BÁO CÁO KHOA HỌC: "ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG VÀ TUỔI PHÔI ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CÂY TỪ PHÔI NON DÒNG NGÔ NHẬP NỘI HR8, HR9"

Chia sẻ: Linh Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:19

Thêm vào BST

Báo xấu

105
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khả năng tái sinh của cây trồng nói chung phụ thuộc nhiều vào kiểu gen của thực vật. Đối với cây ngô, vấn đề tái sinh gặp rất nhiều khó khăn, ngoại trừ một số dòng có khả năng tái sinh cao, được sử dụng làm vật liệu chuyển gen như: A188, H99, HiII…hầu hết các dòng ngô khác có khả năng tái sinh kém (1).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: BÁO CÁO KHOA HỌC: "ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG VÀ TUỔI PHÔI ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CÂY TỪ PHÔI NON DÒNG NGÔ NHẬP NỘI HR8, HR9"

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG VÀ TUỔI PHÔI ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CÂY TỪ PHÔI NON DÒNG NGÔ NHẬP NỘI HR8, HR9 Phạm Thị Lý Thu, Phạm Minh Thợi, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh Viện Di truyền nông nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ Khả năng tái sinh của cây trồng nói chung phụ thuộc nhiều vào kiểu gen của thực vật. Đối với cây ngô, vấn đề tái sinh gặp rất nhiều khó khăn, ngoại trừ một số dòng có khả năng tái sinh cao, được sử dụng làm vật liệu chuyển gen như: A188, H99, HiII…hầu hết các dòng ngô khác có khả năng tái sinh kém (1). Mặt khác, khả năng tái sinh còn phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy và một số yếu tố khác. Việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy và tái sinh ở cây ngô còn hạn chế.
Trong khuôn khổ bài báo này chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và tuổi phôi nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi non trên cơ sở các dòng ngô nhập nội có khả năng tái sinh cao HR8 và HR9. Hai dòng ngô này có nguồn gốc ôn đới, đã được trồng và xác định thời vụ sinh trưởng thích hợp trong điều kiện Việt nam (10). VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Các dòng ngô được sử dụng trong nghiên cứu gồm: hai dòng ngô nhập nội HR8 và HR9 là 2 dòng có khả năng tái sinh cao, do Viện Công nghệ liên bang Thuỵ sỹ ETH cung cấp Cây ngô mẹ cho bắp thí nghiệm được trồng trong nhà lưới từ tháng 10/2000 đến tháng 4/ 2003. Phương pháp
Bắp non sau khi thụ phấn khoảng 18-24 ngày được thu để tách phôi. Mẫu bắp thí nghiệm được giữ ở 40C thời gian từ 2-10 ngày trước khi tách phôi. Khử trùng bề mặt ngoài của bắp bằng ethanol 700, bóc bỏ các lá bao ngoài và tách phôi trong điều kiện vô trùng. Phôi non được cấy trong môi trường nuôi cấy với phần tế bào vảy hướng lên trên, phần trụ phôi tiếp xúc với bề mặt môi trường (Green and Phillips, 1975). Các phôi có kích thước khác nhau (từ 0,5-3mm) được sử dụng trong thí nghiệm. Mật độ cấy 15 phôi/đĩa Petri chứa 8mml môi trường. .Mỗi công thức thí nghiệm được làm với 12 đĩa, tương ứng với 180 phôi tách từ 3 bắp. Môi trường nuôi cấy Hai loại môi trường cơ bản được sử dụng: Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) -
Môi trường N6 (Chu et al., 1975) - bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng và một số phụ gia khác tuỳ từng giai đoạn nuôi cấy (theo Armstrong and Green, 1985 có cải tiến): • Môi trường tạo mô sẹo: gồm 2 môi trường khác nhau về thành phần khoáng và vitamin - Môi trường CMS: môi trường MS bổ sung 20 g/l sucrose, 2 mg/l 2,4-D, 100 mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline và 10mg/l AgNO3. - Môi trường CN6: môi trường N6 bổ sung 20 g/l sucrose, 2 mg/l 2,4-D, 100 mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline và AgNO3 nồng độ từ 0-30mg/l. • Môi trường tái sinh chồi (SM): môi trường N6 bổ sung 60 g/l sucrose, 2 g/l myo-inositol.
• Môi trường kéo dài chồi và tạo cây hoàn chỉnh (RM): môi trường 1/2MS bổ sung 20 g/l sucrose, 1 g/l myo-inositol. Tất cả các môi trường đều sử dụng chất giá thể là phytagel 0,2%, có pH=5,8. Điều kiện nuôi cấy Mẫu được nuôi ở nhiệt độ 260C  2. Đối với giai đoạn tạo mô sẹo và mô sẹo phôi hoá mẫu phôi non được nuôi cấy trong tối thời gian từ 2-3 tuần. Để tái sinh chồi và tạo cây hoàn chỉnh mô sẹo phôi hoá được nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng thời gian 8-10 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 1200-1600 lux. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của nitrat bạc lên khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 Bắp non dòng HR8 sau khi thụ phấn 18-20 ngày được thu
để tách phôi. Các phôi có kích thước khoảng 1-2 mm được chọn và nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo CN6 có bổ sung AgNO3 nồng độ từ 0-30mg/l (các phôi có kích thước lớn hoặc nhỏ hơn đều bị loại bỏ). Kết quả thu được trình bày ở bảng 1 và hình 1. Bảng 1. Ảnh hưởng của AgNO3 đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 Kết quả bảng 1 cho thấy phản ứng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 được cải thiện một cách rõ rệt khi bổ sung AgNO3 nồng độ 1-15mg/l vào môi trường nuôi cấy: tỷ lệ tạo mô sẹo tăng từ 56,6% lên 85,5%, tỷ lệ tái sinh cây tăng từ 18,6% lên 22,6% (trong môi trường không có và có 1mg/l AgNO3). Tần số tạo mô sẹo và tái sinh cây đạt giá trị
tương đối cao (từ 85.5% - 90.5% và 22.6% - 26.6%) và thay đổi không đáng kể khi bổ sung 5-15 mg/l AgNO3 vào môi trường nuôi cấy. Song, ở nồng độ 10mg/l AgNO3 thì khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 đạt giá trị lớn nhất (90.5% và 26.6%) và giảm dần khi tăng nồng độ AgNO3 từ 20mg/l lên 30mg/l. Hình 1. Ảnh hưởng của AgNO3 đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 Khi nghiên cứu ảnh hưởng của AgNO3 đến sự hình thành mô sẹo từ phôi non dòng B73 (Songstad et al. 1991), từ hoa non dòng HiII (Songstad et al. 1992) và từ phôi non dòng A188 (Vain et al. 1989) các tác giả cũng có nhận xét tương tự (7, 8, 11).
Từ kết quả thu được này chúng tôi chọn môi trường tạo mô sẹo CN6 có bổ sung10mg/l AgNO3 để nghiên cứu tiếp ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy và nitrat bạc đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8. Ảnh hưởng của thành phần môi trường và nitrat bạc lên khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 Phôi non dòng HR8 có kích thước khoảng 1-2 mm được chọn và nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo có thành phần khoáng và vitamin khác nhau (MS hoặc N6) bổ sung 10mg/l AgNO3. Kết quả thu được trình bày ở bảng 2. Bảng 2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường và AgNO3 đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh dòng HR8
Trong thí nghiệm này chúng tôi quan sát thấy mô sẹo bắt đầu xuất hiện sau 1-2 tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, chúng tôi chưa quan sát được sự khác biệt về mặt hình thái giữa các loại mô sẹo tạo thành ở giai đoạn này. Vì thế mẫu được cấy chuyển sang môi trường mới và sự hình thành các dạng mô sẹo khác nhau cũng như khả năng tạo mô sẹo đã được quan sát rất rõ sau 1-2 tuần nuôi cấy tiếp theo (hình 4A, 4B, 4C). Kết quả bảng 2 cho thấy có sự khác biệt không đáng kể về khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 khi nuôi cấy trong môi trường có thành phần khoáng và vitamin khác nhau: a) Tỷ lệ tạo mô sẹo: đạt 69,4 % và 60,0%, b) Tỷ lệ tái sinh cây: đạt 18,5 % và 20,8% trong môi trường MS và N6 không bổ sung AgNO3 tương ứng. Tần số tạo mô sẹo và tái sinh cây của phôi nuôi cấy trong môi trường MS và N6 có bổ sung 10mg/l AgNO3 cũng đạt kết quả tương tự.
Hình 3: ẢNh hưởng của thành phần môi trường và AgNO3 đến khả năng tái sinh dòng HR8 Sự có mặt của AgNO3 trong môi trường nuôi cấy đã cải thiện rõ rệt khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng ngô HR8. Tỷ lệ tạo mô sẹo tăng từ 69,4% lên 88,8% (môi trường MS) và 60,0% lên 90,5% (môi trường N6) khi nuôi cấy trong môi trường không có và có bổ sung AgNO3 tương ứng (hình 3). Tần số tái sinh đạt giá trị cao nhất khi nuôi cấy trong môi trường CN6 có bổ sung 10mg/lAgNO3. Điều này có thể được giải thích là do AgNO3 kích thích quá trình tạo mô sẹo bằng cách ngăn cản sự hình thành ethylen nội sinh (tạo ra bởi sự tổn thương của các mẫu nuôi cấy và quá trình nuôi cấy in vitro) (Songstad et al, 1992).
Ảnh hưởng của tuổi phôi (kích thước phôi) lên khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 Phôi non ở các độ tuổi khác nhau 16, 18, 20, 22 và 24 ngày (phôi có kích thước từ 0,5-5mm tương ứng) được cấy trên môi trường tạo mô sẹo CN6 bổ sung 10 mg/l AgNO3. Sau 2-3 tuần nuôi cấy chúng tôi đã quan sát thấy sự sinh trưởng và hình thái của khối tế bào mô sẹo tạo thành từ các phôi có kích thước khác nhau rất khác nhau. Kết quả được trình bày ở bảng 3 và hình 4. Bảng 3. Ảnh hưởng của tuổi phôi (kích thước phôi nuôi cấy) lên khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8
Hình 4. A. Phôi nuôi cấy; B, C. Mô sẹo và mô sẹo phôi hoá tạo thành từ phôi non; D. Cây tái sinh; E, F, G. Mô sẹo tạo thành từ phôi nuôi cấy có kích thước 0,5; 1-2 và 3 mm tương ứng; Đối với các phôi nuôi cấy ở độ tuổi 16 ngày sau thụ phấn (có kích thước 0,5mm) khối tế bào mô sẹo tạo thành rất nhỏ, sinh trưởng chậm và có dạng nhầy (hình 4E). Khi tái sinh chúng tạo thành cụm chồi với các chồi không hữu hiệu, sức sống kém và ít rễ. Tỷ lệ tạo mô sẹo và tái sinh cây
thấp đạt 29,4% và 11,3%. Bên cạnh đó thì khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ các phôi non ở độ tuổi 18-20 ngày (có kích thước khoảng 1- 2mm) là tương đối tốt. Sau 7-10 ngày trên bề mặt của mẫu nuôi cấy đã xuất hiện các khối mô sẹo dạng hạt nhỏ, xốp, có màu trắng ngà (hình 4F). Khối tế bào này sinh trưởng rất nhanh, sau vài lần cấy chuyển đã phát triển thành các phôi dạng hình cầu (hình 4C). Các tế bào phôi này được tách ra một cách dễ dàng, phát triển thành cây hoàn chỉnh (hình 4D). Tỷ lệ tạo mô sẹo và tái sinh cây đạt 54,4-83,3% và 17,7-26,6%. Ngược lại, với các phôi nuôi cấy ban đầu ở độ tuổi trên 20 ngày (có kích thước 3mm) thì khả năng tạo mô sẹo rất kém, tế bào phôi nuôi cấy phồng to lên, rễ xuất hiện (hình 4G). Một số mẫu nuôi cấy xuất hiện khối tế bào mô sẹo ở dạng màu trắng, cứng, chỉ rất ít trong số các khối mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây, tỷ lệ tạo cây rất thấp (5,5%). Với các phôi nuôi cấy có kích thước lớn (5mm) thì không có khả năng ạo mô sẹo và tái sinh cây.
Từ các kết quả trên cho phép chúng tôi đi đến kết luận rằng phôi có độ tuổi 18-20 ngày (kích thước khoảng 1,0-2,0 mm tương ứng) được nuôi cấy trên môi trường CN6 bổ sung 10mg/l AgNO3 sẽ cho hiệu quả tái sinh tốt hơn cả. Nhận xét này cũng tương tự như nghiên cứu trước đây của một số tác giả (Todorova và CS, 1998). KẾT LUẬN Trên cơ sở các kết quả thu được chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Việc bổ sung 1-20 mg/l AgNO3 vào môi trường tạo mô sẹo có tác dụng kích thích phản ứng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng nhập nội HR8. Tần số tạo mô sẹo và tái sinh cây đạt giá trị cao nhất ở nồng độ 10mg/l AgNO3 (90.5% và 26.6%). 2. Khả năng tái sinh cây dòng HR8 thay đổi không đáng kể khi nuôi cấy phôi non trên môi trường tạo mô sẹo có thành phần khoáng và vitamin khác nhau (MS và N6) có bổ sung
20 g/l sucrose, 2 mg/l 2,4-D, 100 mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline và 10 mg/l AgNO3. Sự có mặt của 10mg/l AgNO3 trong môi trường N6 đã có tác dụng kích thích khả năng tạo mô sẹo cũng như tái sinh chồi. 3. Phôi non sau thụ phấn 18-20 ngày (có kích thước tương ứng khoảng 1-2mm) có khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây tốt nhất. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Armstrong CL., and Green CE. (1985) Establishment and maintenance of friable, embryogenic maize callus and the involvement of L-proline. Planta 164: 207-214 2. Chu CC., Wang CC., Sun CS., Hsu C.,Yin KC., Chu CY., Bi FY. (1975) Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen source. Sci Sin 18: 659-668. 3. Do Nang Vinh (1989)
Factors affecting the formation and differentiation of embryogenic callus in cultured in vitro of immature maize embryos. Genetics and breeding, vol. 22, No. 1, Sofia. 4. Green CE., and Phillips RL. (1975) Plant regeneration from tissue culture of maize. Crop Science 15:417-421 5. Lowe K., Taylor DB., Rayan P., Paterdon KE. (1985) Plant regeneration via organogenesis and embryogenesis in the maize inbred line B73. Plant Science 41.2: 125-132. 6. Murashige, T. & Skoog, F.C. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaco tissue culture. Physiologia Plantarum 15:473-497. 7. Songstad DD., Armstrong CL., and Petersen WL. (1991) Silver nitrate increases type II callus production from immature embryos of maize inbred B73 and its derivatives. Plant Cell Reports 9: 699-702. 8. Songstad DD., Petersen WL. and Armstrong CL. (1992) Establishment of friable embryogenic (type II) callus from immature tassels of Zea mays (Poaceae). American Journal
of Botany 79 (7): 761-764. 9. Todorova L., Kruleva M., Krapchev B., Nedev T. (1998) Maize immature embryo culture. Maize Newsletter 72: 76 Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh 10. (2003) Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và tái sinh cây từ phôi non hai dòng ngô nhập nội HR8, HR9 trong điều kiện Việt nam. Tạp chí Nông nghiệp &PTNT, số 9, tr. 726-729. 11. Vain P., Flament P., and Soudain P. (1989) Role of ethylene in embryogenic callus initiation and regeneration in Zea mays L. Jour. of Plant Physiology 135: 537-540. 12. Vain P., Yean H., and Flament P. (1989) Enhancement of production and regeneration of embryogenic type II callus in Zea mays L. by AgNO3. Plant Cell Tissue and Organ Culture 18: 143-151.
SUMMARY The affect of medium component and embryo age on callus induction and plant regeneration from immature embryos of HR8 maize inbred line Pham Thi Ly Thu, Pham Minh Thoi, Le Huy Ham, Do Nang Vinh Institute of Agricultural Genetics The effective regeneration system plays important role in plant transformation. In general, maize (Zea mays L.) is recalcitral plant in regeneration, except some high regenerable lines as A188, H99, HiII… which have been used for transformation. Besides, plant regeneration capacity depends on genotype. It was also affected by medium component and the other factors. HR8 and HR9 are high regenerable lines were used in this study. There was no significant difference among callus induction rates for immature embryos cultured on MS or
N6 medium containing 20 g/l sucrose, 2 mg/l 2,4-D, 100 mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline, 10 mg/l AgNO3 and 0.2% phytagel. Incorporating 10 mg/l AgNO3 into phytagel solidified N6 medium supplemented 20 g/l sucrose, 2 mg/l 2,4-D, 100 mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline promoted callus production from cultured immature embryos of HR8 line. Under these conditions, approximately 90.5% of the xplants produced calli after 2 to 3 weeks incubation in the dark at 280C and plant regeneration frequency was 26.6%. The optimum embryo age for scutellar callus initiation was 18-20 days post-pollination (approximately 1-2 mm size respective). Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Đoàn Duy Thanh.