BÁO CÁO KHOA HỌC: "ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG AZOTOBACTER"

Chia sẻ: Linh Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:17

Thêm vào BST

Báo xấu

171
lượt xem 30
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Hiệu quả tốt của việc xử lý hạt bằng huyền dịch Azotobacter trước khi gieo trồng đã được ghi nhận từ lâu [8]. Sở dĩ như vậy là do Azotobacter có khả năng cố định nitơ, tiết vào môi trường các vitamin, axit amin cũng như các chất kích thích sinh trưởng thực vật (axit indol axetic, gibberelic) [5, 8].

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: BÁO CÁO KHOA HỌC: "ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG AZOTOBACTER"

ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG AZOTOBACTER Ngô Tự Thành , Vũ Thị Minh Đức Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Ngọc Quyên Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Việt Nam Hiệu quả tốt của việc xử lý hạt bằng huyền dịch Azotobacter trước khi gieo trồng đã được ghi nhận từ lâu [8]. Sở dĩ như vậy là do Azotobacter có khả năng cố định nitơ, tiết vào môi trường các vitamin, axit amin cũng như các chất kích thích sinh trưởng thực vật (axit indol axetic, gibberelic) [5, 8]. Gần đây một số tác giả [4, 6] đã phân lập, tinh chế và mô tả một số đặc tính của enzym từ Azotobacter sp. GD1 có khả năng phân giải 2,4, 6 – trichlorophenol (một hợp chất độc, gây kích thích, tác nhân gây ung thư, nguy hiểm đối với môi trường sống). Nghiên cứu này nhằm vào các đặc tính
sinh học của một số chủng Azotobacter mới phân lập, có so sánh với A. chroococcum AT19 nhập nội. I. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vi sinh vật: Azotobacter chroococcum AT19 nhập nội được sử dụng làm chủng đối chứng. Các chủng Azotobacter được phân lập từ đất của các vùng chuyên canh rau màu, trên môi trường Burk. Việc phân lập được tiến hành với hai lô đất: lô được giữ nguyên độ ẩm ban đầu và lô được hong khô ở nhiệt độ phòng rồi nghiền mịn. Xác định khả năng cố định nitơ Khả năng này được xác định bằng cách đo hoạt tính nitrogenza theo phương pháp khử axetylen, trên máy sắc ký khí PYE UNICAM series 204 chromatograp (Anh). Xác định axit indol-3- axetic (IAA) Tiến hành theo chỉ dẫn của [7]. Chủng được cấy vào bình
nón chứa 50 ml môi trường Burk có chứa tryptophan 0,1%, nuôi trên máy lắc 200 vòng/phút ở 300C trong 5 ngày. Li tâm loại bỏ tế bào. Lấy 2 ml dịch trong thêm vào ống nghiệm chứa sẵn 8ml thuốc thử Salkowski cải tiến, lắc đều. Để ở nhiệt độ phòng 30 phút. So mầu ở bước sóng 530 nm. Hàm lượng IAA được tính toán dựa theo đồ thị chuẩn. Xác định khả năng phân giải 2,4 dichlorophenoxyacetate (2,4D) Trước khi cấy vi khuẩn, 200 mg 2,4D được thêm vào 1 lít môi trường vô trùng có hàm lượng glucoza ở các mức 0, 5, 10, 15, 20 g/lít. Nuôi lắc 200 vòng/phút trong 5 ngày. Li tâm lạnh 6500 vòng/phút trong 15 phút. Dịch trong được lọc qua phiến lọc khuẩn 0,2 m vô trùng để loại hết tế bào còn sót lại. Đo phổ hấp phụ trên thiết bị tử ngoại – khả biến – hồng ngoại gần ( UV – VIS – NIR – Scanning spectrophotometer UV 3101 PC) (Shimadzu – Jp). Đối chứng là dịch nuôi vi khuẩn nhưng không bổ sung 2,4D và dịch môi trường có bổ sung 2,4D nhưng không cấy vi khuẩn. Hàm lượng 2,4D được tính theo đồ thị chuẩn đã xác
định trên máy ở bước sóng 283 nm [1]. Xác định ảnh hưởng của dịch nuôi Azotobacter spp. tới sự nảy mầm ở hạt ngô Hạt giống ngô tẻ P.11 và ngô lai ĐK.888 được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 4 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng nhiều lần. Ngâm hạt trong nước cất vô trùng từ 3 đến 4 giờ. Sau đó ủ hạt với dịch vi sinh vật đã li tâm loại bỏ tế bào (pha loãng tỷ lệ 5%) ở 300C trong 2 ngày. Thí nghiệm ở quy mô chậu vại với rau cải trắng Thí nghiệm được tiến hành trong 2 vụ đông xuân và hè thu. Mỗi chậu chứa 7kg đất. Nền phân bón 40 N: 80 P2O4: 40 K2Ô. Công thức thí nghiệm được bón thêm 107 tế bào Azotobacter /chậu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sau 45 ngày trồng, thu hoạch và đánh giá theo các chỉ tiêu: số lá/chậu, khối lượng tươi thân lá, chiều cao cây, % vật chất khô. Hàm lượng vitamin C, đường tổng số và hàm lượng NO3- được xác định tại Trung tâm kiểm tra và tiêu chuẩn
hoá chất lượng nông sản thuộc Viện sau thu hoạch. II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Phân lập Azotobacter spp. từ các mẫu đất Từ 13/38 mẫu đất hong khô và 6/12 mẫu đất giữ nguyên độ ẩm đã phát hiện sự có mặt của Azotobacter. Tuy nhiên các chủng thu nhận từ đất khô tồn tại tốt trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo. Các chủng phân lập từ đất ẩm dễ bị chết sau một thời gian dài bảo quản trong ống nghiệm và dễ bị nhầm lẫn với Azomonas (loại vi khuẩn cố định nitơ hình dạng giống Azotobacter nhưng không hình thành bào nang). Để tăng tính chọn lọc, việc hong khô đất ở nhiệt độ phòng trước khi phân lập Azotobacter là cần thiết. Việc phân tích pH cho thấy Azotobacter thường có mặt ở các mẫu có độ pH 5,15 - 7,75, chứ không ở các mẫu có pH thấp hơn. Theo một nghiên cứu trước đây [9] thì Azotobacter thường tồn tại trong đất có pH axit yếu đến kiềm.
2. Phản ứng khử axetylen – etylen (acetylene reduction assay – ARA) Trong số các chủng phân lập được, chúng tôi đã phát hiện 3 chủng có hoạt tính ARA cao hơn so với chủng đối chứng là A.chroococcum AT 19 từ 17,0 - 56,78 nM C2H4/ml/h, tương ứng với 13,7 – 45,49%. Kết quả được trình bầy ở bảng 1. 3. Khả năng tổng hợp axit indol – 3 – axetic (IAA) IAA là một hocmôn sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin. Nguồn nguyên liệu giàu IAA là các phần non và hạt của cây. Một số vi khuẩn cũng có khả năng tổng hợp loại auxin này. Chúng tôi phát hiện 3 chủng có hoạt tính ARA cao nói trên cũng có khả năng tổng hợp IAA. Đối chứng là chủng A. chroococcum AT. 19. Kết quả được trình bầy ở bảng 1.
Bảng 1. Hoạt tính ARA và khả năng tổng hợp IAA của 3 chủng phân lập 4. Sự phân giải 2,4 dichlorophenoxyaxetat (2,4D) 2,4D là một trong các chất trừ cỏ dại có cơ chế tác dụng gần giống hoạt động của auxin, như IAA. Dưới tác động của 2,4D, thực vật phát triển với tốc độ nhanh bất thường và bị chết. Lợi dụng đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật, nhiều người trồng rau đã phun 2,4D với liều lượng thấp khiến rau trở lên xanh non hấp dẫn người tiêu dùng. Tuy nhiên, cũng như các chất chlorophenoxy khác, 2,4D là chất độc đối với mắt (nhóm độc 1), độc qua đường ruột và ở dạng sữa (nhóm độc 3). Thêm vào đó thời gian tự phân huỷ của 2,4D kéo dài tới 3 tháng [2, 3, 10].
Tìm hiểu khả năng phân giải 2,4D thương phẩm của chủng Azotobacter sp. 86.2, chúng tôi nhận thấy với 2,4D (200mg/l) là nguồn cacbon duy nhất, chủng sinh trưởng rất yếu. Việc bổ sung 5, 10, 15, 20g/l glucoza tạo điều kiện tốt cho tế bào phát triển và lượng 2,4D còn sót lại tương ứng với lượng glucoza được bổ sung nói trên là: 179,5; 127,7; 145,8; 156,9mg/l. Như vậy chủng 86.2 có khả năng phân giải yếu 2,4D, và khi có bổ sung glucoza vào môi trường thì khả năng này tăng lên, đạt cực đại ở nồng độ glucoza 10g/l, sau đó giảm ở các lượng glucoza cao hơn. Phổ hấp phụ của 2,4D trong các mẫu nuôi cấy được quét trên thiết bị tử ngoại – khả biến – hồng ngoại gần được trình bầy ở hình 1. 5. Ảnh hưởng của dịch nuôi tới sự nẩy mầm của hạt ngô Sau khi ngâm ủ với dịch nuôi cấy pha loãng 5%, chúng tôi nhận thấy dịch nuôi các chủng 86.2; 76.6; 20.2 đều kích thích sự nảy mầm của hạt ngô (bảng 2). Với ngô lai ĐK.888 tỷ lệ nảy mầm tăng từ 8,57 – 14,29% so với đối
chứng ngâm ủ bằng nước. Tỷ lệ nảy mầm ở ngô tẻ P.11 tăng 5,71%. Đặc biệt chủng 86.2 làm tăng sự nảy mầm của hạt ngô lai ĐK. 888 lên 2,86% so với chủng A. chroococcum AT. 19 (chủng đối chứng). Kết quả được trình bầy ở bảng 2. Hình 1. Lượng 2,4D còn lại trong các mẫu nuôi cấy A. Mẫu đối chứng C. Mẫu bổ sung glucoza 10g/l
B. Mẫu bổ sung glucoza 5g/l D. Mẫu bổ sung glucoza 20g/l Bảng 2. Ảnh hưởng của dịch nuôi Azotobacter spp. đến sự nảy mầm của hạt ngô 6. Năng suất và chất lượng rau cải trắng được bón Azotobacter sp. Thí nghiệm được tiến hành ở quy mô chậu vại. Ngoài nền phân NPK, mỗi chậu được bón thêm 107 tế bào Azotobacter sp. Sau 45 ngày, năng suất cũng như chất lượng rau cải trắng được kiểm tra. Kết quả trình bầy ở bảng 3 và 4 dưới đây.
Bảng 3. Năng suất rau cải trắng khi được bón thêm Azotobacter sp. Kết quả trên cho thấy, ở công thức bón chủng 86.2, 76.6, 20.2, ở cả 2 vụ (xuân và hè thu) đều cho năng suất rau cao hơn công thức đối chứng (không bón vi sinh vật) và tương đương với công thức bón chủng AT.19 (chủng đối chứng). Chất lượng rau cải trắng được bón thêm Azotobacter sp. được trình bầy ở bảng 4.
Bảng 4. Chất lượng rau cải trắng khi được bón thêm Azotobacter sp. Theo kết quả phân tích trên đây của Trung tâm kiểm tra và tiêu chuẩn hoá chất lượng nông sản, Viện sau thu hoạch, chất lượng rau ở các công thức bón 86.2, 76.6, 20.2 đều rất tốt. Đặc biệt hàm lượng nitrat thấp hơn so với ở rau đối chứng. III. KẾT LUẬN 1. Từ 19/50 mẫu đất đã phát hiện thấy sự có mặt của Azotobacter. Phần lớn chúng có mặt ở các mẫu đất có pH 5,15 – 7,75.
2. Đã tuyển chọn được 3 chủng Azotobacter sp. 86.2, 76.6, 20.2 sinh trưởng ổn định, có hoạt tính ARA và tổng hợp IAA cao hơn chủng nhập nội A. chroococcum AT. 19. 3. Ba chủng này đều kích thích sự nảy mầm của hạt ngô lai ĐK.888 và ngô tẻ P.11 cũng như tăng năng suất và cải thiện chất lượng rau cải trắng. Đặc biệt chủng 86.2 có khả năng phân giải 2,4D, khả năng này được tăng cường khi chủng được nuôi trên glucoza ở nồng độ 10g/l, so với ở các nồng độ khác. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Cason R. and Reed L.W., 1977: Chemistry of two clay systems and three phenoxy herbicides. Proc. Okla. Acad. Sci., 57: 116 - 118. 2. Casarett and Doull's toxicology, 1999: The basic science of poisons, fifth edition, companion handbook. Klaasen C. D. and Watkins III J.B. (ed) McGraw - Hill: 561- 564. 3. Donnelly P.K., Entry J.A. and Crawford D.L, 1993: Degradation of Atrazine and 2,4-Dichlorophenoxyacetic
acid by Mycorrhizal Fungi at Three Nitrogen Concentrations In Vitro, Appl. Environ. Microbiol., 59: 2642 – 2647. 4. Latus M., Seitz H.J, Eberspacher J.V Lingen R., 1995:Purification and Characterization of Hydroxyquinol 1,2 - Dioxygenase from Azotobacter sp. Strain GP1 Appl. Environ. Microbiol., 61: 2453 – 2460. 5. Lee M., Breckenridge C. & Knowles R., 1970: Effect of some culture conditions on the production of indole-3- acetic acid and a gibberellin-like substance by Azotobacter vinelandii, Can.J. Microbiol.,16: 1225 – 1330. 6. Li D. Y., Eberspacher J., Wagner B., Kuntzer J. & Lingens F., 1991: Degradation of 2,4,6- trichlorophenol by Azotobacter sp.strain GP1. Appl. Environ. Microbiol. 57: 1920 - 1928. 7. Misra S. & Kaushik B.D., 1989: Proc. Indian natn. Sci. Acad., 55: 449 – 504. 8. Subba Rao N.S., 1980: Azotobacter inoculant. in: Biofertilizers in Agricultures, 2nd edition, Oxford & IBH. 9. Tchan Y.T. & Peter D., 1984: Genus Azotobacter. in: Bergey's manual of Systematic Bacteriology.1. Krieg N.R.
& Holt H.G (ed), Williams & Wilkins: 220 - 231. 10. Trần Quang Hùng, 1991: Thuốc trừ dịch hại bảo vệ cây trồng. Cục trồng trọt và bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp và CNTP: 142 - 128. SUMMARY Biological properties of some Azotobacter strains Ngo Tu Thanh, Vu Thi Minh Duc Hanoi University of Science Nguyen Ngoc Quyen, Nguyen Thu Ha Vietnam Agricultural Science Institute From 50 soil samples, 18 Azotobacter strains were isolated. All of them were isolated from soil samples having pH values from 5.15 to 7.75. In the soils having lower pH, Azotobacter was not found. Drying soil samples seemed to be a good improvement of the isolation: perhaps the selectivity of the soil was increased, a beneficial result to
Azotobacter, while Azotomonas was killed because of lacking in cysts. Among the isolated strains, 3 strains ( N˚ 86.2, 76.6 and 20.2) were selected because of their good properties: having activity of acetylene reduction assay(ARA) and activity of producing indole-3-acetic acid (IAA) – a plant hormone of auxin group. The first activity of these 3 strains was of 181.58, 141.90 and 167.55 nM C2H4/ml/h, respectively. The second one was of 7.57, 9.50 and 5.73 mg/ml, respectively. Both activities ARA and IAA of these 3 strains were greater than those of Azotobacter chroococcum AT 19 – a imported strain used in microbial inoculant production. The strain 86.2 was able to decompose the herbicide 2,4 dichlorophenoxy acetate (2,4D). It is interesting, although its activity was not very high. The bio-assay showed that the culture supernatant liquor of all three isolated strains stimulated the germination of
maize grains. The grain germination proportion of the maize race P11 was increased by 5.71%, and of the maize hybrid race DK888 (difficult to be germinated ) – by 8.57 to 14.11% in comparison with the control (grains incubated with water). On pot-scale, in both harvests (spring and summer), in all the soil formulae for inoculation with three above strains, the Chinese cabbage (Brassica chinensis) productivity was higher than that of control without inoculation. The quality of this vegetable was clearly improved: the contents of total sugar and vitamin C were higher than those of control, while the NO3- amount was decreased. With the above properties, all the 3 selected strains were considered suitable for the production of microbial inoculant. It is necessary to evaluate the effectiveness of the strains on vegetable yield on field-scale. Người thẩm định nội dung khoa học: GS.TS. Nguyễn Đình Quyến.