Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn địa lan (Cymbidium) khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:24

Thêm vào BST

Báo xấu

9
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về quan hệ di truyền của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm địa phương, đây là tài liệu tham khảo tốt cho công tác nghiên cứu, bảo tồn và phát triển nguồn gen lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn địa lan (Cymbidium) khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống

1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm với thảm thực vật phong phú, nơi đây tập trung nhiều loài lan rừng đẹp nhất thế giới, chúng phân bố chủ yếu ở khu vực miền núi phía Bắc, miền Trung và Tây Nguyên. Các loài địa lan bản địa nước ta rất đa dạng, nhiều loài hiếm và có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên do sự khai thác ồ ạt, nạn phá rừng khiến các loài địa lan Việt Nam đặc biệt là chi lan kiếm (Cymbidium) vùng núi Đông Bắc bị đe dọa tiêu diệt. Hiện nay, các nghiên cứu về lan kiếm hầu hết chỉ tập trung vào việc đánh giá, nhân giống một số loài lan nhập nội hoặc một số loài có giá trị kinh tế. Các nghiên cứu một cách có hệ thống về đặc điểm nông sinh học và mức độ đa dạng di truyền chi lan kiếm ở Việt Nam chưa nhiều, đặc biệt là các loài lan bản địa vùng Đông Bắc chưa được quan tâm đúng mức, vấn đề nghiên cứu lai tạo giống với mục tiêu tạo giống hoa lan kiếm mới mang bản quyền Việt Nam còn đang bỏ ngỏ. Chúng ta chưa khai thác được vốn gen quý mà thiên nhiên ban tặng trong khi đó nguồn gen đang có nguy cơ dần biến mất. Để giải quyết các vấn đề đặt ra, chúng tôi đã thực hiện luận án: “Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn địa lan (Cymbidium) khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống”. 2. Mục tiêu của u Mục tiêu của luận án nhằm đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái kết hợp với chỉ thị phân tử để xác định mối quan hệ di truyền của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm địa phương thu thập tại các tỉnh miền núi Đông Bắc Việt Nam phục vụ cho công tác phân loại, bảo tồn và chọn tạo giống. Nhân giống và lai tạo một số nguồn gen chi lan kiếm địa phương vùng Đông Bắc Việt Nam. 3. Ý ghĩa khoa học và thực tiễn của lu n án 3.1. Ý ghĩa khoa học Kết quả của luận án cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về quan hệ di truyền của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm địa phương, đây là tài liệu tham khảo tốt cho công tác nghiên cứu, bảo tồn và phát triển nguồn gen lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam. Cung cấp thông tin về khả năng đậu quả của một số tổ hợp lai trong chi lan kiếm vùng Đông Bắc Việt Nam, xác định một số marker nhận dạng con lai F1 ở giai đoạn sớm.
2 3.2. Ý ghĩa thực tiễ Đánh giá khả năng lai tạo một số nguồn gen lan kiếm địa phương vùng Đông Bắc và tạo quần thể lai F1 qua đó cung cấp vật liệu khởi đầu phục vụ công tác chọn tạo giống mới. Nhân giống 02 nguồn gen lan kiếm quý, có giá trị kinh tế bằng phương pháp nuôi cấy in vitro góp phần bảo tồn những nguồn gen quý trước nguy cơ tuyệt chủng. 4. Nhữ g đó g góp mới của lu n án - Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu về đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái kết hợp với chỉ thị phân tử, nhận dạng các mẫu giống lan kiếm của khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam dựa vào trình tự vùng gen rbcL qua đó tạo lập được bộ dữ liệu về đa dạng di truyền của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm địa phương thu thập tại vùng núi Đông Bắc Việt Nam, phục vụ cho công tác bảo tồn và khai thác sử dụng nguồn gen lan kiếm. - Nhân giống in vitro 02 nguồn gen lan kiếm Bạch ngọc đuôi công từ hạt và lan kiếm Bạch ngọc từ vật liệu khởi đầu là rễ. - Lai tạo thành công một số nguồn gen lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc, qua đó cung cấp nguồn vật liệu khởi đầu (quần thể cây lai F1) phục vụ công tác chọn tạo giống. CHƯƠNG 1. T NG QU N T I I U V CƠ SỞ HO HỌC C ĐỀ T I Luận án đã tham khảo và tóm lược các tài liệu Tiếng Việt và Tiếng nh, với 3 nội dung liên quan bao gồm: Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam trong đó tóm lược các tài liệu về các nghiên cứu đa dạng di truyền và các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền tại Việt Nam và trên thế giới; Tình hình nghiên cứu nhân giống và lai tạo cây lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam đặc biệt là tình hình nghiên cứu nhân giống và lai tạo cây lan kiếm tại vùng Đông Bắc Việt Nam. Từ đó đưa ra kết luận thông qua phân tích tổng quan như sau: - Hiện nay, nhu cầu trong nước về hoa lan trồng trong chậu là rất lớn và ngành hoa lan trong nước chưa đáp ứng được chính nhu cầu của khách hàng nội địa, hàng năm chênh lệch cán cân xuất - nhập khẩu rất lớn, giá trị nhập khẩu thường gấp 3 lần giá trị xuất khẩu. - Công tác nghiên cứu giống, lai tạo các loài đặc hữu, có bản quyền còn chậm. Chúng ta chưa biết khai thác có hiệu quả các loài lan đặc hữu, những nguồn gen quý mà thiên nhiên ban tặng, báo động hơn
3 nữa là những nguồn gen quý này đang ngày càng bị khai thác bất hợp pháp và dần biến mất khỏi tự nhiên, nơi cư trú của chúng ngày càng bị thu hẹp. Do đó, việc nghiên cứu đa dạng di truyền, nhân giống các nguồn gen quý, có giá trị kinh tế phục vụ công tác bảo tồn và lai tạo một số nguồn gen lan kiếm (Cymbidium) khu vực miền núi Đông Bắc là cần thiết nhằm khai thác có hiệu quả, đáp ứng nhu cầu hoa cảnh trong và ngoài nước. CHƯƠNG 2. V T I U V PHƯƠNG PH P NGHI N C U 2.1. V t i u ghi c u - Nguồn vật liệu sử dụng trong nghiên cứu gồm 24 mẫu giống hoa lan thuộc chi lan kiếm (Cymbidium) được thu thập tại các tỉnh miền núi Đông Bắc Việt Nam và được lưu giữ tại vườn lan thuộc Khoa Công Nghệ Sinh Học & Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. - Quả lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (thu được từ cây tự thụ phấn bằng tay sau 9 tháng thụ phấn) sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho thí nghiệm nhân giống lan kiếm Bạch ngọc đuôi công bằng phương pháp in vitro. - Quả lai lan kiếm được tạo ra từ quá trình thụ phấn nhân tạo của các cặp lai ♀ DL21 (Kiếm vàng) x ♂ DL15 (Kiếm trắng); ♀DL19 (Kiếm lô hội) x ♂DL21 (Kiếm vàng), ♀DL17 (Mạc xuân) x ♂DL19 (Kiếm lô hội) dùng làm nguồn vật liệu nhân giống in vitro tạo các dòng con lai phục vụ các thí nghiệm xác định mối quan hệ huyết thống với bố, mẹ, đồng thời là các vật liệu phục vụ công tác chọn tạo giống. - Mẫu rễ lan kiếm Bạch ngọc được tách từ các cây đang cho hoa, có chiều dài từ 2 - 3 cm, sạch nấm bệnh sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho các thí nghiệm nhân giống lan kiếm Bạch ngọc bằng phương pháp in vitro. - Các hóa chất đa, vi lượng, vitamin của nền môi trường MS (1962), các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin, than hoạt tính, các hóa chất khử trùng trong nuôi cấy mô. - Mẫu tái sinh từ vật liệu nhân giống ban đầu phục vụ nghiên cứu nhân nhanh và tạo cây in vitro hoàn chỉnh. - Một số hóa chất thông dụng dùng trong sinh học phân tử của các hãng Sigma, Merck,...CTAB, Tris base, Boric acid, NaCl, dNTPs, EDTA, 6X orange loading dye solution, Taq Polymerase, Ethanol, 2- propanol, Acetic acid glacial, Phenol, Chloroform, Isoamyl Alcohol, garose…
4 2.2. Nội dung nghiên c u Nội dung 1: Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng chỉ thị hình thái Nội dung 2: Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng chỉ thị phân tử Nội dung 3: Nghiên cứu nhân giống một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng phương pháp nhân giống in vitro Nội dung 4: Nghiên cứu lai, tạo vật liệu khởi đầu từ một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc 2.3. Ph g ph p ghi c u 2.3.1. Phương đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái a) Phương pháp bố trí trồng lưu giữ các mẫu giống lan kiếm đã thu thập trong vườn tập đoàn. b) Phương pháp mô tả đánh giá 20 đặc điểm sinh học theo UPOV [5] c) Tư liệu hóa và chạy phần mềm cho phân tích đa dạng di truyền bằng 20 chỉ thị hình thái. 2.3.2. Kỹ thuật sinh học phân tử a) Phương pháp tách chiết DN tổng số: phương pháp sử dụng CT B của Doyle có một số cải tiến nhỏ để tiến hành tách chiết DN từ các mẫu nghiên cứu [49]. b) Phương pháp đo nồng độ DN c) Chạy phản ứng PCR d) Phương pháp điện di trên gel agarose 1% e) Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen f) Phương pháp giải trình tự 2.3.3. Phương pháp lai tạo giống nguồn gen lan kiếm 2.3.3.1. Phương pháp chọn cây bố, mẹ Tiến hành chọn lọc cây bố, mẹ theo phương pháp của De và cộng sự (2019) 2.3.3.2. Phương pháp lai tạo Phương pháp lai tạo lan kiếm theo mô tả của Dongarwar và Thakur [48]. 2.3.4. Phương pháp nhân giống in vitro Nhân giống in vitro được thực hiện theo phương pháp vi nhân giống hoa lan của rditti kết hợp tham khảo nghiên cứu của Hemanta [56]. 2.3.5. Phần mềm xử lý số liệu - Phần mềm MEG v6.06; P UP Version 4.0 để xây dựng sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống lan kiếm thu thập tại khu vực miền núi Đông Bắc việt Nam.
5 - Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kê toán học bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2010 và phần mềm Sirichai Statistics Version 6.00. 2.4. Thời gia và địa điểm ghi c u - Địa điểm nghiên cứu: Khoa Công Nghệ Sinh Học & Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. - Nội dung đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử thời gian từ 2/2018 đến tháng 2/2019. - Nội dung nghiên cứu nhân giống một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng phương pháp nhân giống in vitro thời gian từ 8/2018 đến tháng 10/2020. - Nội dung nghiên cứu lai, tạo vật liệu khởi đầu từ một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc thời gian từ 10/2018 đến 4/2022. CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LU N 3.1. Đ h gi đa dạng di truyền t p đoà 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miề úi Đô g Bắc bằng chỉ thị hình thái Dựa vào 20 tính trạng quan trọng theo mô tả trong quy phạm khảo nghiệm DUS cho lan kiếm của UPOV để xây dựng sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của 24 mẫu giống. Hình 3.2 là kết quả sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống lan kiếm vùng núi Đông Bắc chạy trên phần mềm P UP với bootstrap 300. Hì h 3.2. S đồ hì h cây về mối qua h di truyề của 24 mẫu giố g a kiếm dựa tr chỉ thị hình thái
6 Kết quả hình 3.2 cho thấy: Nhóm I gồm 18 mẫu giống chia thành 5 nhóm phụ: Nhóm phụ Ia gồm 2 mẫu giống lan kiếm là DL1 (Bạch ngọc) và DL3 (Bạch ngọc đuôi công) với giá trị ủng hộ đạt 100%. Nhóm phụ Ib là mẫu giống DL2 (Trần Mộng Xuân) Nhóm phụ Ic gồm 10 mẫu giống DL4, DL5, DL6, DL7, DL22, DL23, DL14, DL13, DL17, DL20 Nhóm phụ Id chỉ gồm 1 mẫu giống DL8 (Thanh Ngọc) Nhóm phụ Ie gồm 4 mẫu giống DL10 (Kiếm Đỏ Cao Bằng), DL12 (Kiếm Đỏ Hà Giang), DL16 (Kiếm Đen Đỏ), DL18 (Kiếm Đỏ Quảng Ninh). Các mẫu giống trên có giá trị ủng hộ từ 53% đến 61%. Nhóm 2: mẫu giống DL15 (Kiếm trắng) Nhóm 3: mẫu giống DL21 (Kiếm vàng) Nhóm 4: mẫu giống DL24 (Kiếm trắng Thái Nguyên) Nhóm 5: gồm 2 mẫu giống DL9 (Kiếm Tiên Vũ) và DL19 (Kiếm lô hội) có giá trị ủng hộ đạt 80%. Nhóm 6: mẫu giống DL11 (Đoản Kiếm 2 Màu) Về mặt hình thái, quan sát các mẫu giống lan kiếm cho thấy rất nhiều mẫu giống có hình thái rễ, thân, lá tương đồng nhau. Sự khác biệt giữa các mẫu giống này chỉ có thể phân biệt được vào thời kỳ hoa nở như mẫu giống DL24 (Kiếm trắng Thái Nguyên) và DL15 (Kiếm trắng Tuyên Quang), tuy nhiên khi chạy số liệu cây đa dạng di truyền dựa trên hình thái lại cho kết quả DL15 và DL21 ở 2 nhóm khác nhau. Mặt khác, hai mẫu giống DL6 (Tiểu Kiếm Hoa Xanh) vầ DL7 (Kiếm Lá Giáo) hoàn toàn khác biệt về đặc điểm hình thái rễ, thân, lá nhưng trong sơ đồ chúng cùng thuộc phân nhóm Ic với giá trị ủng hộ 82%. Như vậy, nếu chỉ dựa trên đặc điểm hình thái để đánh giá mức độ đa dạng sẽ cho kết quả chưa thật sự hợp lý do đó chúng tôi tiến hành đánh giá đa dạng di truyền chi lan kiếm bằng chỉ thị phân tử để bổ sung thêm độ chính xác về đa dạng di truyền cho tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam. 3.2. Đ h gi đa dạ g di truyề t p đoà 24 mẫu giố g a kiếm khu vực miề úi Đô g Bắc bằ g chỉ thị phâ tử DN của 24 mẫu giống lan kiếm sau tách chiết đều cho nồng độ và độ tinh sạch cao các băng gọn sắc nét đảm bảo cho các bước thí nghiệm tiếp theo. Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi rbcL - F/rbcL - R, kết quả thu được 24 mẫu giống lan kiếm đều cho băng đơn hình với kích thước 650 bp (Hình 3.3).
7 Hì h 3.3. ết quả PCR 24 mẫu giố g a kiếm ghi c u với cặp mồi rbc - F/rbcL - R; M: Marker 100bp ladder 3.2.1. ết quả PCR c c mẫu giố g a kiếm ghi c u Sản phẩm PCR với cặp mồi rbcL - F/rbcL - R sau khi tinh sạch được phân tích trực tiếp trên máy giải trình tự của công ty pical Scientific (Malaysia) và phần mềm MEG v6.06. Trình tự từ 24 mẫu giống lan kiếm được so sánh với trình tự tham chiếu đã được công bố trên NCBI. Sơ đồ đa dạng di truyền bằng chỉ phân tử được thể hiện ở hình 3.4 Hì h 3.4. S đồ hì h cây của 24 mẫu giố g a kiếm và c c mẫu giố g tham chiếu Từ các trình tự nucleotide vùng lục lạp của 24 mẫu giống lan kiếm, tiến hành xây dựng cây quan hệ phát sinh bằng phần mềm Mega
8 6.0 theo phương pháp Maximum likelihood, kết quả thể hiện ở hình 3.4. Dựa vào sơ đồ hình 3,4 có thể chia thành các nhóm sau: *) Nhóm th hất: gồm 11 mẫu giống lan kiếm và 6 mẫu giống tham chiếu được chia thành 4 phân nhóm phụ. - Phân nhóm phụ 1.1 gồm 6 mẫu giống lan kiếm là DL15, DL21, DL9, DL11, DL24, DL19 và 3 mẫu giống tham chiếu MF861098.1 Cymbidium aloifolium, MF861080.1 Cymbidium mannii, MG019923.1 Cymbidium aloifolium là 99,8%. - Phân nhóm phụ 1.2 gồm duy nhất mẫu giống DL16 - Kiếm Đen Đỏ tương đồng 99.7% về trình tự nucleotide với mẫu giống tham chiếu MG980602.1_Cymbidium_densiflorum. - Phân nhóm phụ 1.3 gồm 2 mẫu giống DL4 - Kiếm Tương Tư Lào Cai và DL14 - Kiếm Tương Tư Cao Bằng. Hai mẫu giống này có mức tương đồng về trình tự nucleotide với mẫu giống tham chiếu MK439784.1_Cymbidium_cyperifolium là 99,7%. - Phân nhóm phụ 1.4 gồm 2 mẫu giống DL12 - Kiếm Đỏ Hà Giang và DL18 - Kiếm Đỏ Quảng Ninh có mức tương đồng về trình tự nucleotide với nhau là 99.6%. Hai mẫu giống này có mức tương đồng về trình tự nucleotide với mẫu giống tham chiếu MK848043.1_Cymbidium_floribundum – đoản kiếm là 99,7%. *) Nhóm th hai: gồm duy nhất mẫu giống DL7 - Kiếm Lá Giáo tương đồng 99.7% về trình tự nucleotide với mẫu giống tham chiếu MF861096.1_Cymbidium_lancifolium- kiếm lá giáo *) Nhóm th 3: gồm 5 mẫu giống DL8, DL13, DL10, DL17, DL5 và mẫu tham chiếu KT722983.1_Cymbidium_ensifolium – Thanh Ngọc. *) Nhóm th 4: gồm duy nhất mẫu giống DL6 - Tiểu Kiếm Hoa Xanh, mẫu này không tìm được sự tương đồng cao về trình tự nucleotide với 12 mẫu giống tham chiếu *) Nhóm th 5: gồm 6 mẫu giống là DL2, DL1, DL20, DL22, DL23, DL3 và 4 mẫu tham chiếu. Sáu mẫu giống này có mức tương đồng về trình tự nucleotide dao động từ 98,9% (giữa mẫu giống DL3 và DL22) đến 99,9% (giữa mẫu giống DL22 và DL23). Đề xuất c c h ớ g ghi c u, sử dụ g guồ ge a kiếm hi có Từ các kết quả đánh giá đa dạng di truyền kết hợp đặc điểm hình thái hoa của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu, chúng tôi đề xuất hướng khai thác, sử dụng nguồn gen lan kiếm hiện có như sau: - Lai tạo một số tổ hợp lai gồm ♀ DL21 và ♂ DL15; ♀ DL19 và ♂ DL21 vì các mẫu giống này có hệ số tương đồng di duyền cao, bên
9 cạnh đó mặt hoa của chúng hoàn toàn khác biệt nhau, lai xa một số loài lan kiếm để đánh giá khả năng lai tạo giữa chúng gồm: ♀ DL17 và ♂ DL2, ♀ DL2 và ♂ DL17, ♀ DL7 và ♂ DL17, ♀ DL17 và ♂ DL7, ♀ DL17 và ♂ DL19, ♀ DL2 và ♂ DL3, ♀ DL3 và ♂ DL2. - Quá trình điều tra, thu thập mẫu giống lan kiếm tại vùng núi Đông Bắc chúng tôi thấy loài Kiếm Bạch ngọc (Cymbidium mastersii), Bạch ngọc đuôi công (Cymbidium wenshanense) là những loài có giá trị kinh tế cao tuy nhiên chúng đang bị đe dọa tuyệt chủng do quá trình khai thác cạn kiệt của người dân địa phương. Do đó, chúng tôi nhân giống 2 nguồn gen lan kiếm Bạch ngọc; Bạch ngọc đuôi công để phục vụ bảo tồn, khai thác và phát triển bền vững những các nguồn gen quý này. 3.3. Nghi c u hâ giố g một số mẫu giố g a kiếm khu vực miề úi Đô g Bắc bằ g ph g ph p hâ giố g in vitro 3.3.1. ết quả hâ giố g i vitro oài a kiếm Bạch gọc đuôi cô g (Cymbidium wenshanense) ết quả ghi c u ả h h ở g của môi tr ờ g uôi cấy đế khả ă g ảy mầm của hạt a kiếm Bạch gọc đuôi cô g Môi trường MS cho hiệu quả nhất trong 4 môi trường được thử nghiệm, protocorms hình thành sớm với tỷ lệ hạt nảy mầm cao đạt 90,54%. Hoa lan kiếm Bạch Quả lan kiếm Bạch Hạt được gieo ngọc đuôi công, để ngọc đuôi công khi trên môi trường thụ phấn vào mẫu nuôi cấy MS Protocorms sơ cấp Protocorms thứ cấp Hì h 3.12. Hạt a kiếm Bạch gọc đuôi cô g ảy mầm và ph t triể tr môi tr ờ g MS
10 ết quả ghi c u ả h h ở g cytoki i ( i eti ; TDZ, B ) đế khả ă g hâ ha h chồi a kiếm Bạch gọc đuôi cô g Kết quả thí nghiệm cho thấy, trong 3 loại cytokinin nghiên cứu, cytokinin BA cho số lượng chồi ở các công thức thí nghiệm đạt từ 2,49 đến 4,42 chồi, cao hơn so với đối chứng (chỉ đạt 1,66 chồi), trong đó công thức bổ sung 1 mg B phát sinh số lượng chồi tốt nhất (4,42 chồi) với chiều dài chồi cao nhất ( đạt 3,63 cm). Kết quả này có sự tương đồng với nghiên cứu của tác giả Paek và cộng sự (1991) khi nghiên cứu ảnh hưởng của cytokinin đối với khả năng tái sinh chồi in vitro loài lan kiếm Cymbidium forrestii, Paek đã khuyến cáo sử dụng B có hiệu quả rõ rệt nâng cao khả năng tái sinh của chồi [101]. Như vậy, trong 3 loại cytokinin, B có hiệu quả cao đối với thích thích tái sinh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công. Xử lý B 1 mg/l cho hiệu quả đạt 4,42 chồi/mẫu, chiều dài chồi đạt 3,63 cm, khối lượng tươi đạt 272,67 mg. ết quả ghi c u ả h h ở g của đ ờ g sucrose đế khả ă g t i si h chồi a kiếm Bạch gọc đuôi cô g Kết quả cho thấy, hai công thức bổ sung đường (3% và 5%) cho số lượng chồi cao nhất lần lượt là 4,42 và 4,47 chồi. Chồi tái sinh trên môi Chồi tái sinh trên môi Chồi tái sinh trên môi trường MS + 1,0 mg trường MS + 1,0 mg trường MS + 1,0 mg BA/l + 0% Sucrose BA/l + 3% Sucrose BA/l + 5% Sucrose Chồi tái sinh trên môi Chồi tái sinh trên môi trường MS + 1,0 mg BA/l trường MS + 1,0 mg BA/l + 7% Sucrose + 10% Sucrose Hình 3.14. Ả h h ở g của đ ờ g sucrose đế khả ă g hâ ha h chồi a kiếm Bạch gọc đuôi cô g (sau 8 tuầ )
11 Chỉ tiêu chiều dài chồi, hai công thức đạt giá trị chiều dài chồi cao nhất là công thức bổ sung 3% đường (3,63 cm) và công thức bổ sung 5% đường (3,60 cm). Khối lượng tươi của chồi đạt từ 234,76 mg đến 315,0 mg, trong đó hai công thức bổ sung 3% và 5% đường cho khối lượng mẫu tươi cao nhất lần lượt đạt giá trị là 272,67 mg và 315 mg. Theo tác giả Chung và cộng sự (1985), khi nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cây ở loài lan kiếm Cymbidium kanran đã chỉ ra rằng: nồng độ đường sucrose phù hợp giúp tăng quá trình tái sinh chồi, tăng sinh khối của mẫu nuôi cấy, cụ thể: nồng độ sucrose tối ưu đối cho lan kiếm Cymbidium ensifolium là 4% và và cho loài lan kiếm Cymbidium kanran là 6%, đây là các nồng độ thúc đẩy tái sinh chồi và tăng trọng lượng tươi của chồi đạt giá trị tối đa [38]. Kết quả của nhóm nghiên cứu cũng cho thấy khả năng tái sinh chồi đạt tối đa ở nồng độ đường 3% đến 5%, và đạt khối lượng tươi lớn nhất ở nồng độ đường 5%. ết quả ghi c u ả h h ở g của auxi (IB , N , I ) đế khả ă g t i si h rễ a kiếm Bạch gọc đuôi cô g Kết quả nghiên cứu cho thấy: N có tác dụng kích thích quá trình tái sinh rễ Bạch ngọc đuôi công tốt nhất trong 3 loại auxin khảo sát, N giúp tăng số lượng rễ; chiều dài và trọng lượng tươi của mẫu tốt nhất. Trong 5 công thức bổ sung N , công thức tối ưu để tái sinh rễ là bổ sung 2,0 mg N /L cho số lượng rễ/mẫu cấy đạt 3,21rễ; chiều dài rễ đạt 3,07cm với trọng lượng tươi của mẫu đạt 294,0 mg. Nghiên cứu của Ueda và Torikata (1968) trên cây lan kiếm Cymbidium Goeringii cũng cho kết luận tương tự về vai trò của N trong cảm ứng kéo dài và hình thành rễ từ các mô rễ sạch bệnh. Ueda và Torikata đã tiến hành giải phẫu các mẫu thân rễ thu được sau khi xử lý N và kết luận vai trò của auxin ngoại sinh này trong môi trường nuôi cấy sẽ kích thích mô phân sinh rễ hình thành một vùng tế bào chất nhỏ trong tế bào, còn các dẫn xuất từ mô phân sinh đỉnh biệt hoá nhanh chóng thành nhu mô không bào để làm chậm lại sự hình thành lá [124]. Tuy nhiên, nếu bổ sung auxin N với nồng độ quá cao (≥3,0 mg/L) sẽ ức chế sự tái sinh rễ, điều này được nhóm nghiên cứu của lvarenga và cộng sự (2015) giải thích là do sự tái sinh rễ in vitro phụ thuộc vào hàm lượng auxin nội sinh và ngoại sinh. Khi nồng độ auxin ngoại sinh cao có thể ức chế quá trình tái sinh rễ thông qua đó giảm hệ số mẫu phát sinh rễ mới.
12 Root regeneration on MS Tái sinh rễ trên môi medium without auxin trường MS +1,0 mg IBA /l supplementation Tái sinh rễ trên môi trường Tái sinh rễ trên môi MS +2,0 mg NAA /l trường MS +2,0 mg IAA /l Hình 3.15. Ả h h ở g của auxi (IB , N , I ) đế khả ă g t i si h rễ a kiếm Bạch gọc đuôi cô g (sau 8 tuầ ) ết quả ghi c u ả h h ở g của N kết h p với tha hoạt t h đế khả ă g t i si h rễ của chồi a kiếm Bạch gọc đuôi cô g Kết quả nghiên cứu cho thấy, công thức môi trường bổ sung 2,0 mg NAA/L + 1,0 g/L than hoạt tính cho số rễ/mẫu cao nhất đạt 4,59 rễ với chiều dài rễ đạt 3,60 cm và trọng lượng tươi của mẫu đạt 362,33 mg. Việc tăng dần hàm lượng than hoạt tính từ 3,0 - 5,0 g/L thì các chỉ tiêu số rễ/mẫu; chiều dài rễ và trọng lượng tươi của mẫu có xu hướng giảm dần. Kết quả này tương tự với báo cáo của Paek và Yeung (1991), nghiên cứu của hai tác giả cũng khuyến cáo sử dụng than hoạt tính với hàm lượng 1,0 g/L có hiệu quả rõ rệt nâng cao khả năng tái sinh rễ của Cymbidium forrestii [101], khi có than hoạt tính, đầu của rễ có xu hướng phát triển và cắm sâu vào môi trường với số rễ/mẫu cấy đạt 10,3 rễ; trọng lượng tươi của mẫu đạt 1912,5 mg [101]. Như vậy, môi trường MS +2,0 mg N /L + 1,0 g/L than hoạt tính là công thức thích hợp nhất để điều khiển ra rễ tạo cây hoàn chỉnh.
13 Tái sinh rễ trên môi Tái sinh rễ trên môi Tái sinh rễ trên môi trường MS +2,0 mg trường MS +2,0 mg trường MS +2,0 mg NAA /l + 0,0 g THT/l NAA /l + 0,5 g THT/l NAA /l + 1,0 g THT/l Cây con hoàn chỉnh Tái sinh rễ trên môi Tái sinh rễ trên môi trên môi trường MS trường MS +2,0 mg trường MS +2,0 mg +2,0 mg NAA /l + 7,0 g NAA /l + 3,0 g THT/l NAA /l + 5,0 g THT/l THT/l Hình 3.16. Ả h h ở g của N kết h p với tha hoạt t h đế khả ă g t i si h rễ của chồi a kiếm Bạch gọc đuôi cô g (sau 8 tuầ ) 3.3.2. ết quả hâ giố g in vitro oài địa a Bạch gọc (Cymbidium mastersii) Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên chúng tôi đã nhân giống thành công loài lan kiếm Bạch ngọc (Cymbidium mastersii) bản địa từ vật liệu khởi đầu là mẫu chóp rễ (thu từ cây trưởng thành đang ra hoa). Thông qua quá trình nhân nhanh rễ từ các mẫu rễ vô trùng, chúng tôi tiến hành tái sinh chồi tạo cây hoàn chỉnh. ết quả ghi c u ả h h ở g của 3 oại auxi (IB , N , I ) đế khả ă g t i si h rễ của cây a kiếm Bạch gọc Kết quả thí nghiệm trên 3 loại auxin (IB , N , I ) cho thấy, N hiệu quả hơn IB và I : công thức bổ sung 2 mg N phát sinh số lượng rễ tốt nhất (5,69 rễ), chiều dài rễ đạt 3,50 cm; trọng lượng tươi của mẫu nuôi cấy đạt giá trị cao nhất ở công thức bổ sung N 2 mg/L (463,33 mg). Lượng rễ thu được từ xử lý N cao hơn hẳn với khi xử lý IAA và IBA. Kết quả này có sự tương đồng với nghiên cứu của Paek và cộng sự (1991) trên thân rễ lan kiếm Cymbidium forrestii, Paek cho rằng
14 quá trình tái sinh, nhân nhanh rễ từ các mô rễ sạch bệnh khi bổ sung 2,0 mg/L N làm cho tế bào mở rộng và tăng tốc phát triển mô phân sinh nách.Từ kết quả thí nghiệm cho thấy, môi trường nuôi cấy bổ sung 2,0 mg N /L có tác dụng tăng số lượng rễ/mẫu cấy, tăng chiều dài rễ và tăng trọng tươi của mẫu. ết quả ghi c u ả h h ở g của N kết h p THT đế khả ă g hâ ha h rễ a kiếm Bạch gọc tro g điều ki in vitro Kết quả cho thấy, Môi trường MS +2,0 mg N /l bổ sung than hoạt tính hàm lượng 1,0 g/L cho số rễ/mẫu cao nhất đạt 7,22 rễ với chiều dài rễ đạt 3,83 cm và trọng lượng tươi của mẫu đạt 673,0 mg. Tăng dần hàm lượng than hoạt tính từ 3,0 – 5,0 g/L thì các chỉ tiêu số rễ/mẫu; chiều dài rễ và trọng lượng tươi của mẫu có xu hướng giảm dần. Bàn luận về vai trò của than hoạt tính Weatherhead và cộng sự (1978) chỉ ra rằng, than hoạt tính có tác dụng hấp thụ nhiều loại phân tử, bao gồm cả các chất tăng trưởng được thêm vào môi trường nuôi cấy, đặc biệt là ngăn ngừa sự đổi màu môi trường bởi mẫu cấy [131], cùng chung quan điểm với Weatherhead là nghiên cứu của Thomas (2008) khi cho rằng: Than hoạt tính có vai trò tạo điều kiện “tối” cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật. Ngoài ra, than hoạt tính còn có khả năng làm giảm hiện tượng thuỷ tinh thể ở một số loài thực vật [121]. Như vậy, Môi trường MS +2,0 mg N /l + 1,0 g/L than hoạt tính là công thức thích hợp nhất để điều khiển quá trình nhân nhanh rễ từ các mẫu rễ sạch bệnh. ết quả ghi c u ả h h ở g của hóm cytoki i s ( i eti ; TDZ, B ) đế khả ă g t i si h chồi từ rễ a kiếm Bạch gọc trong điều ki in vitro Kết quả thí nghiệm cho thấy loại cytokinin thích hợp nhất cho cảm ứng chồi lan kiếm Bạch ngọc là B , hàm lượng thích hợp nhất để mẫu rễ lan kiếm Bạch ngọc ra chồi là 3,0 m g/L, khi đó số lượng chồi/mẫu cấy đạt 3,30 chồi; chiều dài chồi đạt 1,27 cm với trọng lượng tươi đạt 167,0 mg. Báo cáo của Paek và cộng sự (1991) khi nghiên cứu nhân giống in vitro trên thân rễ lan kiếm Cymbidium forrestii cũng cho kết quả tương tự, Paek khuyến cáo sử dụng B ở nồng độ 3,0 mg/L để tái sinh chồi Cymbidium forrestii; cho số chồi/mẫu cấy đạt 3,4 ± 0,9 chồi; số rễ/mẫu cấy đạt 4,0 ± 0,5 rễ; trọng lượng tươi của mẫu đạt 160,7 ± 43,2 mg. Kết quả này có cùng xu hướng với kết quả nghiên cứu của chúng tôi.
15 Vì B là cytokinin hiệu quả nhất cho cảm ứng tạo chồi, do đó môi trường bổ sung 3,0 mg/L B được sử dụng là cytokinin duy nhất để tiến hành nghiên cứu trong các thí nghiệm tiếp theo. Tái sinh chồi từ rễ trên Tái sinh chồi từ rễ Tái sinh chồi từ rễ môi trường MS + 0,0 mg trên môi trường MS trên môi trường MS cytokinins/L (Đối chứng) + 1,0 mg TDZ /L + 3,0 mg BA /L Hình 3.17. Ả h h ở g của hóm cytoki i s ( i eti ; TDZ, B ) đế khả ă g t i si h chồi từ rễ a kiếm Bạch gọc (sau 8 tuầ ) ết quả ghi c u ả h h ở g của đ ờ g sucrose đế khả ă g tạo chồi từ rễ a kiếm Bạch gọc tro g điều ki in vitro Số liệu nghiên cứu cho thấy, môi trường bổ sung 5% đường sucrose, sau 8 tuần nuôi cấy cho số lượng chồi/mẫu cấy cao với 5,57 chồi/mẫu cấy; trong lượng tươi của mẫu đạt 327,67 mg với trung bình chiều dài chồi đạt 2,73 cm; số lượng rễ/mẫu cấy đạt 4,42 rễ. Ở nồng độ 7% và 10% sucrose, số lượng chồi/mẫu cấy giảm dần, trọng lượng tươi của mẫu và chiều dài chồi cũng giảm rõ rệt. Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Paek trên đối tượng lan kiếm Cymbidium forrestii [101], Paek khuyến cáo bổ sung 5% sucrose vào môi trường MS + 5mg B /l cho số chồi Cymbidium forrestii đạt 8,2 chồi. Ở các loài lan kiếm khác, Chung và cộng sự (1985) [38, 39] khuyến cáo bổ sung 4% sucrose là tối ưu đối với Cymbidium ensifolium, và 6% sucrose là tối ưu đối với Cymbidium kanran sẽ thúc đẩy số lượng chồi và tăng trọng lượng tối đa của mẫu. Tuy nhiên khi bổ sung nồng độ đường quá cao (7% và 10% sucrose) sẽ hình thành áp suất thẩm thấu, ảnh hưởng không tốt đến sự sinh trưởng của chồi [101]. Từ các dẫn liệu cho thấy, nồng độ đường sucrose tối ưu ở mỗi đối tượng thân rễ lan kiếm là khác nhau, điều này phụ thuộc vào loài và đối tượng thí nghiệm. Như vậy, môi trường MS bổ sung 3mg B /l và 5% sucrose được chọn là môi trường phù hợp cho cảm ứng tạo chồi từ rễ cây lan kiếm Bạch ngọc.
16 Tái sinh chồi từ rễ trên Tái sinh chồi từ rễ Tái sinh chồi từ rễ môi trường MS + 3,0 trên môi trường MS + trên môi trường MS + mg BA /L + 0% 3,0 mg BA /L + 3% 3,0 mg BA /L + 5% Sucrose Sucrose Sucrose Tái sinh chồi từ rễ trên Tái sinh chồi từ rễ môi trường MS + 3,0 trên môi trường MS mg BA /L + 7% + 3,0 mg BA /L + Sucrose 10% Sucrose Hình 3.18. Ả h h ở g của đ ờ g sucrose đế khả ă g tạo chồi từ rễ a kiếm Bạch gọc tro g điều ki i vitro (sau 8 tuầ ) ết quả ghi c u ả h h ở g của B kết h p N đế khả ă g tạo cây co a kiếm Bạch gọc từ rễ tro g điều ki in vitro Các số liệu thí nghiệm cho thấy, N phối hợp với B có hiệu quả đáng kể trong quá trình cảm ứng rễ hình thành chồi lan kiếm Bạch ngọc. Công thức bổ sung 2,0 mg N /L cho kết quả cao nhất, số lượng chồi/mẫu cấy đạt 6,04 chồi với trọng lượng tươi của mẫu đạt 504,33 mg; chiều dài chồi đạt 3,00 cm; số rễ đạt 5,50 rễ/mẫu cấy. Ở các công thức bổ sung ≥ 3,0 mg N /l cho số lượng chồi/mẫu cấy có xu hướng giảm dần. Các kết quả nghiên cứu trên lan kiếm Bạch ngọc tương đồng với báo cáo của Sussex (1989) [119], sự hình thành chồi ở các loài Cymbidium sử dụng phương pháp nhân giống từ rễ dường như được điều chỉnh bởi tỷ lệ auxin/cytokinin [39, 78, 100]. Trong tất cả các loài Cymbidium được
17 nghiên cứu cho đến nay, tỷ lệ auxin/cytokinin cao hơn trong môi trường nuôi cấy nói chung giúp tăng cường sự phát triển của rễ trong khi tỷ lệ auxin/cytokinin thấp hơn sẽ thúc đẩy sự hình thành chồi. 3.4. Nghi c u ai, tạo v t i u khởi đầu từ một số mẫu giố g a kiếm khu vực miề úi Đô g Bắc 3.4.1. hả ă g đ u quả của một số tổ h p ai a kiếm có guồ gốc từ vù g úi Đô g Bắc Vi t Nam Bả g 3.19. Tỷ đ u quả của một số tổ h p ai a kiếm vù g úi Đô g Bắc Tỷ đ u quả sau… gày thụ phấ STT ♀ ♂ 15 ngày 30 ngày 60 ngày 180 ngày 1 DL21 DL15 10% 10% 5% 5% 2 DL19 DL21 15% 15% 10% 10% 3 DL17 DL2 0% 0% 0% 0% 4 DL2 DL17 0% 0% 0% 0% 5 DL7 DL17 15% 10% 0% 0% 6 DL17 DL7 10% 10% 0% 0% 7 DL17 DL19 15% 10% 5% 5% 8 DL3 DL2 0% 0% 0% 0% 9 DL2 DL3 0% 0% 0% 0% ♀ D 21 ( iếm và g) ♀ D 17 (Mạc xuâ ) ♀ D 19 ( iếm ô hội) x ♂ D 15 ( iếm x ♂ D 21 ( iếm ô x ♂ D 21 ( iếm và g) trắ g) hội) Hình 3.19. Một số hì h ả h kết quả ai tạo guồ ge a kiếm vùng úi Đô g Bắc Vi t Nam (sau 8 th g thụ phấ ) Kết quả bảng 3.19 và hình 3.13 cho thấy, có quả lai giữa ♀ DL21 (Kiếm vàng) x ♂ DL15 (Kiếm trắng); ♀DL19 (Kiếm lô hội) x ♂DL21
18 (Kiếm vàng), ♀DL17 (Mạc xuân) x ♂DL19 (Kiếm lô hội). Trong đó, tỷ lệ đậu quả khi lai giữa ♀ DL21 (Kiếm vàng) x ♂ DL15 (Kiếm trắng) sau 15 đến 30 ngày thụ phấn là 10%, sau đó quả rụng và tỷ lệ đậu quả chỉ đạt 5% ở thời điểm 60 đến 180 ngày. Đối với cặp lai ♀DL19 (Kiếm lô hội) x ♂DL21 (Kiếm vàng), tỷ lệ đậu quả sau 15 đến 30 ngày thụ phấn là 15%, ở thời điểm 60 đến 180 ngày sau thụ phấn tỷ lệ đậu quả đạt 10%. Tỷ lệ đậu quả của cặp lai ♀ DL21 (Kiếm vàng) x ♂ DL15 (Kiếm trắng) sau 15 ngày thụ phấn là 15%, sau đó quả rụng dần, tại thời điểm 30 ngày sau thụ phấn tỷ lệ đậu quả đạt 10%, ở thời điểm 60 đến 180 ngày sau thụ phấn chỉ còn 5%. Các tổ hợp lai không đậu quả gồm ♀ DL17 (Mạc xuân) và ♂ DL2 (Trần Mộng Xuân), ♀ DL2 (Trần Mộng Xuân) và ♂ DL17 (Mạc xuân), ♀ DL2 (Trần Mộng Xuân) và ♂ DL3 (Bạch ngọc đuôi công), ♀ DL3 (Bạch ngọc đuôi công) và ♂ DL2 (Trần Mộng Xuân). Hai tổ hợp lai còn lại gồm ♀ DL7 (Kiếm Lá Giáo) và ♂ DL17 (Mạc xuân), ♀ DL17 (Mạc xuân) và ♂ DL7 (Kiếm Lá Giáo) có tạo quả sau thụ phấn tuy nhiên thời gian quả tồn tại trên cây rất ngắn (30 ngày), sau đó quả rụng hoàn toàn. 4 tổ hợp lai không đậu quả (♀ DL17 x ♂ DL2, ♀ DL2 x ♂ DL17, ♀ DL2 x ♂ DL3, ♀ DL3 x ♂ DL2) và 2 tổ hợp lai có quả đậu nhưng rụng sớm (♀ DL7 x ♂ DL17, ♀ DL17 x ♂ DL7) Sau 8 tháng thụ phấn chúng tôi tiến hành thu hoạch các quả lai để chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo. Theo các nghiên cứu đã công bố trước đây của lghamdi và cộng sự (2019), Li và cộng sự (2022), hạt lan có rất ít nội nhũ nên rất khó khăn trong quá trình nảy mầm, để hạt lan nảy mầm trong tự nhiên cần sự cộng sinh của nấm mycorrhiza [25, 66, 82, 85, 126] với yêu cầu cao về điều kiện môi trường [92]. Do đó, để tối ưu hoá khả năng nảy mầm của hạt lai chúng tôi tiến hành cho hạt nảy mầm in vitro trên môi trường MS + 3% Sucrose + 5 g gar/L. Để khẳng định cây con thu được từ các phép lai là do thụ phấn chéo, không phải sản phẩm của quá trình tự thụ phấn chúng tôi sử dụng sử dụng chỉ thị SSR để phân biệt các cá thể có mối quan hệ gần. 3.4.2. hảo s t và x c đị h x c đị h marker h dạ g co ai F1 ở giai đoạ sớm bằ g chỉ thị phâ tử SSR * Khảo sát và xác định chỉ thị phân tử SSR đa hình giữa hai giống bố mẹ Mười tám chỉ thị phân tử SSR đã được sử dụng để khảo sát đa hình giữa ba cặp mẫu giống bố mẹ. Kết quả khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ ở cặp lai ♀ DL21 (Kiếm vàng) x ♂ DL15 (Kiếm trắng) cho thấy 9/18
19 chỉ thị bắt cặp tốt với DN hai mẫu giống lan kiếm bố mẹ. Băng điện di sản phẩm PCR rõ nét và có kích thước tương đương dự kiến. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của 9 chỉ thị được thể hiện ở Hình 3.16. Kết quả cho thấy, 5/9 chỉ thị cho đa hình giữa bố và mẹ đó là CS8, CS15, CS7, CS11 và CS13. Trong đó, 3 chỉ thị CS8, CS15, CS7 cho băng kích thước sản phẩm PCR với DN của 2 loài bố mẹ chênh lệch rõ nét. Cụ thể, chỉ thị CS8 cho băng kích thước sản phẩm PCR với mẫu DN lan Kiếm vàng khoảng 240bp, với mẫu DN lan Kiếm trắng khoảng 305bp. Chỉ thị CS15 và CS7 cho kích thước sản phẩm PCR với DN của 2 loài bố mẹ có sự chênh lệch ít hơn so với chỉ thị CS8, tuy nhiên chênh lệch khá rõ nét. Cụ thể, băng kích thước sản phẩm PCR của chỉ thị CS15 với mẫu ADN lan Kiếm vàng khoảng 255bp và lan Kiếm trắng khoảng 295bp. Tương tự, chỉ thị CS7 cho băng kích thước sản phẩm PCR giữa mẫu ADN lan Kiếm vàng (khoảng 255bp) với Kiếm trắng (khoảng 220bp). Khi đánh giá các cá thể con lai, sử dụng các chỉ thị phân tử thể hiện sự chênh lệch rõ nét giữa băng sản phẩm PCR của DN 2 loài bố mẹ, kết quả sẽ dễ quan sát và chính xác hơn. Chỉ thị CS11 và CS13 tuy không thể hiện sự chênh lệch rõ nét giữa băng sản phẩm PCR của DN 2 loài bố mẹ như các chỉ thị CS8, CS15, CS7 nhưng vẫn đủ đảm bảo sử dụng để đánh giá các cá thể con lai. Cụ thể, chỉ thị CS11 cho băng kích thước sản phẩm PCR giữa mẫu DN lan Kiếm vàng (khoảng 260bp) với Kiếm trắng (khoảng 255bp). Chỉ thị CS13 cho băng kích thước sản phẩm PCR giữa mẫu DN lan Kiếm vàng (khoảng 230bp) với Kiếm trắng (khoảng 250bp). Hình 3.22. ết quả khảo s t đa hì h bố mẹ của cặp ai giữa ♀ D 21 ( iếm và g) x ♂ D 15 ( iếm trắ g) với chỉ thị phâ tử SSR Ghi chú: 1: ADN loài lan Kiếm vàng 2: ADN loài lan Kiếm trắng . Thang chuẩn: 1kb Tương tự, kết quả khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ ở cặp lai ♀DL19 (Kiếm lô hội) x ♂DL21 (Kiếm vàng) cho thấy 8/18 chỉ thị bắt
20 cặp tốt với DN hai mẫu giống lan kiếm bố mẹ. Băng điện di sản phẩm PCR rõ nét và có kích thước tương đương dự kiến. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của 8 chỉ thị được thể hiện ở hình 3.17. Kết quả cho thấy, 2/8 chỉ thị cho đa hình giữa bố và mẹ đó là CS16 và CS7. Cụ thể, chỉ thị CS16 cho băng kích thước sản phẩm PCR với mẫu DN lan Kiếm lô hội khoảng 295bp, với mẫu DN lan Kiếm vàng khoảng 280bp. Chỉ thị CS7 cho băng kích thước sản phẩm PCR giữa mẫu DN lan Kiếm lô hội khoảng 240bp, với mẫu DN lan Kiếm vàng khoảng 255bp. Hình 3.23. ết quả khảo s t đa hì h bố mẹ của cặp ai giữa ♀ D 19 ( iếm ô hội) x ♂ D 15 ( iếm và g) với chỉ thị phâ tử SSR Ghi chú: 1: ADN loài lan Kiếm lô hội 2: ADN loài lan Kiếm vàng . Thang chuẩn: 1kb Kết quả khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ ở cặp lai ♀DL17 (Mạc xuân) x ♂DL19 (Kiếm lô hội) cho thấy, có 9/18 chỉ thị bắt cặp tốt với DN 2 mẫu giống lan kiếm bố mẹ. Băng điện di sản phẩm PCR rõ nét và có kích thước tương đương dự kiến. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của 9 chỉ thị được thể hiện ở hình 3.18. Kết quả cho thấy, 5/9 chỉ thị cho đa hình giữa bố và mẹ đó là CS4, CS5, CS8, CS11 và CS3. Các chỉ thị CS4, CS5, CS11 và CS3 cho băng kích thước sản phẩm thể hiện sự chênh lệch khá rõ nét giữa mẫu DN lan kiếm Mạc xuân với Kiếm lô hội. Duy nhất chỉ thị CS8 cho kích thước sản phẩm PCR với DN của 2 loài bố mẹ có sự chênh lệch ít hơn. Cụ thể, chỉ thị CS4 cho băng kích thước sản phẩm PCR với mẫu DN Mạc xuân khoảng 235bp, với mẫu DN Kiếm lô hội khoảng 300bp. chỉ thị CS4 cho băng kích thước sản phẩm PCR với mẫu DN Mạc xuân khoảng 235bp, với mẫu DN Kiếm lô hội khoảng 300bp. Chỉ thị CS5 cho băng kích thước sản phẩm PCR với mẫu ADN Mạc xuân khoảng 260bp, với mẫu DN Kiếm lô hội khoảng 200bp.