Xây dựng quy trình định lượng Geniposid trong cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GENIPOSID<br /> TRONG CAO KHÔ DÀNH DÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC<br /> Trần Thanh Tâm*, Nguyễn Đức Hạnh**, Huỳnh Trần Quốc Dũng***, Nguyễn Đức Tuấn**<br /> <br /> TÓMTẮT<br /> Mở đầu – Mục tiêu: Quả Dành dành (Gardenia Fructus) với thành phần hóa học đặc trưng là các<br /> iridoid glycosid (trong đó 2 hoạt chất có hàm lượng cao là geniposid và gardenosid) được sử dụng từ bao đời<br /> nay với tác dụng điều trị tăng huyết áp. Dược điển Trung Quốc 2015 sử dụng geniposid là chất đánh dấu<br /> để kiểm nghiệm dược liệu Dành dành. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào trong nước công bố quy trình<br /> định lượng geniposid trong cao khô Dành dành. Vì vậy, việc xây dựng quy trình định lượng geniposid<br /> trong cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC là cần thiết, góp phần kiểm soát chất lượng nguyên liệu<br /> cao khô Dành dành trước khi đưa vào sản xuất thành phẩm.<br /> Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Cao khô Dành dành do công ty cổ phần BV<br /> Pharma cung cấp. Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát một số điều kiện sắc ký như pha động, cột sắc ký để phân<br /> tách geniposid trong cao khô Dành dành; Khảo sát một số điều kiện chiết gineposid trong cao khô Dành dành như<br /> dung môi chiết, tỷ lệ cao và dung môi, thời gian chiết siêu âm; Thẩm định quy trình định lượng geniposid trong<br /> cao khô dành dành bằng phương pháp HPLC-DAD theo hướng dẫn của ICH bao gồm tính phù hợp hệ thống,<br /> tính chọn lọc, tính tuyến tính và miền giá trị, độ chính xác, độ đúng và độ bền.<br /> Kết quả: Đã xác định được được điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng geniposid trong cao khô<br /> Dành dành bằng phương pháp HPLC-DAD như sau: cột sắc ký Gemini NX C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm),<br /> bước sóng phát hiện 240 nm, pha động acetonitril – nước (15:85), thể tích tiêm mẫu 20 µl, tốc độ dòng<br /> 1,0 ml/phút. Quy trình phân tích đã được thẩm định đạt tính phù hợp hệ thống, có tính đặc hiệu, tính<br /> tuyến tính (ŷ = 0,4761x, R2 = 1,0000; 19,4 - 193,8 ppm) và miền giá trị (61 – 92 ppm), độ lặp lại (RSD<br /> = 0,57%), độ chính xác trung gian (RSD = 0,49 %), độ đúng với tỷ lệ hồi phục trong khoảng 100,27 –<br /> 101,46% và độ bền với sự thay đổi cho phép thành phần acetonitril trong pha động là ± 4%.<br /> Kết luận: Quy trình định lượng geniposid trong cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC-DAD<br /> đã được xây dựng và thẩm định thành công. Quy trình này có thể được áp dụng để định lượng geniposid<br /> trong cao khô Dành dành, góp phần vào công tác kiểm tra chất lượng từ khâu nguyên liệu ban đầu.<br /> Từ khóa: Gardenia Fructus, geniposid<br /> ABSTRACT<br /> DEVELOPMENT OF HPLC METHOD FOR DETERMINATION OF GENIPOSIDE<br /> IN GARDENIA FRUCTUS DRY EXTRACT<br /> Tran Thanh Tam, Nguyen Duc Hanh, Huynh Tran Quoc Dung, Nguyen Duc Tuan<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 132 – 142<br /> <br /> Background – Objectives: Gardenia Fructus has iridoid glycosides as the special chemical<br /> components in which geniposide and gardenoside have high content. Gardenia Fructus have been used for<br /> *<br /> Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm – Mỹ phẩm Đồng Tháp<br /> **<br /> Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> ***Bệnh viện Y học cổ truyền TP. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn ĐT: 0913799068 Email: ductuan@ump.edu.vn<br /> <br /> <br /> 132 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> treatment of hypertension for many years. In the Chinese Pharmacopoeia, the quality control index of<br /> Gardenia jasminoides is the content of geniposide. So far, there has been no publication for quantitative<br /> determination of geniposide in Gardenia Fructus dry extract. Therefore, this study was carried out with the<br /> aim of HPLC method development for determination of geniposide in Gardenia Fructus dry extract that<br /> contribute to quality control of the input herbal materials.<br /> Method: The object of this study is Gardenia Fructus dry extract, which was supplied by BV Pharma<br /> joint-stock company. Method: Several chromatographic conditions such as mobile phase and C18 column<br /> with different suppliers for separation of geniposide in Gardenia Fructus dry extract, and several extraction<br /> conditions such as solvent, ratio of solvent and dry extract, and extraction time by ultrasonic, were<br /> investigated. Finally, the analytical procedure was validated according to ICH guidelines, including system<br /> suitability, selectivity, linearity and range, precision, accuracy and ruggedness.<br /> Results: The appropriate chromatographic conditions for quantification of geniposide in Gardenia<br /> Fructus dry extract were obtained on Gemini-NX C18 column (250 x 4.6 mm; 5 µm), DAD detector with<br /> detection wavelength at 240 nm, mixture of acetonitrile and water (15:85) as mobile phase, injection volume<br /> of 20 µL, flow rate of 1.0 ml/min. Validation results showed that the method was suitable for the HPLC<br /> system, selective, linear (ŷ = 0.4761x, R2 = 1.0000, 19.4 – 193.8 ppm) and range (61 – 92 ppm),<br /> repeatability (RSD = 0.57%), intermediate precision (RSD = 0,49%), accurate with the recoveries in the<br /> range of 100.27 – 101.46% of the expected values. The method was also ruggedness with the accepted<br /> fluctuation of acetonitrile within  4% in mobile phase.<br /> Conclusion: The RP-HPLC method for determination of geniposide in Gardenia Fructus dry extract<br /> was successfully developed and validated. The method can be applied for quantification of geniposide in<br /> Gardenia Fructus dry extracts that contribute to quality control of the input herbal materials.<br /> Keywords: Gardenia Fructus, geniposide.<br /> ĐẶTVẤNĐỀ là cần thiết, góp phần kiểm soát chất lượng<br /> nguyên liệu cao khô Dành dành trước khi đưa<br /> Dành dành (Gardenia jasminoides Ellis., vào sản xuất thành phẩm.<br /> Rubiaceae), một loài cây được trồng và phát<br /> triển rất tốt ở các tỉnh miền Bắc nước ta, nổi ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> bật bởi màu lá xanh bóng và hoa thơm trắng Đối tượng nghiên cứu<br /> ngần. Đặc biệt, quả Dành dành với thành phần Cao khô Dành dành do công ty cổ phần BV<br /> hóa học đặc trưng là các iridoid glycosid Pharma cung cấp.<br /> (trong đó 2 hoạt chất có hàm lượng cao là<br /> Nguyên vật liệu<br /> geniposid và gardenosid) đã được sử dụng từ<br /> lâu đời như một phương thuốc quý trong việc Chất đối chiếu<br /> điều trị các bệnh như viêm gan, hạ huyết áp, Geniposid (GP), hàm lượng 99,26%, do<br /> đái tháo đường, lợi tiểu(4)…Dược điển Trung Ban Nghiên Cứu Khoa Học – Thư Viện, Đại<br /> Quốc 2015 sử dụng geniposid là chất đánh học Y Dược TP. Hồ Chí Minh cung cấp.<br /> dấu để kiểm nghiệm dược liệu Dành dành. Trang thiết bị<br /> Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào trong Hệ thống UHPLC Dionex Ultimate 3000,<br /> nước công bố quy trình định lượng geniposid detector DAD – 3000 RS, cột sắc ký Gemini NX<br /> trong cao khô Dành dành. Vì vậy, việc xây C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột Gemini<br /> dựng quy trình định lượng geniposid trong NX C18 (4,0 x 3,0 mm; 5 µm), cột Zorbax XDB<br /> cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột Zorbax<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 133<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> XDB C18 (12,5 x 4,6 mm; 5 µm), cân phân tích lệ và chiết bằng phương pháp siêu âm<br /> A&D GH-202, bể siêu âm S60H – Elma. trong 10 phút. Tiến hành sắc ký dịch chiết.<br /> Hóa chất và dung mô Chọn tỷ lệ cao và dung môi chiết theo tiêu chí<br /> Acetonitril và methanol đạt tiêu chuẩn sau: hàm lượng GP chiết được cao nhất và<br /> dùng trong sắc ký lỏng (Merck) và nước cất 2 chiều cao pic GP trong khoảng 0,2 – 0,8 AU.<br /> lần đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng.<br /> Khảo sát thời gian chiết<br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Từ tỷ lệ cao và dung môi chiết đã được<br /> Khảo sát điều kiện HPLC định lượng<br /> lựa chọn, tiến hành chiết siêu âm ở các thời<br /> geniposid trong cao khô Dành dành:<br /> điểm 3, 5, và 10 phút. Chuẩn bị 3 mẫu thử<br /> Dựa vào cấu trúc hóa học của GP và tham<br /> khảo một số tài liệu(3,5), kỹ thuật sắc ký lỏng riêng biệt cho từng thời điểm. Tiến hành sắc<br /> hiệu năng cao pha đảo với đầu dò DAD đã ký các dịch chiết. Chọn thời gian chiết cho<br /> được lựa chọn với điều kiện sắc ký ban đầu hàm lượng GP chiết được cao nhất.<br /> như sau: cột pha đảo C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) Thẩm định quy trình định lượng GP trong<br /> và tiền cột tương ứng, thể tích tiêm 20 µl, bước cao khô Dành dành<br /> sóng phát hiện là bước sóng hấp thụ cực đại<br /> Quy trình định lượng geniposid trong cao<br /> của geniposid, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, pha<br /> động: acetonitril – nước. Tiến hành khảo sát Dành dành được thẩm định theo hướng dẫn<br /> pha động và cột sắc ký. Qua các khảo sát thực của ICH(2) về tính phù hợp hệ thống, tính chọn<br /> nghiệm, chọn được điều kiện sắc ký thích hợp lọc, tính tuyến tính và miền giá trị, độ chính<br /> sao cho pic geniposid đạt độ tinh khiết (theo xác, độ đúng và độ bền.<br /> phổ UV-Vis), tách hoàn toàn khỏi các pic tạp<br /> Chuẩn bị mẫu<br /> (nếu có) và có hệ số bất đối nằm trong khoảng<br /> 0,8 – 1,5. Mẫu đối chiếu GP gốc: Hòa tan một lượng<br /> chất đối chiếu GP trong methanol 50% để<br /> Khảo sát quy trình xử lý mẫu<br /> được dung dịch có nồng độ khoảng 2600 ppm.<br /> Khảo sát dung môi chiết GP<br /> Mẫu đối chiếu GP: Pha loãng mẫu đối chiếu GP<br /> Chiết cùng một lượng cao với các dung môi<br /> gốc với methanol 50% để thu được mẫu đối<br /> khác nhau như methanol, methanol 70%, 50%,<br /> chiếu GP có nồng độ khoảng 77,5 ppm. Mẫu<br /> 30% (tỷ lệ cao và dung môi chiết cố định) bằng<br /> thử: Được chuẩn bị dựa vào các điều kiện khảo<br /> siêu âm trong 10 phút, chuẩn bị 3 mẫu thử<br /> sát quy trình xử lý mẫu. Mẫu trắng: dung môi<br /> riêng biệt cho từng dung môi. Tiến hành sắc ký<br /> chiết và pha động.<br /> các dịch chiết. Chọn dung môi chiết GP theo các<br /> KẾTQUẢ<br /> tiêu chí sau: diện tích pic và chiều cao pic lớn<br /> nhất, hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5; Khảo sát điều kiện HPLC định lượng<br /> geniposid trong cao khô Dành dành<br /> độ phân giải lớn hơn 1,5; pic GP tinh khiết (theo<br /> phổ UV-Vis) và nồng độ methanol cao. Tiến hành khảo sát pha động acetonitril và<br /> Khảo sát tỷ lệ cao và dung môi chiết GP nước với các tỷ lệ khác nhau. Hình 1 minh họa<br /> <br /> Khảo sát tỷ lệ cao và dung môi chiết đã sắc ký đồ mẫu đối chiếu, mẫu thử và phổ UV<br /> được lựa chọn theo các tỷ lệ 1:1, 1:2 và 1:4. tại thời gian lưu của GP với tỷ lệ pha động<br /> Chuẩn bị 3 mẫu thử riêng biệt cho từng tỷ acetonitril – nước (15:85).<br /> <br /> <br /> 134 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu, mẫu thử và phổ UV tại thời gian lưu của GP.<br /> Nhận xét: Phổ UV tại thời gian lưu GP của các pic tạp khác. Như vậy, pha động ACN –<br /> mẫu đối chiếu có một cực đại hấp thụ tại 240 H2O (15:85) được lựa chọn.<br /> nm nên được lựa chọn để định lượng GP. Pic Hình 2 và Bảng 1 minh họa kết quả khảo<br /> GP đạt độ tinh khiết (peak purity match = sát cột sắc ký pha đảo C18 từ hai nguồn cung<br /> 1000), có hệ số bất đối là 1,1 và tách hoàn toàn cấp khác nhau.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2: Sắc ký đồ mẫu thử khảo sát cột sắc ký<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 135<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> <br /> Bảng 1: Thông số sắc ký của GP tương ứng với cột sắc ký khảo sát (n=3)<br /> tR S H Độ tinh<br /> Cột As Rs1 Rs2 Nbk<br /> (Phút) (mAU*phút) (mAU) khiết<br /> Zorbax XDB C18 7,047 75,825 377,258 1,4 3,4 4,9 8765 1000<br /> Gemini NX C18 7,389 75,653 442,885 1,1 3,4 4,7 12538 1000<br /> Rs1: độ phân giải giữa GP và pic liền trước. Rs2: độ phân giải giửa GP và pic liền sau.<br /> Nhận xét: Pic GP đạt độ tinh khiết, có thời Khảo sát quy trình xử lý mẫu<br /> gian lưu (tR), diện tích pic (S) và độ phân giải Khảo sát dung môi chiết GP<br /> không khác nhau nhiều giữa hai cột. Với cột<br /> Hình 3 và Bảng 2 minh họa kết quả khảo<br /> Gemini NX C18, hệ số bất đối (As) pic GP là<br /> sát dung môi chiết GP.<br /> 1,1; số đĩa lý thuyết biểu kiến (Nbk) lớn hơn,<br /> Dung môi chiết Hàm lượng GP (mg/g)<br /> chiều cao pic (H) GP gấp 1,2 lần so với cột Methanol 116,84<br /> Zorbax XDB C18. Như vậy, cột Gemini NX Methanol 70% 128,56<br /> C18 được lựa chọn. Methanol 50% 142,24<br /> Methanol 30% 142,19<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3: Hàm lượng GP chiết được với các dung môi chiết khác nhau<br /> Bảng 2: Thông số sắc ký của GP tương ứng với dung môi chiết khảo sát (n=3)<br /> tR S H<br /> Dung môi As Rs1 Rs2 Nbk Độ tinh khiết<br /> (phút) (mAU*phút) (mAU)<br /> Methanol 7,328 31,528 157,172 0,94 4,0 3,5 8878 1000<br /> Methanol 70% 7,343 34,688 201,762 1,05 4,5 4,6 12194 1000<br /> Methanol 50% 7,354 38,329 227,751 1,06 4,4 4,8 12715 1000<br /> Methanol 30% 7,355 38,162 227,243 1,07 4,4 4,8 12808 1000<br /> Nhận xét: Cả 4 dung môi methanol, Khảo sát tỷ lệ cao và dung môi chiết GP<br /> methanol 70%, 50%, 30% đều chiết được GP, Hình 4 và Bảng 3 minh họa kết quả khảo<br /> tuy nhiên diện tích và chiều cao pic GP chiết<br /> sát tỷ lệ cao và dung môi chiết GP.<br /> được tăng dần theo thứ tự methanol <<br /> Tỷ lệ cao và dung môi Hàm lượng GP<br /> methanol 70% < methanol 50 %  methanol (mg/ml) (mg/g)<br /> 30%; Pic GP đều tinh khiết, đạt hệ số bất đối 1:1 142,27<br /> và tách hoàn toàn các pic tạp. Như vậy, 1:2 142,24<br /> methanol 50% được chọn làm dung môi chiết 1:4 142,36<br /> GP trong cao Dành dành.<br /> <br /> <br /> <br /> 136 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4: Hàm lượng GP chiết được với tỷ lệ cao và dung môi chiết khác nhau<br /> Bảng 3: Thông số sắc ký của GP tương ứng với tỷ lệ cao và dung môi chiết khác nhau (n=3)<br /> Tỷ̉ ̣ lệ cao và dung môi tR S H<br /> As Rs1 Rs2 Nbk Độ tinh khiết<br /> chiết (mg/ml) (Phút) (mAU*phút) (mAU)<br /> 1:1 7,344 76,931 448,304 1,06 4,6 4,7 12781 1000<br /> 1:2 7,354 38,329 227,751 1,06 4,4 4,8 12715 1000<br /> 1:4 7,343 19,129 114,887 1,06 4,6 5,2 12915 1000<br /> Nhận xét: Các thông số sắc ký của GP đều thích hợp cho quá trình định lượng trên nền<br /> đạt và hàm lượng GP chiết được với các tỷ lệ cao dược liệu. Như vậy, tỷ lệ cao và dung môi<br /> cao và dung môi chiết khảo sát đều tương chiết 1:2 được lựa chọn.<br /> đương nhau, khi tiến hành sắc ký dịch chiết Khảo sát thời gian chiết siêu âm<br /> lần 2 không phát hiện GP, chứng tỏ GP đã<br /> Hình 5 và Bảng 4 minh họa kết quả khảo<br /> được chiết kiệt từ cao khô Dành dành. Với tỷ<br /> sát thời gian chiết GP trong cao Dành dành.<br /> lệ cao và dung môi chiết 1:2, chiều cao pic GP<br /> Thời gian chiết siêu âm Hàm lượng GP (mg/g)<br /> khoảng 227 mAU là cao nhất khi qui về tỷ lệ<br /> 3 phút 142,24<br /> cao và dung môi chiết 1:1. Ngoài ra, tín hiệu 5 phút 142,15<br /> chiều cao khoảng 0,23 AU cũng là tín hiệu 10 phút 142,24<br /> nằm trong khoảng tuyến tính theo định luật<br /> Lambert-Beer khi sử dụng đầu dò DAD và<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 5: Hàm lượng GP chiết được với thời gian chiết khác nhau<br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 137<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> <br /> Bảng 4: Thông số sắc ký của GP tương ứng với thời gian chiết khác nhau (n=3)<br /> *<br /> Thời gian chiết tR S H<br /> As Rs1 Rs2 Nbk Độ tinh khiết<br /> siêu âm (Phút) (mAU*phút) (mAU)<br /> 3 phút 7,344 38,330 228,556 1,06 4,6 4,7 12781 1000<br /> 5 phút 7,341 38,407 228,172 1,05 4,7 4,8 12690 1000<br /> 10 phút 7,354 38,329 227,751 1,06 4,4 4,8 12715 1000<br /> <br /> Nhận xét: Hàm lượng GP chiết được với sắc ký Gemini NX C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm),<br /> thời gian chiết khảo sát đều tương đương đầu dò DAD với bước sóng phát hiện 240 nm,<br /> nhau. Như vậy, thời gian chiết siêu âm 3 phút thể tích tiêm 20 µl, pha động ACN – H2O<br /> được lựa chọn. (15:85, tt/tt), tốc độ dòng 1 ml/phút, thời gian<br /> <br /> Tóm lại, geniposid trong cao khô Dành sắc ký 11 phút.<br /> dành được chiết với tỷ lệ cao và methanol 50% Thẩm định quy trình<br /> là 1:2, chiết 1 lần bằng phương pháp siêu âm Tính phù hợp hệ thống<br /> trong 3 phút. Điều kiện sắc ký thích hợp để Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống<br /> định lượng GP trong cao khô Dành dành là cột được trình bày trong Bảng 5.<br /> Bảng 5: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu đối chiếu GP và mẫu thử (n=6)<br /> Giá trị thống tR S H<br /> Mẫu As Rs1 Rs2 Nbk<br /> kê (Phút) (mAU*phút) (mAU)<br /> TB 7,373 37,028 218,613 1,1 12791<br /> Đối chiếu<br /> RSD 0,10% 0,14% 0,30%<br /> TB 7,373 36,686 216,835 1,1 4,5 7,2 12712<br /> Thử<br /> RSD 0,13% 0,09% 0,39% 0<br /> <br /> Nhận xét: RSD của thời gian lưu, diện của pic GP trong mẫu đối chiếu. Sắc ký đồ<br /> tích và chiều cao pic GP của mẫu đối chiếu mẫu thử xuất hiện pic có thời gian lưu<br /> và mẫu thử đều nhỏ hơn 2,0%; Độ phân giải tương đương với pic GP trong sắc ký đồ<br /> pic GP trong mẫu thử lớn hơn 1,5 và hệ số bất mẫu đối chiếu. Trên sắc ký đồ mẫu thử,<br /> đối pic GP nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Như pic GP tách hoàn toàn các pic tạp. Khi<br /> vậy, quy trình định lượng GP trong cao khô thêm chất đối chiếu GP vào mẫu thử thì<br /> Dành dành đạt tính phù hợp hệ thống. diện tích và chiều cao pic GP tăng. Phổ<br /> Tính chọn lọc UV tại thời gian lưu GP của mẫu thử và<br /> <br /> Hình 6 minh họa kết quả khảo sát tính mẫu đối chiếu giống nhau và có cùng cực<br /> <br /> chọn lọc của quy trình định lượng GP đại hấp thụ tại 240 nm. Pic GP trong sắc<br /> <br /> trong cao khô Dành dành. Kết quả khảo ký đồ mẫu đối chiếu và mẫu thử đều tinh<br /> <br /> sát tính chọn lọc cho thấy sắc ký đồ mẫu khiết (theo phổ UV). Như vậy, quy trình<br /> <br /> trắng không xuất hiện pic trong khoảng định lượng GP trong cao khô Dành dành<br /> <br /> thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu đạt tính chọn lọc.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 138 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 6: Kết quả khảo sát tính chọn lọc của phương pháp định lượng GP. (a)mẫu trắng, (b) mẫu đối chiếu,<br /> (c) mẫu thử, (d) mẫu thử thêm chất đối chiếu, (e) phổ UV tại thời gian lưu GP của mẫu đối chiếu, (f) phổ<br /> UV tại thời gian lưu GP của mẫu thử, (g) sắc ký đồ 3 chiều mẫu đối chiếu, (h) sắc ký đồ 3 chiều mẫu thử<br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 139<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> <br /> Tính tuyến tính Nhận xét: Hệ số b = 0,0037 có p = 0,94 ><br /> Kết quả khảo sát mối tương quan giữa 0,05 nên không có ý nghĩa. Hệ số tương<br /> diện tích pic và nồng độ GP được trình bày quan bình phương r2 = 1,0000  có sự tương<br /> trong Bảng 6. quan tuyến tính giữa nồng độ GP và diện<br /> Bảng 6: Kết quả khảo sát tính tuyến tính GP tích pic.<br /> Nồng độ GP Diện tích pic<br /> (ppm) - X (mAU*phút) - Y Vậy phương trình hồi quy xác định nồng<br /> 19,4 9,222 y = 0,4761x + độ GP theo diện tích pic là ŷ = 0,4761x.<br /> 38,8 18,393 0,0037<br /> 77,5 36,973<br /> 2<br /> R = 1,0000 Độ chính xác<br /> 116,3 55,384 Kết quả thẩm định độ lặp lại và độ chính<br /> 155,0 73,871<br /> xác trung gian của quy trình định lượng GP<br /> 193,8 92,198<br /> trong cao Dành dành được trình bày trong<br /> Bảng 7.<br /> Bảng 7: Kết quả thẩm định độ lặp lại và độ chính xác trung gian của quy trình định lượng GP trong cao<br /> khô Dành dành (n=9)<br /> Người phân tích 1 Người phân tích 2:<br /> Ngày phân tích: 21/05/2018 Ngày phân tích: 22/05/2018<br /> n Hệ thống HPLC: Ultimate 3000 Hệ thống HPLC: Ultimate 3000<br /> Khối lượng cao Diện tích pic Hàm lượng GP Khối lượng cao Diện tích pic Hàm lượng GP<br /> (mg) (mAU*phút) (mg/g) (mg) (mAU*phút) (mg/g)<br /> 1 19,8 28,386 150,0 20,3 28,748 151,3<br /> 2 19,9 28,353 149,1 20,4 28,828 151,0<br /> 3 19,7 28,294 150,3 20,3 28,821 151,7<br /> 4 24,6 35,278 150,1 25,4 35,867 150,9<br /> 5 24,6 35,248 150,0 25,5 35,908 150,5<br /> 6 24,5 35,261 150,6 25,2 35,741 151,6<br /> 7 29,9 43,253 151,4 31,2 43,802 150,0<br /> 8 29,9 43,249 151,4 31,5 44,567 151,2<br /> 9 29,8 43,214 151,8 31,2 44,141 151,2<br /> Trung bình: 150,5 (mg/g) Trung bình: 151,1 (mg/g)<br /> RSD: 0,57% RSD: 0,37%<br /> Kết quả phân tích của 02 người phân tích<br /> - Trung bình: 150,8 (mg/g)<br /> - RSD: 0,49%<br /> Độ sai khác kết quả định lượng trung bình<br /> - Giữa hai người phân tích: 0,26%<br /> - Giữa người phân tích với kết quả trung bình của cả hai người phân tích<br /> + Người phân tích 1: -0,18%<br /> + Người phân tích 2: +0,08%<br /> <br /> Nhận xét: RSD của hàm lượng GP trong Độ đúng<br /> cao khô Dành dành của 9 mẫu thử của từng Kết quả thẩm định độ đúng của quy<br /> người phân tích đều nhỏ hơn 2,0%; Độ sai lệch trình định lượng GP trong cao Dành dành<br /> hàm lượng GP giữa 2 người phân tích đều nhỏ được trình bày Bảng 8.<br /> hơn 2,0%. Như vậy, quy trình định lượng GP<br /> trong cao khô Dành dành đạt độ chính xác.<br /> <br /> <br /> <br /> 140 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Bảng 8: Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình định lượng GP trong cao khô Dành dành (n=9)<br /> Khối lượng Lượng chất đối chiếu Diện tích pic Lượng chất đối chiếu Tỷ lệ<br /> Mẫu n<br /> cao (mg) thêm vào (mg) (mAU*phút) tìm lại (mg) thu hồi (%)<br /> 1 25,0 3,10 65,486 3,11 100,47<br /> 80% 2 25,1 3,10 65,422 3,09 99,77<br /> 3 25,0 3,10 65,506 3,12 100,54<br /> TB 100,26<br /> RSD 0,43%<br /> 1 25,1 3,76 72,259 3,81 101,35<br /> 100% 2 25,0 3,76 72,305 3,83 101,88<br /> 3 25,3 3,76 72,271 3,78 100,58<br /> TB 101,27<br /> RSD 0,64%<br /> 1 25,1 4,52 79,563 4,58 101,28<br /> 120% 2 25,0 4,52 79,464 4,58 101,38<br /> 3 24,9 4,52 79,469 4,60 101,73<br /> TB 101,46<br /> RSD 0,23%<br /> Nhận xét: Tại mỗi mức nồng độ, tỷ lệ thu độ đúng, miền giá trị của quy trình định<br /> hồi đều nằm trong khoảng 98 – 102% và lượng từ 61 – 92 ppm.<br /> RSD của GP tại mỗi mức nồng độ đều nhỏ Độ bền<br /> hơn 2,0%. Như vậy, quy trình định lượng<br /> Kết quả thẩm định độ bền được trình bày<br /> GP trong cao khô Dành dành đạt độ đúng.<br /> trong Hình 7 và Bảng 9.<br /> Dựa theo kết quả thẩm định độ chính xác và<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 7: Sắc ký đồ mẫu thử cao Dành dành trong thẩm định độ bền<br /> Bảng 9: Thông số sắc ký của GP trong thẩm định độ bền (n=3)<br /> Pha động ACN – H2O Giá trị thống tR S H<br /> (tt/tt) As Rs1 Rs2 Nbk<br /> kê (Phút) (mAU*phút) (mAU)<br /> TB 14,496 34,962 100,430 1,1 5,3 5,5 11621<br /> 11:89<br /> RSD 0,11% 0,08% 0,63%<br /> TB 4,722 35,462 350,982 1,1 1,5 4,4 14345<br /> 19:81<br /> RSD 0,21% 0,12% 0,47%<br /> Nhận xét: Khi thay đổi tỷ lệ ACN ± 4% đạt tính phù hợp hệ thống, có tính chọn lọc,<br /> so với điều kiện pha động ban đầu thì các khoảng tuyến tính rộng, đạt độ chính xác và độ<br /> thông số sắc ký vẫn đáp ứng yêu cầu về tính đúng theo Hướng dẫn của ICH.<br /> phù hợp hệ thống. BÀNLUẬN<br /> Như vậy, quy trình định lượng GP trong cao Phổ UV tại thời gian lưu của GP trong<br /> khô Dành dành bằng phương pháp HPLC-DAD khoảng bước sóng 200 – 400 nm có 1 cực đại<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 141<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> hấp thụ tại 240 nm, nên được chọn làm bước phương pháp HPLC đã thấy sự khác biệt về<br /> sóng để định lượng GP, bước sóng này tương hàm lượng GP chiết được của các dung môi.<br /> tự với bước sóng được sử dụng để định lượng KẾTLUẬN<br /> GP trong dịch chiết quả Dành dành(1,3,5). Kết<br /> quả khảo sát cột sắc ký cho thấy cột Gemini Quy trình định lượng geniposid trong cao<br /> NX C18 thích hợp hơn cho quá trình định khô Dành dành bằng phương pháp HPLC với<br /> lượng GP trong cao khô Dành dành so với cột đầu dò DAD đã được xây dựng và thẩm định,<br /> Zorbax Eclipse XDB C18 (chỉ ổn định trong sử dụng chương trình rửa giải đẳng dòng và<br /> khoảng pH 2 – 9). Điều này có thể được giải<br /> pha động đơn giản (acetonitril và nước).<br /> thích là do cột Gemini được sản xuất theo<br /> Quy trình đã được chứng minh đạt tính<br /> công nghệ TWIN - NX (Two-In-One): trong<br /> giai đoạn cuối cùng của quá trình sản xuất hạt chọn lọc, tính phù hợp hệ thống, tính tuyến<br /> silica, một lớp silica hữu cơ đặc biệt được tính (ŷ = 0,4761x, R2 = 1,0000; 19,4 – 193,8 ppm)<br /> thêm vào để tạo ra một loại hạt hoàn toàn mới và miền giá trị (61 – 92 ppm), độ lặp lại<br /> với cấu trúc silica bên trong không bị biến đổi (RSD = 0,57%), độ chính xác trung gian<br /> nên vẫn duy trì được độ bền cơ học để cho (RSD = 0,49 %), độ đúng với tỷ lệ hồi phục<br /> hiệu năng tốt, trong khi lớp silica hữu cơ bên<br /> trong khoảng 100,27 – 101,46% và độ bền với<br /> ngoài sẽ bảo vệ các phân tử silica khỏi các tác<br /> sự thay đổi cho phép thành phần acetonitril<br /> nhân hóa học. Những liên kết chéo silosan<br /> được thay thế bằng liên kết với gốc ethylen trong pha động là ± 4%. Quy trình này có thể<br /> nên giúp hạt silica bền vững hơn trong môi được áp dụng để định lượng geniposid<br /> trường pH cao. Thêm vào đó, việc liên kết trong cao khô Dành dành, góp phần vào<br /> giữa nhóm trimethylsilosan và nhóm silanol công tác kiểm tra chất lượng từ khâu<br /> tự do dẫn đến nhóm silanol không thể tương nguyên liệu ban đầu.<br /> tác với chất phân tích nên cải thiện tình trạng<br /> pic bị kéo đuôi. TÀILIỆUTHAMKHẢO<br /> 1. Bộ Y tế (2017). Dược điển Việt Nam V, tr. 1132-1133. Nhà<br /> Cao khô Dành dành được chiết bằng dung xuất bản Y học Hà Nội, Hà Nội.<br /> môi nước, nên dung môi methanol với các 2. ICH Harmonised tripartite guideline (2005). Validation of<br /> analytical procedures: text and methodology, pp. 1 – 13.<br /> nồng độ khác nhau (100%, 70%, 50%, 30%) 3. Pharmacopedia of The people’s Republic of China (2015),<br /> được sử dụng làm dung môi chiết xuất GP để pp. 182-183, 207-208.<br /> giảm tạp phân cực, nồng độ methanol càng 4. Viện Dược liệu (2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở<br /> Việt Nam, tập 1, tr. 596-600, 800-807. Nhà xuất bản Khoa<br /> cao, tạp phân cực trong dịch chiết sẽ càng học và Kỹ thuật, Hà Nội.<br /> giảm. Các kết quả khảo sát ban đầu trong việc 5. Wang XS, Wu YF, Dai SL, Chen R, Shao Y (2012).<br /> Ultrasound-assisted extraction of geniposide from Gardenia<br /> lựa chọn dung môi chiết bằng phương pháp<br /> jasminoides. Ultrasonics Sonochemistry, 19: pp. 1155–1159.<br /> sắc ký lớp mỏng cho thấy các dịch chiết có<br /> cường độ màu của vết GP, số lượng tạp và<br /> Ngày nhận bài báo: 18/10/2018<br /> cường độ màu của tạp không khác nhau. Tuy<br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018<br /> nhiên, khi phân tích các dịch chiết bằng<br /> Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 142 Chuyên Đề Dược<br />