Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- TRẦN THỊ HỒNG XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƢ LƢỢNG KHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM TƢƠI SỐNG TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC/MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- TRẦN THỊ HỒNG XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƢ LƢỢNG KHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM TƢƠI SỐNG TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC/MS/MS

Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số:

60 44 29

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO

Hà Nội – 2012

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................... 3

1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran ....................................................... 3

1.1.1. Nhóm nitrofuran là gì? ...................................................................................... 3

1.1.2. Các chất nhóm nitrofuran ................................................................................. 3

1.2. Tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran……………………… …….6 1.3. Dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm ..................................... 6

1.4.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV ....................................................... 6

1.4.2. Phƣơng pháp phân tích vi sinh (enzyme-linked immunosorbent assay-

ELISA) ........................................................................................................................ 7

1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS .............................................. 8

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 11

2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu ..................................................... 11

2.1.1. Đối tƣợng, mục tiêu nghiên cứu ...................................................................... 11

2.1.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 11

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 12

2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ ................................................................. 12

2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu .................................................................................. 18

2.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu ........................................................................ 23

2.3.1. Dụng cụ, thiết bị .............................................................................................. 23

2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn ........................................................................................ 24

2.3.3 Pha chế chất chuẩn ........................................................................................... 25

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 27

3.1. Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS ......... 27

3.1.1. Khảo sát các điều kiện khối phổ ..................................................................... 27

3.1.2. Lựa chọn cột tách ............................................................................................ 29

3.1.3. Khảo sát chƣơng trình gradient ....................................................................... 30

3.1.4. Khảo sát quy trình chiết mẫu .......................................................................... 33

3.2. Thẩm đi ̣nh phƣơng pháp .................................................................................... 38 3.2.1 Tính đặc hiệu .................................................................................................... 38

3.2.1. Khảo sát lập đƣờng chuẩn ............................................................................... 38

3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp ......................... 43

3.2.3. Độ lặp lại và độ thu hồi ................................................................................... 46

KẾT LUẬN ............................................................................................................... 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 56

DANH MỤC CÁ C BẢNG

STT Nội dung Trang

Bảng 1.1 4

Cấu trú c hóa ho ̣c củ a mô ̣t số chất nhóm nitrofuran đƣơ ̣c xác đi ̣nh trong đề tai

Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI 27

Bảng 3.2 Kết quả bắn phá các ion mẹ 28

Năng lƣợng bắn phá và các ion con của các chất 29 Bảng 3.3 chuyển hóa nitrofuran

Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng 35 Bảng 3.4 chiết lỏng – lỏng

Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng 37 Bảng 3.5 chiết pha rắn

Bảng 3.6 37 So sánh độ thu hồi của 2 quá trình chiết

Bảng 3.7 Phƣơng trình hồi quy 4 nitrofuran sử dụng nội chuẩn 41

Bảng 3.8 Phƣơng trình hồi quy 4 nitrofuran không sử dụng nội 43

chuẩn

Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện của AOZ trên nền mẫu thịt 44

Bảng 3.10 Giới hạn phát hiện của AMOZ trên nền mẫu thịt 45

Bảng 3.11 Giới hạn phát hiện của AHD trên nền mẫu thịt 45

Bảng 3.12 Giới hạn phát hiện của SEM trên nền mẫu thịt 46

Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền 47 Bảng 3.13 mẫu thịt lợn tại 1 ppb

Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền 48 Bảng 3.14 mẫu thịt lợn tại 1,5 ppb

Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền 49 Bảng 3.15 mẫu thịt lợn tại 2 ppb

Bảng 3.16 Kết quả phân tích trên mẫu thực 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

Nội dung STT Trang

Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ 13

Hình 2.2 Sơ đồ phân tích khối phổ 3 tứ cực 16

Hình 2.3 Các bƣớc của quá trình chiết pha rắn 19

Hình 3.1 30 Sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient

1 ở nồng đồ 20 ng/ml

Hình 3.2 31 Sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient

2 ở nồng đồ 20 ng/ml

Hình 3.3 31 Sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient

3 ở nồng đồ 20 ng/ml

Hình 3.4 32 Sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient

4 ở nồng đồ 20 ng/ml

Hình 3.5 32 Sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient

5 ở nồng đồ 20 ng/ml

Hình 3.6 35 Sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p

Hình 3.7 38 nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 20 ng/ml sƣ̉ du ̣ng quy trình chiết lỏng - lỏng Sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p

nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 20 ng/ml sƣ̉ du ̣ng quy trình chiết pha rắn Đƣờng chuẩn AOZ sử dụng nội chuẩn Hình 3.8 39

Hình 3.9 Đƣờng chuẩn AMOZ sử dụng nội chuẩn 39

Hình 3.10 Đƣờng chuẩn SEM sử dụng nội chuẩn 40

Hình 3.11 Đƣờng chuẩn AHD sử dụng nội chuẩn 40

Hình 3.12 Đƣờng chuẩn AOZ không sử dụng nội chuẩn 41

Hình 3.13 Đƣờng chuẩn AMOZ không sử dụng nội chuẩn 42

Hình 3.14 Đƣờng chuẩn AHD không sử dụng nội chuẩn 42

Hình 3.15 Đƣờng chuẩn SEM không sử dụng nội chuẩn 43

Hình 3.16 47 Sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p

nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 1 ng/g

Hình 3.17 48 Sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p

nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 1,5 ng/g

Hình 3.18 49 Sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p

nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 2 ng/g

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

Collision Gas Presure Áp suất khí mang trong tứ cực Q2 CAD

Collision Energy Thế áp vào tứ cực Q CE

Curtain Gas Khí mang CUR

Collision Cell Exit Potential Thế áp giữa tứ cực Q2 và Q3 CXP

Declustering Potential Thế đầu vào áp vào màn chắn DP

Entrance Potential Thế áp vào nguồn ion mẹ EP

Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử ESI

European Union Liên minh châu Âu EU

Ion Source Gas 1 Áp suất khí hai bên đầu phun GS1

Ion Source Gas 2 Áp suất của luồng khí nóng GS2

High performance liquid Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC chromatography

Identification point IP Điểm nhâ ̣n da ̣ng

IonSpray Voltage Thế ion hóa IS

Liquid chromatography – Sắc kí lỏng khối phổ LC – MS mass spectrometry

Limit of detection Giới hạn phát hiện LOD

Limit of quality Giới hạn định lƣợng LOQ

MeOH Methanol Methanol

Minimum required Yêu cầu giới hạn hiệu năng nhỏ nhất MRPL performance limit của phƣơng pháp

RSD% Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn

TEM Temperature Nhiệt độ của nguồn khí nóng thổi vào

MỞ ĐẦU

An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề đang đƣợc cả xã hội quan tâm, đặc biệt

là ở đô thị và các khu công nghiệp, khi ngày càng có nhiều tác nhân độc hại bị phát

hiện trong thực phẩm khiến dƣ luận lo ngại. Tuy nhiên trong lĩnh vực sản xuất kinh

doanh nói chung và trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nói riêng còn nhiều vấn đề

đáng lo ngại, nhƣ việc quản lý sử dụng thuốc kháng sinh còn lỏng lẻo, tình trạng sử

dụng các chất bổ trợ trong chăn nuôi khá tùy tiện. Từ đó đã để lại tồn dƣ các hóa

chất, kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi, gây nguy hại nghiêm trọng đến sức

khỏe ngƣời tiêu dùng.

Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp thƣờng đƣợc sử dụng cho vào thức ăn gia súc để kích thích tăng trƣởng và là phƣơng pháp điều trị dự phòng, điều

trị các bệnh nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa gây ra bởi Escherichia và Salmonella trong

chăn nuôi gia súc, gia cầm. Chúng cũng đã đƣợc sử dụng để điều trị nhiễm trùng do

vi khuẩn và sinh vật đơn bào trong nuôi trồng thủy sản...Vì vậy sự tồn dƣ của

chúng gây tác hại cho sức khỏe con ngƣời, đặc biệt là gây ung thƣ và đột biến ở

ngƣời. Năm 2002 – 2003 phát hiện dƣ lƣợng chất chuyển hóa của nitrofuran trong

số lƣợng lớn các mẫu từ gia cầm và nuôi trồng thủy sản các sản phẩm nhập khẩu

vào Châu Âu từ một số khu vực Đông Nam Á và các nƣớc Nam Mỹ. Từ đó đã dẫn

đến lệnh cấm sử dụng nitrofuran trong sản xuất thực phẩm động vật tại nhiều quốc

gia bao gồm Mỹ, Canada và EU... Các nƣớc này đã đặt lệnh cấm trên tất cả các loại

thực phẩm nhập khẩu có chứa dƣ lƣợng nitrofuran. Tháng 3 năm 2003 EU đã quy

định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phƣơng pháp (MRPL) đối với các chất

chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29]. Năm 2002, ở Việt Nam, Bộ nông

nghiệp và phát triển nông thôn đã quyết định cấm sản xuất, nhập khẩu, lƣu thông và

sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản xuất và kinh doanh TACN trong

đó có nitrofuran [9].

Hiện nay việc sử dụng dƣ lƣợng kháng sinh sai mục đích đang ở mức báo động

ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời và động vật. Vì vậy với nhu cầu bức thiết về vấn

đề đảm bảo VSATTP, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phát triển phƣơng pháp

“Xác định đồng thời dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại

thực phẩm tƣơi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối

phổ LC/MS/MS”.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran

1.1.1. Nhóm nitrofuran là gì?

Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp có chứa nhóm 5-nitro, thƣờng

đƣợc sử dụng làm thức ăn gia súc kích thích sự tăng trƣởng, chủ yếu đối với gia súc

(nhƣ gia cầm, lợn), nuôi trồng thủy sản (cá, tôm) và nuôi ong để điều trị các vi

khuẩn và sinh vật đơn bào nhiễm trùng nhƣ viêm ruột tiêu hóa gây ra bởi

Escherichia coli và Salmonella spp, gia cầm bệnh tả và bênh cầu trùng màu đen đầu

[12].

1.1.2. Các chất nhóm nitrofuran

Các chất nhóm n itrofuran bao gồm Furazolidone, furaltadone, furazolidone,

nitrofurazone, khi đi vào cơ thể sinh vâ ̣t nó tạo thành các chất chuyển hóa tƣơng ứng (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) liên kết trong các mô tồn ta ̣i trong nhiều tuần sau

khi sƣ̉ du ̣ng [12]. Ví dụ nhƣ quá trình chuyển hóa của nitrofurazone nhƣ sau :

Bảng 1.1: Cấu trú c hóa ho ̣c củ a mô ̣t số chất nhóm nitrofuran đƣơ ̣c xác đi ̣nh trong đề tài

Khố i

lƣơ ̣ng Công thƣ́ c STT Các chất nitrofuran phân Công thƣ́ c cấ u ta ̣o phân tƣ̉ tƣ̉

(g/mol)

AOZ 102,09 1 C3H6N2O2 3-amoni-2-oxazolidinone

NPAOZ

3-(2-nitrobenzylidenamino)- 235,2 2 C10H9N3O4 2-oxazolidinone)

AMOZ

3 3-amoni-5-morpholinomethyl 201,22 C8H15N3O3

-1,3-oxazolidinone

NPAMOZ

5-(morpholinomethyl)-3-(2-

4 nitrobenzylidenamino)-2- C15H18N4O5 334,33

oxazolidinone

AHD 5 116,05 C3H5N3O2 1-aminohydantoin

NPAHD

6 [3-(2-nitrobenzylidenamino) 248,19 C10H8N4O4

-2,4-imidazolidinedione]

SEM CH5N3O 7 75,08 semicarbazide

NPSEM

3[(2-nitrophenyl)methylene]- 208,174 C8H8N4O3 8 hydrazinecarboxamide

1.2. Tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran

McCracken và các cô ̣ng sƣ̣ 1995, Nouws và Laurensen 1990 chỉ ra rằng các

hợp chất nhóm nitrofuran sau khi vào cơ thể tạo thành các chất chuyển hóa tƣơng

ứng liên kết trong các mô.

Về mặt cơ chế tác dụng, các chất chuyển hóa tƣ̀ nitrofuran đã kìm hãm hoặc

phá hủy các hệ thống men điều hòa trao đổi chất ở vi khuẩn. Do đó vi khuẩn không

phát triển và không sinh sản đƣợc nữa. Tác dụng tốt với vi khuẩn gram âm và gram

dƣơng. Đồng thời còn tác dụng cả với nguyên sinh động vật, một số chất có tác

dụng tốt trong viê ̣c giê ̣t trƣ̀ giun đũa [7].

Vớ i n ồng độ thấp, nitrofuran có tác dụng kháng sinh, nồng độ cao có tác

dụng diệt khuẩn.

Theo nhiều báo cáo, nitrofuran tác dụng rất tốt trong viê ̣c diê ̣t khuẩn

salmonellosis, colisepticeamia. Nitrofuran còn có tác dụng kích thích dinh dƣỡng.

Trộn nitrofuran với thức ăn, theo tỉ lệ thích hợp sẽ giúp cho gà và lợn còn tăng trọng

nhanh.

Nitrofuran ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời nhƣ gây ung thƣ và đột biến

[7], khi thƣ̣c phẩm có tồn dƣ nitrofuran và các dẫn xuất củ a nó .

Do đó hầu hết các nƣớ c trên thế giớ i đã cấm sƣ̉ du ̣ng kháng sinh nhóm nitrofuran trong chăn nuôi. Ở Việt Nam, bô ̣ Nông nghiê ̣p và phát triển nông thôn đã quyết đi ̣nh cấm sƣ̉ du ̣ng ni trofuran cho vào trong thƣ́ c ăn chăn nuôi [9]. EU đã quy

định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phƣơng pháp (MRPL) đối với các chất

chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29].

1.3. Dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm

Từ năm 2002 – 2003 nitrofuran thƣờng xuyên đƣơ ̣c phát hiện thấy trong thịt

gia cầm và các sản phẩm nuôi trồng thủy sản nhập khẩu vào các nƣớc EU từ Thái

Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Việt Nam, Ecuador và Brazil [25].

Hơn nữa, dƣ lƣợng nitrofuran cũng đƣợc tìm thấy trong sản phẩm gia súc và

gia cầm ở Châu Âu nhƣ: Bồ Đào Nha, Ý, Hy Lạp, Romania và Bulgari. Sau đó EU

đã kiểm tra và cho thấy nitrofuran ô nhiễm trong các sản phẩm có nguồn gốc từ hơn

9 quốc gia trong năm 2007, tỷ lệ mắc cao nhất là từ Ấn Độ (37%), Trung Quốc

(37%), Bangladesh (10%) và Thái Lan (5%) trong một loạt cá sản phẩm bao gồm

tôm, mật ong và thịt hộp [25].

Từ tháng 10/2006 đến tháng 5/2007, FDA liên tục phát hiện thủy sản nhập

khẩu từ Trung Quốc có nhiễm nitrofuran. Kết quả lấy trên các sản phẩm tôm, cá trê,

cá ba sa..cho thấy, 22/89 mẫu (chiếm 22%) bị phát hiện có chất cấm nitrofuran

trong tôm [11].

Ở Việt Nam theo kết quả khảo sát của TS . Nguyễn Quốc Ân , phó trƣởng

phòng quản lý thuốc , cục thú y vào năm 2007 đã phát hiện 5 mẫu thủ y sản nuôi lấy

tại ao nuôi nhiễm SEM (3 mẫu tôm, 1 mẫu cá và 1 mẫu cua lô ̣t) vớ i hàm lƣơ ̣ng tƣ̀ 0 – 3,55 ng/g. Năm 2008 phát hiện 1 mẫu tôm thẻ chân trắng ta ̣i Phú Mỹ – Bình Định nhiễm AOZ vớ i hàm lƣơ ̣ng 12,6 ng/g; 2/754 mẫu cua lô ̣t ta ̣i Cần Guô ̣c – Long An nhiễm SEM vớ i hàm lƣơ ̣ng tƣ̀ 2 – 2,2 ng/g [1].

1.4. Các phƣơng pháp xác định kháng sinh nhóm nitrofuran

Hiê ̣n nay có nhiều phƣơng pháp để xác đi ̣nh kháng sinh nhóm nitrofuran , bao gồm: phƣơng pháp sắc ký lỏng v ới detector UV , phƣơng pháp vi sinh (kỹ thuật

Elisa), phƣơng pháp sắc ký lỏng vớ i detector MS/MS.

1.4.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV

Một số tác giả đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector tử ngoại khả

kiến (HPLC-UV-VIS) để phân tích kháng sinh nhóm nitrofuran và các dẫn xuất của

nó trong một số đối tƣợng thực phẩm. Horne và cộng sự, đã xây dựng phƣơng pháp

xác định AOZ, AMOZ trong gan lợn sử dụng HPLC – UV. Phƣơng pháp dựa trên

sự dẫn xuất các nitrofuran với 2-nitrobenzaldehyde, sau đó chiết với ethyl acetate,

làm sạch bằng n-hexan và phân tích bằng HPLC-UV sử dụng cột C18 kết hơ ̣p vớ i

detector UV ở bƣớ c sóng 275nm. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 5 và 10

µg/kg tƣơng ứng cho AOZ và AMOZ vớ i độ thu hồi trong khoảng 71-101% [18].

Tác giả Cooper và cộng sự cũng giới thiệu phƣơng pháp xác định AOZ,

AMOZ, AHD, SEM trong gan và thận của lợn dùng HPLC-UV đã tách đƣợc 4 chất

chuyển hóa nhóm nitrofuran. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là từ 2 – 5 µg/kg

[21].

là dễ thực hiện , và có thể ứng dụng Phƣơng pháp HPLC -UV có ƣu điểm

phân tích rô ̣ng rãi . Tuy nhiên phƣơng pháp la ̣i không đáp ƣ́ ng đƣơ ̣c yêu cầu về đô ̣ nhạy để phân tích các nitrofuran trong thực phẩm vì hiện nay giới hạn cần phải đạ t

tớ i (MRPL) là 1 µg/kg.

1.4.2. Phƣơng pháp phân tích vi sinh (enzyme-linked immunosorbent assay-

ELISA)

Hiện nay, ELISA đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu nhƣ

y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lƣợng

các sản phẩm sinh học. Nguyên tắc chung đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa

kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme, enzyme

sẽ thủy phân thành một chất có màu .

Phòng thí nghiệm randox của Anh đã nghiên cứu xác định các chất chuyển

hóa nhóm nitrofuran sử dụng phƣơng pháp Elisa: mẫu đƣợc đồng nhất, thủy phân

và dẫn xuất bằng o-NBA trong môi trƣờ ng axit HCl , trung hòa axit bằng NaOH, chiết và làm sạch mẫu bằng ethyl acetate và n-hexane. Giới hạn phát hiện của

phƣơng pháp từ 0,2 – 0,6 ng/g [28].

Vass và cộng sự (2008) sử dụng kỹ thuật Elisa trực tiếp sử dụng kháng thể

đặc hiệu cho NPSEM, kháng thể đƣợc gắn 1 enzym HRP xác định SEM trong trứng

với quy trình xử lý mẫu: mẫu đƣợc đồng nhất, thủy phân và dẫn xuất bằng o-NBA

trong môi trƣờ ng axit HCl , sau đó trung hòa bằng NaOH, chiết và làm sạch mẫu

bằng ethyl acetate và n-hexane. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 0,13 µg/kg,

CCα = 0,3 µg/kg [25].

Diblikova và cộng sự (2005) giớ i thiê ̣u kỹ thuật Elisa trực tiếp, sử dụng

kháng thể đặc hiệu cho NPAOZ, kháng thể đƣợc gắn 1 enzym HRP xác định AOZ

trong tôm, thịt gà, thịt lợn, thịt bò với CCβ là 0,4 µg/kg, độ thu hồi từ 66 – 119%

[20].

Lui và cộng sự (2007) giớ i thiê ̣u kỹ thuật Elisa gián tiếp, sử dụng kháng thể

NFT, kháng thể đƣợc gắn 1 enzym HRP xác định AHD trong nƣớc. Giới hạn phát

hiện là 0,2 µg/l, độ thu hồi từ 88 – 103% [31].

Tƣơng tự Chang và cộng sự (2008) xác định trong gan lợn, gan gà và cá với

giới hạn phát hiện lần lƣợt là 0,19; 0,24; 0,18 µg/kg [15].

Phƣơng pháp Elisa đáp ƣ́ ng đƣơ ̣c yêu cầu về đô ̣ nha ̣y , đơn giản dễ thƣ̣c hiê ̣n ,

tuy nhiên đô ̣ đă ̣c hiê ̣u bi ̣ giớ i ha ̣n vì phải đánh dấu cho tƣ̀ ng kháng thể chuyên biê ̣t cho tƣ̀ ng đối tƣơ ̣ng.

1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS

Đây là một phƣơng pháp nhanh, nhạy để xác định đồng thời dƣ lƣơ ̣ng

nitrofuran. Sau khi qua cột tách, chất phân tích đƣợc hóa hơi, các hợp chất hữu cơ

trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện

dƣơng hoặc âm, các gốc tự do. Sau đó, các ion đựơc đƣa sang bộ phận tách theo

khối lƣợng. Từ các tín hiệu thu đƣợc, dựa vào khối lƣợng ion phân tử, dựa vào đồng

vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ

liệu các ion và mảnh ion, ngƣời ta định tính và định lƣợng đƣợc chất phân tích một

cách chính xác.

Ở Việt Nam năm 2004, Bộ Thủy sản (nay là Bộ Nông nghiệp và phát triển

nông thôn) đã ban hành TCN 194:2004 xác định các chất chuyển hóa thuộc nhóm

nitrofuran trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối

phổ phân tích dƣ lƣợng liên kết với mô của các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong sản phẩm thủy sản đƣợc thủy phân bằng axit clohydric loãng để thu đƣợc

mạch nhánh của các chất nhóm nitrofuran. Các mạch nhánh này đƣợc dẫn xuất bằng

2-nitrobenzaldehyde, sau đó đƣa pH đến 7 và đƣợc chiết bằng ethyl axetat. Dịch

chiết đƣợc thổi khô bằng N2 đến cạn, hòa tan cặn, sau đó đo dung di ̣ch mẫu này

bằng hệ thống LC/MS/MS vớ i pha đô ̣ng kênh A là axit acetic , kênh B là acetonitril .

Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 1 µg/kg [10].

Năm 2002 phòng thử nghiệm thức ăn chăn nuôi của Thái Lan đƣa ra quy

trình phân tích 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran (AOZ, AMOZ, AHD, SEM)

bằng LC/MS/MS giới hạn phát hiện lần lƣợt của từng chất là AHD 0,1 µg/kg; AOZ

0,04 µg/kg; SEM 0,15 µg/kg; AMOZ 0,02 µg/kg [29].

Tác giả Pascal Mottier và cộng sự, xác định 4 chất chuyển hóa nhóm

nitrofuran trong thịt bằng LC/MS/MS vớ i pha đô ̣ng kênh A là axit acetic 0,025%, kênh B là acetonitril , sƣ̉ du ̣ng quy trình làm sạch bằng cột chiết pha rắn polymeric trƣớc khi phân tích bằng LC/MS/MS và thu đƣợc CCα từ 0,11 – 0,21 µg/kg, CCβ từ

0,19 – 0,36 µg/kg [26].

Trong tài liê ̣u [25] của tác giả M.Vass, tác giả Boket và cộng sự (2007) xác

định các chất chuyển hóa nitrofuran trong trứng bằng LC/MS/MS, CCα lần lƣợt của

từng chất AOZ, AMOZ, AHD, SEM là 0,03; 0,05; 0,22; 0,2. Độ thu hồi từ 95,2 –

102,1 %.

Leitner và cộng sự xác định các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt

gia súc, gia cầm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS vớ i pha đô ̣ng kênh A là amoniacetat 10mM, kênh B là methanol, sƣ̉ du ̣ng quá trình làm sa ̣ch bằng cột chiết pha rắn SPE với chất hấp thụ polystyrene đƣợc kết hợp bằng cách thủy

phân các chất chuyển hóa hình thành liên kết trong các mô và đƣợc dẫn xuất bằng

2-nitrobenzaldehyde. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 0,5 – 5 ng/g; giới hạn

định lƣợng từ 2,5 – 10 ng/g [12].

Verdon và cộng sự năm 2007 cũng giới thiệu phƣơng pháp xác định các

chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt lợn bằng LC/MS/MS vớ i cô ̣t C 18, pha

đô ̣ng kênh A là amonifomiat 1mM, kênh B là methanol, sử dụng phƣơng pháp chiết

lỏng – lỏng thu đƣơ ̣c CCα = 0,08 – 0,54 µg/kg và CCβ = 0,10 – 0,66 µg/kg [19].

Tác giả C.Bock và cộng sự đã thẩm định phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng 4

chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong trứng bằng LC/MS/MS vớ i CCα từ 0,03 – 0,22 µg/kg [14].

Các t ác giả Chung-Wei Tsai, Chuan-ho Tang và Wei-Hsien Wang đã xác

định các chất chuyển hóa nitrofuran trên LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là

amoniacetat 20mM, kênh B là methanol có giới hạn định lƣợng 1 µg/kg vớ i CCα =

0,19 – 0,43 µg/kg. Khoảng tuyến tính từ 1 – 10 µg/kg [16].

Tác giả Lech Rodziewicz (2008), xác định các chất chuyển hóa nitrofuran

trong sữa bằng LC/MS/MS vớ i pha đô ̣ng kênh A là amoniacet at 0,5mM, kênh B là methanol. Phƣơng pháp có hê ̣ số biến thiên nhỏ hơn 9,3%, độ tái lập nội bộ nhỏ hơn

13%, CCα từ 0,12 – 0,29 µg/kg, CCβ từ 0,15 – 0,37 µg/kg [22].

Tác giả Caroline Douny và cộng sự (2012), đã xác định các chất chuyển

hóa nhóm nitrofuran, nghiên cứu ứng dụng để đánh giá furanzolidone trong tôm sú

ở Việt Nam. Mẫu đƣợc đồng nhất, thủy phân và dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyte,

chiết lỏng – lỏng bằng etylacetat trƣớc khi xác định bằng hệ thống LC/MS/MS vớ i

pha đô ̣ng kênh A là axit acet ic 0,1%, kênh B là acetonitril thu đƣơ ̣c CCα từ 0,08 – 0,36 µg/kg, CCβ từ 0,12 – 0,61 µg/kg [13].

Tóm lại: Các phƣơng pháp (phƣơng pháp sắc ký lỏng vớ i detector UV -VIS, phƣơng

pháp hóa sinh Elisa , phƣơng pháp s ắc ký lỏng với detector MS /MS) đều có điểm

chung là thủy phân để đƣa các chất chuyển hóa nitrofuran liên kết trong các mô

thành dạng tự do sau đó sử dụng 2-nitrobenzaldehyde để chuyển nitrofuran thành

các dẫn xuất tƣơng ứng. Các dẫn xuất này sau đó đƣợc chiết lỏng lỏng hoặc chiết

pha rắn và phân tích bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ. Phƣơng pháp này có

ƣu điểm là có độ nhạy rất tốt, thƣờng từ 0,1 µg/kg có độ chọn lọc cao và có độ

chính xác đáp ứng để xác định nitrofuran trong thực phẩm. Do đó trong nghiên cứu

đề tài chúng tôi thống nhất lựa chọn phƣơng pháp LC-MS/MS với quá trình thủy

phân bằng axit clohydric và dẫn xuất với 2-nitrobenzaldehyde để xác định các chất

chuyển hóa của nitrofuran.

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1. Đối tƣợng, mục tiêu nghiên cứu

Đối tƣợng nghiên cứu là các chất chuyển hóa của nitrofuran, bao gồm: AOZ,

AMOZ, SEM và AHD.

Vật liệu nghiên cứu là sản phẩm thực phẩm tƣơi sống bao gồm thịt và gan

của gia súc gia cầm.

Mục tiêu chung của đề tài là nghiên cứu xây dƣ̣ng phƣơng pháp xác định

đồng thời 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran: AOZ, AMOZ, AHD, SEM trong thực

phẩm tƣơi sống bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS. Các mục tiêu cụ

thể nhƣ sau:

- Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời 4 chất chuyển hóa của nitrofuran trong

thực phẩm tƣơi sống bằng LC-MS/MS.

- Ứng dụng phƣơng pháp để xác định các chất chuyển hóa của nitrofuran trong thực

phẩm tƣơi sống cụ thể trong thịt lợn, thịt bò, thịt gà, gan.

2.1.2. Nội dung nghiên cứu

2.1.2.1. Xây dựng phƣơng pháp

 Khảo sát phƣơng pháp bao gồm:

 Điều kiện và thông số vận hành máy LC/MS/MS,

 Điều kiện tách chiết lấy chất phân tích.

 Thẩm định phƣơng pháp:

 Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lƣợng LOQ,

 Khoảng tuyến tính,

 Độ chụm (độ lặp lại),

 Độ đúng (độ thu hồi, độ chệch).

2.1.2.2. Ứng dụng phƣơng pháp

Áp dụng phƣơng pháp mới xây dựng để xác định dƣ lƣợng kháng sinh nhóm

nitrofuran cụ thể là các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống

đang bán trên địa bàn Hà Nội.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ

2.2.1.1. Nguyên tắc chung về phƣơng pháp sắc kí lỏng HPLC

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và

pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng – rắn). Mẫu phân tích đƣợc chuyển lên cột tách

dƣới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phan tích đƣợc phân bố

liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc

phân tử và tính chất lí hóa của các chất khác nhau, nên khả năng tƣơng tác của

chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ

khác nhau và tách ra khỏi nhau thành từng lớp của mỗi chất.

2.2.1.2. Pha tĩnh trong HPLC [8]

Trong LC, pha tĩnh (stationary phase) chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ

tách hỗn hợp chất phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thƣớc hạt rất nhỏ, từ

3-7µm. Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phƣơng pháp sắc ký lỏng pha liên kết

thƣờng chia làm 2 loại: sắc ký pha thƣờng (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-

HPLC). Khi dùng chất nhồi cột có cỡ hạt nhỏ hơn đƣờng kính hạt 1,7 µm, chịu

đƣợc áp suất cao lên tới 700 atm làm tăng độ phân giải và giảm thời gian phân tích

đó là những ƣu điểm của sắc ký lỏng UPLC (Ultra Performance Liquid

Chromatography).

2.2.1.3. Pha động trong HPLC [8]

Có thể chia pha động làm hai loại: là pha động có độ phân cực cao và pha

động có độ phân cực thấp.

Loại thứ nhất có thành phần chủ yếu là nƣớc, tuy nhiên để phân tích các chất

hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực. Pha động loại này đƣợc dùng

trong sắc ký pha ngƣợc.

Loại thứ hai là các dung môi ít phân cực nhƣ cychlorpentan, n-pentan, n-

heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CCl4, toluene…Tuy nhiên

pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng đƣợc khả năng rửa giải, ngƣời ta

thƣờng phối hợp 2 hay 3 dung môi để có đƣợc dung môi có độ phân cực từ thấp đến

cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra

theo thời gian, trƣờng hợp này ngƣời ta gọi là chƣơng trình rửa giải gradient.

2.2.1.4. Detector trong HPLC [5]

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phƣơng pháp. Đối

vớ i các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran có khối lƣơ ̣ng phân tƣ̉ thấp không có khả năng hấp thu ̣ tia UV , có thể tạo dẫn xuất với 2-nitrobenzaldehyde ta ̣o sản phẩm có khả năng hấp thụ tia UV và đƣợc xác định bằng detector HPLC -UV.

Hiê ̣n nay, detector có thể cung cấp thông tin định tính, định lƣợng và cấu trúc

của các chất phân tích là detector khối phổ.

2.2.1.5. Hệ thống detector khối phổ (Mass Spectrometry)

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lƣợng phân tử của

các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lƣợng

và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích

của chúng nhƣ loại bỏ electron, proton hóa,…Các ion tạo thành này đƣợc tách theo

tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lƣợng hoặc cấu trúc phân

tử của hợp chất.

Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị

phân tích khối và bộ phận phát hiện. Trƣớc hết, các mẫu đƣợc ion hóa trong nguồn

ion, sau đó đƣa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Các tín

hiệu thu đƣợc sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lƣu trữ.

Ƣu điểm của phƣơng pháp là:

 Giúp phát hiện hầu hết các chất tan

 Độ nhạy cao

 Có thể giúp xác định đƣợc các chất tan ngay khi độ phân giải chƣa tốt.

 Hữu hiệu cho nghiên cứu các hợp chất.

Cung cấp đầy đủ thông tin về cấu trúc và khối lƣợng

2.2.1.5.1. Bô ̣ nguồn ion (Ion sources)

Chất phân tích ra khỏi cột sắc ký ở dạng lỏng, khó khăn lớn nhất ở đây là

phải chuyển chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi. Theo kỹ thuật ion hoá của

LC/MS, năng lƣợng của máy trực tiếp tác động vào pha lỏng hoặc rắn để tạo thành

ion ở thể hơi. Trong máy khối phổ, có rất nhiều cách để ion hoá phân tử và nguyên

tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi. Sau đây là một số kỹ thuật thƣờng dùng:

a) Ion hóa bằng dòng electron (Electron Ionization – EI):

Trong phổ EI-MS, dòng electron có năng lƣợng cao đƣợc phát ra từ sợi dây

catot vonfram hoặc reni đƣợc đốt nóng sinh ra dòng electron chuyển động vuông

góc với mẫu về phía anot xảy ra sự va chạm biến các mẫu thành các ion phân tử

hoặc ion mảnh. Thông thƣờng các hợp chất hữu cơ có thế ion hóa nằm trong khoảng

8 eV đến 15 eV nhƣng để đạt đƣợc hiệu quả cao thƣờng áp dụng dòng 70 eV .

ABC + e → ABC+● + 2e (1) (ion phân tử)

ABC+● → A+ + BC● (2) (ion mảnh, gốc tự do, mảnh trung hòa)

ABC+● → A+ + B +C●

Ƣu điểm: áp dụng cho phân tử nhỏ, cho cơ sở dữ liệu phổ. Tuy nhiên, một số

hợp chất dễ phân mảnh thì thời gian sống ngắn, nhiều mảnh nhỏ hay ít hoặc không

thu đƣợc ion phân tử và đòi hỏi hợp chất phải dễ bay hơi.

b) Chế độ ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization- ESI)

Nguyên tắc: biến đổi ion ở thể lỏng thành ion ở thể hơi, dung dịch mẫu đƣợc

dẫn vào điện trƣờng mạnh và duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV. Tại đây, dung dịch

mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và đƣợc hút tĩnh điện tới lối vào của bộ

phân tích khối phổ. Các giọt tích điện trƣớc khi vào bộ phân tích khối phổ sẽ kết

hợp với dòng khí khô để làm bay hơi hết dung môi.

Ƣu điểm của ESI là có hai chế độ bắn phá: bắn phá chế độ ion dƣơng và ion

âm, ESI-MS thích hợp cho cả phân tử có phân tử khối nhỏ (khoảng 100-150 amu)

cũng nhƣ phân tử khối lớn của các phân tử sinh học, các hợp chất khó bay hơi,

không bền nhiệt, phân cực và không phân cực.

c) Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí quyển (Atmospheric Presure Chemical

Ionization-APCI)

Sự ion hóa trong APCI phụ thuộc vào sự va chạm của dòng ion dƣơng hay

+)...

âm với phân tử, mẫu bị ion hóa bởi phản ứng với các ion đƣợc tạo ra từ các chất khí

+), amoniac (ở dạng NH4

nhƣ methan (ở dạng CH5

Khi sử dụng khí methan làm chất khí phản ứng ta có các quá trình ion hóa

nhƣ sau:

Quá trình 1:

+● + CH3

+ + CH2

●

CH4 + e → CH4

+● + CH4 → CH5

+ + CH3

CH4

+ + CH4 → C2H5

+ + H2

CH3

Quá trình 2: ion mảnh va chạm trực tiếp với phân tử mẫu.

+ + M → CH4 + (MH)+ (chuyển proton thành dƣơng m/z = M+1)

(chuyển proton thành dƣơng m/z = M+1)

CH5

+ + M → (MH)+ + C2H4

C2H5

+ + M → (MC2H5)+ (thêm ái lực điện tử thành dạng m/z = M+29)

+ + M → (M-H)+ (hydrua chuyển thành dạng m/z = M-1)

C2H5

Sự thay đổi chất khí trong phản ứng APCI-MS cho phép thay đổi tính chọn

lọc của sự ion hóa và mức độ phân mảnh. Đây là phƣơng pháp có độ nhạy cao cho

phép phân tích định lƣợng ở mức picomol tới femtomol, thích hợp cho những chất

có phân tử khối 1000 đơn vị nhƣng đòi hỏi chất phân tích phải dễ dàng bay hơi.

2.2.1.5.2. Bộ phận phân giải khối

Sau khi đƣợc ion hóa, chất phân tích đƣợc đƣa vào bộ phận phân giải khối.

Tại đây, các ion đƣợc tách ra khỏi nhau theo tỉ số m/z. Bộ phận phân tích khối đƣợc

chia thành 4 loại: bộ phân tích từ, bộ phân tích tứ cực, bộ phân tích bẫy ion tứ cực

và bộ phân tích thời gian bay. Trong đó bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)

và bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser) đƣợc sử dụng

phổ biến.

a) Bộ phân giải tứ cực (Quadrupole Analyser)

Tứ cực đƣợc cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng

trống để các ion bay qua. Một trƣờng điện từ đƣợc tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng

một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF). Các tứ cực đƣợc đóng vai trò nhƣ một

bộ lọc khối. Khi một trƣờng điện từ đƣợc áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ

dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trƣờng RF. Chỉ những ion có tỉ số m/z

phù hợp mới có thể có thể đi qua đƣợc bộ lọc này.

Bộ phân giải tứ cực đƣợc phát triển và cho ra đời bộ phận phân giải khối phổ

ba tứ cực (Triple Quadrupole).

Hình 2.2: Sơ đồ bộ phân giải khối phổ ba tứ cực

Bộ phân tích khối phổ ba tứ cực gồm một buồng va chạm (collision cell,

đƣợc xem là tứ cực thứ hai Q2) đặt ở giữa 2 tứ cực (Q1 và Q3).

 Ở buồng Q1: Các ion đƣợc tách.

 Ở buồng Q2: Với áp suất cao, các ion bị phân ly do va chạm với khí trơ

có mặt nhƣ nitơ, argon, heli nên chúng bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion

nhỏ hơn (ion con).

 Ở buồng Q3: Làm nhiệm vụ tách các ion con.

b) Bộ phân giải bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)

Loại thiết bị này bao gồm một điện cực vòng (ring electrode) với nhiều điện

cực bao xung quanh, điện cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dƣới. Trái với

lại thiết bị tứ cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đƣờng cong ổn

định đƣợc bẫy lại cho đến khi một điện áp RF đƣợc đặt trên điện cực vòng. Các ion

khác nhau m/z sau đó trở nên không ổn định và sẽ có hƣớng đi về phía detector. Do

điện áp RF khác nhau trong hệ thống này mà thu đƣợc một phổ khối lƣợng đầy đủ

Các ion tồn tại trong bẫy có thể đƣợc chọn riêng và phân tích theo sự khác

nhau về m/z, đồng thời có thể chọn riêng và thực hiện quá trình bắn phá để thu đƣợc

các mảnh ion con từ đó thực hiện phân tích theo m/z của ion con (khối phổ 2 lần).

Về nguyên tắc các ion con có thể tồn tại trong bẫy thời gian đủ lâu để có thể thực

hiện đến MS n lần, tuy nhiên trong thực tế thƣờng chỉ có khả năng thực hiện đến

khối phổ 3 lần.

2.2.1.5.3. Bộ phận phát hiện

Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân giải khối lƣợng, các ion đƣợc đƣa tới phần

cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối

phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tƣơng ứng từ các electron thứ cấp đã đƣợc

khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát

hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang.

Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất,

có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron. Các electron

thứ cấp sau đó đƣợc dẫn tới các dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều

hơn nữa, tạo thành dòng electron.

Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống nhƣ thiết bị nhân electron, các ion

ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng electron. Khác với detector nhân electron,

các electron sau đó sẽ đập vào một màn chắn photpho và giải phóng ra các photon.

Các photon này đƣợc phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động nhƣ thiết bị nhân

electron. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là các ống nhân quang đƣợc đặt trong chân

không nên loại bỏ đƣợc các khả năng nhiễm bẩn.

2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu

2.2.2.1. Xử lý mẫu bằng chiết lỏng lỏng [8]

Chiết lỏng – lỏng là kỹ thuật dựa trên sự phân bố khác nhau của chất tan vào

2 pha không trộn lẫn, từ đó tách chiết chất phân tích ra khỏi nền hoặc tách các tạp

chất ra khỏi chất phân tích. Cho nên, nguyên tắc của kỹ thuật chiết này là cho chất

tan (chất phân tích) ƣu tiên tan vào một trong hai pha lỏng không trộn lẫn, còn tạp

chất hay các chất khác ở lại trong pha kia.

Để có đƣợc kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện và đảm

bảo đƣợc các yêu cầu nhất định sau đây:

- Dung môi chiết và dịch chất mẫu cần chiết gọi tắt là hai pha không đƣợc

trộn lẫn vào nhau , trong đó dung môi chiết phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo

không làm nhiễm bẩn chất phân tích.

- Hệ số tách và hiển nhiên là α càng khác 1 càng tốt. Điều

kiện tối ƣu là KDA . KDB = 1.

- Cân bằng chiết đạt đƣợc nhanh và thuận nghịch, sự phân lớp phải rõ ràng

để tách hai pha đƣợc tốt.

- Phải chọn đƣợc điều kiện chiết tối ƣu bao gồm: pH của dung dịch mẫu,

nồng độ tác nhân chiết, nồng độ thuốc thử, chất phụ gia…

2.2.2.2. Xử lý mẫu bằng chiết pha rắn [8]

Chiết pha rắn là một phƣơng pháp chuẩn bị mẫu để tách làm giàu và làm

sạch mẫu phân tích từ dung dịch mẫu bằng cách hấp phụ lên cột chiết pha rắn. Sau

đó chất phân tích đƣợc rửa giải bằng một lƣợng nhỏ dung môi thích hợp. Các chất

ảnh hƣởng đƣợc loại bỏ.

Cột SPE đƣợc nhồi chặt bằng những vật liệu xốp, hạt nhỏ có các nhóm chức

khác nhau. Chất lỏng qua cột dƣới tác dụng của áp suất hoặc chân không.

Các bƣớc tiến hành trong quá trình chiết pha rắn:

Hình 2.3: Các bước của quá trình chiết pha rắn

1. Hoạt hóa chất hấp phụ pha rắn

 Làm ƣớt vật liệu nhồi, solvat hóa các nhóm chức của chất hấp phụ,

 Loại không khí trong các khoảng trống trong lớp chất hấp phụ,

 Không đƣợc để chất hấp phụ bị khô.

1. Mẫu và chất phân tích được chảy qua cột

 Chất phân tích đƣợc làm giàu trên chất hấp phụ,

 Một vài thành phần ảnh hƣởng khác cũng có thể bị giữ lại,

 Các thành phần không bị hấp phụ bị loại ra làm sạch chất phân tích.

2. Loại bỏ các chất gây ảnh hưởng ra khỏi cột

 Giữ lại chất phân tích,

 Nếu mẫu là dung dịch nƣớc, sử dụng dung dịch đệm hoặc hỗn hợp nƣớc-

dung môi hữu cơ,

 Nếu mẫu bị hòa tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa cột có thể sử dụng

chính dung môi hữu cơ.

3. Giải hấp chất phân tích bằng dung môi thích hợp

 Dung môi đƣợc chọn đặc trƣng đê phá vỡ tƣơng tác giữa chất phân tích

và chất hấp phụ với mục đích rửa giải đƣợc chất phân tích với hiệu quả

cao,

 Dung môi sử dụng rửa giải đồng thời càng ít chất gây ảnh hƣởng tới phép

phân tích càng tốt.

Chất hấp phụ chiết pha rắn thƣờng đƣợc sử dụng gồm các loại:

- Chất hấp thụ pha thƣờng: Các silica trung tính, oxit nhôm,

- Chất hấp phụ pha ngƣợc: Các silica đã đƣợc ankyl hóa nhóm OH,

- Chất có khả năng trao đổi ion,

- Chất rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn, kích thƣớc,

- Chất hấp phụ pha khí-rắn,

Hiện nay, phƣơng pháp chiết pha rắn ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi và phổ

biến do những ƣu điểm vƣợt trội sau:

- Hiệu suất thu hồi cao,

- Khả năng làm giàu, làm sạch các chất phân tích lớn,

- Giảm lƣợng dung môi sử dụng,

- Có khả năng kết hợp các phƣơng pháp phân tích,

- An toàn, đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt,

Oasis HLB (hydrophilic-lipophilic balance) là một chất hấp phụ kết hợp cơ

chế tƣơng tác pha đảo và tƣơng tác ƣa nƣớc. Pha tĩnh này đƣợc trùng hợp từ hai

monomer có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidone có tính ƣa nƣớc và divinylbenzen

có tính kỵ nƣớc. Chất hấp phụ Oasis có cấu trúc không gian lớn (thể tích lỗ rỗng là 1.3 cm2/g), có diện tích bề mặt trên một đơn vị khối lƣợng pha tĩnh cao (810 m2/g).

Các nhóm chức phân cực của monomer N-vinylpyrolidone đã tạo ra các hốc phân

cực nên pha tĩnh Oasis có hệ số lƣu giữ tốt đối với các chất phân tích phân cực đồng

thời có khả năng làm việc trong khoảng pH rộng.

2.2.3. Thẩm định phƣơng phá p 2.2.3.1. Tính đặc hiệu

Sƣ̉ du ̣ng các p hƣơng pháp xác nhâ ̣n (confirmation method ) là một cách rất tố t để đảm bảo tính đă ̣c hiê ̣u củ a phƣơng pháp . Hô ̣i đồng châu Âu quy đi ̣nh cách tính điểm IP (điểm nhâ ̣n da ̣ng – identification point) đối vớ i các phƣơng pháp khác nhau để khẳng đi ̣nh chắc chắn sƣ̣ có mă ̣t củ a các chất . Cách tính điểm IP đƣợc chỉ ra ở phu ̣ lục 3.

2.2.3.2. Khoảng tuyến tính

Tiến hành thực nghiệm: Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn của chất phân tích . Xác

định các giá trị đo đƣợc y theo nồng độ x. Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có

khoảng khảo sát đƣờng biểu diễn là một phƣơng trình:

y = ax + b

và hệ số tƣơng quan:

Nếu 0,995 < r2 ≤ 1 : Có tƣơng quan tuyến tính

Khi đã xác định đƣợc khoảng tuyến tính, có thể xây dựng phƣơng trình hồi quy của

khoảng này, tức là xác định hệ số a và b. Trên đƣờng hồi quy, lấy đoạn tuyến tính

làm khoảng xác định (kể cả hai điểm đầu và cuối).

2.2.3.3. LOD, LOQ

Tính LOD và LOQ theo biểu thƣ́ c:

Tính giá trị trung bình , và độ lệch chuẩn SD

LOD = 3 x SD

LOQ = 10 x SD

Vớ i

Đánh giá LOD đã tính đƣợc: tính R = / LOD là hệ số đánh giá LOD

 Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD

tính đƣợc là đáng tin cậy.

 Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm

một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và

tính lại R.

 Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng

dung thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R.

2.2.3.4. Độ lặp lại, đô ̣ thu hồi

Độ thu hồi và độ lặp lại đƣợc xác định theo các đại lƣợng SD và RSD nhƣ

công thức dƣới đây:

Trong đó:

Stb : Diện tích pic trung bình.

Si : Diện tích píc thứ i

n: Số lần đo.

SD: Độ lệch chuẩn

RSD: Độ lệch chuẩn tƣơng đối (%).

Độ thu hồi của phƣơng pháp theo công thức sau :

Trong đó: Cm+c : nồng độ nitrofuran xác định đƣợc trong mẫu có thêm chuẩn (ng/g).

Cm: nồng độ nitrofuran có trong mẫu (ng/g).

C: nồng độ chuẩn nitrofuran đƣợc thêm vào (ng/g).

H: độ thu hồi (%).

2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu

Các kết quả phân tích trên LC-MS/MS đƣợc tính toán và xử lý bằng phần mềm

Analyst, Excel, origin 6.0.

Các công thức thống kê tính đô ̣ lă ̣p la ̣i, đô ̣ thu hồi, tính LOD, LOQ… 2.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu

2.3.1. Dụng cụ và thiết bị

2.3.1.1. Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL của

Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem: bộ phận bơm dung

môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt.

- Cột sắc ký Agilent C18 (150mm x 2,1mm x 3,5µm).

- Cột chiết pha rắn SPE (Oasis HLB).

- Máy lắc vortex VELP.

- Máy đồng nhất mẫu.

- Máy li tâm MIKRO 22R.

- Cân phân tích (có độ đọc 0,1mg và 0,01mg).

- Cân kĩ thuật (có độ đọc 0,01g).

- Máy thổi khí N2 làm khô có điều nhiệt.

- Bể điều nhiệt

2.3.1.2 Dụng cụ

- Cốc có mỏ dung tích 50, 100, 200 ml.

- Ống đong dung tích 10, 100, 200 ml.

- Pipetman, pipet nhựa, pipet pasteur 200 µl; 1000 µl; 5 ml…đầu côn.

- Ống ly tâm 50 ml, màng lọc 0,2 µm.

- Vial loại 1,8 ml.

- Bình định mức loại A dung tích 10, 25, 50, 100 ml.

- Ống nghiệm thủy tinh…

2.3.2 Hóa chất và chất chuẩn

Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích

2.3.2.1 Chất chuẩn

- AOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- AMOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- AHD.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- SEM.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99,5%

- d4-AOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- d5-AMOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- d2-AHD.HCl 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 99% - 13C15N2-SEM.HCl 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 98%

2.3.2.2 Hóa chất

- Methanol (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%)

- Amoni acetate (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 98%)

- 2-NBA (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99%)

- K2HPO4.3H2O (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99%)

- NaOH (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%)

- HCl 37% (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%)

- HCl 0,2M: Hút 17 ml HCl 37% vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch

bằng nƣớc cất.

- 2-NBA 1000 mg/l: cân 100 mg 2-NBA hòa tan và định mức vào bình 10 ml bằng

methanol. Dung dịch chuẩn bị hằng ngày.

- K2HPO4 0,2 M: cân 45,7 mg K2HPO4.3H2O hòa tan và định mức vào bình 1000

ml bằng nƣớc cất 2 lần.

- NaOH 2 M: cân 8 g NaOH hòa tan và định mức vào bình định mức 1000 ml bằng

nƣớc cất 2 lần.

- CH3COONH4 10 mM: cân 0,077 g CH3COONH4 hòa tan và định mức vào bình

định mức 1000 ml bằng nƣớc cất 2 lần.

2.3.3 Pha chế chất chuẩn

- Chuẩn AHD 1000 mg/l: cân 13,2 mg ± 0,1 mg chuẩn AHD.HCl hòa tan và định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng.

- Chuẩn AHD 10 mg/l: hút 100 µl chuẩn AHD 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng. - Chuẩn SEM 1000 mg/l: cân 14,9 mg ± 0,1 mg chuẩn SEM.HCl hòa tan và định

mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml.

- Chuẩn SEM 10 mg/l: hút 100 µl chuẩn SEM 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng. - Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 1 mg/l: hút lần lƣợt 1 ml chuẩn

AOZ 10 mg/l, AMOZ 10 mg/l, AHD 10 mg/l, SEM 10 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 3 tháng. - Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 20 µg/l: hút 200 µl hỗn hợp

chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 1 tháng. - d4-AOZ 1000 mg/l: Cân 10 mg ± 0,1 mg d4-AOZ định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng. - d4-AOZ 10 mg/l: hút 100 µl d4-AOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng. - d5-AMOZ 1000 mg/l : Cân 10 mg ± 0,1 mg d5-AMOZ định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng. - d5-AMOZ 10 mg/l: Hút 100 µl d5-AMOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng.

- Hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13C15N2-SEM.HCl) 1 mg/l:

hút lần lƣợt 1 ml chuẩn d4-AOZ 10 mg/l, d5-AMOZ 10 mg/l, d2-AHD.HCl 10 mg/l và 13C15N2-SEM.HCl 10 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 3 tháng. - Hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13C15N2-SEM.HCl) 20 µg/l: hút lần lƣợt 200 µl hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl, 13C15N2- SEM.HCl) 1 mg/l vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 1 tháng.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS

Phân tích dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran dựa trên việc phân tích các

chất chuyển hóa của nhóm nitrofuran. Các chất chuyển hóa của nitrofuran có khối

lƣợng phân tử thấp gây nhiễu phổ nền cao, hiệu quả ion hóa thấp và không đặc hiệu

cho sự phân mảnh (chủ yếu là mất nƣớc, NH3, CO2), độ nhạy phát hiện bằng MS

tƣơng đối thấp. Vì vậy sử dụng 2-nitrobezaldehyte để dẫn xuất các chất chuyển hóa

nhóm nitrofuran để có đƣợc các hợp chất dẫn xuất (NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD,

NPSEM) với nhiều đặc tính thuận lợi.

3.1.1. Khảo sát các điều kiện đo phổ khố i

3.1.1.1. Khảo sát ion mẹ

Các chất NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM có khối lƣợng phân tử nhỏ

và phân cực. Qua tham khảo một số tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23,

26], chúng tôi tiến hành khảo sát xác định NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM

bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chệ độ bắn phá ion dƣơng. Để tối ƣu

hóa điều kiện khối phổ, dùng xylanh 500 µl bơm từng chuẩn AOZ, AMOZ, AHD,

SEM 500 ng/ml đã đƣợc dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyte , sau đó đƣa vào

detector để khảo sát. Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chất, tối ƣu hóa

từng ion mẹ, thu đƣợc điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI ở bảng 3.1.

Bảng 3.1: Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI

Khí màn (CUR) 20 psi

Khí va chạm (CAD) 8 psi

Thế ion hóa (IS)

Nhiệt độ mao quản (TEM) 5000 V 4000C

Áp suất khí 2 bên đầu phun (GS1) 50 psi

Áp suất của luồng khí nóng (GS2) 40 psi

Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion dƣơng, các ion

mẹ có dạng (MH)+ vớ i số khối m = (M+1) theo phản ƣ́ ng: M0 + H+ → (MH)+

Tiến hành khảo sát bắn phá tạọ các ion mẹ, kết quả đƣợc chỉ ra ở bảng 3.2

Bảng 3.2: Kết quả bắn phá các ion mẹ

Chuyển hóa nhóm Khối lƣợng phân tử M Ion mẹ (M+H) nitrofuran

236 235 NPAOZ

335 334 NPAMOZ

209 208 NPSC

249 248 NPAHD

240 239 d4-AOZ

340 339

212 211 d5-AMOZ 13C-15N2 SEM.HCl

251 250 D2-AHD.HCl

3.1.1.2. Khảo sát điều kiện bắn phá ion me ̣ để thu đƣơ ̣c ion con

Detector sử dụng trong nghiên cứu này là hê ̣ khối phổ 2 lần, do đó để phát

hiện đúng chất phân tích thì việc lựa chọn đƣợc ion con là rất quan trọng. Ion con

phải có tín hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion mẹ. Để thu đƣợc mảnh ion con có tín

hiệu cao cần phải chọn đƣợc mức năng lƣợng bắn phá thích hợp. Dùng xylanh 500

µl bơm từng chuẩn đã đƣợc dẫn xuất vào detector khối phổ và lựa chọn 2 ion con

đă ̣c trƣng có cƣờng độ tín hiệu cao nhất để định tính và định lƣợng. Mảnh ion con

m/z có cƣờng độ lớn nhất dùng để định lƣợng, mảnh ion con thứ 2 có cƣờng độ thấp

hơn dùng để xác nhận chất phân tích. Đối với các chất nội chuẩn, lựa chọn 1 ion

con đặc trƣng có cƣờng độ cao nhất. Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.3

Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá và các ion con của các chất chuyển hóa nitrofuran

Chuyển hóa

Ion con DP (V) CE (eV) CXP (V) nhóm Ion mẹ (M+H)+ nitrofuran

80 15 10 134 236 NPAOZ 104 80 27 14

80 15 16 291 335 NPAMOZ 262 80 21 16

80 11 18 192 209 NPSEM 166 80 13 14

80 15 18 134 249 NPAHD 104 80 27 14

240 134 80 17 16

340 296 80 15 16

212 168 80 13 12

251 134 80 15 14 d4-AOZ d5-AMOZ 13C-15N2 SEM.HCl d2-AHD.HCl

Nhâ ̣n xét: Theo qui đi ̣nh củ a Châu Âu 2002/657/EC, số điểm nhâ ̣n da ̣ng (IP) đƣơ ̣c tính đối vớ i kỹ thuật LC/MS/M, tƣơng ƣ́ ng vớ i 1 ion me ̣ và 2 ion con, số điểm nhâ ̣n da ̣ng (IP) là 4. Nhƣ vâ ̣y phƣơng pháp đã đáp ƣ́ ng đƣơ ̣c yêu cầu củ a Châu Âu [phụ lục 4]. Phù hơ ̣p vớ i các nghiên cƣ́ u khác củ a mô ̣t số tác giả nhƣ tác giả Leitner , tác giả D.Tyler

của phòng thí nghiệm của Anh…

3.1.2. Lựa chọn cột tách

Các chất nhóm nitrofuran là các chất phân cực, đồng thời theo khuyến cáo

của nhà sản xuất thiết bị khối phổ thì hệ pha động sử dụng an toàn với thiết bị là các

dung môi phân cực và phân cực trung bình nhƣ methanol, acetonitrile, nƣớc, acid

formic (0 đến 1%, amoni acetate (0 tới 1%)…cột tách nên sử dụng là cột tách pha

đảo. Do đó chúng tôi lựa chọn cột tách pha đảo C18 vớ i các thông số dƣớ i đây cho các nghiên cứu tiếp theo:

- Cột C18 của Agilent có:

- Chiều dài 150mm, - Đƣờng kính 2,1mm,

- Cỡ ha ̣t 3,5µm.

3.1.3. Khảo sát chƣơng trình gradient pha đô ̣ng

Các dẫn xuất của nhóm nitrofuran có cấu trúc gần giống nhau, nên sử dụng

chế độ rửa giải đẳng dòng (isocratic) không phù hợp. Chúng tôi tiến hành khảo sát

một số chƣơng trình rửa giải gradient. Qua tham khảo một số tài liệu [12, 16, 17,

24] chúng tôi sử dụng pha động kênh A: Amoniacetat 10 mM, kênh B là methanol.

Cố định các điều kiện sắc ký:

- Cột C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm),

- Pha động: kênh A: amoniacetat 10 mM, kênh B: methanol,

- Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút,

- Mẫu phân tích: hỗn hợp dẫn xuất nitrofuran, nồng độ: 20 ng/ml.

Tiến hành thí nghiệm theo: a) Chƣơng trình Gradient 1, thu đƣơ ̣c sắc đồ nhƣ trong hình 3.1 :

Thời gian (phút) % MeOH 0,01 20 12,00 90 14,00 90 15,00 20 20,00 20

Hình 3.1: sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 1 ở nồng đô ̣ 20 ng/ml

b) Chƣơng trình Gradient 2, thu đƣơ ̣c sắc đồ trong hình 3.2:

Thời gian (phút) % MeOH 0,01 20 5 90 8 90 9 20 12 20

Hình 3.2: sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 2 ở nồng độ 20 ng/ml

c) Chƣơng trình Gradient 3, thu đƣơ ̣c sắc đồ trong hình 3.3 :

Thời gian (phút) 0,01 % MeOH 20 8 90 10 90 13 20 13,01 20

Hình 3.3: sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 3 ở nồng độ 20 ng/

d) Chƣơng trình Gradient 4, thu đƣơ ̣c sắc đồ trong hình 3.4:

Thời gian (phút) % MeOH 0,01 20 10 90 12 90 15 20 15,01 20

Hình 3.4: sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 4 ở nồng độ 20 ng/ml

e) Chƣơng trình Gradient 5, thu đƣơ ̣c sắc đồ trong hình 3.5:

16,00 20 Thời gian (phút) % MeOH 0,01 20 12,00 90 13,00 90 13,01 20

Hình 3.5: sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 5 ở nồng độ 20 ng/ml

Bàn luận :

- Khi tăng nồng độ MeOH trong khoảng thời gian ngắn (chƣơng trình gradient 1, gradient 2, gradient 3, gradient 4) píc của AOZ rất xấu và bị chẻ píc. Hiê ̣n tƣơ ̣ng

bâ ̣c nhất R -NH2 và dạng R -NH3

chẻ pic này là do hàm lƣợng MeOH cao , AOZ tồn ta ̣i đồng thờ i ở hai da ̣ng là amin +. Do đó , nồng đô ̣ MeOH cần phải đƣơ ̣c khống chế phù hợp, đồng nghĩa vớ i tăng nồng đô ̣ CH3COONH4 để chuyển toàn bộ dạng amin thành dạng R-NH3

. Do đó

- Chƣơng trình gradient 5 pic nhọn, cân xứng và có tín hiê ̣u píc rõ ràng chúng tôi lựa chọn chƣơng trình gradient 5 cho các nghiên cứu tiếp theo.

Tóm lại : Các thông số phù hợp cho quá trình tách sắc ký là :

- Cột Agilent C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm)

- Pha động kênh A (amoniacetat 10 mM) ; kênh B (methanol) theo chƣơng

trình gradient 5:

16,00 20 0,01 20 12,00 90 13,00 90 13,01 20

Thời gian (phút) % MeOH - Tốc độ pha đô ̣ng: 0,4 ml/phút,

- Thể tích bơm mẫu : 10 µl, - Nhiệt độ cột: 300C.

3.1.4. Khảo sát quy trình chiết mẫu

Qua tham khảo một số tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 26] có

một số quy trình đã và đang đƣợc ứng dụng để tách chiết các chất nhóm nitrofuran

bao gồm : quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng, quy trình xử lý mẫu bằng

chiết pha rắn. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát 2 quy trình chiết mẫu sau đây để

tiến hành thí nghiê ̣m. 3.1.4.1. Lựa chọn quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng

Dự kiến quy trình xử lý mẫu nhƣ sau:

Cân 2 g mẫu vào ống ly tâm

Thêm 10 ml HCl 0,2M và 240 µl 2-NBA 10mg/ml

Thêm 100 µl hỗn hợp nội chuẩn vào mỗi ống

Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu

Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sáng để qua đêm trong bể điều nhiệt 400C

Trung hòa axit bằng 10 ml K2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc

vortex 20 giây

Ly tâm ở 4500 rpm trong 15 phút lấy dung di ̣ch mẫu

Chiết lặp 2 lần mỗi lần bằng 4 ml ethylactetate, ly tâm hút lấy lớp trên thổi khô

bằng N2

Hòa tan cặn bằng 1 ml H2O:MeOH (60:40)

Chuyển mẫu vào vial và đem phân tích bằng LC/MS/MS

Tiến hành thêm chuẩn 20 ng/g vào mẫu thịt lợn, sử dụng quy trình chiết lỏng

– lỏng nói trên làm lặp lại 3 lần cho kết quả chỉ ra ở bảng 3.4 và sắc đồ ở hình 3.6:

Bảng 3.4: Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng chiết lỏng – lỏng

Chất Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB SD % RSD H (%) phân tích (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g)

AOZ 8,51 7,66 9,11 8,43 0,729 8,65 42,1

AMOZ 9,32 10,2 7,55 9,01 1,38 15,3 45,0

AHD 6,82 5,89 7,43 6,71 0,776 11,6 33,7

SEM 6,12 6,27 5,98 6,12 0,145 2,37 30,6

Hình 3.6: Sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p nitrofuran ở mƣ́ c nồng đô ̣ 20 ng/g sƣ̉ du ̣ng quy trình chiết lỏng – lỏng. 3.1.4.2. Lựa chọn quy trình xử lý mẫu bằng chiết pha rắn

Thƣ̣c hiê ̣n theo sơ đồ sau:

Cân 2 g mẫu vào ống ly tâm

Thêm 10 ml HCl 0,2M và 240 µl 2-NBA 10mg/ml

Thêm 100 µl hỗn hợp nội chuẩn vào mỗi ống

Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu

Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sáng để qua đêm trong bể điều nhiệt 400C

Trung hòa mẫu bằng 10 ml K2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc vortex 20 giây

Ly tâm ở 4500 rpm trong 15 phút lấy dung di ̣ch mẫu

Hoạt hóa cột SPE (Oasis HLB): 3 ml EtAc → 3 ml MeOH → 2 x 2,5 ml H2O

Nạp mẫu vào cột, rửa loại chất bẩn bằng 2 x 2,5 ml H2O

Hút chân không cho khô cột SPE

Rửa giải chấ t phân tích bằng 4 ml EtAc vào ống nghiệm

Thổi khô bằng N2

Hòa tan cặn bằng 1 ml H2O:MeOH (60:40)

Chuyển mẫu vào vial và đem phân tích bằng LC/MS/MS

Tiến hành thêm chuẩn 20 ng/g vào mẫu thịt lợn, sử dụng quy trình chiết pha

rắn làm lặp lại 3 lần cho kết quả chỉ ra ở bảng 3.5 và hình 3.7:

Bảng 3.5: Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng chiết pha rắn

Chất Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB SD % RSD H (%) phân tích (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g)

AOZ 17,3 18,4 16,9 17,5 0,777 4,43 87,7

AMOZ 19,3 18,5 17,8 18,5 0,750 4,04 92,7

AHD 15,7 14,8 13,5 14,7 1,11 7,54 73,3

SEM 14,3 13,2 14,8 14,1 0,818 5,80 70,5

Hình 3.7: Sắc đồ thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p nitrofuran ở mƣ́ c nồng đô ̣ 20 ng/g sƣ̉ dụng qui trình chiết pha rắn SPE

Bảng 3.6: So sá nh độ thu hồi của 2 quy trình chiết:

Thịt lợn thêm chuẩn

Chiết lỏng-lỏng H (%) 42,1 Chiết SPE H (%) 87,7 AOZ 20 ng/g

45,0 92,7 AMOZ 20 ng/g

33,7 73,3 AHD 20 ng/g

30,6 70,5 SEM 20 ng/g

Nhâ ̣n xét: Nhìn vào bảng trên ta thấy quy trình chiết SPE cho độ thu hồi cao hơn so với quy trình chiết lỏng lỏng và đáp ứng đƣợc quy định của Châu Âu

2002/657EC. Do đó chúng tôi chọn quy trình chiết SPE cho các nghiên cứu tiếp

theo

3.2. Thẩ m đi ̣nh phƣơng phá p 3.2.1 Tính đặc hiệu

Phƣơng pháp trên sƣ̉ du ̣ng kỹ thuâ ̣t sắc ký lỏng khối phổ 2 lần, thƣ̣c hiê ̣n bắn phá ion mẹ m/z, đi ̣nh lƣơ ̣ng theo ion con ta ̣o thành. Theo cách tính điểm IP thì vớ i 1 ion me ̣ và 2 ion thu đƣơ ̣c 4 điểm IP, nhƣ vâ ̣y phƣơng pháp có tính đă ̣c hiê ̣u đáp ƣ́ ng đƣơ ̣c yêu cầu củ a châu Âu 2002/657/EC [32].

3.2.1. Khảo sát lập đƣờng chuẩn

3.2.1.1. Đường chuẩn của các chất nhóm nitrofuran sử dụng nội chuẩn (để phân

tích mẫu thực)

Chúng tôi khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích píc sắc kí, tỷ lệ diện

tích píc nitrofuran/nội chuẩn vào nồng độ chất phân tích ở các nồng độ khác nhau xác định hệ số tƣơng quan và phƣơng trình đƣờng chuẩn. Theo quy định của Châu Âu các chất nhóm nitrofuran là chất cấm, MRPL về yêu cầu giới hạn hiệu năng nhỏ

nhất của phƣơng pháp đối với các chất dẫn xuất nhóm nitrofuran là 1 µg/kg, do đó

inh nhóm nitrofuran thu đƣơ ̣c các hình

chúng tôi khảo sát xây dựng khoảng đƣờng chuẩn từ 0,5 – 5 ppb, sử dụng các nội chuẩn ở cùng nồng độ 2 ppb để phân tích mẫu thực. Sƣ̉ du ̣ng phần mềm origin 6.0 để xây dựng đƣờng chuẩn của các kháng s 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 và bảng 3.7 dƣớ i đây:

Hình 3.8: Đƣờng chuẩn xác định AOZ sử dụng nội chuẩn

Hình 3.9: Đƣờng chuẩn xác định AMOZ sử dụng nội chuẩn

Hình 3.10: Đƣờng chuẩn xác định SEM sử dụng nội chuẩn

Hình 3.11: Đƣờng chuẩn xác định AHD sử dụng nội chuẩn

Dƣ̣a vào đƣờ ng chuẩn xây dƣ̣ng phía trên kết hơ ̣p tra bảng giá tri ̣ chuẩn t vớ i bâ ̣c tƣ̣ do f=4, đô ̣ tin câ ̣y 95% có t = 2,776 nên phƣơng trình hồi quy y = (a ± t.Sa) + (b ± t.Sb)x có da ̣ng nhƣ dƣớ i đây:

Bảng 3.7: Phương trình hồi quy 4 nitrofuran sử dụng nội chuẩn

TT Chất Phƣơng trình hồi qui Hệ số R

1 AOZ y = (0,21426 ± 0,039142) + (0,31607 ± 0,016822)x 0,9992

2 AMOZ y = (0,01807 ± 0,044860) + (0,45988 ± 0,019293)x 0,9995

AHD y = (0,12446 ± 0,119312) + (1,22034 ± 0,051273)x 0,9995 3

SEM y = (0,26595 ± 0,262915) + (1,44626 ± 0,112983)x 0,9984 4

Nhận xét: tỉ lệ diện tích pic nitrofuran/diện tích pic nội chuẩn (IS) trong khoảng 0,5 – 5 ng/ml có hệ số tƣơng quan R2 > 0,99.

3.2.1.2. Đường chuẩn của các chất nhóm nitrofuran không sử dụng nội chuẩn (để

đánh giá hiệu suất thu hồi)

Lập mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ các chất nhóm

nitrofuran, thu đƣợc đƣờng chuẩn của các chất nhóm nitrofuran chỉ ra ở hình 3.12,

3.13, 3.14, 3.15 và bảng 3.8:

Hình 3.12: Đƣờng chuẩn của AOZ không sử dụng nội chuẩn

Hình 3.13: Đƣờng chuẩn của AMOZ không sử dụng nội chuẩn

Hình 3.14: Đƣờng chuẩn của AHD không sử dụng nội chuẩn

Hình 3.15: Đƣờng chuẩn của SEM không sử dụng nội chuẩn

Bảng 3.8: Phương trình hồi quy của 4 nitrofuran không sử dụng nội chuẩn

TT Chất Phƣơng trình hồi qui Hệ số R

1 AOZ y = (14569 ± 32560) + (307751 ± 13990)x 0,9994

2 AMOZ y = (42233 ± 53499) + (363895 ± 22988)x 0,9989

3 AHD y = (6879 ± 4425) + (36695 ± 1902)x 0,9993

4 SEM y = (592 ± 4175) + (35485 ± 1793)x 0,9993

Nhận xét: Diện tích nitrofuran với nồng độ trong khoảng 0,5 – 5 ng/ml có hệ số tƣơng quan R2 > 0,99.

3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp

Giới hạn phát hiện đƣợc định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích

mà phƣơng pháp phân tích có thể phát hiện đƣợc, có tín hiệu sắc ký lớn gấp 3 lần

tín hiệu đƣờng nền. Đây là một thông số đặc trƣng cho độ nhạy của phƣơng pháp.

Chất nào nhạy hơn sẽ có giới hạn phát hiện nhỏ.

Cũng theo phƣơng pháp này giới hạn định lƣợng là nồng độ nhỏ nhất chất

phân tích mà có tín hiệu lớn gấp 10 lần tín hiệu nhiễu đƣờng nền hay mẫu trắng

(S/N = 10).

Chúng tôi tiến hành thêm chuẩn trên nền mẫu thử không chứa chất phân tích,

làm 10 lần song song. Bảng 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 chỉ ra giới hạn phát hiện của AOZ,

AMOZ, AHD, SEM

Bảng 3.9: Giới hạn phát hiện của AOZ trên nền mẫu thịt

LOQ LOD Thêm chuẩn Số TT SD (ng/g) (ng/g)

AOZ 0,5 ng/ml

Lần 1 0,386

Lần 2 0,463

Lần 3 0,483

Lần 4 0,459

Lần 5 0,419 0,434 0,0333 0,100 0,300 4,34 Lần 6 0,432

Lần 7 0,395

Lần 8 0,412

Lần 9 0,456

Lần 10 0,436

Bảng 3.10: Giới hạn phát hiện của AMOZ trên nền mẫu thịt

LOQ SD Số TT LOD (ng/g) (ng/g) Thêm chuẩn AMOZ 0,5 ng/ml

0,405 Lần 1

0,504 Lần 2

0,520 Lần 3

0,508 Lần 4

0,432 Lần 5 0,485 0,0398 0,119 0,357 4,06 0,489 Lần 6

0,532 Lần 7

0,465 Lần 8

0,491 Lần 9

0,502 Lần 10

Bảng 3.11: Giới hạn phát hiện của AHD trên nền mẫu thịt

LOQ Số TT SD LOD (ng/g) (ng/g) Thêm chuẩn AHD 1 ng/ml

1,01 Lần 1

1,13 Lần 2

0,983 Lần 3

1,10 Lần 4

0,94 Lần 5 1,06 0,0743 0,223 0,669 4,73 1,15 Lần 6

1,11 Lần 7

1,01 Lần 8

1,12 Lần 9

Lần 10 0,997

Bảng 3.12: Giới hạn phát hiện của SEM trên nền mẫu thịt

LOQ Số TT SD LOD (ng/kg) (ng/g) Thêm chuẩn SEM 1,5 ng/ml

1,57 Lần 1

1,32 Lần 2

1,37 Lần 3

1,60 Lần 4

1,65 Lần 5 1,53 0,126 0,378 1,13 4,04 1,70 Lần 6

1,60 Lần 7

1,58 Lần 8

1,40 Lần 9

1,52 Lần 10

Trong đó :

- là trung bình của 10 lần làm lặp lại

- / LOD là hệ số đánh giá LOD

Bàn luận:

- LOD củ a các chất kháng sinh nhóm nitrofuran nằm trong khoảng từ 0,100 – 0,378

ng/g; LOQ tƣ̀ 0,300 – 1,13 ng/g đáp ƣ́ ng đƣơ ̣c yêu cầu củ a Châu Âu 2002/657/EC về đô ̣ nha ̣y củ a phƣơng pháp. Phù hợp với các nghiên cứu tƣơng tự.

Thực hiện thêm chuẩn vào mẫu thịt lợn không chứa nitrofuran ở các mức nồng

độ (MRPL; 1,5MRPL; 2MRPL) đối với mỗi chất là: 1 ng/g; 1,5 ng/g; 2 ng/g. Phân

3.2.3. Độ lặp lại và độ thu hồi

tích lặp lại 6 lần mỗi mẫu. Các kết quả thu đƣợc ở bảng 3.13 đến 3.15:

Bảng 3.13: Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền mẫu thịt lợn tại 1 ng/g

Thông Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Trung % Chất SD 1 2 3 4 5 6 bình RSD số

C 0,994 0,979 1,06 1,10 0,985 0,991 1,02 0,050 4,89 (ng/g) AOZ

H (%) 99,4 97,9 106 110 98,5 99,1 102

C 1,03 1,07 0,998 1,04 1,06 1,038 0,025 2,45 (ng/g) AMOZ 1,03 AOZ

H (%) 103 107 99,8 104 106 103 104

AHD

C 0,859 0,986 0,814 0,992 0,885 1,00 0,923 0,079 8,55 (ng/g) AHD

H (%) 85,9 98,6 81,4 99,2 88,5 100 92,3

C 0,805 0,732 0,859 0,781 0,659 0,992 0,805 0,076 9,42 (ng/g) SEM

H (%) 80,5 73,2 85,9 78,1 65,9 99,2 80,5

Hình 3.16: Sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 1 ng/g.

Bảng 3.14: Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền mẫu thịt lợn tại 1,5 ng/g.

Chất SD Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6 Trung bình % RSD

1,56 1,15 1,60 1,25 1,32 1,59 1,41 0,196 13,0 AOZ

104 76,7 106 83,3 88,0 106 94

1,56 1,54 1,55 1,57 1,60 1,58 1,57 0,023 1,46 AMOZ

104 103 103 105 107 105 105

1,44 1,61 1,54 1,60 1,63 1,67 1,58 0,077 4,87 AHD

96 107 103 107 109 111 106

1,37 1,60 1,17 1,69 1,4 1,72 1,49 0,205 13,7 SEM Thông số C (ng/g) H (%) C (ng/g) H (%) C (ng/g) H (%) C (ng/g) H (%) 91,3 107 78,0 113 93,3 115 99,6

Hình 3.17: Sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 1,5 ng/g.

Bảng 3.15: Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền mẫu thịt lợn tại 2 ng/g.

Thông Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Trung % Chất SD số 1 2 3 4 5 6 bình RSD

C 2,14 1,98 1,73 2,05 2,15 2,17 2,04 0,171 8,41 (ng/g) AOZ

H (%) 107 99,0 86,5 102 108 109 102

C 2,06 2,07 2,11 2,09 1,87 1,98 2,03 0,097 4,78 (ng/g) AMOZ

H (%) 103 104 105 93,5 99,0 102 101

C 2,04 1,89 1,76 2,24 1,84 1,90 1,95 0,171 8,80 (ng/g) AHD

H (%) 102 94,5 88,0 112 92,0 95,0 97,2

C 1,77 2,04 2,00 2,06 1,,82 2,04 1,96 0,125 6,47 (ng/g) SEM

H (%) 88,5 102 100 103 91,0 102 99,8

Hình 3.18: sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 2 ng/g Bàn luận: Ta thấy đô ̣ thu hồi trung bình củ a các chất tƣ̀ 80,5 – 106%, đô ̣ lă ̣p lại tốt 2002/657/EC. Tƣ̀ các (%RSD < 13,7%) đa ̣t yêu cầu theo quy đi ̣nh củ a Châu Âu

điều kiê ̣n đã đƣơ ̣c tối ƣu ở trên đủ đảm bảo cho phép phân tích xác định 4 chất

nhóm nitrofuran.

Từ những kết quả khảo sát và thẩm định phƣơng pháp, chúng tôi đƣa ra

phƣơng pháp phân tích các chất chuyển hóa của nitrofuran nhƣ sau:

Cân 2 g mẫu/blank/QC vào ống ly tâm

Thêm 10 ml HCl 0,2M và 240 µl 2-NBA 10mg/ml

Thêm 100 µl hỗn hợp nội chuẩn vào mỗi ống

Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu thêm chuẩn chỉ tính trên mẫu

Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sang để qua đêm trong bể điều nhiệt 400C

Trung hòa mẫu bằng 10 ml K2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc vortex 20 giây

Ly tâm ở 4500 rpm trong 15 phút lấy dung di ̣ch mẫu

Hoạt hóa cột SPE (Oasis HLB): 3 ml EtAc → 3 ml MeOH → 2 x 2,5 ml H2O

Nạp mẫu vào cột chiết rửa bằng 2 x 2,5 ml H2O

Hút chân không cho khô cột SPE

Rửa giải chất phân tích bằng 4 ml EtAc vào ống nghiệm

Thổi khô dung di ̣ch mẫu bằng N2

Hòa tan cặn bằng 1 ml H2O:MeOH (60:40)

Chuyển mẫu vào vial và đem phân tích bằng LC/MS/MS

3.3. Ứng dụng phƣơng pháp trong phân tích thực phẩm

Trên cơ sở phƣơng pháp đã xây dựng và thẩm định, chúng tôi ứng dụng để

phân tích một số loại thực phẩm tƣơi sống trên địa bàn Hà Nội. Các kết quả đƣợc

trình bày ở bảng 3.16

Bảng 3.16: Kết quả phân tích mẫu thực theo phương phá p thêm chuẩn

Lƣợng thêm Lƣợng tìm STT Mẫu Nitrofuran R% vào (ng) thấy (ng)

0 KPH - AOZ 1 0,87 87

0 KPH - AMOZ 1 0,96 96 Thịt lợn chợ 1 Nguyễn Cao 0 KPH - AHD 1 0,78 78

0 KPH - SEM 1 0,72 72

0 KPH - AOZ 1 1,12 112

0 KPH - AMOZ 1 1,02 102 Thịt gà chợ 2 Nguyễn Cao 0 KPH - AHD 1 0,95 95

0 KPH - SEM 1 0,89 89

0 KPH - AOZ 1 0,99 99 Thịt bò chợ Mai 3 Động 0 KPH - AMOZ 1 1,05 105

0 KPH - AHD 1 1,03 103

0 KPH - SEM 1 1,09 109

0 KPH - AOZ 1 0,88 88

0 KPH - AMOZ 1 0,97 97 Gan chợ Mai 4 Động 0 KPH - AHD 1 0,75 75

0 KPH - SEM 1 0,69 69

0 KPH AOZ 1 1,02 102

0 KPH AMOZ 1 0,79 79 Thịt lợn chợ Cầu 5 Giấy 0 KPH AHD 1 1,01 101

0 KPH SEM 1 1,03 103

0 KPH AOZ 1 0,92 92

0 KPH AMOZ 1 0,88 88 Thịt bò chợ Cầu 6 Giấy 0 KPH AHD 1 0.79 79

0 KPH SEM 1 1,06 106

0 KPH AOZ 1 1,05 105

0 KPH AMOZ 1 1,11 110 Thịt lợn chợ Ngọc 7 Hà 0 KPH AHD 1 0,98 98

0 KPH SEM 1 0,67 67

0 KPH AOZ 1 0,76 76

0 KPH AMOZ 1 0,82 82 Thịt gà chợ Ngọc 8 Hà 0 KPH AHD 1 0,97 97

0 KPH SEM 1 0,73 73

KPH: không phát hiện < LOD của phương pháp,

R %: Phần trăm độ thu hồi.

Bàn luận:

Qua quá trình phân tích một số mẫu thực trên địa bàn Hà Nội, không phát

hiện mẫu nào có chứa các chất nhóm nitrofuran.

Độ thu hồi hầu hết các chất tƣ̀ 67 – 112% đáp ƣ́ ng đƣơ ̣c qui đi ̣nh củ a Châu Âu 2002/657/EC. Tƣ̀ kết quả đô ̣ thu hồi này cho t hấy có thể mở rô ̣ng phƣơng pháp cho các sản phẩm thƣ̣c phẩm tƣơi sống khác.

3.4 Hƣớng phát triển của đề tài

Trong bản luận văn này, do điều kiện còn hạn chế nên chúng tôi chỉ xác định

đƣợc dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS trong một số mẫu thực

phẩm tƣơi sống (thịt gà , thịt lợn, thịt bò , gan). Phƣơng pháp còn có thể đƣợc mở

rộng phân tích trong những dạng nền mẫu khác nhau nhƣ: thức ăn chăn nuôi, mẫu

sinh học, mẫu sữa…Vì vậy rất cần có những nghiên cứu tiếp theo để phát triển

phƣơng pháp và áp dụng phu ̣c vu ̣ phân tích mẫu vào thực tiễn.

KẾT LUẬN

Trên cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng kỹ

thuâ ̣t sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS để tách và xác định các kháng sinh nhóm

nitrofuran trong mẫu thực phẩm tƣơi sống, chúng tôi đã thu đƣợc các kết quả sau:

1. Đã nghiên cứu đƣợc các điều kiện chạy sắc ký lỏng khối phổ để xác định 4

chất chuyển hóa nhóm nitrofuran bao gồm:

- Khảo sát đƣợc các điều kiện đo phổ khối (thế phân nhóm (DP), năng lƣợng

va chạm (CE)..) để thu đƣợc các ion khối đặc trƣng của từng chất nitrofuran.

- Khảo sát chọn đƣợc các điều kiện sắc ký lỏng: cột sắc C18 Agilent (150mm

× 2,1mm × 3,5µm); pha động vớ i kênh A amoniacetat 10mM trong nƣớc và

kênh B là metanol; chƣơng trình rửa giải gradient.

2. Đã khảo sát đƣợc điều kiện tách và làm sạch các nitrofuran ra khỏi nền mẫu

thịt lợn bằng chiết pha rắn với cột chiết oasis HLB.

3. Đã thẩm định các thông số của phƣơng pháp bao gồm:

- Khoảng tuyến tính: trong khoảng từ 0,5 – 5 µg/kg với hệ số tƣơng quan

tuyến tính R2 > 0,996.

- Giới hạn phát hiện AOZ (0,100 µg/kg), AMOZ (0,119 µg/kg), AHD (0,223

µg/kg), SEM (0,378 µg/kg), đáp ứng yêu cầu về độ nhạy để phân tích các

chất nhóm nitrofuran.

- Độ thu hồi trung bình tƣ̀ 80,5 – 106% cho thấy phƣơng pháp có độ đúng tốt.

- Độ lệch chuẩn tƣơng đối thấp (RSD% < 13,7%) cho thấy phƣơng pháp có độ

lặp lại và chính xác cao.

4. Đã ứng dụng phƣơng pháp để phân tích các mẫu thực phẩm tại các chợ trên

địa bàn Hà Nội, cho thấy phƣơng pháp có thể ứng dụng để phân tích xác định

dẫn xuất nhóm nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Quốc Ân (2009), Sử dụng khá ng sinh trong chăn nuôi thú y ở Viê ̣t Nam ,

Cục thú y.

2. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa

học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất bản Khoa học

và Kỹ thuật, Hà Nội.

3. Nguyễn Đức Huệ (2005), Các phương pháp phân tích Hữu cơ, Nhà xuất bản Đại

học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội.

4. Phạm Luận (2000), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC),Nhà xuất

bản Đại học Quốc Gia Hà Nội.

5. Nguyễn Đình Thành (2011), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học

trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

6. Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình Thống kê trong Hóa học phân tích, khoa Hóa học

trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

7. Bùi Thị Tho (2003), Thuốc kháng sinh và nguyên tắc sử dụng trong chăn nuôi,

Nhà xuất bản Hà Nội.

8. Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học trƣờng

Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

9. Số 54/2002/QĐ-BNN, ngày 20 tháng 06 năm 2002 về việc cấm sản xuất, nhập

khẩu, lưu thông và sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản xuất và kinh

doanh thức ăn chăn nuôi của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.

10. 28 TCN 194:2004,Các chất chuyển hóa thuộc nhóm nitrofuran trong thủy sản

và sản phẩm thủy sản – Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ - khối

phổ, Bộ Thủy Sản.

11. Trang web (2008), http//vietbao.vn/Kinh-te/My-kiem-tra-thuy-san-nuoi-Trung-

Quoc-Viet-Nam-lo-ngai/55154852/93. Việt Báo

Tiếng Anh

12. Alexander Leitner, Peter Zollner, Wolfgang Lindner (2001),“Determination of

the metabolites of nitrofuran antibiotics in animal tissue by high-performance liquid

chromatography–tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography A,

Volume 939, pp. 49-58.

13. Caroline Douny, Joelle Widart, Edwin De Pauw, Frederic sivestre, Packtrick

Kestemont, Huynh Thi Tu, Nguyen Thanh Phuong (2012), Development of an

analytical method to detect metabolites of nitrofurans: Application to the study of

furazolidone elimination in Vietnamese black tiger shrimp (Penaeus monodon),

Aquaculture, Volume 376-379, pp. 54-58.

14. C. Bock, C. Stachel, P.Gowik (2007), Validation of a confirmatory method for

the determination of residues of four nitrofurans in egg by liquid chromatography-

tandem mass spectrometry with the software interval, Analytica Chimica Acta,

Volume 586, pp. 348-358.

15. C. Chang, D.P. Peng, J.E. Wu, Y.L. Wang, Z.H. Yuan (2008), Development of

an indirect competitive ELISA for the detection of furazolidone marker residue in

animal edible tissues. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol.53, pp

8934-8939.

16. Chung-Wei Tsai, chuan-ho tang and Wei-Hsien wang (2010), “Quantitative

Determination of Four Nitrofurans and Corresponding Metabolites in the Fish

Muscle by Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-Tandem Mass

Spectrometry”, Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 18, No. 2, pp. 98-106.

17. D. Tyler (2009), Analysis of nitrofurans in animal tissues a food of animal

origin by LC/MS/MS, sop FSG341.

18. E. Horne, A. Cadogan, M. OKeeffe, Hoogenboo, L.A.P. (1996), Analysis of

protein-bound metabolites of furazolidone and furaltadone in pig liver by high

performance liquid chromatography and liquid chromatography mass spectrometry.

Analyst, Vol.121, 1463-1468.

19. E. Verdon, P. Couedor, P. Sanders (2007), Multi-residue monitoring for the

simultaneous determination of five nitrofurans (furazolidone, furaltadone,

nitrofurazone, nitrofurantoine, nifursol) in poultry muscle tissue through the

detection of their five major metabolites (AOZ, AMOZ, SEM, AHD, DNSAH) by

liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry – Inhouse

validation in line with Commission Decision 657/2002/EC. Analytica Chimica Acta,

Vol.586, pp 336-347.

20. I. Diblikova, K.M. Cooper, D.G. Kennedy, M. Franek (2005), Monoclonal

antibody-based ELISA for the quantification of nitrofuran metabolite 3-amino-2-

oxazolidinone in tissues using a simplified sample preparation. Analytica Chimica

Acta, Vol.540, 285-292.

21. K.M. Cooper, P.P. Mulder, van Rhijn J.A. van Rhijn, L. Kovacsics, R.J.

McCracken, P.B. Young, D.G. Kennedy (2005), Depletion of four nitrofuran

antibiotics and their tissue-bound metabolites in porcine tissues and determination

using LC-MS/MS and HPLC-UV. Food Additives and Contaminants, pp 405-414.

22. Lech Rodziewicz (2008), Determination of nitrofuran metabolites in milk by

liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry, Journal

of chromatography, Vol.864, pp. 156-160.

23. Mayda I.Lopez (2007), “Determination and confirmation of Nitrofuran residues

in honey using LC-MS/MS”, Journal of agricultural and food chemistry, Vol.55,

pp. 1103-1108.

24. M. O’Keeffe , A. Conneely, K.M. Cooper, D.G. Kennedy, L. Kovacsics, A.

Fodor, P.P.J. Mulder, J.A. van Rhijn, G. Trigueros (2004), Nitrofuran antibiotic

residues in pork the FoodBRAND retail survey. Analytical Chimica Acta, Vol.520,

125-131.

25. M. Vass*, K. Hruska, M. Franek (2008), “Nitrofuran antibiotics: a review on the

application, prohibition and residual analysis”, Veterinarni Medicina, Vol.53, pp.

469–500.

26. Pascal Mottier, Seu-Ping Khong, Eric Gremaud, Janique Richoz, Thierry

Delatour, Till Goldmann, Philippe A.Guy (2005), Quantitative determination of

four nitrofuran metabolites in meat by isotope dilution liquid chromatography-

electrospray ionization-tandem mass spectrometry, Journal of chromatography A,

Volume 1067, pp. 85-91.

27. P. Vinas, N. Campillo, L. Carrasco, M. Hernandez-Cordoba (2007), Analysis of

nitrofuran residues in animal feed using liquid chromatography and photodiode-

array detection, Chromatographia, Vol.65, pp. 85-89.

28. Randox laboratory (2008), “Measurement of four nitrofuran metabolites with

elisa kits using multi-analyte reagents”, Randox life sciences.

29. Sujittra Phongvivat, Bangkok, Thailand (2004), “Nitrofurans Case Study:

Thailand’s experience”, Joint FAO/WHO Technical Workshop on, Residues of

Substances without ADI/MRL in Food.

30. Tao Ding, Jingzhong Xu, Chongyu Shen and Kefei Wang (2007),

“Determination of trace level nitrofuran metabolites in crawfish meat by

electrospray LC-MS/MS on the TSQ quantum discovery MAX, Thermo fisher

scientific, San Jose, CA, USA.

31. W. Lui, C. Zhao, Y. Zhang, S. Lu, J. Liu, R. Xi (2007), Preparation of

polyclonal antibodies to a derivative of 1-amonihydantoin (AHD) and development

of an indirect competitive ELISA for the detection of nitrofurantoin residue in

water. Journal of Agriculture and Food Chemistry, Vol.55, 6829-6834.

32. 2002/657/EC implementing Council Directive 96/23/EC concerning the

performance of analytical methods and the interpretation of results.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Sắc đồ củ a hỗn hơ ̣p chuẩn.

P 1.1: Sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn nitrofuran 1 ppb.

P 1.2: Sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn nitrofuran1,5 ppb.

P 1.3: sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn nitrofuran 2 ppb.

P 1.4: sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn nitrofuran 5 ppb.

Phụ lục 2: Sắc đồ mẫu thêm chuẩn

P 2.1: sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 1 ng/g.

P 2.2: sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 1 ng/g.

P 2.3: sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 1 ng/g.

P 2.4: sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 1,5 ng/g.

P 2.5: sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 1,5 ng/g.

P 2.6: sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 1,5 ng/g.

P 2.7: sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 2 ng/g.

P 2.8: sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 2 ng/g.

P 2.9: sắc đồ mẫu thi ̣t lơ ̣n thêm chuẩn hỗn hơ ̣p nitrofuran ta ̣i mƣ́ c nồng đô ̣ 2 ng/g. Phụ lục 3: cách tính điểm IP

P 3.1: Quan hê ̣ giƣ̃a các kỹ thuâ ̣t khối phổ và số điểm IP đa ̣t đƣơ ̣c

P 3.2: Ví dụ về số điểm IP đạt đƣợc đối với các kỹ thuật khối phổ khác nhau

Phụ lục 4:

P 4.1: Bảng qui định hệ số biến thiên tại các cấp nồng độ

P 4.2: Bảng qui định về độ thu hồi tại các cấp nồng độ

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS

Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số:

60 44 29

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO

Hà Nội – 2012

Tiến hành thực nghiệm: Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn của chất phân tích . Xác

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Quản lý hoạt động phát triển nhận thức cho trẻ mẫu giáo ở các trường mầm non, huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về điều kiện đầu tư kinh doanh trong lĩnh vực giáo dục, đào tạo ở Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Sự nghiệp nghiên cứu phê bình văn học của Hoài Thanh

Luận văn Thạc sĩ: Tiểu thuyết của Đỗ Phấn từ góc nhìn sinh thái

Luận văn Thạc sĩ: Giải pháp ứng phó với nhập cư ở Liên minh Châu Âu

Luận văn Thạc sĩ: Diễn ngôn về giới nữ trong văn xuôi nữ Việt Nam đương đại (khảo sát sáng tác của Dạ Ngân, Y Ban, Lý Lan, Nguyễn Thị Thu Huệ)

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng mức phát thải tham chiếu rừng khu vực huyện Bảo Lâm tỉnh Lâm Đồng

Luận văn Thạc sĩ: Đặc điểm nhân vật chính trong ba tác phẩm của Franz Kafka: Lâu đài, Vụ án, Hóa thân

Kháo luận tốt nghiệp: Vận dụng lí thuyết học tập trải nghiệm vào dạy học Thống kê - Xác suất ở lớp Hai

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng hệ thống điều khiển và thu nhận dữ liệu cho Robot dịch vụ

Luận văn Thạc sĩ: Thế giới nhân vật trong truyện ngắn Lê Minh Khuê sau năm 1975

Luận văn Thạc sĩ: Tác động của cấu trúc vốn đến hiệu quả hoạt động của các ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Kiểm soát rủi ro tín dụng bán lẻ tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Đầu tư và Phát triển Việt Nam chi nhánh Thủ Thiêm

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kinh doanh của ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hành vi sử dụng dịch vụ ngân hàng điện tử tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Ngoại thương Việt Nam – Chi nhánh Thủ Đức

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố tác đồng đến nợ xấu tại Ngân hàng Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn - Chi nhánh Tiền Giang

Luận văn Thạc sĩ: Yếu tố ảnh hưởng đến quyết định sử dụng dịch vụ thanh toán không dùng tiền mặt tại Ngân hàng TMCP Công thương Việt Nam (Vietinbank)

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về du lịch biển, thực tiễn tại tỉnh Bình Định

Luận văn Thạc sĩ: Ảnh hưởng của các yếu tố thương hiệu với vai trò trung gian của Marketing truyền miệng đến quyết định chọn việc làm của nhân viên GenZ tại chuỗi nhà hàng gà rán Popeyes khu vực Thành Phố Hồ Chí Minh

Luận văn Thạc sĩ: Ảnh hưởng của Marketing mix đến ý định học cao học của sinh viên khối ngành kinh tế thuộc Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok