Trao đổi chất ở vi sinh vật

Chia sẻ: Thanh Thảo | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:25

Thêm vào BST

Báo xấu

522
lượt xem 48
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong điều kiện có hoặc không có O2, glucose đều được chuyển a. Pyruvic thành pyruvate qua 10 phản ứng, trong đó 3 phản ứng 1, 3 và 10 là phản Hình 5.1: Con đường EMP ứng một chiều, còn các phản ứng khác là phản ứng thuận nghịch. Trừ chất đầu và chất cuối, tất cả các chất trung gian trong chu trình đều ở dạng phosphoryl hóa

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Trao đổi chất ở vi sinh vật

102 Chương 5 Trao đổi chất ở vi sinh vật I. Các con đường phân giải hexose 1. Con đường Embden - Meyerhof - Parnas (EMP hay đường phân) 1.1 Cơ chế (hình 5.1) Glucose (1) Glucose - 6 P (2) Fructose - 6P ATP (3) ADP Fructose - 1,6 DP (5) (4) (AlPG) Glyceraldehyd - 3P Dioxy acetone – P (DAP) H3PO4 NAD (6) NADH2 a. 1,3 diphosphoglyceric (a. 1,3DPG) ADP (7) ATP a.3 P - Glyceric (A3PG) (8) a.2P- Glyceric (A2PG) (9) Phosphoenolpyruvic (PEP) (10) ADP A TP Trong điều kiện có hoặc không có O2, glucose đều được chuyển a. Pyruvic thành pyruvate qua 10 phản ứng, trong đó 3 phản ứng 1, 3 và 10 là phản ứng một chiều, còn cácìnhả5.1:ng khác là phản ứng thuận nghịch. Trừ chất H ph n ứ Con đường EMP
103 đầu và chất cuối, tất cả các chất trung gian trong chu trình đều ở dạng phosphoryl hóa. Gốc phosphoryl mang 3 chức năng là giúp cho chất trung gian mang điện tích âm cao không thể thoát ra ngoài, là vị trí gắn enzyme và là vị trí cung cấp liên kết cao năng. Phương trình chung: Glucose 2 pyruvate + 2ATP + 2 NADH2 ATP được tạo thành từ 2 phản ứng 7 và 10. Sự tạo thành ATP ở 2 phản ứng trên gọi là phosphoryl hóa ở mức độ cơ chất vì phosphate cao năng trước đó là một phần của phân tử chất trao đổi (1,3 di - P - glycerate và PEP), khi có mặt của ADP thì chất trao đổi sẽ chuyển gốc P cho ADP tạo thành ATP. Có thể chia con đường EMP thành 4 giai đoạn: 1. Hoạt hóa glucose tạo fructose - 1,6 diphosphate (có thể xẩy ra ở nhiều monosaccharide khác). 2. Bẻ đôi phân tử fructose - 1,6 diphosphate tạo AlPG và DAP. 3. Ôxy hóa AlPG thành A2PG. 4. Chuyển hóa A2PG tạo acid pyruvic (hình 5.1). 1.2. Ý nghĩa của con đường EMP - Quá trình đường phân cung cấp cho tế bào 6 trong số 12 tiền chất dùng để tổng hợp các đơn vị kiến trúc: glucose - 6-P, fructose - 6-P, 3-P- glyceraldehyd, 3P - glycerate, PEP, pyruvate. - Cung cấp năng lượng cho hoạt động sống của tế bào tuy hiệu suất không cao (khoảng 10%), nhưng đây là con đường nguyên thủy nhất gặp ở hầu hết sinh vật. 2. Con đường pentosophosphate ôxy hoá (PP, HMP) Do một đột biến nào đó (thiếu enzyme) mà một số vi sinh vật có thể chuyển hóa glucose thành pyruvate theo con đường PP (hình 5.2). Từ glucose qua quá trình decarboxyl hóa tạo ribuloso - 5P và CO2. Các phản ứng tiếp theo là sự chuyển hóa giữa pentoso- 5P và hexoso - 6P. Ý nghĩa của chu trình: Xét về mặt năng lượng, từ 1 phân tử glucose khi phân giải tạo 35 ATP nhưng qua con đường này tạo riboso - 5P tham gia vào quá trình sinh tổng hợp acid nucleic, tạo các loại đường C4, C7... tham gia vào quá trình sinh tổng hợp acid amin. Con đường này tạo NADPH2 cần thiết cho các phản ứng sinh tổng hợp trong tế bào. Đây là con đường phân giải đường thường gặp ở vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas.
104 Phương trình tổng quát: Glucose + 6O2 6CO2 + 6H2O + 35ATP Glucose Glucose Ribulose Glucose Frutose Xilulose Fructos Ribose Erytrose Xilulose Xilulose Erytros Ribose Fructos Fructos Xilulose Hình 5.2 Con đường pentosophosphate 3. Con đường KDPG (2keto - 3deoxy - 6Pgluconate) Phương trình tổng quát như sau: Glucose 2 Pyruvate + ATP + NADH2 + NADPH2 Con đường KDPG giúp cho nhiều vi khuẩn sử dụng gluconate và chỉ gặp ở một số vi khuẩn. Ở E. coli và nhiều loài của Clostridium chuyển hóa glucose qua con đường EMP nhưng phân giải gluconate qua con đường KDPG. Qua các con đường phân giải glucose, pyruvate được tạo thành. Nếu trong điều kiện hiếu khí các vi sinh vật sẽ ôxy hoá pyruvate tạo CO2 và nước. Nếu điều kiện kị khí các vi sinh vật sẽ tiến hành quá trình lên men hoặc hô hấp kị khí (hình 5.3).
105 Glucose Glucose -6- hh 6 - phosphoglucono-18-lactose 6 - phosphogluconate 2-keto-3 deoxy-6-phosphogluconate pyruvate Glyceraldehyd 1,3 Phosphoenol-pyruvate 2-phosphoglycerate 3-phosphoglycerat Hình 5.3 Con đường KDPG 4. Ôxy hoá pyruvate Pyruvate chiếm vị trí trung tâm trong trao đổi chất trung gian và là tiền chất của nhiều sản phẩm. Nhiều vi sinh vật ôxy hóa pyruvate thành acetyl - CoA chủ yếu qua 3 phản ứng sau (hình 5.4):
106 Pyruvate +CoA+NAD+ Acetyl - CoA + NADH2 + CO2 (1) Pyruvate + CoA + 2Fd Acetyl - CoA + 2FdH + CO2 (2) Pyruvate + CoA + NAD+ Acetyl - CoA + formate (3) (Formate - Fd - ferredoxin) Pyruvate- carboxylase Vòng tiasolium Pyruvate của thiamin pyrophosphate Enzyme Acid lipoic Dihydrolipoid- transacetylase Enzyme Dihydrolipoid - dehydrogenas Enzyme Enzyme Acid dihydrolipoic Acid acetyl-lipoic Hình 5.4 Quá trình ôxy hóa pyruvate Phản ứng (1) do phức hệ pyruvate - dehydrogenase (PDH) xúc tác. PDH gặp ở hầu hết vi sinh vật hiếu khí (không gặp ở vi khuẩn kị khí bắt buộc). PDH gồm 3 enzyme, ngoài CoA và NAD+ còn cần TPP (thiamine - pyrophosphate) và acid lipoic. Phản ứng (2) xúc tác bởi pyruvate - Fd - oxidoreductase, enzyme này gặp nhiều ở vi khuẩn kị khí như Clostridium. Phản ứng (3) do pyruvate - formate - liase xúc tác, enzyme này gặp nhiều ở vi khuẩn kị khí tiết acid formic (thuộc họ Enterobacteriaceae) và vi khuẩn quang năng.
107 II. Chu trình tricarboxylic (Krebs) Trong quá trình ôxy hóa hoàn toàn, pyruvate sẽ được ôxy hoá triệt để thông qua chu trình Krebs (chu trình acid tricarboxylic = ATC). Cơ chế được trình bày ở hình 5.5. Hình 5.5 Chu trình Krebs (theo Lehninger) Trong chuỗi phản ứng vòng của chu trình ATC, acid pyruvic bị phân huỷ triệt để tạo CO2, coezyme dạng khử và các hợp chất trung gian. Các coezyme thông qua chuỗi hô hấp vận chuyển H và electron đến cho O2 phân tử tạo nước đồng thời giải phóng năng lượng ATP.
108 Ý nghĩa của chu trình: Ngoài chức năng ôxy hóa tận cùng, chu trình ATC còn cung cấp cho tế bào 3 tiền chất là oxalacetate (tổng hợp aspactate), α - ketoglutarate và succinyl - CoA (tổng hợp nhân hem). Về năng lượng, chu trình cung cấp 1ATP ở mức độ phosphoryl hóa cơ chất nhưng sản sinh NADH2 để đi vào chuỗi vận chuyển electron tạo ATP. Trong điều kiện kị khí chu trình TCA không có chức năng sinh năng lượng nhưng cũng phải cung cấp cho tế bào 3 tiền chất trên. Tế bào phải sử dụng phần lớn pyruvate để lên men thu năng lượng, còn phần nhỏ chuyển thành acetyl - CoA nhờ pyruvate - ferredoxin - oxidoreductase. Phần lớn các vi sinh vật hiếu khí ôxy hóa chất dinh dưỡng hữu cơ thành CO2 và H2O (vì carbon trong phân tử CO2 đạt mức độ ôxy hóa cao nhất nên người ta gọi là quá trình ôxy hóa hoàn toàn). Một số vi sinh vật có khả năng ôxy hóa cơ chất trong điều kiện hiếu khí nhưng lại sinh ra các sản phẩm chưa được ôxy hóa hoàn toàn (ketoacid, acid gluconic, acid malic, acid fumaric...). Nhiều quá trình ôxy hóa không hoàn toàn có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp lên men vì chúng sản sinh ra nhiều sản phẩm có giá trị. III. Chuỗi hô hấp (respiratory chain) và phosphororyl hóa ôxy hóa (oxidative phosphorylation) Khác với vi khuẩn kị khí, vi khuẩn hiếu khí có thể tổng hợp ATP mạnh mẽ hơn nhiều nhờ có chuỗi hô hấp và ATP - synthetase. Hai hệ thống này nằm ở màng tế bào Prokaryota hoặc màng trong ti thể của tế bào Eukaryota. Năng lượng thoát ra được chuyển thành ATP, một phần nhỏ giải phóng ra ở dạng nhiệt. Các thành phần của chuỗi nằm trong lớp lipid kép, gồm nhiều enzyme vận chuyển electron và hydro, các coenzyme và nhóm thêm, các dehydrogenase và hệ thống vận chuyển. Các thành phần quan trọng nhất tham gia vào ôxy hóa hydro là : - Flavoprotein là các enzyme chứa nhóm thêm là FMN hoặc FAD - vận chuyển hydro. - Protein Fe-S vận chuyển electron, chứa nguyên tử Fe, vừa liên kết với S của cysteine vừa liên kết với S của H2S. Cysteine là một phần của chuỗi polypeptide, có thể coi trung tâm Fe - S là nhóm thêm của chuỗi polypeptide. Các protein Fe - S cũng tham gia vào sự cố định N, khử sulphite, khử nitrite, quang hợp... - Quinol: nằm ở màng trong của ti thể, ở vi khuẩn G- là ubiquinol (CoQ), vi khuẩn G+ là naphtoquinol và ở lục lạp là plastoquinol. Quinol, đặc biệt là CoQ có đặc tính ưa lipid do đó lắp vào lớp lipid kép của màng, vận chuyển hydro hoặc enzyme.
109 - Cytochrome: vận chuyển electron, không vận chuyển hydrogen. Cytochrome nhận electron từ quinol, trong quá trình vận chuyển một số lượng H+ tương đương với số lượng electron bị tách vào môi trường (hình 5.6). Cyt Cyt Cyt Cyt Hình 5.6 Sơ đồ chuỗi hô hấp Trong quá trình vận chuyển 2[H] từ NADH2 đến O2 có 3 bước chuyền electron liên quan đến tạo thành ATP và được biểu thị bằng hệ số P/O (mol ATP/mol nguyên tử O). Hệ số P/O = 3 khi 2[H] được chuyền qua NAD+ và P/O = 2 khi 2[H] từ succinate qua FAD đến O2. Do đó 1mol glucose khi phân giải qua chu trình EMP và TCA với tất cả [H] tách ra được chuyển vào chuỗi hô hấp để tạo thành nước sẽ tạo 38 ATP. Sự tính toán trên đúng với ti thể và một số vi khuẩn. Tuy nhiên, ở một số vi khuẩn do chỉ có 2 vị trí phosphoryl hóa nên sự hô hấp hiếu khí glucose chỉ cho 26 ATP (như ở E. coli không có NAD, Proteus vulgaris không có cytochrome C). Cơ chế phosphoryl hoá ôxy hoá (sự tạo thành ATP trong chuỗi hô hấp) được giải thích theo thuyết hoá thẩm thấu của Mitchell (1979). Theo thuyết này, màng tế bào vi khuẩn và màng trong ti thể không thấm các ion kể cả H+ và OH- và kém dẫn điện. Sự sắp xếp các protein của màng (các thành phần vận chuyển electron, permease, ATP - sinthetase...) khiến màng mang tính chất không đối xứng. Sự định hướng không gian của các phân tử enzyme dẫn đến trao đổi chất có đặc tính vectơ. Chuỗi hô hấp bao gồm một dãy các chất vận chuyển hidro và electron sắp xếp luân phiên trong màng. Do sự ôxy hoá cơ chất mà phía trong màng có sự tiêu thụ H+ và phía màng ngoài giải phóng H+. Trong sự ôxy hoá NADH2, 6H+ đã
110 được vận chuyển ra phía ngoài qua 3 núm. Việc vận chuyển proton do hô hấp làm xuất hiện một gradien điện hoá giữa 2 phía của màng. Thế proton này sẽ là động lực của sự phosphoryl hoá nghĩa là sự tạo thành ATP. Quá trình được xúc tác bởi ATP - sinthetase, enzyme này chuyển năng lượng phát ra từ dòng electron thành liên kết esterphosphate cao năng của ATP. ATP - sinthetase gặp ở các màng tham gia vào sự chuyển hoá năng lượng là màng ti thể, lục lạp và màng tế bào vi khuẩn. Có lẽ, dòng H+ từ ngoài đã đi qua rãnh của ATP - sinthetase trở vào bên trong ti thể hoặc vi khuẩn, năng lượng thoát ra được dùng cho phản ứng phosphoryl hoá tạo ATP. IV. Sự vận chuyển chất dinh dưỡng vào tế bào Để tồn tại, sinh trưởng và phát triển, tế bào vi sinh vật phải thường xuyên trao đổi vật chất và năng lượng với môi trường bên ngoài. Một mặt chúng nhận các chất dinh dưỡng cần thiết từ môi trường, mặt khác chúng thải ra các sản phẩm trao đổi chất. Giữa môi trường xung quanh và môi trường bên trong tế bào tồn tại một hàng rào thẩm thấu, hàng rào này chính là màng tế bào chất. Tế bào nhận và thải các chất một cách chọn lọc. Sự xâm nhập của nước và các chất hòa tan qua màng tế bào là một quá trình động học; tế bào sống không bao giờ ở trạng thái cần bằng với các chất của môi trường chung quanh. Sự vận chuyển các chất qua màng tế bào vi sinh vật tuân theo một trong hai cơ chế: khuếch tán đơn giản (hay còn gọi là vận chuyển thụ động hay vận chuyển xuôi dòng) và vận chuyển chủ động (vận chuyển ngược dòng). Theo cơ chế khuếch tán thụ động các phân tử đi qua màng nhờ sự chênh lệch nồng độ (trong trường hợp các chất không điện phân) hay chênh lệch điện thế (trong trường hợp các ion) ở hai phía của màng. Hàng loạt nghiên cứu đã khẳng định, trừ nước ra rất ít hợp chất có thể được vận chuyển qua màng theo cơ chế nói trên. Trái lại, đa số các chất hòa tan qua màng do cơ chế vận chuyển đặc biệt. Những phân tử vận chuyển sắp xếp trong màng liên kết với các phân tử chất hòa tan và chuyển chúng vào bề mặt bên trong của màng, từ đây các phân tử chất hòa tan được chuyển vào tế bào chất. Kiểu khuếch tán này được gọi là khuếch tán xúc tiến. Các phân tử protein vận chuyển (carrier protein) nói trên gọi là protein thấm – permease. Sự vận chuyển các chất nhờ permease có thể là thụ động (không cần năng lượng của tế bào) hoặc chủ động (cần năng lượng). Theo cơ chế vận chuyển thụ động, chất hòa tan liên kết thuận nghịch vào một vị trí đặc biệt trên phân tử permease nằm ở bên trong màng (có thể ở các lỗ của màng). Phức hợp “chất hòa tan - permease” được vận chuyển theo hai phía của
111 màng nhờ sự chênh lệch nồng độ ở một chất nào đó, nghĩa là sự vận chuyển diễn ra theo kiểu “xuôi dòng”. Sự vận chuyển thụ động nhờ permease đã được chứng minh ở một số vi sinh vật. Tuy nhiên, vi sinh vật có khả năng tích lũy một số chất với nồng độ cao hơn nhiều so với nồng độ bên ngoài. Chẳng hạn, nồng độ K+ bên trong một số tế bào vi sinh vật có thể lớn hơn nồng độ bên ngoài hàng ngàn lần. Để đảm bảo độ trung hòa điện, tế bào cũng đồng thời thải ra bên ngoài các ion H+ hoặc Na+. Thêm vào đó, người ta đã phát hiện thấy ở các màng vi khuẩn có hoạt tính của ATP - ase là enzyme có liên quan đến việc vận chuyển các chất. Rõ ràng, trong tế bào vi sinh vật ngoài cơ chế vận chuyển thụ động còn tồn tại cơ chế vận chuyển chủ động nhờ permease. Sự vận chuyển này được tiến hành ngược với gradien nồng độ nghĩa là theo kiểu “ngược dòng”, năng lượng tiêu thụ có thể do ATP cung cấp. Cho tới nay người ta đã phân lập được hàng loạt protein vận chuyển trong các loài vi sinh vật. Giống như enzyme, chúng có tính đặc hiệu cơ chất khác nhau. Một số có tính đặc hiệu gần như tuyệt đối. Chẳng hạn, permease của galactose ở E.coli chỉ vận chuyển galactose. Các permease của các đường và acid amin khác thể hiện tính đặc hiệu yếu hơn đối với các chất hòa tan. Điều đáng chú ý là trong vi khuẩn sự vận chuyển chủ động của hầu hết các loại đường phụ thuộc vào quá trình phosphoryl hóa và hệ thống enzyme phosphotransferase. Hệ thống này bao gồm hai enzyme EI, EII và một protein vận chuyển bền nhiệt (Hpr: heat stable carried protein) có khối lượng phân tử thấp. Các thành phần protein của hệ thống này đã được thuần khiết và phản ứng diễn ra theo hai bước. Trước hết EI chuyển phosphate từ phosphoenolpyruvate (PEP) đến Hpr: Hpr + PEP Hpr - P + Pyruvate Sau đó EII chuyển phosphate từ Hpr - P đến C6 của đường đơn. EI là chung cho nhiều loại đường nhưng EII lại đặc trưng cho mỗi loại đường. Nghĩa là một đột biến nào đó ảnh hưởng đến việc tổng hợp EI sẽ dẫn đến mất khả năng vận chuyển nhiều loại đường. Trái lại với đột biến như thế đối với EII chỉ ảnh hưởng đến sự vận chuyển của một loại đường (hình 5.7).
112 Trong Màng Ngoài Glucose- 6P EII Glucose Hpr PEP pyruvic Hpr-P EII glucose Hình 5.7 Sơ đồ vận chuyển đường qua màng tế bào vi sinh vật V. Trao đổi chất và năng lượng 1. Các nguồn năng lượng ở vi sinh vật Tùy theo bản chất của nguồn năng lượng sơ cấp, có hai con đường cơ bản để cung cấp cho vi sinh vật: con đường quang dưỡng và hóa dưỡng. Trong cả hai trường hợp, sự thu nhận năng lượng của tế bào được liên hệ với sự vận chuyển electron qua màng, do đó tạo ra một gradient electron proton từ phần này đối với phần kia của màng tế bào chất. Chính gradien nồng độ ion là nguồn gốc của lực bơm proton (sự khác biệt điện tích) có thể được dùng vào những mục đích khác nhau như vận chuyển tích cực, sản xuất các chất giàu năng lượng, chuyển động v.v.. . Trong thế giới vi sinh vật có sự khác biệt rất lớn về khả năng sử dụng các nguồn năng lượng. Một số vi khuẩn hiếu khí cũng giống như động vật có khả năng tổng hợp ATP cho mình từ đường bị phân giải theo con đường đường phân (glycolyse) và chu trình Krebs nhờ chuỗi hô hấp trên màng tế bào chất (tương tự như chuỗi hô hấp ở màng trong của ty thể). Còn những vi sinh vật kị khí lại thu năng lượng cho hoạt động sống của mình nhờ quá trình lên men của các loại đường hoặc nhờ một loại chuỗi vận chuyển electron trong đó có sử dụng các hợp chất không phải là ôxy phân tử làm chất nhận electron cuối cùng trong chuỗi vận chuyển. Ở đây, chuỗi vận chuyển cũng khu trú trên màng tế bào chất tương tự như chuỗi vận chuyển nằm trong các ty thể. Đối với các cơ thể quang dưỡng thì lại khác, chúng có thể thu nhận năng lượng của ánh sáng.
113 Đứng về quan điểm năng lượng sinh học, thì ty thể, lục lạp và tế bào vi khuẩn có nhiều nét tương đồng. Tất cả các vi khuẩn có trên màng tế bào chất một hệ enzyme ATP - synthetase tương tự như ATP - synthetase của các ty thể và lục lạp. Phức hợp protein vận chuyển qua màng đảm bảo biến đổi dòng proton thành năng lượng trong mối liên kết phosphate ở dạng ATP. 1.1.Các cơ thể quang dưỡng (phototroph) và quang tổng hợp (photosynthesis) Hình thái của cơ thể quang dưỡng và quang tổng hợp giữa vi khuẩn, tảo, thực vật có sự khác biệt rõ ràng. Mặt khác, cấu tạo các cơ quan quang hợp, sắc tố quang tổng hợp, cũng khác biệt (xem chương II). Đối với thực vật, chất cho electron là H2O và quá trình quang hợp giải phóng ôxy phân tử. Đối với vi khuẩn quang hợp không thải ôxy và chất cho electron là những hợp chất vô cơ (như H2S, S) hoặc hợp chất hữu cơ (isopropanol) (xem thêm chương VII). 1.2. Các cơ thể hóa dưỡng và ôxy hóa sinh học Phần lớn vi khuẩn không có cơ quan và sắc tố quang hợp. Chúng lấy năng lượng hữu ích cho các quá trình tổng hợp của tế bào nhờ giải phóng năng lượng trong các phản ứng hóa học. Sự trao đổi chất của các cơ thể hoá dưỡng nói chung bao gồm 3 giai đoạn: - Phân cắt các đại phân tử ở ngoài tế bào. - Phân giải các phân tử bé để tạo ra các chất trao đổi trung gian (pyruvate, acetyl - CoA) và tạo năng lượng hữu ích (ATP). - Phân giải triệt để các chất trao đổi trung gian thành CO2 và H2O với việc tạo ra lượng lớn ATP. Đó là những phản ứng ôxy hóa cơ chất hữu cơ và vô cơ. Quá trình ôxy hóa một cơ chất A có thể xem là một chuỗi phản ứng mà trong đó cơ chất A mất đi các eletron của mình. Cơ chất A gọi là chất cho electron sẽ biến thành một sản phẩm được ôxy hóa. Tương tự, một hợp chất B khác gọi là chất nhận electron sẽ biến thành sản phẩm khử. Trong phần lớn trường hợp, một hợp chất A là một chất hữu cơ có thể xem là chất được hydro hóa, như vậy thì quá trình ôxy hóa về thực chất là một quá trình khử hydro (dehydrogenation), trong khi đó quá trình khử là quá trình hydro hóa (hydrogenation), tổ hợp hai quá trình này là quá trình ôxy hóa khử (oxidoreduction). Quá trình ôxy hoá:
114 - 2H+ AH2 (chất cho hydro) A (sản phẩm ôxy hoá) + Năng lượng - 2e Quá trình khử: + 2H+ B (chất nhận hydro) BH2 (sản phẩm khử) + 2e Kết quả: AH2 + B A + BH2 + Năng lượng Trong chuỗi phản ứng, việc vận chuyển hydro hay electron từ cơ chất sang chất nhận được thực hiện nhờ hàng loạt enzyme, các enzyme này tạo thành chuỗi vận chuyển điện tử. Các chất xúc tác thích ứng cao với quá trình ôxy hoá cơ chất là những dehydrogenase. Những enzyme này đặc trưng cho một loại cơ chất và tổ hợp với các coenzyme mà nó đóng vai trò là chất nhận hydro từ cơ chất. Đó là các dẫn xuất của flavin (FMN, FAD) hoặc của pyridine (NAD, NADP) và nhiều hợp chất khác. Ở các cơ thể hiếu khí, sự vận chuyển các electron giữa coenzyme của dehydrogenase và ôxy phân tử được thực hiện nhờ các hợp chất trung gian của cytochrome. 2. Các kiểu hô hấp Thông thường khi chất nhận electron cuối cùng là ôxy phân tử thì gọi là quá trình hô hấp hiếu khí và vi sinh vật thuộc dạng này gọi là vi sinh vật hiếu khí (aerobes). Khi chất nhận electron cuối cùng là một cơ chất khác không phải là ôxy tự do, thì người ta gọi là quá trình lên men hoặc có thể là quá trình hô hấp kị khí và vi sinh vật thực hiện các quá trình này gọi là các cơ thể kỵ khí (anaerobes). Trong số các cơ thể kỵ khí, chất nhận electron có thể là chất hữu cơ hoặc chất vô cơ. Nếu chất nhận electron là chất hữu cơ người ta gọi là lên men, nếu chất nhận là electron là chất vô cơ người ta gọi là hô hấp kỵ khí (anaerobic respiration). Hô hấp của một cơ thể hiếu khí là một quá trình vận chuyển electron và proton qua màng với ôxy phân tử làm chất nhận electron cuối cùng, còn “hô hấp kỵ khí” dùng để chỉ một quá trình vận chuyển qua màng của các electron và proton đến chất nhận electron cuối cùng là một chất khác ôxy phân tử, như nitrate trong trường hợp hô hấp nitrate (nitrate respiration), fumarate như hô hấp fumarate (fumarate respiration ) v.v...
115 Rất nhiều vi sinh vật có nhiều chuỗi vận chuyển electron có thể cùng hoạt động, hoặc được hoạt động trong những điều kiện nuôi cấy nhất định. Ví dụ như ở E. coli, vi khuẩn đường ruột này có chuỗi vận chuyển electron với ôxy phân tử là chất nhận electron cuối cùng (chuỗi hoạt động như cơ thể hiếu khí ) và chuỗi “hô hấp nitrate” hoạt động kỵ khí trong môi trường nitrate, một chuỗi “hô hấp fumarate”, hoạt động kỵ khí trên môi trường chứa cơ chất hữu cơ mà vi khuẩn này có thể lên men. Hô hấp được đặc trưng trước hết là nơi khu trú của chuỗi vận chuyển electron ở màng tế bào chất đối với các cơ thể nhân sơ và ở màng trong của ty thể đối với các cơ thể nhân chuẩn. Hô hấp còn đặc trưng ở bản chất của chất nhận electron cuối cùng là ôxy phân tử. Sự ôxy hoá cơ chất và đồng thời sự khử của ôxy được thực hiện nhờ một chuỗi phản ứng enzyme, trong đó có sự tham gia của dehydrogenase và các coenzyme liên kết với nó. Cơ chế thường thấy ở hô hấp là con đường của các cytochrome gián tiếp. Ngày nay người ta hoàn toàn biết rõ thành phần và cơ chế hoạt động của các cytochrome này trong tế bào nhân chuẩn và trong một số cơ thể nhân sơ. Bên cạnh quá trình phosphoryl ôxy hoá cơ chất, còn tồn tại những con đường khác, đặc biệt là con đường ôxy hoá trực tiếp nhờ các enzyme vận chuyển các electron từ cơ chất đến ôxy với sự tạo thành H2O2 . FADH2 + O2 FAD- oxydase FAD + H2O2 Hợp chất này rất độc và cần phải được phân giải nhờ catalase, peroxydase hoặc superoxyd dismutase tránh cho tế bào khỏi bị chết. H2O2 H2O + 1/2 O2 catalase + - H2O2 + 2H + 2e 2H2O peroxydase Những con đường này tạo rất ít hoặc không tạo năng lượng hữu ích. Một vi khuẩn không có enzyme trên, nhưng con đường phân giải trên buộc chúng phải sống kỵ khí bắt buộc, bởi vì ôxy phân tử là tác nhân gây độc với chúng. Có một số vi khuẩn chịu được hiếu khí như Streptococcus, chúng không có catalase, nhưng có các enzyme flavin (NAD - oxydase và NAD - peroxydase) cho phép chúng thực hiện sự cân bằng trong hô hấp ở màng tế bào chất. Tuỳ thuộc vào số lượng và lượng các enzyme có thể phân giải H2O2 mà quyết định tính hiếu khí hay kỵ khí ở các vi khuẩn. Lên men để chỉ sự có mặt của chuỗi vận chuyển electron nằm trong tế bào chất, không có sự tự động đi qua của dòng electron hoặc proton ở phần bên này và phần bên kia của màng tế bào (một dòng vận chuyển thứ
116 cấp được thiết lập nếu cần thiết, nhờ năng lượng của ATP). Về phương diện trao đổi năng lượng, đây cũng là một quá trình ôxy hóa khử, nhưng chất nhận electron cuối cùng là các hợp chất hữu cơ, chứ không phải là các phân tử ôxy. Quá trình này cũng giải phóng năng lượng nhưng ít hơn nhiều so với quá trình hô hấp. Các hợp chất cho electron (AH2) và chất nhận electron (B) đều là các hợp chất hữu cơ. Việc vận chuyển electron được thực hiện nhờ NAD. Ở đây có sự khác biệt rõ rệt so với hô hấp về bản chất của chất vận chuyển electron về sản phẩm cuối cùng... Cơ chế vận chuyển electron trong quá trình lên men được tóm tắt như sau: NAD+ AH2 BH2 A NADH2 B 3. Nghiên cứu sự trao đổi năng lượng Sự khác biệt về các phản ứng ôxy hóa khử ở các nhóm vi sinh vật khác nhau là một tiêu chuẩn dùng để định loại chúng, một số nhà nghiên cứu đề xuất những phương pháp và môi trường có thể định loại nhanh chóng và đơn giản các nhóm vi sinh vật. 3.1 Nghiên cứu kiểu hô hấp Để xác định kiểu hô hấp của một loại vi khuẩn, trong phòng thí nghiệm người ta sử dụng môi trường VF (nước thịt - gan) đã chế đặc và đưa vào ống nghiệm, rồi cấy giống vào sâu, dựa vào khả năng phát triển trong các ống nghiệm ta biết được đó là loại hô hấp gì. 3.2 Dùng phản ứng oxydase Phản ứng này cho phép sự có mặt của chuỗi hô hấp đang hoạt động với cytochrome C ở màng nhờ TMPD (tetra - methyl - paraphenylene - diamine). Phản ứng này đặc biệt hiệu quả đối với vi khuẩn G-, phản ứng dương tính với các vi khuẩn hiếu khí bắt buộc (trừ Pseudomonas maltophyla và Acinatobacter), phản ứng âm tính đối với các vi khuẩn kị khí không bắt buộc trừ các Vibrio và Aeromonas. Đặc biệt đối với các vi khuẩn đường ruột là có phản ứng âm tính mặc dù vi khuẩn này có chuỗi hô hấp với các cytochrome. 3.3 Thử catalase Enzyme catalase thường có ở các vi khuẩn G-, trừ các giống Streptococcus và Lactobacilus. Khi có mặt H2O2, một vài giọt huyền phù vi khuẩn có catalase dương sẽ làm sủi bọt giải phóng ôxy phân tử. Nếu:
117 - Sủi nhiều bọt: đó là huyền phù vi khuẩn hiếu khí - Sủi ít bọt: vi khuẩn hiếu - kị khí - Không có bọt: vi khuẩn kị khí 3.4 Phản ứng nitrate reductase Sự khử nitrate có thể được nghiên cứu trên môi trường có nitrate (môi trường lỏng hoặc đặc) để phát hiện sự có mặt của nitrite (nhờ thuốc thử Griess), có thể dẫn đến 2 kết quả theo 2 cơ chế khác nhau: - Khử nitrate đồng hóa được xúc tác bởi nitrate reductase B tạo nitrite, chất này có thể được chuyển hóa tiếp thành muối ammon là nguồn nitơ dễ được cơ thể sử dụng. - Khử nitrate dị hóa hay “hô hấp nitrate” dưới ảnh hưởng của nitrate reductase A và các enzyme khác, các nitrate sẽ được khử hoàn toàn thành N2O và N2 sẽ được giải phóng ngoài tế bào. Hô hấp nitrate là loại hô hấp kị khí. 3.5 Nghiên cứu kiểu trao đổi chất Nghiên cứu này được thực hiện nhờ sử dụng glucose làm cơ chất, loại đường được dùng phổ biến nhất ở nhiều loại vi khuẩn. Thí nghiệm cần nuôi cấy ở 2 điều kiện hiếu khí và kị khí. Sau khi nuôi ở tủ ấm với nhiệt độ thích hợp, có thể có 4 trường hợp xảy ra: - Vi khuẩn lên men khi có giống phát triển trong canh trường và làm acid hóa trong 2 ống nghiệm. - Vi khuẩn ôxy hóa khi nó chỉ làm acid hóa trong ống nghiệm ở điều kiện hiếu khí. - Vi khuẩn bất hoạt khi không thấy acid hóa trong cả 2 ống nghiệm. - Vi khuẩn kiềm hóa khi thấy môi trường bị kiềm hoá trong điều kiện hiếu khí, điều này có thể thấy khi dùng peptone. 3.6 Khử các sản phẩm lưu huỳnh Thí nghiệm khử các sản phẩm ôxy hóa của lưu huỳnh (sulfate, sulfite, thiosulfate v.v...) có thể thấy rõ nhờ tạo ra hydro được lưu huỳnh hóa (H2S...) phát hiện dưới dạng sulfua kim loại bị đen (sulfua sắt hay sulfua chì...). 3.7 Đo mức độ hô hấp Hô hấp kế (Respirometre) Warburg là dụng cụ đầu tiên dùng để xác định mức độ sử dụng ôxy của tế bào sống. Nó bao gồm một bình cách thủy chịu nhiệt để mẫu cần nghiên cứu. Mẫu này được đặt trong một bình chứa nối với một áp kế, bình chứa mẫu và áp kế tạo thành một nhánh được
118 cố định chắc chắn trên ống có mức nước di động, sự di chuyển ở đây là do sự giao động của mẫu nghiên cứu gây nên. Bình chứa mẫu được nối với một nhánh của bình cong của áp kế và được điều chỉnh để có một dung tích khí nhất định ở phần trên của mẫu nghiên cứu. Để loại bỏ ảnh hưởng của CO2 sinh ra trong quá trình hô hấp, người ta đặt một ống nhỏ giữa bình đựng mẫu nghiên cứu, trong đó, chứa KOH 10% để hấp thụ CO2 do quá trình hô hấp sinh ra. Sự thay đổi áp suất trong áp kế sẽ được tính chuyển nhờ dung tích ôxy tiêu thụ. Với dụng cụ hô hấp kế này không những dùng để đo sự tiêu thụ ôxy phân tử mà còn có thể nghiên cứu các phản ứng enzyme khác nữa, trong đó sự thay đổi khí xuất hiện do khử carbonic, khử amin hóa. 4. Sự tích trữ và sử dụng năng lượng 4.1. Các mối liên kết giàu năng lượng Tế bào sống tích trữ năng lượng vào các hợp chất và chúng có thể được giải phóng dễ dàng khi tế bào cần. Phản ứng hóa học phổ biến là thủy phân mối liên kết esterphosphate. Hợp chất được tế bào sử dụng thuận lợi và thường xuyên nhất là ATP. Ngoài ra còn có các hợp chất giàu năng lượng khác như các nucleotide UTP, GTP, CTP, TTP; các acylphosphate, ví dụ như 1-3 diphosphoglycerate; các enolphosphate như PEP; các acyl - thio - ester như CoA - SH. CH2 R- C-O∼P Ví dụ: PEP (G = - 53,5 Kj.mole -1) + Các acyl - thioester: O R-C-S∼P Ví dụ: Coenzyme A 4.2. Nguồn gốc hợp chất cao năng ATP có thể được tổng hợp bằng hai cơ chế: - Quá trình phosphoryl hóa cơ chất xảy ra trong tế bào chất. - Quá trình phosphoryl hóa liên hệ với gradien electron và proton xảy ra ở màng tế bào chất, ở đây người ta thấy có quá trình phosphoryl ôxy hóa và phosphoryl quang hóa (photophosphorylation). Trong cả hai trường hợp quá trình tổng hợp ATP phụ thuộc vào lượng ADP và phosphate vô cơ.
119 + Quá trình phosphoryl hóa cơ chất: trong quá trình này, một phosphate vô cơ được liên kết (nhờ xúc tác bởi enzyme) với các sản phẩm của sự phân giải. Hợp chất ôxy hóa là chất mang một mối liên kết phosphate giàu năng lượng và có thể được chuyển đến ADP. Kiểu hình thành ATP này thường thấy ở sự phân giải glucose theo con đường EMP (giai đoạn ôxy hóa 3 - phosphoglyceraldehyd thành acid 1,3- diphosphoglyceric và sự biến đổi hợp chất này thành acid pyruvic). + Quá trình phosphoryl hóa cũng liên hệ với gradien proton. Cả khi vận chuyển electron trong quá trình hô hấp (hiếu khí hoặc kị khí) cũng như trong quang hợp đã tạo ra một gradien proton quan trọng và nó là năng lượng dự trữ (có thể được so với một tụ điện được nạp sẵn), năng lượng dự trữ này có thể được thu hồi bằng cách để lại các proton một bên màng mà người ta thường so sánh như một động cơ sản sinh ATP. 5. Sự trao đổi carbohydrate 5.1. Sự phân giải carbohydrate Carbohydrate nếu ở dạng hợp chất có trọng lượng phân tử lớn phải được thuỷ phân thành các dạng đường đơn để có thể đi vào các con đường phân giải đường để cung cấp năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của cơ thể hoặc tạo ra các hợp chất trung gian cần cho sự chuyển hoá trao đổi chất. 5.2. Sự tổng hợp carbohydrate Tương tự như các thực vật bậc cao, vi sinh vật có khả năng tổng hợp các oligo - và polysaccharide. Lượng các oligo - và polysaccharide nội bào đạt tới 60% khối lượng khô của tế bào, còn polysaccharide ngoại bào có thể vượt nhiều lần khối lượng của vi sinh vật. Thành tế bào cũng chứa một lượng lớn polysaccharide. Tất cả các oligo và polysaccharide được tổng hợp bằng cách kéo dài chuỗi saccharide có trước nhờ việc thêm đơn vị monosaccharide (X). Đơn vị monosaccharide này tham gia vào phản ứng ở dạng nucleotide - monosaccharide được hoạt hóa, thường là dẫn xuất của uridine - diphosphate (UDP.X) nhưng đôi khi cùng với các nucleotide purine và pirimidine khác. Sự tổng hợp diễn ra theo phản ứng chung như sau: ...X.X.X.X.X.X + UDP - X = ...X.X.X.X.X.X.X. + UDP (n - nhánh) (n + 1 - nhánh) Trong trường hợp polysaccharide bao gồm hai loại monosaccharide liên tiếp (X và Y) phản ứng chung xảy ra qua hai bước: Bước 1: ...X.Y.X.Y.X.Y + UDP - X = ... X.Y.X.Y.X.Y.X. + UDP
120 Bước 2: ...X.Y.X.Y.X.Y.X + UDP - Y = ... X.Y.X.Y.X.Y.X.Y + UDP Con đường tổng hợp polysaccharide phân nhánh ta còn biết rất ít. Trong dịch chiết tế bào của một số loài nấm sợi có chứa enzyme kitine - sinthetase xúc tác phản ứng chuyển các nhánh N - acetylglucosamine từ UDP - acetylglucosamine đến phân tử nhận. Một cách tương tự việc tổng hợp mannan của thành tế bào nấm men cũng bao gồm việc chuyển các nhánh mannose từ GDP - mannose đến chất nhận. Trong việc tổng hợp tinh bột ở Chlorella và glycogen ở Arthrobacter có sự tham gia của ADP - glucose. - Tổng hợp glycogen: Khi có điều kiện ngoại cảnh hạn chế sự phát triển của vi khuẩn thì chúng có thể tích lũy glycogen nhờ hệ enzyme trùng hợp các glucose. Glycogen tích lũy dưới dạng các hạt trong chất ngyên sinh mà chúng ta có thể phát hiện bằng cách nhuộm màu với iode (hình 5.8). Hình 5.8 Sơ đồ tổng hợp glycogen - Tổng hợp levan và dextran: Các levan (poly β- 2,6-fructose) và các dextran (poly α-1,6 glucose) với sự phân nhánh α - 1,3 hoặc α -1,4 được tổng hợp từ saccharose theo phản ứng sau: n saccharose n glucose + (fructose)n n saccharose (glucose)n + n fructose Sự hình thành những hợp chất này chính là nguyên nhân của hiện tượng nhầy nhớt khi nuôi cấy một số loại vi khuẩn trên môi trường giàu saccharose. Các hợp chất polysaccharide cùng với hợp chất nitơ sẽ hình thành nên glycopeptide của thành tế bào. 6. Sự trao đổi protein 6.1. Sự phân giải protein Khác với lên men, cơ chất của quá trình thối rữa là protein. Đây là một trong những thành phần quan trọng của xác bã động vật, thực vật và vi sinh vật. Sự phân giải các hợp chất hữu cơ chứa nitơ có ý nghĩa to lớn
121 đối với nông nghiệp và đối với vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Người ta gọi quá trình phân giải này là quá trình ammon hóa (ammonification). Muốn phân giải protein, cũng như các hợp chất cao phân tử khác, trước hết vi sinh vật phải tiết ra protease ngoại bào và chuyển hóa protein thành các hợp chất có phân tử nhỏ hơn (polypeptide, olygopeptide). Các chất này tiếp tục được phân hủy thành acid amin nhờ các peptidase ngoại bào, hoặc được xâm nhập ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển hóa thành acid amin. Một phần các acid amin này được vi sinh vật sử dụng trong tổng hợp protein, một phần khác được phân giải theo nhiều con đường khác nhau để tạo NH3, CO2 và nhiều sản phẩm trung gian khác. Những vi sinh vật không có khả năng sản sinh các enzyme phân giải protein ngoại bào sẽ không đồng hóa được các loại protein thiên nhiên. Chúng chỉ có thể sử dụng được các sản phẩm thủy phân của protein. Rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau tham gia vào quá trình ammon hóa trong tự nhiên. Đáng chú ý là các vi sinh vật sau: - Vi khuẩn: Bacillus mycoides, B. subtilis, Proteus vulgais, Pseudomonas aeruginosa, E. coli... - Xạ khuẩn và nấm: Streptomyces griseus, S. fradiae, Aspergillus niger, A. awamori, Penicillium camemberti, Mucor spp., ... Trong cơ thể vi sinh vật, các acid amin thường được chuyển hóa nhờ quá trình khử amin, quá trình khử carboxyl hoặc đồng thời vừa khử amin vừa khử carboxyl. Khi phân giải các acid amin tùy theo từng loại phản ứng sẽ tạo các sản phẩm trung gian, đây là tiền chất cho các phản ứng sinh tổng hợp hoặc cần thiết cho một số quá trình trao đổi chất, như sự tạo thành acid fumaric từ acid aspactic: HOOC- CH2- CH (NH2) - COOH HOOC-CH=CH-COOH+ NH3 hay tạo α - ketoglutaric từ acid glutamic, acid acetic từ glycine, acid succinic từ aspactic...). Trong quá trình khử amin thủy phân có sự liên kết với các ion H+ và OH- như sự tạo thành acid lactic từ alanine: CH3-CH(NH2)-COOH + H2O CH3-CHOH-COOH + NH3