Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính enzym 5α-reductase từ mô tuyến tiền liệt người

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> XÂY DỰNG QUI TRÌNH Đ[NH GI[ HOẠT TÍNH<br /> ENZYM 5α-REDUCTASE TỪ MÔ TUYẾN TIỀN LIỆT NGƢỜI<br /> Trần Thủy Tiên*, Nguyễn Đức Toàn*, Trần Mạnh Hùng*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Xây dựng qui trình đ{nh gi{ hoạt tính 5α-reductase in vitro từ mô tuyến tiền liệt người để sàng<br /> lọc các thuốc có t{c động điều trị PĐTTLLT.<br /> Đối tượng v| phương pháp nghiên cứu<br /> Mẫu thử nghiệm: Mẫu mô tuyến tiền liệt của bệnh nh}n PĐTTLLT được chỉ định phẩu thuật tại bệnh viện<br /> Bình Dân, Tp. HCM với đầy đủ hồ sơ bệnh án và sự đồng ý của bệnh nhân.<br /> Quy trình tạo dịch đồng thể chứa enzym 5α-reductase: Mô tuyến tiền liệt được đồng nhất hóa, ly tâm<br /> thu cắn. Hòa cắn với dịch bảo quản và tiếp tục nghiền đồng thể cho đến khi thu được dịch đồng nhất.<br /> Định lượng protein trong dịch đồng thể enzym bằng phương ph{p Bradford<br /> Định lượng testosteron bằng phương ph{p ELISA: Thực hiện theo hướng dẫn từ bộ Kit của công ty sản<br /> xuất DRG, Đức.<br /> Khảo s{t điều kiện thực hiện phản ứng khử testosteron thành dihydrotestosteron<br /> Các yếu tố như nồng độ testosteron, nồng độ NADPH, lượng protein enzym, pH và thời gian phản ứng<br /> được khảo s{t để chọn điều kiện phản ứng xảy ra với hoạt tính enzym cao.<br /> Kết quả: Qui trình tạo dịch đồng thể chứa 5α-reductase từ mô tuyến tiền liệt người xúc tác cho phản ứng<br /> chuyển testosteron thành dihydrotestosteron diễn tiến tốt ở pH = 5,5, lượng protein enzym tối thiểu 1,4 mg, nồng<br /> độ testosteron khoảng 16 ng/ml (55 nM), nồng độ NADPH: 0,15 mM, nhiệt độ ủ: 37 ºC và thời gian ủ: 60 phút.<br /> Finasterid ức chế mạnh 5α-reductase chiết từ tuyến tiền liệt người với IC50 là 10,87 nM.<br /> Kết luận: Qui trình tạo dịch đồng thể enzym 5α-reductase v| điều kiện phản ứng khử testosteron thành<br /> dihydrotestosteron có thể ứng dụng để sàng lọc thuốc có t{c động ức chế 5α-reductase.<br /> Từ khóa: Dịch đồng thể enzym, 5α-reductase, in vitro, finasterid<br /> <br /> ABSTRACT<br /> DEVELOPING AN IN VITRO PROCEDURE FOR EVALUATION OF<br /> 5α-REDUCTASE ACTIVITY FROM HUMAN PROSTATE TISSUE<br /> Tran Thuy Tien, Nguyen Duc Toan, Tran Manh Hung<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 332 - 339<br /> Aim of study: This study aimed to develop an in vitro procedure for evaluation of 5α-reductase activity from<br /> human prostate tissue that was applicable in drug screening.<br /> Material and methods<br /> BHP tissue: tissue was collected from patients undergoing endoscopic surgery for BHP at Binh Dan hospital<br /> with complete medical records and agreement of acceptance.<br /> Procedure to prepare homogenate containing 5α-reductase: BHP tissue was sliced and homogenized. Centrifuge<br /> the homogenate and remove supernatant. Continue to homogenize to form and a homogenous suspension.<br /> * Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trần Mạnh Hùng<br /> ĐT: 0937746596<br /> <br /> 332<br /> <br /> Email: manhhung1969@yahoo.com<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Protein in the homogenate was assayed by Bradford method<br /> Testosterone was assayed by ELISA: using the Kit provided by DRG, Germany.<br /> Optimizing reactive conditions to covert testosterone into dihydrotestosterone: factors such as testosterone<br /> concentration, NADPH concentration, amount of enzymatic protein, pH and reaction time were investigated to<br /> establish high enzyme activity in the reaction.<br /> Results: Procedure to prepare homogenate from BHP tissue containing 5α-reductase catalyzed the<br /> conversion of testosterone to dihydrotestosterone under following conditions: pH 5.5, amount of enzymatic<br /> protein at least 1.4 mg, testosterone concentration approximate 16 ng/ml, NADPH: 0.15 mM, reaction<br /> temperature: 37ºC and reaction time: 60 minutes.<br /> Finasteride strongly inhibited 5α-reductase in the homogenate with IC50 of 10.87 nM.<br /> Conclusion: Procedure for preparation of enzyme homogenate containing 5α-reductase and reaction<br /> conditions can be applied as a screening tool for 5α-reductase inhibitors.<br /> Key words: enzym homogenate, 5α-reductase, in vitro, finasteride<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Phì đại tuyến tiền liệt l|nh tính (PĐTTLLT)<br /> là một bệnh lý thƣờng gặp ở nam giới sau tuổi 40<br /> v| thƣờng gây ra các triệu chứng ở đƣờng tiểu<br /> dƣới. Với những tiến bộ trong điều trị, đặc biệt là<br /> các kỹ thuật điều trị ngoại khoa, bệnh đã đƣợc<br /> kiểm soát phần n|o v| thƣờng không dẫn đến tử<br /> vong. Tuy nhiên, các triệu chứng của bệnh nhƣ<br /> đau buốt, tiểu đêm, khó tiểu gây ra sự phiền toái,<br /> khó chịu, làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng cuộc<br /> sống của bệnh nh}n, l|m tăng g{nh nặng bệnh<br /> tật v| chi phí điều trị ở ngƣời cao tuổi.<br /> Hiện nay việc điều trị PĐTTLLT bao gồm<br /> điều trị nội khoa v| điều trị ngoại khoa, ngoài ra<br /> còn sử dụng các loại thảo dƣợc trong liệu pháp<br /> điều trị bổ sung, hỗ trợ. Hai nhóm thuốc đƣợc sử<br /> dụng phổ biến trong điều trị PĐTTLLT là thuốc<br /> chẹn α-adrenergic receptor (terazosin, alfuzosin)<br /> và thuốc ức chế 5α-reductase (finasterid,<br /> dutasterid).<br /> 5α-reductase, một enzym gắn kết với màng<br /> nhân trong tế bào tuyến tiền liệt có hoạt tính xúc<br /> tác sự khử testosteron thành dihydrotestosteron<br /> l| androgen chính thúc đẩy sự tăng sinh tế bào<br /> tuyến tiền liệt phụ thuộc androgen. Do đó, ức<br /> chế 5α-reductase là một cơ chế quan trọng trong<br /> việc nghiên cứu tìm ra các thuốc mới có tác dụng<br /> ngăn sự tiến triển của bệnh cũng nhƣ cải thiện<br /> các triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân.<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về<br /> enzym 5α-reductase. Hoạt tính in vitro của 5αreductase trong màng nhân và microsom của tế<br /> bào mào tinh hoàn chuột nhắt đƣợc nghiên cứu<br /> bởi Monsalve và cộng sự(6). Sau đó Normington<br /> và cộng sự đã nghiên cứu sự khác nhau về các<br /> chỉ số động học và sự phân bố trên các mô của 2<br /> loại isozym 5α-reductase từ chuột nhắt(7). Pratis<br /> và cộng sự nghiên cứu về hoạt tính in vitro của 2<br /> loại isozym chiết từ tinh hoàn chuột(9). Nghiên<br /> cứu so sánh hoạt tính của enzyme 5α-reductase<br /> từ tuyến tiền liệt và mào tinh hoàn chuột nhắt tại<br /> pH trung tính đƣợc thực hiện bởi Span và cộng<br /> sự(11). Tại Việt Nam, Trần Thủy Tiên và cộng sự<br /> đã sơ bộ tìm đƣợc những điều kiện tối ƣu cho<br /> hoạt tính in vitro của 5α-reductase từ mào tinh<br /> hoàn chuột(15), nghiên cứu của Tạ Quang Vƣợng<br /> và cộng sự sau đó đã x}y dựng đƣợc quy trình<br /> định lƣợng và các thông số tối ƣu hóa cho hoạt<br /> tính in vitro của enzym chiết từ mào tinh hoàn<br /> chuột nhắt(12). Tuy vậy vẫn chƣa có nghiên cứu<br /> nào cho thấy hoạt tính in vitro của 5α-reductase<br /> có nguồn gốc từ ngƣời, qua đó có đƣợc những<br /> thông số v| điều kiện để nghiên cứu về khả<br /> năng ức chế enzym này từ các loại thuốc v| dƣợc<br /> liệu. Xuất phát từ những đặc điểm trên, nghiên<br /> cứu n|y đƣợc tiến hành với những mục tiêu sau:<br /> - Xây dựng quy trình tạo dịch đồng thể chứa<br /> enzym 5α-reductase từ tuyến tiền liệt ngƣời.<br /> <br /> 333<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> - Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới hoạt tính<br /> in vitro của enzym 5α-reductase.<br /> <br /> Định lƣợng protein trong dịch đồng thể enzym<br /> bằng phƣơng ph{p Bradford<br /> <br /> ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPH[P NGHIÊNCỨU<br /> <br /> Dựa vào phản ứng màu của protein với xanh<br /> Coomassie, đo độ hấp thu ở 595 nm. Dựa vào<br /> đƣờng tuyến tính chuẩn từ albumin bò (BSA),<br /> xác định nồng độ protein trong mẫu.<br /> <br /> Mẫu thử nghiệm<br /> Mẫu mô tuyến tiền liệt lấy từ các bệnh nhân<br /> nam đƣợc chỉ định điều trị phì đại tuyến tiền liệt<br /> lành tính bằng phƣơng ph{p cắt đốt nội soi tại<br /> bệnh viện Bình Dân, Tp. HCM với đầy đủ hồ sơ<br /> bệnh án và sự cho phép của bệnh nhân.<br /> Hóa chất và thuốc thử nghiệm<br /> D,L-Dithiothreitol, độ tinh khiết ≥ 98% (TLC)<br /> của Sigma Aldrich (số lô SLBK4951V),<br /> testosteron độ tinh khiết ≥ 99% (HPLC) của<br /> Sigma Aldrich (số lô BCBL3419V), β-nicotinamid<br /> adenin dinucleotid phosphat tetrasodium dạng<br /> khử (NADPH), độ tinh khiết ≥ 95% của Santa<br /> Cruz (số lô C0315), finasterid của Santa Cruz (số<br /> lô SC-203954). Các hóa chất phụ trợ kh{c đạt tiêu<br /> chuẩn thí nghiệm phân tích.<br /> <br /> Định lƣợng testosteron bằng phƣơng ph{p<br /> ELISA<br /> Phƣơng ph{p định lƣợng testosteron đƣợc<br /> thực hiện theo hƣớng dẫn từ bộ Kit của công ty<br /> sản xuất DRG, Đức. Xây dựng đƣờng tuyến tính<br /> định lƣợng testosteron ở các nồng độ testosteron<br /> chuẩn: 0,25 - 0,5 - 1 - 2 - 6 -16 (ng/ml). Đo độ hấp<br /> thu sau phản ứng ở bƣớc sóng 450 nm. Xây<br /> dựng đƣờng tuyến tính theo công thức(11,12):<br /> <br /> Bộ kit định lƣợng testosteron bằng phƣơng<br /> ph{p ELISA đƣợc sản xuất bởi DRG, Đức.<br /> <br /> Với<br /> <br /> Trang thiết bị thử nghiệm<br /> <br /> B: Mật độ quang mẫu chuẩn<br /> <br /> C}n ph}n tích Satorious, m{y đo pH, máy<br /> nghiền đồng thể tế bào kiểu stato/roto ULTRA<br /> TURRAXR T25, máy ly tâm lạnh Sigma, Đức,<br /> máy quang phổ UV-Vis HITACHI U-1900, máy<br /> đo quang microplate reader BIORAD 16591 v|<br /> các dụng cụ thí nghiệm khác.<br /> <br /> C: Mật độ quang mẫu trắng<br /> <br /> Quy trình chiết enzym từ mô tuyến tiền liệt của<br /> ngƣời<br /> Mô tuyến tiền liệt đƣợc cắt nhỏ, cho vào ống<br /> falcon 15 ml có chứa dung dịch bảo quản enzym<br /> (sucrose 0,32 M, dithiothreitol (DTT) 1 mM trong<br /> đệm phosphat 20 mM, pH 6,5). Đồng nhất hóa<br /> mẫu mô với tốc độ 16.000 vòng/phút ở nhiệt độ 4<br /> ºC (nghiền 20 gi}y, ngƣng 10 gi}y, lặp lại 5 lần).<br /> Ly tâm dịch đồng thể ở nhiệt độ -4ºC, lực ly tâm<br /> 13.000 g trong 10 phút, bỏ dịch thu cắn. Hòa cắn<br /> với lƣợng thể tích dịch bảo quản gấp 3 lần thể<br /> tích cắn, sau đó đem hỗn dịch tiếp tục nghiền<br /> đồng thể với thời gian, tốc độ và số lần tƣơng tự<br /> nhƣ giai đoạn nghiền thứ nhất.<br /> <br /> 334<br /> <br /> C: Nồng độ testosteron chuẩn<br /> <br /> Chọn lựa điều kiện thực hiện phản ứng khử<br /> testosteron thành dihydrotestosteron<br /> Tiến hành phản ứng khử testosteron thành<br /> dihydrotestosteron nhờ vào hoạt tính xúc tác<br /> của 5α-reductase. Hoạt tính enzym đƣợc đ{nh<br /> giá bằng sự giảm đi của lƣợng cơ chất<br /> testosteron sau khi phản ứng xảy ra. Nồng độ<br /> testosteron sau phản ứng đƣợc định lƣợng<br /> bằng phƣơng ph{p ELISA. Nồng độ cơ chất<br /> testosteron trong các mẫu phải nằm trong giới<br /> hạn định lƣợng của bộ kit 0-16 ng/ml. Dung<br /> dịch bảo quản DTT đóng vai trò l| t{c nh}n<br /> chống oxy hóa, đƣợc sử dụng trong phản ứng<br /> với nồng độ khoảng 0,9-1 Mm(12).<br /> Thực hiện các phản ứng thăm dò hoạt tính<br /> enzym phụ thuộc các tác nhân:<br /> - pH: thăm dò hoạt tính enzym tại các giá trị<br /> pH 2 - 5,5 - 6 - 6,5 - 7 - 8,5 và 12.<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> - Cofactor NADPH: thăm dò tại các nồng độ<br /> 0 mM; 0,15 mM và 0,3 mM.<br /> - Dịch đồng thể enzym: tiến hành khảo sát<br /> trên lƣợng protein enzym: 0,28 - 0,56 - 0,84 - 1,12<br /> - 1,4 và 1,68 mg/ml<br /> - Nhiệt độ phản ứng: thực hiện ủ phản ứng ở<br /> nhiệt độ 37ºC.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> - Các phản ứng đƣợc thực hiện trong<br /> eppendolf dung tích 2 ml có nắp đậy. Kết thúc<br /> phản ứng bằng cách đƣa pH > 10 bằng NaOH<br /> 0,1M nhằm bất hoạt enzym, ủ ở nhiệt độ phòng<br /> trong vòng 10 phút v| sau đó trung hòa bằng<br /> HCl 0,1M.<br /> Hoạt tính enzym đƣợc tính theo công thức:<br /> <br /> - Thời gian phản ứng: khảo sát phản ứng ở<br /> các khoảng thời gian 15 - 30 - 60 - 120 phút.<br /> <br /> Khảo sát tác dụng ức chế 5α-reductase in vitro<br /> của finasterid<br /> <br /> 1mM; nhiệt độ ủ 37ºC và thời gian phản ứng 60<br /> phút nhƣ trong bảng 1:<br /> <br /> Thực hiện quy trình tạo dịch đồng thể<br /> enzym nhƣ mô tả ở trên và khảo sát hoạt tính ức<br /> chế 5α-reductase trong dịch đồng thể của<br /> finasterid với các nồng độ (ng/ml) là: 0; 0,1; 1; 5;<br /> 10; 15; 20; 30; 100; 1000. X{c định IC50 của<br /> finasterid.<br /> <br /> Kết quả cho thấy lƣợng testosteron giảm khi<br /> thực hiện phản ứng, do đó enzym trong dịch<br /> đồng thể có hoạt tính xúc tác cho sự chuyển hóa<br /> testosteron. Khi tăng lƣợng protein enzym thì<br /> hoạt tính enzym cũng tăng theo. Phản ứng với<br /> lƣợng protein 1,68 mg cho hoạt tính enzym<br /> không tăng hơn so với lƣợng protein 1,4 mg do<br /> đó 1,4 mg protein enzym đƣợc chọn cho các<br /> phản ứng tiếp theo.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Xây dựng đƣờng tuyến tính định lƣợng protein<br /> từ albumin huyết thanh bò (BSA) v| đƣờng<br /> tuyến tính định lƣợng testosteron<br /> Đƣờng tuyến tính của dung dịch BSA chuẩn<br /> đƣợc xây dựng ở khoảng nồng độ 1-6 mg/dL và<br /> đƣờng tuyến tính testosteron đƣợc xây dựng ở<br /> khoảng nồng độ 0,25-16 ng/ml.<br /> Khảo sát sự thay đổi hoạt tính enzym theo hàm<br /> lƣợng protein enzym<br /> Thực hiện quy trình tạo dịch đồng thể<br /> enzym từ tuyến tiền liệt ngƣời v| định lƣợng<br /> h|m lƣợng protein, thu đƣợc dịch đồng thể<br /> enzym có nồng độ protein là 2,81 mg/ml. Kết<br /> quả khảo sát sự ảnh hƣởng của lƣợng protein<br /> enzym lên hoạt tính 5α-reductase ở điều kiện:<br /> lƣợng cơ chất testosteron ban đầu: 20,17 ng; pH =<br /> 6,5; nồng độ NADPH: 0,3 mM; nồng độ DTT:<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Khảo sát sự thay đổi hoạt tính enzym theo<br /> nồng độ NADPH<br /> NADPH đƣợc khảo sát ở 2 nồng độ 0,15 mM<br /> và 0,3 mM với điều kiện phản ứng nhƣ sau:<br /> lƣợng testosteron ban đầu: 15,09 ng; pH = 6,5;<br /> lƣợng protein enzym: 1,4 mg; nồng độ DTT:<br /> 1mM; nhiệt độ ủ 37ºC và thời gian phản ứng 60<br /> phút. Kết quả trình bày ở bảng 2.<br /> Kết quả cho thấy phản ứng xúc tác của<br /> enzym gần nhƣ không xảy ra khi không sử dụng<br /> NADPH trong phản ứng. Điều này hoàn toàn<br /> phù hợp vì 5α-reductase là một enzym phụ<br /> thuộc NADPH. Hoạt tính của enzym giảm<br /> không đ{ng kể khi nồng độ NADPH giảm từ 0,3<br /> mM xuống 0,15 mM, do đó NADPH đƣợc sử<br /> dụng ở nồng độ 0,15 mM trong các phản ứng<br /> tiếp theo.<br /> <br /> 335<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Biểu đồ 1: Đường tuyến tính của dung dịch BSA (A) và testosteron (B)<br /> Bảng 1: Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính 5α-reductase theo lượng protein enzym<br /> Mẫu<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> <br /> Lượng protein enzym<br /> (mg)<br /> 0,28<br /> 0,56<br /> 0,84<br /> 1,12<br /> 1,4<br /> 1,68<br /> <br /> Lượng testosteron ban đầu<br /> (ng)<br /> <br /> 20,17<br /> <br /> Lượng testosteron sau phản ứng<br /> (ng)<br /> 20,04<br /> 19,79<br /> 15,95<br /> 15,47<br /> 9,67<br /> 9,48<br /> <br /> Hoạt độ enzym<br /> (pmol/phút)<br /> 0,45<br /> 1,32<br /> 14,65<br /> 16,32<br /> 36,46<br /> 37,12<br /> <br /> Bảng 2: Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính enzym theo nồng độ NADPH<br /> Mẫu Nồng độ NADPH (mM) Lượng testosteron ban<br /> đầu (ng)<br /> 1<br /> 0<br /> 2<br /> 0,15<br /> 15,09<br /> 3<br /> 0,30<br /> <br /> Khảo sát sự thay đổi hoạt tính enzym theo pH<br /> Phản ứng đƣợc thực hiện trong khoảng pH =<br /> 2-12, với c{c điều kiện: lƣợng testosteron ban<br /> đầu: 15,21 ng; lƣợng protein enzym: 1,4 mg;<br /> nồng độ NADPH: 0,15 mM, nồng độ DTT: 1mM;<br /> nhiệt độ ủ 37 oC và thời gian phản ứng 60 phút,<br /> nhằm x{c định pH thể hiện hoạt tính enzym cao.<br /> Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.<br /> <br /> Lượng testosteron sau phản ứng<br /> (ng)<br /> 15,00<br /> 0,49<br /> 0,38<br /> <br /> Hoạt độ enzym<br /> (pmol/phút)<br /> 0,31<br /> 50,69<br /> 51,07<br /> <br /> v| thay đổi không nhiều khi pH thay đổi trong<br /> khoảng 5,5-8,5. Do vậy có thể dự đo{n đƣợc rằng<br /> trong mô tuyến tiền liệt của ngƣời biểu hiện<br /> cùng lúc 5α-reductase loại 1 (pH tối ƣu từ 6-8,5)<br /> và loại 2 (pH tối ƣu 5,5). Do 5α-reductase loại 2<br /> hiện diện ở c{c cơ quan sinh dục và kết quả từ<br /> thí nghiệm này, chọn thông số pH = 5,5 l|m điều<br /> kiện cho các phản ứng tiếp theo.<br /> <br /> Kết quả cho thấy ở pH = 2 và 12, enzym gần<br /> nhƣ không có hoạt tính. Enzym có hoạt tính cao<br /> Bảng 3: Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính enzym theo pH<br /> Mẫu<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> 7<br /> <br /> 336<br /> <br /> pH<br /> 2<br /> 5,5<br /> 6<br /> 6,5<br /> 7<br /> 8,5<br /> 12<br /> <br /> Lượng testosteron ban đầu (ng)<br /> <br /> 15,71<br /> <br /> Lượng testosteron sau phản ứng (ng)<br /> 15,21<br /> 0,3<br /> 0,59<br /> 0,63<br /> 0,51<br /> 0,48<br /> 15,42<br /> <br /> Hoạt độ enzym (pmol/phút)<br /> 1,74<br /> 53,51<br /> 52,5<br /> 52,36<br /> 52,78<br /> 52,88<br /> 1<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br />