Báo cáo: Hoàn thiện quy trình nhân giống nhanh chóng cây trồng năng suất cao bằng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật cho một số dòng keo lai, bạch đàn lai và keo lá tràm

Chia sẻ: Nguyen Lan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:17

Thêm vào BST

Báo xấu

192
lượt xem 42
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nuôi cấy mô là phương pháp khá phổ biến để nhân nhanh các loài cây trồng chất lượng cao. Trong lâm nghiệp phương pháp này đã được áp dụng tương đối sớm ở một số nước tiên tiến như Pháp, Đức, Braxin....để nhân nhanh một số giống cây trồng rừng có năng suất cao.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo: Hoàn thiện quy trình nhân giống nhanh chóng cây trồng năng suất cao bằng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật cho một số dòng keo lai, bạch đàn lai và keo lá tràm

ViÖnkhoa häc l©m nghiÖp viÖt nam Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng ------------------------------ B¸o c¸o kÕt qu¶ thùc hiÖn ®Ò tµi nh¸nh Tªn ®Ò tµi: Hoµn thiÖn quy tr×nh nh©n nhanh gièng c©y trång rõng n¨ng suÊt cao b»ng c«ng nghÖ nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt cho mét sè dßng Keo lai, b¹ch ®µn lai vµ keo l¸ trµm. (Thuéc ®Ò tµi KC.04.08) Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh: th.s. ®oµn thÞ mai hµ néi, n¨m 2004
I. ®Æt vÊn ®Ò. Nu«i cÊy m« lµ ph−¬ng ph¸p kh¸ phæ biÕn ®Ó nh©n nhanh c¸c loµi c©y trång chÊt l−îng cao. Trong l©m nghiÖp ph−¬ng ph¸p nµy ®· ®−îc ¸p dông t−¬ng ®èi sím ë mét sè n−íc tiªn tiÕn nh− Ph¸p, §øc, Braxin, Trung Quèc... ®Ó nh©n nhanh mét sè gièng c©y trång rõng cã n¨ng suÊt cao. ë ViÖt Nam c«ng nghÖ nµy ®· ®−îc du nhËp vµo cïng víi mét sè dßng B¹ch ®µn tõ Trung Quèc vµo n¨m 1992 cho mét sè ®¬n vÞ nh»m nh©n nhanh c¸c gièng −u tréi phôc vô s¶n xuÊt. Ngoµi c¸c dßng Keo lai tù nhiªn ®· ®−îc c«ng nhËn lµ gièng quèc gia, gÇn ®©y Trung t©m nghiªn cøu Gièng c©y rõng thuéc ViÖn khoa häc l©m nghiÖp ViÖt Nam ®· chän t¹o ®−îc mét sè gièng c©y trång rõng cã n¨ng suÊt vµ chÊt l−îng cao h¬n h¼n c¸c gièng ®ang sö dông trong s¶n xuÊt. Trong ®ã cã mét sè tæ hîp b¹ch ®µn lai, mét sè dßng Keo l¸ trµm. Nh÷ng gièng nµy ®¸p øng ®−îc yªu cÇu cÊp b¸ch vÒ trång rõng vµ s¶n xuÊt nguyªn liÖu cho c«ng nghiÖp giÊy, v¸n nh©n t¹o. Tuy nhiªn, nh÷ng gièng nãi trªn ®Òu lµ nh÷ng dßng v« tÝnh kh«ng thÓ nh©n gièng tõ h¹t. Nh©n gièng b»ng gi©m hom mÆc dï cã hÖ sè nh©n lín, kü thuËt ®¬n gi¶n h¬n nh−ng nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« lµ ph−¬ng ph¸p nh©n gièng kh«ng nh÷ng cã kh¶ n¨ng nh©n nhanh víi sè l−îng lín, cã t¸c dông trÎ ho¸ cao mµ cßn ®¶m b¶o gi÷ ®−îc c¸c ®Æc ®iÓm cña gièng gèc. Song kÕt qu¶ nghiªn cøu nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« míi lÇn ®Çu ®−îc nghiªn cøu vµ ¸p dông thµnh c«ng cho c¸c ®èi t−îng trªn vµo n¨m 2001 thuéc ®Ò tµi KC 04.08 nh»m hoµn thiÖn quy tr×nh nh©n gièng c©y trång cã n¨ng suÊt cao. Nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« còng lµ ph−¬ng ph¸p tèt nhÊt ®Ó gi¶i quyÕt nhu cÇu c©y con phôc vô trång rõng s¶n xuÊt trªn quy m« lín víi ®é ®ång ®Òu cao, ®¸p øng yªu cÇu s¶n xuÊt c«ng nghiÖp. Gi¶i quyÕt ®−îc vÊn ®Ò nµy ®· gãp phÇn thiÕt thùc cho viÖc thùc hiÖn cã hiÖu qu¶ ch−¬ng tr×nh trång míi 5 triÖu ha rõng cña nhµ n−íc. II. Môc tiªu cña ®Ò tµi - Nh©n ®−îc mét sè gièng míi chän t¹o ë quy m« b¸n s¶n xuÊt: mét sè dßng Keo l¸ trµm, mét sè tæ hîp B¹ch ®µn lai nh©n t¹o. - TiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm bæ sung, hoµn thiÖn c¸c kh©u trong quy tr×nh nh©n giãng cho c¸c mét sè dßng Keo lai. - X©y dùng ®−îc b¶n h−íng dÉn kü thuËt nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« vµ chuyÓn giao kü thuËt cho mét sè ®¬n vÞ. III. néi dung nghiªn cøu. - X¸c ®Þnh tuæi chåi vµ thêi kú lÊy mÉu thÝch hîp. - X¸c ®Þnh m«i tr−êng t¹o chåi vµ ra rÔ tèi −u. - X¸c ®Þnh ph−¬ng ph¸p d−ìng c©y cã hiÖu qu¶ nhÊt ®Ó ®−a vµo s¶n xuÊt. - X©y dùng b¶n h−íng dÉn kü thuËt. IV. §èi t−îng nghiªn cøu. 1. Keo l¸ trµm. Keo l¸ trµm (Acacia auriculiformis) lµ loµi c©y mäc nhanh −a s¸ng, cã t¸c dông c¶i t¹o ®Êt, chÞu ®−îc ®Êt nghÌo dinh d−ìng, sèng trªn ®Êt thiÕu «xi, ®Êt thÞt nÆng vµ c¶ ®Êt c¸t pha. Gç cã vai trß quan träng trong c«ng nghiÖp s¶n xuÊt nguyªn liÖu giÊy, lµm cñi, ®èt than. Mäc tù nhiªn ë miÒn B¾c n−íc óc, T©n Ghinª, Indonesia, ®· ®−îc g©y trång cã hiÖu qu¶ ë §«ng Phi, Ên §é.
ë ViÖt Nam ®©y lµ lo¹i Keo ®−îc trång thµnh rõng ë c¸c vïng sinh th¸i kh¸c nhau nh− Qu¶ng Nam - §µ N½ng, Thõa Thiªn HuÕ, VÜnh Phóc. Cho ®Õn nay Trung t©m nghiªn cøu Gièng c©y rõng ®· chän ®−îc c¸c dßng c©y tréi cã gi¸ trÞ cho trång rõng: 81, 82, 83, 84, 85 vµ ®ang ®−îc g©y trång t¹i Tr¹m thùc nghiÖm gièng Ba V×. Ngoµi biÖn ph¸p nh©n gièng b»ng hom, ®Ó ®¶m b¶o tÝnh di truyÒn cña nã vµ t¹o nguån c©y gièng phong phó ®−a vµo s¶n xuÊt phôc vô cho nhu cÇu trång rõng, viÖc nh©n gièng Keo l¸ trµm b»ng ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy m« ph©n sinh lÇn ®Çu tiªn ®−îc nghiªn cøu vµ ¸p dông thµnh c«ng t¹i Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng. 2. Keo lai. Keo lai lµ gièng keo lai tù nhiªn gi÷a hai loµi Keo tai t−îng (Acacia mangium) vµ Keo l¸ trµm (Acacia auriculiformis), cã kh¶ n¨ng sinh tr−ëng nhanh, ph¸t triÓn tèt h¬n so víi c¸c dßng bè mÑ, cã t¸c dông c¶i t¹o ®Êt vµ cã vai trß quan träng trong c«ng nghiÖp s¶n xuÊt bét giÊy. Do yªu cÇu t¹o gièng ®Ó cung cÊp c¸c gièng gèc ®−îc c¶i thiÖn cho c¸c c¬ së s¶n xuÊt ngµy cµng cao nªn viÖc nh©n nhanh c¸c gièng nµy trªn quy m« b¸n c«ng nghiÖp lµ mét yªu cÇu thiÕt yÕu. Kü thuËt nh©n gièng nu«i cÊy m« c©y Keo lai ®· ®−îc tiÕn hµnh t¹i Trung t©m nghiªn cøu Gièng c©y rõng nh»m hoµn thiÖn ph−¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh c©y rõng vµ t¹o ra sè l−îng c©y lín trong thêi gian ng¾n phôc vô cho s¶n xuÊt vµ nghiªn cøu. 3. B¹ch ®µn lai. B¹ch ®µn lµ lo¹i c©y mäc nhanh, chu kú kinh doanh ng¾n, cã kh¶ n¨ng sinh tr−ëng trªn nhiÒu d¹ng lËp ®Þa kh¸c nhau, thÝch hîp cho rõng s¶n xuÊt nguyªn liÖu c«ng nghiÖp nh− giÊy, d¨m, gç trô má,... B¹ch ®µn ®· ®−îc trång réng r·i ë nhiÒu n−íc trªn thÕ giíi. NhiÒu gièng B¹ch ®µn ®−îc c¶i thiÖn cïng víi kü thuËt trång rõng th©m canh cho n¨ng suÊt rÊt cao. ë ViÖt Nam, B¹ch ®µn chiÕm vÞ trÝ quan träng trong c¬ cÊu c©y trång rõng. Tuy nhiªn, n¨ng suÊt vµ chÊt l−îng rõng trång B¹ch ®µn ë n−íc ta cßn thÊp vµ rÊt kh¸c nhau gi÷a c¸c gièng B¹ch ®µn ®−îc nhËp tõ n−íc ngoµi. GÇn ®©y, Trung t©m nghiªn cøu Gièng c©y rõng thuéc ViÖn khoa häc l©m nghiÖp ViÖt Nam ®· nghiªn cøu lai t¹o vµ chän läc ®−îc nhiÒu tæ hîp lai cã nhiÒu triÓn väng vÒ kh¶ n¨ng sinh tr−ëng. Mét sè tæ hîp lai trong loµi vµ kh¸c loµi cña c¸c loµi B¹ch ®µn Uro (Eucalyptus urophylla), B¹ch ®µn Camal (E.camaldulnessis) vµ B¹ch ®µn liÔu (E.exserta) cã thÓ cho n¨ng suÊt gÊp tõ 2 ®Õn 4 lÇn c¸c loµi bè mÑ ( Lª §×nh Kh¶ vµ NguyÔn ViÖt C−êng, 1998, 2000). ViÖc nh©n gièng b»ng ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy m« nh÷ng gièng lai míi ®−îc chän t¹o cã ý nghÜa rÊt lín ®Ó sím ®−a nh÷ng gièng nµy vµo s¶n xuÊt trªn diÖn réng vµ b¶o ®¶m gi÷ ®−îc c¸c ®Æc ®iÓm −u viÖt cña chóng. V. VËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu. 1. VËt liÖu. 1.1. Keo l¸ trµm. - C¸c ®o¹n chåi cña c©y con 6 th¸ng ®Õn 1 n¨m tuæi cña c¸c dßng 81, 82, 83 t¹i v−ên −¬m Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng. 1.2. Keo lai. - C¸c ®o¹n chåi gèc c©y Keo hom 6 th¸ng tuæi cña c¸c dßng BV10, BV16, BV 32 t¹i v−ên −¬m. - Tõ c¸c c©y tréi ®· ®−îc tuyÓn chän t¹i rõng, c¾t cµnh ®Ó t¹o chåi. - Tõ c¸c c©y tréi ®· xö lý ®Ó t¹o chåi gèc. 1.3. B¹ch ®µn lai
- C¸c chåi kháe m¹nh dµi tõ 15-20cm cã m¾t ngñ ®−îc lÊy tõ chåi gèc c©y 2 tuæi. C¸c c©y lai nµy thuéc c¸c tæ hîp lai trong loµi vµ kh¸c loµi cña B¹ch ®µn Uro (E.urophylla), B¹ch ®µn tr¾ng (E. camaldulensis) vµ B¹ch ®µn liÔu (E.exerta) : U29C3, U29E1, U29U24. 2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu. 2.1. Ph−¬ng ph¸p khö trïng. MÉu vËt ®−îc c¾t bá ngän, vµ ®−îc khö trïng theo c¸c b−íc sau: - Röa d−íi vßi n−íc s¹ch nh»m lo¹i bá c¸c t¸c nh©n g©y bÈn, sau ®ã ®−îc röa b»ng c¸c chÊt tÈy vµ tr¸ng s¹ch b»ng n−íc cÊt. - Khö trïng mÉu vËt b»ng c¸c chÊt khö trïng bÒ mÆt Canxihypoclorit vµ HgCl2 cã thªm 2-3 giät Tween 20 trong c¸c thêi gian kh¸c nhau. - Cuèi cïng c¸c mÉu vËt ®−îc röa s¹ch b»ng n−íc cÊt v« trïng vµ cÊy vµo m«i tr−êng t¹o mÉu. 2.2. M«i tr−êng nu«i cÊy. - M«i tr−êng t¹o mÉu: m«i tr−êng Murashige & Skoog c¬ b¶n (MS) - M«i tr−êng nh©n chåi : m«i tr−êng Murashige & Skoog c¶i tiÕn (MS*) cã bæ sung mét sè axit amin, vitamin, chÊt phô gia : than ho¹t tÝnh (CC), n−íc dõa (CW)..., c¸c Cytokynin ngo¹i sinh nh− Benzylamino purine (BAP) vµ Kinetin (Kn)... - M«i tr−êng t¹o rÔ invitro : m«i tr−êng Murashige & Skoog c¶i tiÕn (MS bæ sung lµ axit α-Naphtyl acetic (NAA) vµ axit β- indol butyric (IBA) ë c¸c nång ®é kh¸c nhau. - M«i tr−êng ®−îc ®iÒu chØnh ë ®é pH 5.8 víi Keo lai vµ Keo l¸ trµm, 5.8-6.0 ®èi víi m«i tr−êng nu«i cÊy B¹ch ®µn. - Thêi gian hÊp khö trïng 20 phót (1.2 kg/ cm3 t¹i 1210C). 2. 3. §iÒu kiÖn nu«i cÊy. ChÕ ®é ¸nh s¸ng 3000lux chiÕu s¸ng 10 giê 1 ngµy, nhiÖt ®é 25 ± 20C ®èi víi Keo lai vµ Keo l¸ trµm. ChÕ ®é ¸nh s¸ng 2000lux chiÕu s¸ng 8 giê 1 ngµy, nhiÖt ®é 25 ± 20C ®èi víi B¹ch ®µn lai. C¸c thÝ nghiÖm ®Òu ®−îc bè trÝ nhiÒu lÇn lÆp vµ xö lý kÕt qu¶ theo ph−¬ng ph¸p thèng kª th«ng th−êng. 2.4. Bè trÝ thÝ nghiÖm vµ xö lý sè liÖu. ThÝ nghiÖm ®−îc bè trÝ víi 3 lÇn lÆp vµ sè mÉu ®ñ lín theo quy luËt thèng kª, sè liÖu ®−îc xö lý trªn m¸y tÝnh b»ng ch−¬ng tr×nh Excel 6.0. - Sè trung b×nh mÉu tÝnh theo c«ng thøc. n 1 ∑ x= xi n i=1 - Sai tiªu chuÈn (sai dÞ) mÉu ®−îc tÝnh theo c«ng thøc. n 1 ∑ Sd = ± ⋅ ( Xi − X ) 2 n −1 i =1
- HÖ sè biÕn ®éng. Sd V% = ⋅ 100 X Vi. KÕt qu¶ nghiªn cøu. A. B¹ch §µn lai. 1. Khö trïng. a. ¶nh h−ëng cña chÊt khö trïng. KÕt qu¶ khö trïng phô thuéc vµo chÊt khö, thêi gian xö lÝ vµ kh¶ n¨ng x©m nhËp cña ho¸ chÊt vµo c¸c kÏ låi lâm trªn bÒ mÆt cña vËt liÖu cÊy. Trong 2 lo¹i ho¸ chÊt cã ho¹t tÝnh diÖt nÊm cao ®−îc sö dông trong thÝ nghiÖm th× HgCl2 ë nång ®é 0.1 % cho kÕt qu¶ tèt nhÊt: tØ lÖ nhiÔm thÊp vµ tØ lÖ nÈy chåi cao h¬n h¼n khi dïng Canxihypoclorit. B¶ng 1. KÕt qu¶ khö trïng mÉu b»ng c¸c ho¸ chÊt khö. Thêi ®iÓm Ho¸ chÊt khö Thêi gian Tû lÖ nhiÔm Tû lÖ nÈy chåi lÊy mÉu trïng khö trïng (%) (%) (phót) §o¹n1 §o¹n2 §o¹n1 §o¹n2 8/1999 HgCl2 2 77.00 60.00 22.20 30.00 4 55.50 54.00 22.20 40.00 6 50.50 24.00 33.30 38.00 8 35.50 20.00 33.30 60.00 10 15.00 10.00 22.20 30.00 8/1999 Canxi 2 90.90 100.0 18.18 0.00 hypoclorit 4 70.00 100.0 20.00 0.00 6 61.90 80.70 19.00 38.00 8 40.95 91.60 9.00 12.30 10 44.73 90.20 5.20 9.50 Tõ sè liÖu cña b¶ng1 cho thÊy khi xö lÝ mÉu b»ng HgCl2 vµ Canxihypoclorit ë thêi gian nh− nhau trong cïng mét thêi ®iÓm lÊy mÉu tØ lÖ nhiÔm cña mÉu khi xö lÝ b»ng HgCl2 lµ thÊp h¬n. §ång thêi, tØ lÖ nÈy chåi còng cao h¬n ( thÊp nhÊt lµ 22.2% vµ cao nhÊt lµ 66%) so víi khi xö lÝ b»ng Canxihypoclorit (tØ lÖ nÈy chåi thÊp nhÊt lµ 0% vµ cao nhÊt lµ 38% ). Thêi gian khö trïng trong vßng 6 ®Õn 8 phót cho kÕt qu¶ cao nhÊt: tØ lÖ nhiÔm thÊp vµ tØ lÖ nÈy chåi kh¸ cao (33.3 - 66 %). Trong khi ®ã thêi gian khö trïng d−íi 6 phót cho hiÖu qu¶ thÊp (nhiÔm 100 %). Tõ 10 phót trë nªn tØ lÖ n¶y chåi gi¶m h¼n. b. ¶nh h−ëng cña mïa vô tíi kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi. §Ó x¸c ®Þnh ¶nh h−ëng cu¶ mïa vô tíi kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi, c¸c thÝ nghiÖm khö trïng ®−îc tiÕn hµnh trong 12 th¸ng. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm cho thÊy nh÷ng mÉu lÊy vµo mïa hÌ - thu cho tØ lÖ n¶y chåi cao ®¹t 22.2-56 %. Cã thÓ thêi gian nµy ®ang lµ mïa sinh tr−ëng m¹nh nªn qu¸ tr×nh n¶y chåi thuËn lîi h¬n. Nh÷ng mÉu lÊy ë cïng ®Þa ®iÓm vµo mïa ®«ng ®Õn mïa xu©n n¨m sau cho kÕt qu¶ kÐm h¬n râ rÖt: tØ lÖ n¶y chåi chØ ®¹t tõ 2 ®Õn 15 %. Lóc nµy lµ mïa kh«, c©y sinh tr−ëng chËm vµ hay xuÊt hiÖn bÖnh b¹c l¸ vµ mét sè nÊm bÖnh kh¸c.
B¶ng 2. ¶nh h−ëng cña mïa vô tíi kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi. Thêi ®iÓm lÊy mÉu Thêi gian khö trïng (phót) Tû lÖ nÈy chåi (%) §o¹n1 §o¹n2 6 10.00 10.00 Xu©n 8 10.00 10.00 HÌ 6 22.20 38.00 8 22.20 56.00 Thu 6 19.00 38.00 8 9.00 15.50 §«ng 6 5.00 10.00 8 2.00 9.00 KÕt qu¶ thÝ nghiÖm còng cho thÊy tû lÖ n¶y chåi vµ kh¶ n¨ng nh©n chåi cßn phô thuéc vµo lo¹i vËt liÖu gèc ban ®Çu. B¶ng 3. ¶nh h−ëng cña lo¹i vËt liÖu tíi kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi. Lo¹i vËt liÖu gèc Tû lÖ bËt chåi HÖ sè nh©n chåi ChÊt l−îng chåi Tû lÖ ra rÔ Chåi v−ît 21.15 15.25 Tèt 97.5 Chåi bªn 19.75 12.85 Trung b×nh 92.4 Nh− vËy ®Ó tèi −u ho¸ c«ng ®o¹n nh©n chåi viÖc chän lo¹i vËt liÖu còng cã vai trß hÕt søc quan träng. C¸c chåi ®−îc nh©n tõ chåi v−ît cña c©y mÑ vÒ c¬ b¶n kh«ng sai kh¸c so vãi c¸c chåi nh©n tõ chåi bªn (cµnh na) vÒ mÆt di truyÒn vµ kh¶ n¨ng bËt chåi ban ®Çu nh−ng h¬n h¼n vÒ chÊt l−îng chåi vµ kh¶ n¨ng nh©n chåi vµ ra rÔ trong c¸c c«ng ®o¹n tiÕp theo. Bªn c¹nh viÖc chän lùa lo¹i vËt liÖu cho qu¸ tr×nh khö trïng th× viÖc thay ®æi thµnh phÇn vµ nång ®é chÊt trong m«i tr−êng nu«i d−ìng còng cã t¸c ®éng kh«ng nhá ®Õn qu¸ tr×nh t¹o chåi. B¶ng 4. ¶nh h−ëng cña m«i tr−êng tíi kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi. M«i tr−êng Sè mÉu thÝ Sè chåi t¹o thµnh Thßi gian xuÊt ChiÒu cao chåi nghiÖm ban ®Çu sau khö trïng hiÖn chåi sau 10 ngµy MS 30 32 35-40 ngµy 1.5 cm 30 MS * 52.6 25-27 ngµy 2.1 cm KÕt qu¶ thÝ nghiÖm cho thÊy cïng sè mÉu khö trïng, cïng mét lo¹i vËt liÖu khi ®−îc cÊy vµo m«i tr−êng MS* sÏ cho sè chåi t¸i sinh lín h¬n (gÊp 1,5 lÇn), kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi nhanh, chiÒu dµi chåi t¸i sinh cao. §iÒu nµy cã ý nghÜa rÊt lín ®Õn kh¶ n¨ng nh©n nhanh c¸c gièng cã chÊt l−îng do rót ng¾n ®−îc thêi gian t¹o chåi còng nh− cung cÊp l−îng chåi lín cho qu¸ tr×nh nh©n chåi ban ®Çu. 2. Nh©n chåi. Sau khi h×nh thµnh vµ ®¹t chiÒu cao tõ 1.0 - 1.5 cm chåi ®−îc t¸ch ra vµ cÊy chuyÓn tiÕp vµo nh©n chåi lµ m«i tr−êng MS* cã bæ sung c¸c Cytokinin ngo¹i sinh nh− Benzyl amino purine (BAP) vµ Kinetin (Kn). Ph©n tÝch sè liÖu cho thÊy tØ lÖ nh©n chåi cßn phô thuéc nhiÒu vµo thµnh phÇn vµ nång ®é cña Cytokinin ®−îc bæ sung vµo m«i tr−êng. KÕt qña thÝ nghiÖm cho thÊy sù cã mÆt cña BAP kh¶ n¨ng sinh chåi cao nhÊt th−êng ®¹t tõ 10 ®Õn 20 chåi /côm mét sè mÉu cã thÓ ®¹t tíi 30 chåi/ côm. Khi phèi hîp c¶ BAP vµ Kn th× kÕt qu¶ kÐm h¬n chØ ®¹t 6 ®Õn 15 chåi / côm. NÕu dïng riªng Kn chØ ®¹t 2 ®Õn 5 chåi /côm.
B¶ng 5. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm nh©n chåi. M«i tr−êng MS* + Tæ hîp U29C3 Tæ hîp U29E1 Tæ hîp U29U24 ChÊt, nång ®é Sè chåi/ Sd Sè chåi/ côm Sd Sè chåi/ côm Sd (mg/l) côm BAP 0.1 6.20 2.29 5.25 2.29 8.25 3.25 BAP 0.5 16.62 2.70 15.35 3.70 14.63 1.56 BAP 1.0 11.49 0.40 12.53 1.40 12.33 2.33 BAP 1.5 8.34 1.56 9.23 1.23 8.33 1.35 Kn 0.5 2.41 0.88 2.3 0.97 2.36 1.03 Kn 1.0 2.68 0.28 3.56 1.10 4.57 1.23 Kn 1.5 2.94 0.11 2.43 0.65 2.82 0.96 Kn 2.0 2.69 0.24 1.89 1.25 2.29 0.33 BAP 0.5 + Kn 0.5 6.22 1.49 5.24 1.33 9.23 0.83 BAP 0.5 + Kn 1.0 12.26 0.94 6.98 0.83 6.33 0.93 BAP 0.5 + Kn 1.5 7.52 0.6 15.23 1.33 7.83 1.36 BAP 0.5 + Kn 2.0 6.71 0.25 7.89 0.33 5.36 1.33 §Ó x¸c ®Þnh ®iÒu kiÖn ¸nh s¸ng thÝch hîp nh»m tèi −u ho¸ kh¶ n¨ng t¹o sè l−îng vµ chÊt l−îng chåi tèt nhÊt cho B¹ch ®µn lai trong giai ®o¹n nh©n chåi c¸c thÝ nghiÖm vÒ ¶nh h−ëng cña chÕ ®é chiÕu s¸ng ®∙ lÇn ®Çu tiªn ®ù¬c thùc hiÖn. MÉu vËt sau khi cÊy ®−îc nu«i d−ìng trong c¸c chÕ ®é chiÕu s¸ng : - C§1: ChiÕu s¸ng hoµn toµn trong thêi gian nh©n chåi (8h/ngµy trong12 ngµy cña chu kú cÊy chuyÓn). - C§2: 4 ngµy kh«ng chiÕu s¸ng, chiÕu s¸ng 8h/ngµy trong 8 ngµy. - C§3: 6 ngµy kh«ng chiÕu s¸ng, chiÕu s¸ng 8h/ngµy trong 6 ngµy. - C§4: 8 ngµy kh«ng chiÕu s¸ng, chiÕu s¸ng 8h/ngµy trong 4 ngµy. - C§5: Che tèi hoµn toµn trong thêi gian nh©n chåi. B¶ng 6. ¶nh h−ëng cña chÕ ®é chiÕu s¸ng tíi kh¶ n¨ng nh©n chåi cña B¹ch ®µn lai. STT ChÕ ®é ChiÒu dµi chåi (cm) trung b×nh Sè chåi/ côm chåi sau 12 ngµy cÊy nh©n chåi. U29C3 U29E1 U29U24 U29C3 U29E1 U29U24 1. C§1 1.0 1.33 1.22 16.00 15.78 15.89 2. C§2 1.51 1.66 1.58 14.00 13.25 12.56 3. C§3 3.00 3.56 3.20 13.25 13.23 12.31 4. C§4 3.50 3.61 3.50 12.56 10.27 11.30 5. C§5 4.00 3.87 3.67 10.25 10.21 10.25 KÕt qu¶ thÝ nghiÖm cho thÊy c¸c chÕ ®é chiÕu s¸ng cã ¶nh h−ëng rÊt kh¸c nhau ®Õn sù sinh tr−ëng vÒ chiÒu cao cña c©y. §èi víi B¹ch ®µn lai ¶nh h−ëng cña chÕ ®é chiÐu s¸ng tíi kh¶ n¨ng ph¸t triÓn chåi lµ râ rÖt. ë chÕ ®é chiÕu s¸ng C§1 c©y ph¸t triÓn nhiÒu chåi hÖ sè nh©n chåi cao nhÊt nh−ng th©n chåi ng¾n, tû lÖ ra rÔ thÊp, rÔ kh«ng ®Òu.
Trong khi ®ã ë chÕ ®é chiÕu s¸ng C§5 sè l−îng chåi gi¶m, th©n chåi dµi vµ rÊt m¶nh do thiÕu ¸nh s¸ng, c¸c chåi nµy cã tû lÖ ra rÔ thÊp, c©y yÕu, søc sèng gi¶m do c©y kh«ng ®ñ ¸nh s¸ng cho qu¸ tr×nh quang hîp. ChÕ ®é chiÕu s¸ng C§3 cho kÕt qu¶ tèt nhÊt, ë chÕ ®é nµy c©y ph¸t triÓn ®Òu hÖ sè nh©n chåi cao, tû lÖ ra rÔ vµ søc sèng chåi t¨ng. Theo Emerson vµ Arnold (1984) giai ®o¹n tèi cña quang hîp dµi h¬n so víi giai ®o¹n s¸ng rÊt nhiÒu (kh¸c víi pha tèi), thêi gian kÐo dµi cña quang hîp chñ yÕu do pha tèi quyÕt ®Þnh, trong ®iÒu kiÖn thuËn lîi tèc ®é ph¶n øng quang hîp do c¸c ph¶n øng tèi chi phèi. Nh− vËy khi thay ®æi chÕ ®é chiÕu s¸ng (do c−êng ®é ¸nh s¸ng vµ nhiÖt ®é kh«ng thay ®æi) trong giai ®o¹n nh©n chåi ®· tèi −u ho¸ c¸c qu¸ tr×nh cña ph¶n øng quang hîp t¹o ra ®Çy ®ñ vµ c©n b»ng gi÷a c¸c s¶n phÈm cÇn thiÕt cho sù sinh tr−ëng vµ ph¸t triÓn cña chåi. §Æc biÖt khi ®iÒu tiÕt ®−îc chÕ ®é chiÕu s¸ng cßn gi¶m thêi gian cÊy chuyÓn gi÷a hai lÇn nh©n chåi tõ 20 ngµy/ lÇn cÊy chuyÓn gi¶m xuèng cßn 12 ngµy/ lÇn cÊy chuyÓn rót ng¾n ®−îc 35% thêi gian nh©n chåi vµ ra rÔ, ®iÒu nµy cã ý nghÜa rÊt lín trong s¶n xuÊt. Ph−¬ng ph¸p cÊy còng cã ¶nh h−ëng trùc tiÕp ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi cña B¹ch ®µn. B¶ng 7. ¶nh h−ëng cóa ph−¬ng ph¸p cÊy tíi kh¶ n¨ng nh©n chåi cña B¹ch ®µn lai. Ph−¬ng ph¸p cÊy ChiÒu dµi chåi (cm) trung b×nh Sè chåi/ côm chåi sau 12 ngµy cÊy nh©n chåi. U29C3 U29E1 U29U24 U29C3 U29E1 U29U24 CÊy th¼ng 1.20 1.18 1.54 12.57 12.25 11.23 CÊy n»m ngang 2.50 2.36 3.01 22.62 20.28 18.34 Nh− vËy qua kÕt qu¶ thÝ nghiÖm cho thÊy khi cÊy c¸c chåi theo ph−¬n g ph¸p n»m ngang tèt h¬n so víi ph−¬ng ph¸p cÊy c¸c chåi th¼ng. Do c¸c chåi ®−îc c¾t thµnh nhiÒu ®o¹n, diÖn tÝch tiÕp xóc, kh¶ n¨ng trao ®æi chÊt víi m«i tr−êng lín, kh¶ n¨ng hÊp thô chÊt dinh d−ìng vµ chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng theo c¬ chÕ thô ®éng cao do ®ã kÝch thÝch sù t¸i sinh vµ ph¸t triÓn chåi nhiÒu. HÖ sè nh©n chåi ®¹t 22.62 so víi 12.57 (gÊp tõ 1,5 ®Õn 2 lÇn) so víi khi cÊy th¼ng. Nh− vËy viÖc kÕt hîp gi÷a thay ®æi vÒ thµnh phÇn m«i tr−êng víi ph−¬ng ph¸p cÊy vµ chÕ ®é chiÕu s¸ng (chÕ dé nu«i d−ìng) sÏ lµm t¨ng kh¶ n¨ng t¹o chåi tèi −u vµ chÊt l−îng chåi còng ®¶m b¶o h¬n. 3. Qu¸ tr×nh ra rÔ trong lä. Khi chåi ®¹t chiÒu cao tõ 2,5 ®Õn 3 cm cã thÓ c¾t ®Ó chuyÓn sang m«i tr−êng h×nh thµnh rÔ. M«i tr−êng h×nh thµnh rÔ lµ m«i tr−êng MS* cã bæ sung NAA vµ IBA ë c¸c nång ®é kh¸c nhau. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm cho thÊy, nÕu cïng sö dông nång ®é nh− nhau th× viÖc bæ sung thªm IBA lu«n cho tØ lÖ cao h¬n so víi bæ sung NAA vµ m«i tr−êng cÊy. Víi c¸c c«ng thøc sö dông IBA ®¹t tØ lÖ ra rÔ ®¹t trªn 80%, trong khi dïng NAA tØ lÖ cao nhÊt chØ ®¹t 55%. Ngoµi thµnh phÇn m«i tr−êng th× nång ®é cña c¸c chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng bæ sung trong m«i tr−êng nu«i cÊy còng ¶nh h−ëng râ rÖt ®Õn kÕt qu¶ ra rÔ. Nång ®é qu¸ thÊp ch−a thÓ hiÖn t¸c dông, hay víi nång ®é qu¶ cao g©y k×m h·m ®Òu dÉn tíi kÕt qu¶
ra rÔ thÊp. Do ®ã, viÖc t×m ®−îc nång ®é tèi thÝch cã ý nghÜa rÊt lín tíi kÕt qu¶ thÝ nghiÖm. B¶ng 8. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm kÝch thÝch ra rÔ b¹ch ®µn lai. M«i tr−êng MS* + Tû lÖ ra rÔ cña tõng tæ hîp ChÊt, nång ®é U29C3 U29E1 U29U24 (mg/l) T.b×nh Sai dÞ T.b×nh Sai dÞ T. b×nh Sai dÞ IBA 0.5 81.56 5.63 82.15 5.89 82.56 6.79 1.0 82.35 4.56 88.35 7.56 84.25 5.56 1.5 97.25 3.29 95.33 4.32 92.23 4.33 2.0 92.56 6.75 88.26 6.53 83.25 8.55 NAA 0.5 41.56 5.67 42.15 5.89 42.26 2.56 1.0 52.33 4.25 48.35 7.56 44.67 3.26 1.5 47.25 3.35 55.32 4.32 52.83 7.78 2.0 42.56 6.68 48.26 6.53 43.65 5.49 IBA+NAA1.5 + 0.5 61.55 5.52 62.20 3.65 62.31 3.25 1.5 + 1.0 72.31 4.45 68.00 4.59 74.28 6.33 1.5 + 1.5 67.29 3.32 75.04 5.67 72.98 4.61 1.5 + 2.0 62.55 2.56 68.28 5.53 63.01 8.19 Qua kÕt qu¶ thÝ nghiÖm cho thÊy B¹ch ®µn lai m«i tr−êng ra rÔ thÝch hîp lµ m«i tr−êng MS* bæ sung IBA nång ®é 1.5 mg/ lÝt. 4. KÕt luËn. - Thêi gian khö trïng tèi −u cho B¹ch ®µn lai lµ 6-8 phót trong dung dÞch HgCl2 0,1%. - Mïa vô khö trïng thÝch hîp lµ vô mïa hÌ - thu. - M«i tr−êng t¹o chåi thÝch hîp lµ m«i tr−êng cã bæ sung thªm BAP nång ®é 0,5mg/l, thêi gian cÊy chuyÓn thÝch hîp lµ 12 ngµy/ lÇn. - ChÕ ®é ¸nh s¸ng thÝch hîp cho nh©n chåi B¹ch ®µn lai lµ C§3: 6 ngµy kh«ng chiÕu s¸ng, chiÕu s¸ng 8h/ngµy trong 6 ngµy - CÊy c¸c chåi n»m ngang trªn bÒ mÆt m«i tr−êng trong giai ®o¹n nh©n chåi cho kÕt qu¶ tèt h¬n khi cÊy c¸c chåi th¼ng ®øng. - M«i tr−êng t¹o rÔ phï hîp lµ m«i tr−êng MS* cã bæ sung IBA nång ®é 1.5mg/ lÝt. B. Keo l¸ trµm. 1. Khö trïng a. ¶nh h−ëng cña thêi gian khö trïng. C¸c ®o¹n chåi ®−îc khö trïng b»ng HgCl2 0,1% trong c¸c thêi gian tõ 2’-10’. Sau ®ã röa s¹ch b»ng n−íc cÊt v« trïng. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm cho thÊy tuú thuéc vµo mÉu ®−îc lÊy vµ thêi gian xö lý, tû lÖ n¶y chåi kh¸c nhau. Tû lÖ n¶y chåi t¨ng dÇn khi thêi gian khö trïng t¨ng vµ tû lÖ nhiÔm gi¶m ®i. Chøng tá thêi gian xö lý ng¾n kh«ng ®ñ ®Ó lo¹i trõ hÕt bôi bÈn, nÊm bÖnh trªn mÉu vËt. Nh−ng thêi gian khö trïng qu¸ l©u ho¸ chÊt sÏ ngÊm sau vµo c¸c c¬ quan vµ lµm chÕt mÉu vËt. KÕt qu¶ cho thÊy víi Keo l¸ trµm thêi gian khö trïng 8’ vµ 10’ lµ hiÖu qu¶ nhÊt tû lÖ nhiÔm d−íi 60% vµ tû lÖ n¶y chåi ®¹t trªn 14%.
B¶ng 9. ¶nh h−ëng cña thêi gian khö trïng tíi kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi cña Keo l¸ trµm. Hãa chÊt Thêi gian Tû lÖ nhiÔm (%) Tû lÖ n¶y chåi (%) (Phót) §o¹n1 §o¹n2 §o¹n1 §o¹n2 2 93.00 95.00 3.50 0.00 HgCl2 4 85.25 89.50 7.50 3.25 6 67.25 75.46 13.50 6.78 8 58.00 60.00 17.00 14.50 10 45.76 48.00 17.68 14.65 12 35.00 37.85 9.50 6.30 b. ¶nh h−ëng cña thßi gian thu mÉu. C¸c mÉu ®−îc lÊy vµo c¸c th¸ng kh¸c nhau trong n¨m. B¶ng 10. ¶nh h−ëng cña mïa vô tíi kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi cña Keo l¸ trµm. Mïa Thêi gian Tû lÖ nhiÔm (%) Tû lÖ n¶y chåi (%) (Phót) §o¹n1 §o¹n2 §o¹n1 §o¹n2 Xu©n 8 42.00 43.70 43.00 39.50 10 37.50 36.00 39.00 38.75 H¹ 8 33.25 29.00 41.50 37.85 10 30.50 27.85 40.25 30.50 Thu 8 58.00 60.00 17.00 14.50 10 45.76 48.00 17.68 14.65 §«ng 8 32.00 35.67 11.50 15.25 10 30.56 34.25 10.50 8.75 KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy lÊy mÉu vµo thêi kú xu©n - hÌ c©y ®ang ë giai ®o¹n sinh tr−ëng, ph¸t triÓn, nªn kh¶ n¨ng nÈy chåi tèt nhÊt, mÉu cã thÓ sau 3 tuÇn ®−îc bËt chåi, tû lÖ n¶y chåi cao ®¹t tõ 30.50%-43.00%. Vµo mïa thu ®«ng do mïa kh«, c©y ®ang ë giai ®o¹n ngñ, kh¶ n¨ng bËt chåi chËm h¬n ph¶i 35 - 40 ngµy míi xuÊt hiÖn chåi, tû lÖ t¸i sinh chåi thÊp 8.70-15.25%. 2. Nh©n t¹o chåi. B¶ng 11. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm nh©n chåi. M«i tr−êng MS* + HÖ sè nh©n chåi cña tõng dßng chÊt, nång ®é (mg/l) (sè chåi/côm) 81 82 83 BAP 0.5 3.21 3.25 3.67 BAP 1.0 4.21 3.98 4.25 BAP 1.5 3.25 3.62 3.78 BAP 2.0 2.85 3.12 3.05 Kn 0.5 2.10 2.32 3.01 Kn 1.0 2.15 2.35 2.89 Kn 1.5 3.02 3.24 3.26 Kn 2.0 2.13 2.86 3.20 BAP 0.5+ Kn 0.5 3.25 3.20 3.05 BAP 0.5+ Kn 1.0 3.56 4.00 3.01 BAP 0.5+ Kn 1.5 4.56 4.27 3.89 BAP 0.5+ Kn 2.0 2.56 2.75 3.26
BAP 1.0+ GA 0.5 7.89 8.35 8.26 Sau khi chåi xuÊt hiÖn 3 tuÇn chiÒu cao ®¹t tõ 2-3cm ®−îc t¸ch vµ cÊy chuyÓn vµo m«i tr−êng nh©n chåi lµ m«i tr−êng MS* cã bæ c¸c cytokinin ngo¹i sinh nh− : BAP, Kn,... KÕt qu¶ thÝ nghiÖm cho thÊy BAP cã t¸c dông m¹nh nhÊt trong qu¸ tr×nh kÝch thÝch qu¸ tr×nh nh©n chåi cña Keo l¸ trµm. Khi dïng kÕt hîp BAP vµ Kn cho hÖ sè nh©n chåi cao h¬n khi dïng BAP hoÆc Kn riªng rÏ. M«i tr−êng nh©n chåi ®ù¬c bæ sung BAP nång ®é 1.0mg/l kÕt hîp GA3 nång ®é 0.5mg/l cho tû lÖ nh©n chåi cao nhÊt, hÖ sè nh©n chåi ®¹t tõ 7.89 ®Õn 8.35, cao h¬n khi dïng riªng lÎ hoÆc kÕt hîp BAP vµ Kn, hÖ sè nh©n chåi chØ ®¹t 2-5. B¶ng12 . ¶nh h−ëng cña m«i tr−êng tíi sù ph¸t triÓn cña chåi keo l¸ trµm. M«i tr−êng HÖ sè nh©n chåi ChiÒu cao chåi Sè chåi cã chÊt l−îng/b×nh cÊy Sè chåi/côm (cm) MS * 4.21 3.98 12 MS*+CW+CC 4.05 4.32 20 KÕt qu¶ thÝ nghiÖm còng cho thÊy, khi thay ®æi thµnh phÇn m«i tr−êng nu«i cÊy hÖ sè nh©n chåi thay ®æi kh«ng ®¸ng kÓ nh−ng chiÒu cao chåi còng nh− sè l−îng chåi ®ñ tiªu chuÈn cho qu¸ tr×nh ra rÔ ë m«i tr−êng bæ sung than ho¹t tÝnh (CC) vµ n−íc dõa (CW) cao h¬n h¼n. Do than ho¹t tÝnh hÊp thô c¸c s¶n phÈm g©y h¹i s¶n sinh trong qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt gi÷a mÉu vËt vµ m«i tr−êng nu«i cÊy. MÆt kh¸c trong thµnh phÇn n−íc dõa chøa mét sè chÊt phï hîp cho qu¸ tr×nh hoµn thiÖn bé l¸, t¨ng chiÒu cao chåi tõ ®ã t¨ng kh¶ n¨ng t¹o rÔ vµ søc chèng chÞu víi sù thay ®æi ®iÒu kiÖn m«i tr−êng sau khi huÊn luyÖn vµ cho ra rÔ. 3. Qu¸ tr×nh ra rÔ trong lä. C¸c chåi cao 2 - 2,5 cm t¹o ®−îc trong qu¸ tr×nh nh©n chåi ®−îc t¸ch vµ cÊy vµo m«i tr−êng ra rÔ bæ sung c¸c auxin ngo¹i sinh. B¶ng 12. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ra rÔ. M«i tr−êng 1/2MS* + Tû lÖ ra rÔ cña tõng dßng (%) Sai dÞ chÊt, nång ®é (mg/l) 81 82 83 81 82 83 IBA 0.5 88.0 90.03 91.73 3.62 3.67 3.21 IBA 1.0 90.33 97.53 95.57 3.12 4.25 4.21 IBA 1.5 98.33 99.12 97.89 2.32 3.78 3.25 IBA 2.0 92.13 90.15 91.35 2.35 3.05 2.85 NAA 0.5 90.12 82.10 85.17 3.24 3.01 2.10 NAA 1.0 92.10 82.56 87.58 2.86 2.89 2.15 NAA 1.5 82.00 82.23 84.25 3.20 3.26 3.02 KÕt qu¶ thÝ nghiÖm cho thÊy ë m«i tr−êng 1/2 MS* bæ sung IBA cho tû lÖ ra rÔ cao h¬n h¼n khi dïng NAA ë cïng nång ®é. Trong khi tû lÖ ra rÔ ®¹t 88-98% khi dïng IBA th× víi NAA tû lÖ ra rÔ chØ ®¹t 82-92.10%. Tû lÖ ra rÔ cao nhÊt khi dïng NAA ®¹t 92.10% trong khi tû lÖ nµy ë c«ng thøc dïng IBA lµ 99.12%. §iÒu nµy cho thÊy IBA thÝch h¬n hîp trong vai trß kÝch thÝch t¹o rÔ cho Keo l¸ trµm. Khi ra rÔ ë m«i tr−êng 1/2 MS*bæ sung IBA nång ®é 1.5 mg/l cho kÕt qu¶ ra rÔ tèt nhÊt ®¹t tû lÖ trªn 97% cho c¶ 3 dßng thÝ nghiÖm, khi ta t¨ng hoÆc gi¶m nång ®é
IBA th× tû lÖ ra rÔ gi¶m dÇn. ë c«ng thøc nµy thÊy r»ng sè l−îng vµ chiÒu dµi rÔ còng cao h¬n so víi c¸c c«ng thøc kh¸c. 4. Ra rÔ trùc tiÕp. §Ó rót ng¾n thêi gian t¹o rÔ trong èng nghiÖm, t¨ng kh¶ n¨ng chèng chÞu cña c©y tr−íc khi ®−a ra m«i tr−êng c¸c chåi nu«i cÊy invitro cã chiÒu cao ®¹t tõ 2,5 cm ®−îc c¾t xö lý b»ng dung dÞch Benlat nång ®é 0,3 %, chÊm thuèc bét kÝch thÝch t¹o rÔ TTG (thuèc kÝch thÝch ra rÔ th−¬ng phÈm cã gèc lµ IBA do Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng pha chÕ) vµ c¾m trùc tiÕp vµo c¸t Èm ®· xö lý thuèc tÝm 0.15%. C¸c chåi ®· xö lý thuèc gi©m hom ®−îc ch¨m sãc nh− ph−¬ng ph¸p gi©m hom th«ng th−êng. Ph−¬ng ph¸p nµy lÇn ®Çu tiªn ®−îc ¸p dông víi Keo l¸ trµm . KÕt qu¶ ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 15. Qua kÕt qu¶ cho thÊy theo ph−¬ng ph¸p nµy tû lÖ ra rÔ cao, tËn dông nh©n c«ng, tiÕt kiÖm ®−îc thêi gian vµ vËt t− hãa chÊt, h¹ gi¸ thµnh s¶n phÈm. Khi rÔ dµi 2 cm, cÊy c©y vµo bÇu ®Êt vµ ®−îc ch¨m sãc b×nh th−êng tû lÖ sèng ®¹t trªn 85%. B¶ng 13 . KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ra rÔ trùc tiÕp c¸c dßng Keo l¸ trµm. Nång ®é TØ lÖ % ra rÔ thuèc (%) Dßng sè 81 Dßng sè 82 Dßng sè 83 Tb Sd Tb Sd Tb Sd IBA 0.5 80.33 5.3 79.8 5.0 70.3 5.2 1.0 85.00 6.50 85.33 6. 1 88.50 6.3 2.0 79.33 8.5 79.4 7. 4 78.3 5.3 5. KÕt luËn. - Ph−¬ng ph¸p khö trïng thÝch hîp víi Keo l¸ trµm lµ b»ng HgCl2 0.1% trong 8- 10 phót. - Thêi vô khö trïng thÝch hîp lµ vô xu©n - hÌ. - Qu¸ tr×nh nh©n t¹o chåi Keo l¸ trµm trong m«i tr−êng MS* kÕt hîp víi BAP vµ GA3 cã hÖ sè nh©n chåi cao h¬n m«i tr−êng MS* kÕt hîp víi BAP vµ Kn, thêi gian cÊy chuyÓn thÝch hîp lµ 20 - 25 ngµy/ lÇn cÊy chuyÓn (tr−íc ®©y lµ 35 - 40 ngµy/ lÇn) . - §Ó chuÈn bÞ cho qu¸ tr×nh ra rÔ m«i tr−êng nh©n chåi thÝch hîp lµ m«i tr−êng MS* c¶i tiÕn bæ sung BAP nång ®é 1.0mg/l , GA3 nång ®é 0.5mg/l , than ho¹t tÝnh 1,5g/l vµ n−íc dõa 150ml/l. - M«i tr−êng ra rÔ thÝch hîp cho c¸c dßng Keo l¸ trµm lµ m«i tr−êng 1/2 MS* cã bæ sung IBA nång ®é 1.5 mg/ lit. C. Keo lai. 1. Khö trïng. ¶nh h−ëng cña thêi gian khö trïng. C¸c ®o¹n chåi ®−îc khö trïng b»ng dung dÞch HgCl2 0,1%, l¾c ®Òu trong thêi gian 2', 4', 6',8', 10', 12'. Sau ®ã röa s¹ch b»ng n−íc cÊt v« trïng. KÕt qu¶ cho thÊy xö lý HgCl2 0,1% trong 12' tû lÖ nhiÔm b»ng 0 vµ còng kh«ng cã chåi nµo nÈy chøng tá ë thêi gian nµy HgCl2 ®· g©y ®éc ®èi víi c¸c chåi, c¸c chåi ®Òu chÕt. HgCl2 ®· thÊm vµo tÕ bµo chÊt, ph¸ huû chÊt nguyªn sinh, ph¸ huû ho¹t ®éng sèng cña tÕ bµo, ¶nh h−ëng tíi mäi qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt, do ®Êy mµ ¶nh h−ëng tíi qu¸ tr×nh bËt chåi .
Thêi gian xö lý HgCl2 trong 2 phót , 4 phót th× tû lÖ nhiÔm t¨ng dÇn vµ tû lÖ chåi gi¶m dÇn chøng tá thêi gian xö lý cßn qu¸ Ýt ch−a ®ñ lo¹i trõ mét sè nÊm bÖnh , bôi bÈn b¸m trªn mÉu vËt vÉn cßn tû lÖ nhiÔm nhiÒu. Xö lý HgCl2 trong thêi gian 8 phót vµ 10 phót ®Òu cã kÕt qu¶ tû lÖ nhiÔm d−íi 50% (®Æc biÖt ë ®o¹n I) vµ tû lÖ n¶y chåi còng ®¹t cao h¬n so víi c¸c c«ng thøc kh¸c. B¶ng 14. ¶nh h−ëng cña thêi gian xö lý b»ng HgCl2 0,1% ®Õn tû lÖ nhiÔm vµ tû lÖ bËt chåi. Hãa chÊt Thêi gian xö lÝ TØ lÖ nhiÔm (%) TØ lÖ bËt chåi (%) (phót) §o¹n1 §o¹n2 §o¹n1 §o¹n2 HgCl2 2 95.0 98.0 0.0 0.0 4 87.0 98.0 7.5 0.0 6 72.3 75.0 14.1 10.5 8 67.0 66.0 17.3 16.0 10 68.0 60.0 12.0 14.0 12 0.0 0.0 0.0 2.0 b. ¶nh h−ëng cña thêi kú lÊy mÉu. C¸c mÉu ®−îc lÊy vµo c¸c mïa trong n¨m, mçi lÇn c¸ch nhau 3 th¸ng. Do ®iÒu kiÖn thêi tiÕt c¸c mïa kh¸c nhau nªn ¶nh h−ëng rÊt lín ®Õn kÕt qu¶ thÝ nghiÖm . KÕt qu¶ thÝ nghiÖm cho thÊy thu mÉu vµo mïa hÌ thu cho tØ lÖ n¶y chåi tèt nhÊt. ë giai ®o¹n nµy c©y ®ang sinh tr−ëng tèt cßn c¸c th¸ng kh¸c ®Òu kÐm h¬n vÒ kh¶ n¨ng bËt chåi. Cã thÓ vµo cuèi mïa sinh tr−ëng nh− trong th¸ng 10, th¸ng 12, c©y chuyÓn sang giai ®o¹n ngõng sinh tr−ëng , hoÆc th¸ng 2 vµo ®Çu xu©n c©y chuyÓn sang giai ®o¹n sinh tr−ëng ®ång thêi còng lµ thêi gian thuËn lîi cho c¸c mÇm bÖnh ph¸t triÓn nªn ®· ¶nh h−ëng ®Õn tû lÖ nhiÔm bÖnh vµ tû lÖ bËt chåi. B¶ng 15. ¶nh h−ëng cña mïa vô tíi kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi Keo lai. Mïa Thêi gian xö lÝ TØ lÖ nhiÔm (%) TØ lÖ bËt chåi (%) (phót) §o¹n1 §o¹n2 §o¹n1 §o¹n2 67.0 66.0 17.3 16.0 8 Xu©n 10 68.0 60.0 12.0 14.0 8 37.0 74.0 32.0 30.0 H¹ 10 32.0 64.0 37.5 40.4 8 24.0 8.0 35.5 38.5 Thu 10 0.0 6.0 33.5 38.0 8 5.0 10.0 25.0 18.0 §«ng 10 5.0 10.0 27.5 30.0 Ngoµi ¶nh h−ëng cña hãa chÊt khö trïng, thêi gian khö trïng th× tuæi cña c©y mÑ, tuæi cña chåi còng nh− vÞ trÝ lÊy vËt liÖu gèc ban ®Çu còng cã ¶nh h−ëng rÊt lín ®Õn kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi vµ ph¸t triÓn cña c©y sau nµy. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm còng cho thÊy mÉu vËt ®−îc lÊy tõ c¸c chåi v−ît cho tû lÖ t¸i sinh chåi cao, kh¶ n¨ng ph¸t triÓn cña c©y tèt h¬n so víi mÉu vËt ®−îc lÊy tõ c¸c chåi cµnh. 2. Nh©n t¹o chåi. C¸c chåi bÊt ®Þnh cao tõ 2-2,5 cm ®−îc t¸ch ra, cÊy vµo m«i tr−êng nh©n chåi cã bæ sung mét sè chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng ë c¸c nång ®é kh¸c nhau. B¶ng 16. ¶nh h−ëng cña c¸c Cytokinin ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi cña c¸c dßng Keo lai.
M«i tr−êng HÖ sè nh©n chåi cña c¸c dßng Keo lai MS* + chÊt- Dßng sè 10 Dßng sè 32 Dßng sè 16 nång ®é(mg/l) Tb Sd Tb Sd Tb Sd BAP 0.5 12.0 3.00 12.33 3.33 8.3 3.03 1.0 20.33 5.03 18.00 4.56 18.00 3.29 2.0 23.33 5.77 20.33 3.33 20.67 4.3 3.0 15.5 3.52 10.56 5.56 13.25 5.35 K 0.5 6.00 2.65 4.6 2.33 5.0 3.06 1.0 9.00 2.00 8.3 2.57 7.6 1.53 2.0 12.33 3.79 9.33 1.33 11.33 3.6 3.0 7.56 2.36 7.56 1.6 7.23 2.35 Sè liÖu cho thÊy khi dïng m«i tr−êng MS* + BAP ë c¸c nång ®é 2.0 mg/l cho sè chåi nhiÒu nhÊt ®¹t tõ 20,33 - 23,3 chåi/côm, tû lÖ nh©n chåi gi¶m dÇn khi nång ®é BAP gi¶m hoÆc t¨ng. Trong khi ®ã c«ng thøc MS* + Kn ë nång ®é 2,0mg/l cao nhÊt chØ ®¹t 9 - 12 chåi/côm . §iÒu nµy chøng tá khi nh©n chåi bæ sung BAP lµ phï hîp víi qu¸ tr×nh nh©n chåi Keo lai. Sù thay ®æi vÒ thµnh phÇn m«i tr−êng nu«i cÊy: nguyªn tè ®a l−îng, vi l−îng c¸c chÊt phô gia, axit amin còng cã t¸c ®éng m¹nh mÏ ®Õn kh¶ n¨ng h×nh thµnh chåi Keo lai. B¶ng 17. ¶nh h−ëng cña thµnh phÇn m«i tr−êng tãi kh¶ n¨ng nh©n chåi Keo lai M«i tr−êng HÖ sè nh©n chåi (sè chåi/côm) Dßng BV10 Dßng BV16 Dßng BV32 MS*1 15.63 15.36 17.53 MS* 2 23.33 20.67 20.33 MS*3 17.33 15.50 13.26 Nh− vËy khi sö dông c¸c m«i tr−êng kh¸c nhau ë cïng nång ®é chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng cho hÖ sè nh©n chåi kh¸c biÖt râ rÖt. ë m«i tr−êng MS*2 ®èi víi tÊt c¶ c¸c dßng hÖ sè nh©n chåi cao h¬n c¸c c«ng thøc MS*1 vµ MS*3. MÆt kh¸c khi nh©n chåi Keo lai trong m«i tr−êng MS*2 thêi gian cÊy chuyÓn gi÷a hai lÇn nh©n chåi còng gi¶m ®¸ng kÓ tõ 25- 30 ngµy/ lÇn cÊy chuyÓn cßn 20- 25 ngµy/ lÇn cÊy chuyÓn ®iÒu nµy cã ý nghÜa rÊt lín trong s¶n xuÊt bëi kh«ng nh÷ng thu ®−îc sè l−îng chåi lím h¬n mµ cßn rót ng¾n ®−îc thêi gian s¶n xuÊt, h¹ gi¸ thµnh s¶n phÈm. Ph−¬ng ph¸p cÊy nh©n chåi còng cã ¶nh h−íng lín ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi cña Keo lai: khi cÊy nh©n côm chåi cho tû lÖ nh©n chåi cao h¬n khi cÊy riªng lÎ tõng chåi. Tuy nhiªn ®Ó t¹o ®−îc sè l−îng lín c¸c chåi cøng c¸p, ph¸t triÓn ®ång ®Òu cho ra rÔ chåi non m«i tr−êng tèi −u trong giai ®o¹n chuÈn bÞ lµ m«i tr−êng MS c¶i tiÕn bæ sung BAP nång ®é 1.0mg/l vµ NAA nång ®é 0.2mg/l, khi nu«i cÊy trong m«i tr−êng nµy chåi ph¸t triÓn ®ång ®Òu vÒ chiÒu cao, ®é mËp th©n, bé l¸ do m«i tr−êng cã tû lÖ cytokinin/auxin thÝch hîp. 3. Qu¸ tr×nh ra rÔ tron g lä. C¸c chåi cao 2,5 cm t¹o trong qu¸ tr×nh nh©n chåi ®−îc t¸ch ra vµ cÊy vµo m«i tr−êng ra rÔ lµ m«i tr−êng MS* cã bæ sung c¸c chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng.
KÕt qu¶ thÝ nghiÖm cho thÊy ë m«i tr−êng 1/2MS* bæ sung IBA cho tû lÖ ra rÔ cao h¬n khi dïng NAA. M«i tr−êng bæ sung IBA cho tû lÖ ra rÔ cao ®¹t 88.0-98.33% trong khi m«i tr−êng bæ sung NAA chØ ®¹t 65.31-85.56%. M«i tr−êng 1/2MS* bæ sung IBA nång ®é 2 mg/l cho kÕt qu¶ ra rÔ tèt nhÊt dßng BV10 vµ BV32 ®¹t tû lÖ ra rÔ 97.33 vµ 98.33%, riªng dßng BV16 cã kÕt qu¶ ra rÔ tèt nhÊt ë m«i tr−êng MS* bæ sung IBA nång ®é 1.0mg/lÝt ®¹t 97.2%. B¶ng 18. ¶nh h−íng cña c¸c chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng tíi kh¶ n¨ng ra rÔ cña c¸c dßng Keo lai. M«i tr−êng 1/2MS* + TØ lÖ % ra rÔ cña c¸c dßng keo lai ChÊt, nång ®é (mg/l) Dßng sè 10 Dßng sè 32 Dßng sè 16 Tb Sd Tb Sb Tb Sd +IBA 0.5 88.0 3.00 88.33 8.3 92.67 5.03 1.0 90.33 5.03 93.00 3.0 97.32 9.62 2.0 97.33 5.77 98.33 5.3 94.67 9.3 2.5 96.21 5.46 92.53 2.9 95.64 8.56 +NAA 0.5 75.36 6.35 75.26 5.6 82.16 3.25 1.0 76.58 6.89 79.26 6.2 85.56 25.6 2.0 81.23 3.56 68.35 6.5 79.36 4.26 2.5 76.53 4.58 65.31 5.1 75.48 3.46 Ra rÔ trùc tiÕp b»ng thuèc TTG: §Ó rót ng¾n thêi gian t¹o rÔ trong èng nghiÖm, t¨ng kh¶ n¨ng chèng chÞu cña c©y tr−íc khi ®−a ra m«i tr−êng c¸c chåi cã chiÒu cao ®¹t tõ 2,5 cm ®−îc c¾t xö lý b»ng dung dÞch Benlat nång ®é 0,3 %, chÊm thuèc TTG vµ c¾m trùc tiÕp vµo c¸t Èm ®· xö lý thuèc tÝm 0.15%. C¸c chåi ®· xö lý thuèc gi©m hom ®−îc ch¨m sãc nh− c©y m« ra rÔ trong lä th«ng th−êng. ViÖc kÕt hîp kü thuËt nu«i cÊy m« vµ gi©m hom t¹o c«ng nghÖ m« - hom nµy lÇn ®Çu tiªn ®· ®−îc thùc hiÖn thµnh c«ng t¹i Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng. Ph−¬ng ph¸p nµy cho tû lÖ ra rÔ cao trªn 88 %, khi rÔ dµi 2 cm, cÊy c©y vµo bÇu ®Êt vµ ®−îc ch¨m sãc b×nh th−êng tû lÖ sèng ®¹t trªn 80% víi c¸c dßng thÝ nghiÖm. ¸p dông thµnh c«ng ph−¬ng ph¸p nµy sÏ tËn dông nh©n c«ng, tiÕt kiÖm ®−îc thêi gian vµ vËt t− hãa chÊt, h¹ gi¸ thµnh s¶n phÈm. B¶ng 19 . KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ra rÔ trùc tiÕp c¸c dßng Keo lai. Nång ®é TØ lÖ % ra rÔ cña c¸c dßng keo lai (%) Dßng sè 16 Dßng sè 10 Dßng sè 32 Tb Sd Tb Sd Tb Sd + IBA 0.5 78.33 4.73 79.67 5.03 70.33 4.16 1.0 83.00 7.00 83.33 5.51 78.00 7.21 2.0 88.33 9.5 89.33 6.34 88.32 4.09 2.5 72.35 3.26 73.58 8.69 70.25 5.69 c. KÕt luËn.
- Qu¸ tr×nh nh©n t¹o chåi Keo lai trong m«i tr−êng MS* kÕt hîp víi BAP cã hÖ sè nh©n chåi cao h¬n khi dïng m«i tr−êng MS* kÕt hîp víi Kn. thêi gian cÊy chuyÓn thÝch hîp lµ 20 - 25 ngµy/ lÇn. - Trong giai ®o¹n chuÈn bÞ ra rÔ m«i tr−êng nh©n chåi thÝch hîp lµ m«i tr−êng MS* c¶i tiÕn bæ sung BAP nång ®é 1.0mg/l vµ NAA nång ®é 0.2mg/l. - M«i tr−êng ra rÔ thÝch hîp cho c¸c dßng Keo lai dßng BV10, BV32 lµ m«i tr−êng 1/2 MS* cã bæ sung IBA nång ®é 2.0 mg/ lit, dßng BV16 lµ m«i tr−êng 1/2MS* bæ sung IBA nång ®é 1.0mg/lit. - Keo lai ra rÔ trùc tiÕp b»ng thuèc TTG cho tû lÖ ra rÔ cao. D. HuÊn luyÖn c©y. Sau khi c©y ra rÔ 10 ngµy, chiÒu dµi rÔ ®¹t tõ 1,5-2cm, ®−îc ®−a ra nhµ huÊn luyÖn trong 1 tuÇn cho thÝch nghi dÇn víi ®iÒu kiÖn tù nhiªn. §©y còng lµ giai ®o¹n chuyÓn c©y con invitro tõ tr¹ng th¸i sèng dÞ d−ìng sang sèng hoµn toµn tù d−ìng, do ®ã ph¶i ®¶m b¶o c¸c ®iÒu kiÖn ngo¹i c¶nh: nhiÖt ®é, ¸nh s¸ng, ®é Èm, gi¸ thÓ… phï hîp ®Ó c©y con ®¹t tû lÖ sèng cao. Khi ®−a c©y con tõ b×nh nu«i cÊy ra ngoµi m«i tr−êng, c©y ®−îc röa s¹ch vµ xö lý b»ng Benlat nång ®é 0,15% trong 30 gi©y tr−íc khi cÊy vµo 2 lo¹i gi¸ thÓ gi¸ thÓ: - CÊy trùc tiÕp vµo bÇu ®Êt: thµnh phÇn ruét bÇu gåm: ph©n c¨mp«t, x¬ dõa...®−îc pha trén theo c¸c c«ng thøc vµ tû lÖ kh¸c nhau. - CÊy vµo gi¸ thÓ c¸t: sau 4 tuÇn khi c©y æn ®Þnh cÊy chuyÓn vµo bÇu ®Êt. Hai lo¹i gi¸ thÓ trªn ®−îc xö lý Benlat nång ®é 0,15% tr−íc khi cÊy c©y con. C©y con ®−îc che b»ng l−íi nilong ®en cã ®é che s¸ng 75%, hµng ngµy ®−îc t−íi b»ng vßi phun s−¬ng trong 2 tuÇn. Khi c©y æn ®Þnh th¸o bá dÇn dµn che cho thÝch nghi dÇn víi ®iÒu kiÖn m«i tr−êng vµ ch¨m sãc nh− c©y con ë v−ên −¬m th«ng th−êng. B¶ng 20. ¶nh h−ëng cña gi¸ thÓ ®Õn kh¶ n¨ng sèng vµ sinh tr−ëng cña c©y sau 2 tuÇn. Gi¸ thÓ Tû lÖ sèng ChiÒu cao c©y Keo lai Keo l¸ trµm B¹ch ®µn lai Keo lai Keo l¸ trµm B¹ch ®µn lai C¸t 68,5 65,25 71,0 2.5 3,3 2,5 BÇu ®Êt 92,3 85,5 90,0 4.1 4,0 3,5 KÕt qu¶ ë b¶ng 4 cho thÊy c©y ®−îc chuyÓn tõ m«i tr−êng invitro ra m«i tr−êng bªn ngoµi sau 2 tuÇn c©y ®−îc cÊy vµo bÇu ®Êt th× tØ lÖ sèng ®¹t 85.5-92.3% . Trong khi ®ã, c©y cÊy vµo gi¸ thÓ c¸t tû lÖ sèng chØ ®¹t 65.25-71%. Nh− vËy, gi¸ thÓ bªn ngoµi lµ bÇu ®Êt cho tû lÖ sèng cao h¬n khi cÊy ë gi¸ thÓ c¸t. §iÒu nµy cã thÓ gi¶i thÝch do c©y nu«i cÊy m« th©n yÕu, tÕ bµo mäng n−íc, hÖ rÔ ph¸t triÓn ch−a hoµn chØnh nªn trong m«i tr−êng c¸t gi÷ n−íc kÐm c©y hÐo nhanh. C©y cÊy trong bÇu ®Êt ®−îc gi÷ Èm tèt h¬n nªn c©y mau phôc håi, hÖ rÔ ph¸t triÓn nhanh, kh¶ n¨ng t¹o tÕ bµo l«ng hót lín, gióp cho c©y nhanh chãng hót n−íc vµ kho¸ng chÊt.
KÕt qña thÝ nghiÖm cho thÊy ®èi víi B¹ch ®µn lai, c©y ®−îc huÊn luyÖn trong thêi gian tõ th¸ng 9 ®Õn th¸ng 4 n¨m sau cho tû lÖ sèng cao ®¹t 85%-90%, c©y ph¸t triÓn tèt. - ChÕ ®é t−íi n−íc: Giai ®o¹n ®Çu (kho¶ng 12 ngµy) dïng b×nh phun hay dµn phun s−¬ng t−íi tõ 4-5 lÇn/ ngµy, khi c©y æn ®Þnh sè lÇn t−íi gi¶m dÇn. - ChÕ ®é bãn ph©n: sau khi cÊy c©y (kho¶ng 20 ngµy) b¾t ®Çu t−íi thóc b»ng hç hîp NPK (5 :10 :3), nång ®é 0,5%, liÒu l−îng lµ 100 lit /20.000 c©y (t−íi vµo lóc trêi r©m m¸t) sau ®ã ph¶i t−íi röa l¹i b»ng n−íc s¹ch, vµ cø 10 ngµy t−íi thóc 1 lÇn ®Õn khi chiÒu cao c©y ®¹t tõ 15-20cm, th× ngõng t−íi. - ChÕ ®é ¸nh s¸ng: c¸c luèng B¹ch ®µn khi cÊy xong dïng vßm cã phñ kÝn b»ng nilong tr¾ng, trªn lµ l−íi che r©m cã ®é che s¸ng 90%, che trong 10 ngµy ®Çu sau khi cÊy. Sau ®ã bá nilong chØ che l−íi cã ®é che s¸ng 50-70% khi c©y ®−îc 1 th¸ng cã thÓ bá hoµn toµn l−íi che. §èi víi Keo lai vµ Keo l¸ trµm thêi gian huÊn luyÖn c©y thÝch hîp lµ tõ th¸ng 10 ®Õn th¸ng 6 n¨m sau. Ph−¬ng ph¸p ch¨m sãc t−¬ng tù nh− víi B¹ch ®µn lai.