Ứng Dụng ‘Dấu’ Phân Tử Trong Công Tác Giống Cây Trồng

Chia sẻ: Lan Lan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:20

Thêm vào BST

Báo xấu

177
lượt xem 16
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khái niệm: Khái niệ Dấu (Marker) = đặc điểm dùng để̉ phân biệt/nhận diện điể dùng đê biệ t/nhậ diệ Dấu di truyền (Genetic Marker) = đặc điểm dùng để̉ phân điể dùng đê biệt/nhận diện về̀ bản chất di truyền biệ t/nhậ diệ vê bản chấ truyề Dấu phân tử (DNA Marker) = đặc điểm ADN dùng để phân biệt/nhận diện (về bản chất di truyền) Ứng dụng: Dùng để phân biệt/nhận diện sự khác nhau (về bản chất di truyền) giữa các cá thể/giống/loài Yêu cầu: + Khác nhau (Polymorphism) giữa các cá thể/các giống/các loài + mang...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ứng Dụng ‘Dấu’ Phân Tử Trong Công Tác Giống Cây Trồng

Chương 1 Ứng Dụng ‘Dấu’ Phân Tử Trong Công Tác Giống Cây Trồng Dấu phân tử (Molecular Markers/DNA Markers) 1
Sự khác biệt giữa cá thể/giống/loài = Polymorphism Phân biệt/nhận diện đặc điểm nhận diện – ‘Dấu’ ‘DNA Marker’ Khái Khái niệ niệm: Dấu (Marker) = đặc điể điểm dùng dùng để để phân biệ biệt/nhậ t/nhận diệ diện Dấu di truyền (Genetic Marker) = đặc điể điểm dùng dùng để để phân biệ biệt/nhậ t/nhận diệ diện về về bản bản chấ chất di truyề truyền Dấu phân tử (DNA Marker) = đặc điểm ADN dùng để phân biệt/nhận diện (về bản chất di truyền) Ứng dụng: Dùng để phân biệt/nhận diện sự khác nhau (về bản chất di truyền) giữa các cá thể/giống/loài Yêu cầu: + Khác nhau (Polymorphism) giữa các cá thể/các giống/các loài + mang tính đặc trưng và ổn định, ít/không bị thay đổi bởi đk ngoại cảnh 2
Đặc điểm của các loại ‘Genetic Marker’ Hình thái Marker Isozyme Protein ADN /Nông học Số lượng Marker + + +++ +++ Mức độ Polymorph. + + + +++ Đòi hỏi kỹ thuật + ++ +++ +++ Chịu t/động ngoại cảnh +++ ++ ++ + Phản ánh b/chất DT + ++ ++ +++ Dấu phân tử (Molecular Markers) = Dấu ADN (DNA Markers) Dấu phân tử được thiết lập và xác định dựa trên sự đa dạng (Polymorphism) xuất hiện ngẫu nhiên (Naturally) trên phân tử ADN (VD: mất, thay thế, thêm các base nitơ, hay thay đổi về ‘trình tự sắp xếp đặc biệt’ (patterns) của các base nitơ) Phân loại: có 2 nhóm dấu ADN - Dựa trên đột biến của 1 cặp base nitơ (thiếu, thay thế, thêm) làm thay đổi điểm nhận diện của Enz cắt giới hạn (regconition sites) (RFLP, SCAR, SNP), hoặc thay đổi trình tự vị trí gắn của ‘con mồi’ (primer) (RAPD), hoặc thay đổi cả 2 (AFLP) - Dựa vào sự thay đổi về số lượng đoạn lặp lại của 1 trình tự sắp xếp đặc biệt của phân tử ADN (repetitive motif) (SSR) 3
Kỹ thuật phân tích Dấu phân tử • Cắt ADN (Restriction Digestion) • Phản ứng PCR • Điện di ADN (Gel Electrophoresis) Các dạng DNA Marker trên TV Dựa trên kỷ thuật cắt bằng Enz. cắt giới hạn (Digestion): - RFLP (Restricted Fragment Length Polymorphism) - DArT (Diversity Array Technique) Dựa trên kỷ thuật PCR: - RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA Marker) - SSR (Simple Sequence Repeat) - ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) - SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Dựa trên Digestion + PCR: - AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) - SCAR (Sequence-Characterized Amplified Regions ) 4
Các dạng DNA Marker trên TV Dựa trên kỷ thuật Digestion: - RFLP (Restricted Fragment Length Polymorphism) - DArT (Diversity Array Technique) Dựa trên kỷ thuật PCR: - RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) - SSR (Simple Sequence Repeat) - ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) - SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Dựa trên Digestion + PCR: - AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) - SCAR (Sequence-Characterized Amplified Regions ) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Nguyên tắc: + Cắt ‘genomic ADN’ bằng Enz. cắt giới hạn + Điện di để phân tách các đoạn cắt Tìm và ghi nhận sự đa dạng (Polymorphism) Điểm nhận diện của mỗi Enz giới hạn có: + Trình tự đặc biệt của các base nitơ + Không phụ thuộc vào bất kỳ loại gien nào + Phân bố ngẫu nhiên khắp toàn bộ bộ gien của SV Kiểu gien ≠ = vị trí điểm nhận diện của Enz giới hạn ≠ Kết quả cắt ≠ (đoạn được cắt có chiều dài ≠) 5
RFLP (ttheo...) Enzymes cắt ADN ở vị trí chuyên biệt Điểm nhận diện thường có trình tự đối xứng (palindromes): 6 Nu-cutter GAATTC 4 Nu-cutter TCGA CTTAAG AGCT RFLP (ttheo.) RFLP ↔ Đa dạng về Dạng k/quả: điểm nhận diện của Có // Không Enz. cắt giới hạn 6
RFLP (ttheo.) RFLP = co-dominant (phân biệt được Heterozygote/Homozygote) RFLP (ttheo.) Ưu điểm: Mức độ đa dạng tương đối cao (Relatively High Polymorphism) Marker mang tính đồng trội (Co-dominant) Kết quả ổn định (Reproductive) Không cần biết trước thông tin về đối tượng NC Khuyết điểm: Đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và đắt tiền; Đòi hỏi số lượng lớn ADN Đòi hỏi ADN có độ sạch cao (tinh khiết) 7
RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA Markers) Nguyên tắc: + Sử dụng 1 con mồi ngắn (~10 bp) (Primer F = Primer R) + Kỹ thuật PCR Tổng hợp ngẫu nhiên các đoạn ADN trên khắp bộ gien (đoạn tổng hợp có chiều dài
RAPD (ttheo...) Hạn chế của PPháp B Băng B thực sự là do khác biệt về di truyền hay do sai sót về kỹ thuật ? Tính ổn định ??? A Cá thể 232 mang băng B là đồng hợp tử hay dị hợp tử ở locus B ? Trội hoàn toàn (Có/không) ??? RAPD (ttheo...) Ưu điểm: Phương pháp đơn giản, rẽ tiền và ít tốn thời gian nhất Không cần biết trước thông tin về đối tượng NC Không đòi hỏi số lượng lớn ADN Không đòi hỏi ADN có độ sạch cao (tinh khiết) Khuyết điểm: Marker không chuyên biệt (Unspecific) Marker mang tính trội (Dominant) Kết quả không ổn định (UnReproductive) 9
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) = RFLP + RAPD Nguyên tắc: + Cắt ‘Genomic ADN’ bằng Enz giới hạn + Gắn Adaptor ở 2 đầu mỗi đoạn được cắt + Kỹ thuật PCR với con mồi = Adaptor + Điện di để phân tích các đoạn ADN được tổng hợp Tìm và ghi nhận sự đa dạng (Polymorphism) AFLP = Đa dạng về điểm nhận diện của Enz giới hạn + Đa dạng về vị trí gắn của con mồi Mẫu A Mẫu B AFLP (Các bước cơ bản) Mẫu A B Adaptor 10
AFLP (cont.) Polymorph. (Đa hình) AFLP (ttheo...) Ưu điểm: Không cần biết trước thông tin về đối tượng NC Mức độ đa dạng rất cao (High Polymorphism) Marker tương đối chuyên biệt (specific) Kết quả rất ổn định (Reproductive) được áp dụng trên nhiều loài SV khác nhau Khuyết điểm: Phương pháp tương đối phức tạp và tốn kém Marker mang tính trội (Dominant) Đòi hỏi số lượng ADN tương đối lớn Đòi hỏi ADN có độ sạch cao (tinh khiết) 11
VNTR: Variable Number Tandem Repeats • Vùng không mang thông tin DT (Non-coding) • Nhiều đoạn lặp (copy) của cùng 1 trình tự đặc biệt (Motifs) • Đa dạng (Polymorphism) rất cao giữa các cá thể cùng loài = Khác biệt về số lượng đoạn lặp của 1 trình tự đặc biệt SSR (Simple Sequence Repeat = MicroSatellite) VNTR 12
SSR (Simple Sequence Repeats/Microsatellites) SSR có trong bộ gien của tất cả SV nhân thật (Eukaryote) và có chứa từ vài đến vài trăm đoạn lặp (Copies) của 1 trình tự đặc biệt (Motif) từ 1-4 base nitơ • Rất đa dạng (nhiều alen/locus) • Rất nhiều locus SSR (hàng 1000 locus) trong mỗi loài SV Nguyên tắc: + Kỹ thuật PCR với 2 con mồi (F/R) tương ứng với 2 đầu của SSR + Điện di để phân tách các đoạn được tổng hợp Tìm và ghi nhận sự đa dạng 13
SSR (ttheo...) • Thường sử dụng đề tìm sự đa dạng trong cùng loài; • Thường sử dụng để tìm quan hệ gia phả SSR (ttheo...) Ưu điểm: Mức độ đa dạng rất cao (High Polymorphism) Phương pháp nhanh và rẽ tiền Marker mang tính đồng trội (Co-Dominant) Không đòi hỏi số lượng và chất lượng ADN Marker chuyên biệt (specific) Kết quả rất ổn định (Reproductive) Khuyết điểm: Cần biết trước thông tin về đối tượng NC Đối tượng áp dụng có giới hạn Cần nhiều thời gian và công sức để thu thập thông tin trước về đối tượng NC 14
SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Các dạng SNP 15
MicroArray Slide spot pingroup subarray gene SNP (ttheo...) Stable (L.kết bền) Unstable (L.Kết không bền) L.k L.kếết không bề bền có có thể thể bị cắt bằ bằng Enz. S1 hoặ hoặc bị bị tách tách thành thành mạ mạch đơn ở nhữ những đk đặ đặc biệ biệt 16
DArT (Diversity Array Technique Marker) DArT = AFLP + Array DArT = Đa dạng về điểm nhận diện của Enz cắt giới hạn (Thay đổi 1 Nu hay mất đoạn, thêm đoạn) Nguyên tắ tắc: + Thi Thiếết kế kế Chip dự dựa trên cá các thông tin đã đã biế biết trướ trướcc (đoạn oạn biế biết trướ trước) c) + Đoạn oạn chưa biế biết đượ đượcc nhân lên và và gắn mà màu huỳ huỳnh nh quang + Cho Cho lai đoạ đoạn n chưa biế biết // // đoạn oạn đã đã biế biết + Rữa và và đọc kế kết quả quả A Diversity Array Panel of 4 parents of CIAT’ CIAT’s 2 cassava mapping populations onto which was hybridized Cy3- Cy3- and Cy5- Cy5-labeled cloned amplicons of 2 of these parents. 17
Nguyên tắc phát hiện đa dạng (Diversity Arrays) Genotype1 Genotype2 A B C D E F G H Dấu phân tử ‘lý tưởng’ ??? Cần có 5 ưu điểm: • Có mức độ đa dạng từ cao rất cao • Mang đặc tính đồng trội • Phân bố ngẫu nhiên và rộng khắp bộ gien của SV • Dễ thực hiện và rẽ tiền • Có tính ổn định cao 18
Đặc điểm của các dấu ADN (DNA Markers) RFLP RAPD AFLP SSR DArT Polymorphisme ++ ++ ++ +++ +++ Technical Facilities + +++ ++ + + Prior Information + - - + - Reproductivity +++ + ++ +++ +++ Automation - +/- +/- +/- +++ (Karp et al., 1997; O’Hanlon et al., 2000 ) Ứng dụng của dấu phân tử Dấu phân tử được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: – Nghiên cứu và phân tích ngân hàng vật liệu di truyền, – ChNn đoán về di truyền, – Khảo sát và lập lý lịch giống hoặc các SV chuyển gien – N ghiên cứu bộ gien – Phân tích phả hệ và sự quan hệ giữa các SV trong quá trình tiến hóa – Tìm sự liên kết giữa dấu phân tử và các đặc điểm mong muốn chọn giống 19
Câu hỏi ??? 20