệnh nhân tiểu đường. Đối chiếu với kết quả phân tích glucose trong máu và tiểu sử sức khỏe của tình nguyện viên, cho thấy tình nguyện viên đang bị bệnh đái tháo đường, kết quả phân tích bằng cảm biến chế tạo cho đáp số trùng khớp. Kết quả thí nghiệm này cho thấy tiềm năng lớn của việc áp dụng cảm biến glucose đã được phát triển trong xác định glucose trong các dung dịch nước tiểu dựa trên nguyên lý so màu. Cách tiếp cận này có nhiều triển vọng hứa hẹn vì sẽ không cần dùng mẫu máu cũng như loại bỏ việc dùng kim chích máu là sự bất tiện đối với rất nhiều người. 3.2 Đặc trưng và ứng dụng vật liệu Fe3O4 bọc cacbon (Fe/C) trong chế tạo cảm biến sinh học so màu phát hiện glucose 3.2.1. Đặc trưng vật liệu Fe/C 100 95 90 85 80 T% 75 70 1% 65 3% 60 5% 55 10% 50 45 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wavenumber (cm-1) Hình 3.26 Phổ XRD của các mẫu vật liệu FeC (1-0), FeC (1-3), FeC (1-5), FeC (1-10); Phổ FT-IR của các mẫu vật liệu FeC (1-0), FeC (1-3), FeC (1-5), FeC (1-10). Các hạt cacbon bọc Fe3O4 (Fe/C) được chế tạo thành công bằng đồng kết tủa kết hợp với phương pháp than hóa glucose bằng thủy nhiệt thu được ở dạng bột mềm, mịn màu đen. Sản phẩm bột mịn màu đen Fe/C so với bột nano Fe3O4 không bọc cacbon thì bột Fe/C mềm và dễ nghiền hơn nhiều. Đặc biệt khi tăng hàm lượng glucose lên thì bột càng có màu nâu và càng mềm, mịn, dễ nghiền. Các mẫu vật liệu tổng hợp được Fe/C với tỉ lệ khối lượng Fe3O4:C =1:0; 1:2, 1:3, 1:5, 1:7, 1:10 được dùng để nghiên cứu cấu trúc và khả năng cảm biến với hydrogen peroxid và glucose. Phổ XRD của hạt nano Fe3O4 (hình 3.16) cho thấy 6 đỉnh nhiễu xạ đặc trưng ở 30.1°, 35.4°, 43.1°, 53.4°, 57.0° và 62.5° tương ứng với các đỉnh (220), (311), (400), (422), (511) và (440) của Fe3O4, từ đó khẳng định sự hình thành của pha tinh thể nano spinel từ 16
của Fe3O4. Hình 3.22 cho thấy phổ XRD của mẫu FeC (1-1), FeC (1-3), vẫn xuất hiện 6 pic nhiễu xạ đặc trưng của nano Fe3O4, tuy nhiên phổ XRD của mẫu FeC (1-10) có thể thấy thiếu pic 53,4 ͦ là do bị che khuất bởi lớp vỏ cacbon vô định hình nhưng vẫn xuất hiện các pic đặc trưng khác của Fe3O4 nhưng với cường độ thấp hơn và độ sắc nét kém dần theo tỷ lệ của Fe3O4:C tăng dần. Điều đó chứng tỏ trong vật liệu cacbon bọc Fe3O4, tinh thể Fe3O4 vẫn giữ nguyên cấu trúc, còn cacbon hình thành ở dạng vô định hình. Ta nhận định được mẫu FeC (1-1), FeC (1- 3), vẫn giữ được đặc tính của Fe3O4, còn mẫu FeC (1-10) thì không. Phổ FT-IR của mẫu Fe3O4 và mẫu Fe3O4/C thể hiện trên hình 3.22. Các pic ở 443, 445, 447 cm-1 và 590, 592 cm-1 thể hiện sự có mặt của liên kết Fe- O và vai yếu ở 445, 447 và 443 cm-1. Các đỉnh ở 3406 cm-1 hoặc 3365 cm-1 đặc trưng cho liên kết O-H của nước hấp phụ. Đáng chú ý là trong mẫu Fe3O4, có 1 đỉnh ở 1622 cm-1 CO2 trong không khí hấp phụ lên mẫu; còn đối với mẫu Fe3O4/C (1:2) thì chuyển thành 1 đám phổ với số sóng từ 1697 đến 1620 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=O trên lớp vỏ cacbon hình thành, đó có thể là nhóm chức axit hoặc nhóm cacbonyl của gốc aldehide, xeton; các mẫu Fe3O4/C các đỉnh ở 1118-1000 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-OH trên vỏ cacbon hình thành [11-13]. So sánh 2 phổ FTIR của các mẫu, kết hợp với phân tích ảnh TEM, phổ XRD có thể khẳng định chế tạo thành công vật 3.2.2 Ứng dụng vật liệu Fe/C trong chế tạo cảm biến sinh học phát hiện glucose 3.2.3.1 Cảm biến sinh học glucose trên cơ sở vật liệu Fe/C 0.6 1.5 0.01mM 0.5 Absorbance (AU) 0.05mM 0.075mM 1.2 0.1mM 0.4mM Absorbance (AU) 0.5mM 0.4 0.6mM 0.75mM 0.9 1mM 1.5mM 2mM 0.3 Equation y = a + b*x Weight No Weighting 0.6 Residual 0.00311 Sum of 0.2 Squares Adj. R-Square 0.96521 Value Standard Erro Intercept 0.11378 0.01348 B 0.3 0.1 Slope 0.43995 0.03399 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 0.0 500 600 700 800 [Glucose] (mM) Wavelength (nm) Hình 3.40 Độ hấp thụ A652 của các mẫu tương ứng trong thí nghiệm control; Phổ UV-vis đường chuẩn Glucose; Đường chuẩn glucose 17
Với việc cố định các điều kiện tối ưu, độ hấp thụ quang (A652) chỉ phục thuộc vào nồng độ của cơ chất, trong trường hợp này là glucose. Qua thí nghiệm ta nhận thấy nồng độ glucose và độ hấp thụ quang tỷ lệ thuận với nhau và tuân theo quy luật tuyến tính. Phương pháp đường chuẩn được chọn để xây dựng phương pháp định lượng glucose. Hình 3.33 cho thấy quan hệ giữa nồng độ glucose trong mẫu và độ hấp thụ quang A652 của cảm biến là tuyến tính tuân khi nồng độ glucose từ 0.01mM đến 0.9 mM với phương trình tuyến tính là: A652= 0.11378 +0.43995.Cglucose với R2=0.96521. Với nồng độ glucose lớn hơn nồng độ khoảng tuyến tính, phương pháp định lượng của cảm biến sẽ đạt đến giá trị bão hòa nên gây sai số lớn. 3.3 Tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng vật liệu FN-GQDs trong chế tạo cảm biến sinh học phát hiện glucose bằng phương pháp so màu 3.3.1 Tổng hợp, đặc trưng của vật liệu FN-GQDs Vật liệu FN-GQDs sau khi tổng hợp thu được ở dạng bột mịn. Do đây là một loại vật liệu mới nên chúng tôi đã sử dụng nhiều phép phân tích hóa lý để khảo sát các đặc trưng của chúng, kết quả thể hiện trên hình 3.37. (A) (B) (C) 18