Báo cáo nghiên cứu nông nghiệp " Thay thế phân bón N hoá học bằng chế phẩm vi sinh cố định đạm cho cây họ đậu tại Việt nam để tăng thu nhập cho nông dân và bảo vệ môi trường "

Chia sẻ: Nguyen Nhi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:35

Thêm vào BST

Báo xấu

101
lượt xem 20
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong suốt giai đoạn thực hiện dự án, nhiều nghiên cứu R&D tập trung vào việc đánh giá các chủng rhizobium cho đậu tương và lạc cả trong phòng tăng trưởng của cây và ngoài đồng ruộng. Hai chủng sản xuất thương mại của Úc là chủng CB1809 (đậu tương) và NC92 (lạc) đã bộc lộ có hiệu quả cố định đạm cao hơn các chủng địap phương Việt nam ở hầu như tất cả 20 điểm thí nghiệm đã phân tích số liệu. Do đó, khi cây nhiễm với CB1809 hoặc NC92, trọng lượng nốt sần, năng suất sinh khối và năng suất hạt...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo nghiên cứu nông nghiệp " Thay thế phân bón N hoá học bằng chế phẩm vi sinh cố định đạm cho cây họ đậu tại Việt nam để tăng thu nhập cho nông dân và bảo vệ môi trường "

Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Hợp tác vì sự Phát triển Nông nghiệp và Nông thôn Báo cáo Tiến độ Báo cáo sáu tháng lần 2 013/06VIE Thay thế phân bón N hoá học bằng chế phẩm vi sinh cố định đạm cho cây họ đậu tại Việt nam để tăng thu nhập cho nông dân và bảo vệ môi trường July 2008
Mục lục 1. Thông tin cơ quan thực hiện _____________________________________________ 1 2. Tóm tắt dự án ___________________________________ Error! Bookmark not defined. 3. Tóm tắt thực hiện dự án ________________________________________________ 2 4. Giới thiệu và nền tảng dự án_____________________________________________ 3 5. Tiến độ ______________________________________________________________ 6 Các điểm thực hiện nổi bật ______________________________________________ 7 5.1 Lợi ích đối với nông hộ ________________________________________________ 22 5.2 Xây dựng năng lực _____________________________________________________ 23 5.3 Xuất bản ______________________________________________________________ 24 5.4 Quản lý dự án _________________________________________________________ 24 5.5 6. Báo cáo về các vấn đề liên quan môi trường, giới và xã hội ___________________ 24 Môi trường ____________________________________________________________ 24 6.1 Giới và các vấn đề xã hội _______________________________________________ 24 6.2 7. Các vấn đề thực hiện và tính ổn định ____________________________________ 23 Các khó khăn, tồn tại __________________________________________________ 23 7.1 Lựa chọn giải pháp ____________________________________________________ 23 7.2 Tính ổn định __________________________________________________________ 25 7.3 8. Các bước thực hiện tiếp theo____________________________________________ 25 9. Kết luận ____________________________________________________________ 25 10. Công bố _____________________________________ Error! Bookmark not defined. 2
1. Thông tin các cơ quan tham gia dự án Thay thế phân bón N hóa học bằng chế phẩm vi Tên dự án: sinh cố định đạm cho cây họ đậu tại Việt nam để tăng thu nhập cho nông dân và cải thiện môi trường Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu (OPI) Cơ quan Việt nam chủ trì dự án Ths. Trần Yên Thảo Chủ nhiệm dự án Việt nam NSW Department of Primary Industries Cơ quan Úc Đại học Sydney Dr David Herridge Nhân sự phía Úc Dr Roz Deaker Bà Elizabeth Hartley Ông Greg Gemell Tháng 3/2007 Thời gian bắt đầu Tháng 3/2009 Thời gian hòan tất (đầu tiên) Như trên Thời gian hòan tất (sửa đổi) 9/2007 – 3/2008 Giai đoạn Cán bộ liên lạc Tại Úc: trưởng nhóm Dr David Herridge Telephone: 02 67631143 Tên: Nhà Khoa học cao cấp 02 67631222 Chức vụ: Fax: Organisation Sở các nghành Công nghiệp david.herridge@dpi.nsw.gov.au Email: cơ bản NSW Tại Úc: cán bộ quản lý Mr Graham Denney 02 63913219 Tên: Telephone: Chức vụ: Quản lý Tài chính Fax: 02 63913327 Organisation Sở các nghành Công graham.denney@dpi.nsw.gov.au Email: nghiệp cơ bản NSW Tại Việt nam Ths. Trần Yên Thảo 08 9143024 – Tên: Telephone: 8297336 Cán bộ nghiên cứu 08 8243528 Chúc vụ: Fax: Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có yenthao@ioop.org.vn Cơ quan Email: dầu (OPI) yenthao@hcm.fpt.vn yenthao9@yahoo.com 1
2. Tóm tắt dự án Nông dân Việt nam hiện nay bón phân đạm cho cây họ đậu như đậu tương và lạc mà không nhiễm chế phẩm vi sinh cố định đạm rhizobia. Thay thế phân đạm hoá học bằng chế phẩm vi sinh sẽ tiết kiệm cho nông dân Việt nam khoảng 50-60 triệu đô la Úc/năm dùng vào đầu tư phân N hoá học, và cùng lúc, thúc đẩy mở rộng diện tích sản xuất cây họ đậu. Cũng có các lợi ích về môi trường khi sử dụng chế phẩm này. Dự án này có mục tiêu là tăng sản xuất chế phẩm vi sinh cố định đạm rhizobium thông qua tăng cường năng lực sản xuất, thực hiện chương trình bảo đảm chất lượng sản phẩm ở mức độ quốc gia (QA) và tăng cường nghiên cứu và phát triển R&D. Tham gia trong dự án này là Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu (OPI), Viện Khoa học Nông nghiệp Miền nam (IAS) và Viện Quốc gia Nông hoá Thổ nhưỡng (NISF; hiện nay đổi tên là Viện Nông hoá Thổ nhưỡng (SFI)). Cơ quan Úc tham gia trong dự án là Sở Các nghành Công nghiệp cơ bản NSW và Trường Đại học Sydney. Sử dụng chế phẩm vi sinh cố định đạm bởi nông dân sẽ tăng lên thông qua sự phát triển và thực hiện một chương trình khuyến nông hiệu quả và chương trình đào tạo ho cán bộ nghiên cứu, cán bộ khuyến nông của MARD và nông dân. Lợi ích của chế phẩm và cố định đạm sinh học sẽ được trình diễn trên đồng ruộng và thảo luận trong các hội thảo, hội nghị đầu bờ và các ấn bản khuyến nông. Để chắc chắn tính ổn định của sản xuất và sử dụng, dự án này có sự tham gia của các công ty tư nhân trong việc marketing và “sản xuất thử” với mục đích là các công ty này sẽ mở rộng sản xuất và việc cung cấp chế phẩm sẽ tăng dần lên cùng lúc khi công nghệ và thị trường phát triển. 3. Tóm tắt thực hiện dự án Nâng cao sản xuất chế phẩm vi sinh cố định đạm chất lượng cao và quản lý chất lượng sản phẩm Trong suốt giai đoạn thực hiện dự án, nhiều nghiên cứu R&D tập trung vào việc đánh giá các chủng rhizobium cho đậu tương và lạc cả trong phòng tăng trưởng của cây và ngoài đồng ruộng. Hai chủng sản xuất thương mại của Úc là chủng CB1809 (đậu tương) và NC92 (lạc) đã bộc lộ có hiệu quả cố định đạm cao hơn các chủng địap phương Việt nam ở hầu như tất cả 20 điểm thí nghiệm đã phân tích số liệu. Do đó, khi cây nhiễm với CB1809 hoặc NC92, trọng lượng nốt sần, năng suất sinh khối và năng suất hạt đều tăng so với các chủng địa phương của Việt nam ở 80%, 85% và 90% điểm thí nghiệm theo thứ tự. Tuy nhiên mức độ của sự tăng này thì khác nhau và phụ thuộc vào điểm thí nghiệm và các chủng địa phương Việt nam khác nhau. Hai chủng của Úc tăng nốt sần, sinh khối và năng suất hạt đậu tương và lạc trung bình là 62%, 34% và 27%, so với lô không nhiễm và 26%, 11% và 10% so với các chủng địa phương Việt nam. R&D về công nghệ sản xuất chế phẩm thì tập trung vào các chất thêm vào cả trong dịch sinh khối và trong than bùn, nghiên cứu khả năng tồn tại của rhizobium trên nền chất mang than bùn, nhiệt độ và ảnh hưởng của pH đối với sinh trưởng và tồn tại của rhizobium. Khảo sát ảnh hưởng của dịch sinh khối pha loãng trước khi nhiễm vào than bùn như là một phương pháp để tăng dịch sinh khối. Vấn đề thuần chủng của giống sản xuất và bảo quản các chủng đã được thảo luận tại Hội thảo Giai đoạn của Dự án vào tháng hai năm 2008, đưa ra gợi ý cần thực hiện cho việc duy 2
trì các chủng giống sản xuất. Các vấn đề khác đã được đặt ra và thảo luận là các thực hiện để mà hoàn thiện chất mang thông qua việc chỉnh pH, độ ẩm và khử trùng than bùn. Dự án chưa thực hiện đào tạo trong thời gian này nhưng chương trình đào tạo vào thời gian tháng 8- tháng 9 năm 2008 và muộn hơn tại Úc đã được thảo luận tại Hội thảo Giai đoạn của dự án tháng 2/2008. Khuyến nông và đào tạo nông dân và cán bộ khuyến nông Công tác khuyến nông và đào tạo nông dân và cán bộ khuyến nông là một trọng tâm của dự án và là phương cách để đạt dược sự chấp nhận áp dụng chế phẩm tại Việt nam. Chương trình khuyến nông-đào tạo đã được xây dựng trên nền tảng các thí nghiệm có thiết kế đơn giản, thực hiện tại nhiều điểm tại rộng khắp các vùng sản xuất cây họ đậu tại Việt nam. Nông dân và các cán bộ khuyến nông tham gia vào thí nghiệm ở tất cả các giai đoạn, từ thiết kế thí nghiệm cho đến gieo trồng, lấy mẫu, thu hoạch và xử lý kết quả. Các Trung tâm Khuyến nông của MARD đã có vai trò lớn trong các hoạt động khuyến nông của dự án. Các dữ liệu của các điểm thí nghiệm trình diễn sẽ được sử dụng cho việc đưa ra mô hình kinh tế cho sản xuất và sử dụng chế phẩm vi sinh cố định đạm tại Việt nam. Thêm vào đó, các khóa học sẽ được tổ chức cho nông dân, cán bộ khuyến nông và các cán bộ nghiên cứu về phương pháp sử dụng chế phẩm, hiệu quả kinh tế cũng như lợi ích về môi trường của việc sử dụng chế phẩm. Có 28 điểm trình diễn đã được thực hiện tại 9 tỉnh. Ở thời điểm này đã có số liệu của 15 điểm. Các điểm trình diễn thường có 2 nghiệm thức: nhiễm và không nhiễm. Trung bình nhiễm chế phẩm cho cây đậu tương và lạc đã tăng thu nhập cho nông dân trung bình là 3.5000.000VNĐ/ha. Lợi ích kinh tế thì thay đổi tùy theo các điểm khác nhau. Nông dân đã được mời đến các điểm trình diễn ít nhất là một lần. Ở nhiều diểm ví dụ như ở DakNong và DakLak nông dân đã đến các điểm trình diển từ 2 đến 3 lần tại lúc lấy mẫu nốt sần, thu hoạch sinh khối và thu hoạch hạt. Tại mỗi điểm trình diễn, ít nhất có 20 nông dân và cán bộ khuyến nông đến dự hội thảo đầu bờ đánh giá thí nghiệm (600 – 800 người đến điểm trình diễn). Họ quan sát sự phát triển của đậu tương và lạc, so sánh sức khỏe và sự tăng trưởng của cây ở hai nghiệm thức. Họ nhổ cây, quan sát nốt sần và học cách làm sao để nhận diện các nốt sần hiệu quả với màu hồng đỏ phía trong và các nốt sần trắng không có hiệu quả cố định đạm. Họ đánh giá hiệu quả của việc áp dụng chế phẩm bằng cách lấy mẫu cây đậu tương và lạc, cân sinh khối và hạt. Họ cũng được cung cấp tài liệu khuyến nông. Cán bộ nghiên cứu và cán bộ khuyến nông cũng giải thích sự hoạt động của rhizobium và các điều kiện để sự áp dụng thành công. Nông dân rất thích thú tìm hiểu về cố định đạm sinh học. Các câu hỏi thường được đặt ra bởi nông dân là: - Giá của chế phẩm là bao nhiêu? - Sử dụng bao nhiêu cho 1000m2 hay cho 1ha? - Nơi nào có thể mua được chế phẩm? - Chế phẩm có lợi ích nào khác hơn việc thay thế phân urea (N)? - Có thể dùng chung chế phẩm với các chất bảo vệ thực vật? - Có thể dùng chế phẩm cho các cây khác không? - Có phải chế phẩm sẽ bị ảnh hưởng xấu bởi các điều kiện thời tiết khắc nghiệt như là mưa lớn, nóng trong lúc nhiễm vào hạt và trong quá trình cây tăng trưởng? - Có thể dùng chế phẩm chung với urea (phân bón N)? 3
Và các đòi hỏi chính: - Cung cấp chế phẩnm cho nông dân để họ tự thử nghiệm trên đồng ruộng của họ. - Trợ giúp về kỹ thuật sử dụng cho nông dân Tham gia của công ty tư nhân vào sản xuất, phân phối và marketing chế phẩm Sự lựa chọn cẩn thận các đối tác tư nhân cho sản xuất thương mại chế phẩm vi sinh cho cây họ đậu thì rất quan trọng để chắc chắn về sự cung cấp ổn định chế phẩm chất lượng cao tại Việt nam. Sau khi thăm quan các công ty tư nhân vào tháng 2/2008 và sự rút lui của Fitohoocmon khỏi dự án, chúng tôi có kết luận ban đầu là triển vọng sản xuất chế phẩm với chất lượng cao bởi các công ty tư nhân tại Việt nam trong tương lai gần là thấp và sản xuất với số lương lớn cần được thực hiện bởi các viện nghiên cứu. Tuy nhiên sau khi liên lạc với công ty Thiên Sinh (Komix) mà công ty này được trang bị tốt hơn để sản xuất chế phẩm và một kế hoạch đã được phát triển cho chuyển giao công nghệ từ các viện nghiên cứu đến công ty này. Sự tham quan vào tháng 2/2008 này đã hé mở một khả năng tốt để sản xuất chế phẩm. Công ty này có điều kiện thuận lợi cho các áp dụng công nghiệp vi sinh. Chuyển giao công nghệ từ các viện nghiên cứu đến công ty này đã được thảo luận và một kế hoạch đã được xác định. Công ty này cũng đã đồng ý thực hiện công tác khuyến nông thông qua hệ thống rộng khắp của họ. 4. Giới thiệu và nền tảng dự án Mục tiêu dự án và các kết quả dự kiến Nhà nước Việt nam (Bộ Công nghiệp, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) đã có kế hoạch thực hiện tăng diện tích trồng các cây họ đậu từ diện tích hiện tại là 780.000 ha lên đến hơn 1.000.000 ha vào năm 2010, đặc biệt đối với cây đậu tương và cây lạc tại vùng Đồng bằng sông Cửu long, Duyên hải miền Trung và các vùng đất cao Bắc, Trung và Nam. Cây họ đậu sử dụng làm thực phẩm, dầu ăn và bánh dầu cho gia súc, và trồng luân canh với lúa (ở Đồng bằng sông Cửu long), xen canh với sắn, mía, cao su, cây ăn quả và bắp trên các vùng đất cao, trồng như cây phủ đất trên đất cát ven biển. Dự án nhỏ ACIAR LWR2/98/27 (Tăng năng suất và cố định đạm của đậu tương, lạc và đậu xanh thông qua sử dụng chế phẩm vi sinh Rhizobium) đã chỉ ra rằng sản xuất cây họ đậu tại Việt nam hiện tại phụ thuộc vào phân N hóa học đắt tiền mà không áp dụng chế phẩm vi sinh rẻ tiền. Thay thế phân N hóa học bằng chế phẩm vi sinh cố định đạm, nông dân Việt nam sẽ tiết kiệm được khoảng 50-60 triêu đô la Úc hàng năm, và cùng lúc sẽ thúc đẩy mở rộng sản xuất cây họ đậu. Hơn nữa, còn có lợi cho môi trường khi thay thế phân đạm khoáng bằng N được tạo ra bởi chính cây họ đậu. Hiệu quả kinh tế đã được tổng kết chi tiết trong báo cáo kết thúc dự án LWR2/98/27. Trong 23 thí nghiệm ở Miền nam, lợi ích kinh tế mang lại là tăng lợi nhuận lên đến 760 đô la Úc/ha (trung bình tăng hơn 100 đô la Úc/ha) do tăng năng suất và giảm sử dụng phân bón N hóa học. Chế phẩm vi sinh này đã tăng năng suất hạt lạc trồng trên đất acid Đồng bằng sông Cửu long trung bình là 42% so với không bón phân N và 28% so với bón phân N. Đối với 13 thí nghiệm của đậu tương năng suất tăng trung bình là 19% so với không bón phân, và năng suất tăng 40-50% trong một số thí nghiệm. Năng suất của các lô thí nghiệm sử dụng chế phẩm vi sinh và bón phân N hầu như không khác biệt. Mức độ lợi ích kinh tế thì thay đổi phụ thuộc vào loại cây, vùng đất và lịch sử trồng. Không có trường hợp nào giảm năng suất khi thay phân đạm khoáng N bằng chế phẩm vi sinh cố định đạm. Các nhà khoa học và quản lý đã kết luận trong hội nghị tổng kết dự án LWR2/98/27 rằng nông dân Việt nam nên thay thế phân đạm khoáng bằng chế phẩm vi sinh cố định đạm. Tuy 4
nhiên, để điều này trở thành hiện thực thì sản phẩm vi sinh này cần phải có sẵn trên thị trường. Năng lực sản xuất hiện tại chỉ nhỏ hơn 5000 túi/năm, và cần phải tăng lên khoảng 500.000 túi/năm để đáp ứng nhu cầu. Hơn nữa chế phẩm hiện tại có chất lượng kém (dự án LWR2/98/27) và cần thiết phải cải thiện. Thời gian bảo quản, phân phối và marketing là các vấn đề cũng cần quan tâm. Ngoài ra, sự hiểu biết của nông dân và ngay cả cán bộ khuyến nông về lợi ích của chế phẩm cũng như cách sử dụng rất giới hạn. Giới hạn về năng lực thì thấy rất rõ ở cả mức độ quốc gia và cơ quan nghiên cứu. Thiếu hụt chính ở cấp độ quốc gia là thiếu một chương trình hợp tác, tập trung. Ở mức độ cơ quan thì không đủ năng lực để sản xuất chế phẩm này ở qui mô trung bình, bảo đảm chất lượng (QA) kém cũng như cần tăng cường năng lực R&D và đào tạo. Dự án này mong muốn được chú trọng vào các vấn đề sản xuất, chất lượng, phân phối, marketing và đào tạo nông dân. Sự tham gia phối hợp của công ty tư nhân trong dự án về cả sản xuất và marketing sẽ bảo đảm sự áp dụng công nghệ sản xuất vào thực tế. Mục tiêu của dự án là để: 1. Tăng cường sản xuất chế phẩm vi sinh cố định đạm chất lượng cao cho đậu tương, lạc và các cây họ đậu khác tại Việt nam thông qua tăng cường năng lực sản xuất (con người và trang thiết bị) ở các viện nghiên cứu tham gia dự án, thực hiện bảo đảm chất lượng sản phẩm (QA), và tăng cường R&D. 2. Tăng sự quan tâm và sử dụng chế phẩm vi sinh cố định đạm của nông dân thông qua việc phát triển và thực hiện một chương trình khuyến nông và đào tạo hiệu quả về chế phẩm cho cán bộ nghiên cứu, cán bộ khuyến nông của MARD và nông dân bằng việc thực hiện thí nghiệm trình diễn đồng ruộng, tập huấn, hội nghị đầu bờ và xuất bản, phân phối tài liệu khuyến nông. 3. Bảo đảm tính ứng dụng thực tế của dự án bằng sự phối hợp tham gia vào hoạt động dự án của các doanh nghiệp tư nhân trong ‘sản xuất pilot” các chế phẩm vi sinh cố định đạm, với mục tiêu là các công ty này sẽ mở rộng sản xuất cùng lúc khi công nghệ và thị trường phát triển. Dự án này phù hợp với Mục tiêu chiến lược 2 “Cải thiện năng suất và kết nối với thị trường cho vùng nông thôn nghèo ở Đồng bằng sông Cửu long và vùng Duyên hải miền Trung”, phù hợp với Mục tiêu 2.1 “Tăng năng suất ở nông thôn”, và sử dụng Chiến lược 1 “Tăng năng suất và cạnh tranh của các hệ thống nông nghiệp” Cách tiếp cận và phương pháp thực hiện Chiến lược của dụ án là để tăng cường sản xuất chế phẩm vi sinh cố định đạm cho cây họ đậu, quản lý chất lượng, phân phối, tiếp cận thị trường và đào tạo nông dân thông qua họat động hợp tác của các cơ quan. Nó liên quan đến cả hai, các viện nghiên cứu của nhà nước – Viện Nghiên cứu Dầu và cây có dầu (OPI), Viện Khoa học Nông nghiệp Miền nam (IAS) và Viện Nghiên cứu Nông hóa Thổ nhưỡng (ISF) – cũng như các công ty tư nhân (Công ty Cổ phần Phân bón Fitohoocmon, Công ty Cổ phần Phân bón Sinh hóa Củ Chi và Công ty Phân bón Humix). Các công ty tư nhân sẽ bước đầu tham gia trong việc tiếp cận thị trường và phân phối sản phẩm và được hướng dẫn về kỹ thuật và cho lời khuyên để mà cải thiện và mở rộng khả năng sản xuất của họ. Dự tính rằng đơn vị tư nhân sẽ đảm nhận việc sản xuất và công việc QA sẽ do các cơ quan nhà nước đảm nhận. Sự tham gia của bộ phận tư nhân trong cả sản xuất và marketing sẽ bảo đảm tính hiện thực của ý tưởng này. Tăng cường sản xuất chế phẩm vi sinh cố định đạm có chất lượng cao và QA Các chủng giống cho sản xuất tại Việt nam: chọn lựa từ bộ giống hiện tại của Việt nam và/hoặc từ bộ giống của ALIRU (Úc), Niftal (Đại học Hawai), Đại học Suranaree (Thái lan). 5
Sẽ thảo luận để lựa chọn các giống pjù hợp nhất cho sản xuất chế phẩm thông qua một chương trình nghiên cứu và phát triển. Bảo quản giống cho sản xuất: phát triển và thực hiện phương pháp duy trì hoạt tính lâu dài và nhận diện các chủng sản xuất để bảo đảm tính ổn định chất lượng của chế phẩm. Trong quá trình thực hiện dự án sẽ quyết định cơ quan/các cơ quan sẽ chịu trách nhiệm duy trì và bảo đảm hoạt tính của bộ giống phục vụ cho sản xuất chế phẩm. Cơ quan này sẽ được trang bị thêm các vật liệu, hóa chất cần thiết để tiếp tục cung cấp giống gốc cho sản xuất sau này. Công nghệ sản xuất: phát triển công nghệ sản xuất ở qui mô trung bình tại Việt nam dựa trên kinh nghiệm sản xuất tại Thái Lan và Úc, về: • Cải tiến công thức môi trường lên men, thực hiện các thí nghiệm để duy trì tính vô trùng và kỹ thuật chiết dịch nuôi cấy vào chất mang. • Thử nghiệm các dạng chế phẩm thích hợp (than bùn, hạt, dịch thể) để đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng, dễ dàng sử dụng, thuận lợi cho cung cấp và vận chuyển. Hiệu quả kinh tế sẽ được xác định bằng cách xác định hiệu quả của chúng trong phòng thí nghiệm và đồng ruộng. • Lựa chọn các chủng cho sản xuất: các chủng rhizobia khác nhau sẽ được thử nghiệm về khả năng tồn tại của các chủng trong chế phẩm và trong suốt quá trình bảo quản, vận chuyển cho tới khi ứng dụng nhiễm vào cây. Bảo đảm chất lượng sản phẩm (QA): Phương pháp bảo đảm chất lượng sản phẩm của Úc sẽ được áp dụng trong thời gian ban đầu như một mô hình. Trên cơ sở này, các bước tiến hành QA, đào tạo và soạn tài liệu phù hơp với điều kiện sản xuất tại Việt nam sẽ được tiến hành bởi các nhà khoa học Úc và Việt nam tham gia trong dự án. Một cơ quan tham gia dự án được trang bị sẽ chịu trách nhiệm thực hiện tiếp tục việc đảm bảo chất lượng các chế phâm sản xuất tại Việt nam sau khi dự án kết thúc. Đào tạo về sản xuất và bảo đảm chất lượng sản phẩm: Các cán bộ nghiên cứu của Việt nam sẽ được đào tạo tại Việt nam bởi các chuyên gia Úc và được đào tạo tại trường Đại học Công nghệ Suranaree (Thái lan) về sản xuất, QA và cách quản lý cũng như R&D về Rhizobium. Khuyến nông và đào tạo nông dân và cán bộ khuyến nông Chương trình khuyến nông và đào tạo cho nông dân và cán bộ khuyến nông sẽ được thực hiện trên cơ sở các thí nghiệm đồng ruộng đơn giản (về các nghiệm thức thí nghiệm), trên các vùng sản xuất khác nhau (Đồng bằng sông Cửu long, Duyên hải miền trung, các vùng đất cao Bắc bộ, Trung bộ và Đông Nam bộ). Nông dân sẽ tham gia ở mọi góc độ, từ lựa chọn nghiệm thức thí nghiệm đến gieo trồng, lấy mầu, thu hoạch và đọc kết quả. Hy vọng rằng Trung tâm Khuyên nông Quốc gia sẽ đóng góp vai trò lớn trong các hoạt động khuyến nông của dự án này. Trung tâm và OPI đang thảo luận để tiến tới một thoả thuận hợp tác. Các số liệu thu được từ các thí nghiệm trình diễn đồng ruộng sẽ dùng để xây dựng một mô hình kinh tế về sản xuất và sử dụng chế phẩm vi sinh cố định đạm cho cây họ đậu tại Việt nam. Bên cạnh đó, các tập huấn sẽ được tổ chức cho nông dân, cán bộ khuyến nông và cán bộ nghiên cứu về phương pháp sử dụng, hiệu quả kinh tế và hiệu quả đối với môi trường của việc sử dụng chế phẩm. Chương trình khuyến nông – đào tạo này sẽ được thực hiện bởi các cán bộ Việt nam trong sự kết hợp với đối tác phía Úc. Các chuyên gia Úc sẽ trợ giúp để tập hợp, chọn lọc, soạn thảo các tài liệu khuyến nông và chuyển giao cho Việt nam. 6
Sự tham gia của đơn vị tư nhân vào sản xuất, phân phối và tiếp cận thị trường Hai (có thể là 3) công ty Việt nam chuyên sản xuất và kinh doanh phân bón sẽ tham gia trong dự án, đó là Công ty Cổ phần Phân bón Fitohoocmon và Công ty Cổ phần Phân bón Củ Chi (và Humix). Chúng tôi dự đoán rằng thị trường chế phẩm sẽ lớn dần lên trong suốt quá trình thực hiện dự án so với khởi điểm thấp hiện nay. Doanh nghiệp tư nhân sẽ từng bước tham gia sản xuất cùng lúc khi công nghệ phát triển và thị trường mở rộng. Các công ty này sẽ tham gia marketing và phân phối sản phẩm. Đào tạo cũng sẽ mở ra cho các cán bộ của công ty. Dự án thông qua ISF sẽ trợ giúp kỹ thuật trực tiếp cho Fitohoocmon để giải quyết các khó khăn về kỹ thuật, tăng năng lực sản xuất cũng như cải thiện chất lượng sản phẩm. 5. Tiến độ thực hiện 5.1 Các hoạt động mấu chốt 5.1.1 Tăng sản xuất chế phẩm vi sinh cố định đạm chất lượng cao và QA Nội dung trọng tâm là chọn lọc các chủng rhizobium, duy trì hoạt tính của chúng, công nghệ sản xuất chế phẩm (công nghệ lên men), QA của quá trình sản xuất và sản phẩm, đào tạo công nghệ sản xuất và QA. 5.1.1.1 Các chủng rhizobium Hiệu quả của các chủng địa phương Việt nam cho đậu tương và lạc đã được so sánh với các chủng thương mại của Úc là CB1809 (đậu tương) và NC92 (lạc). Thí nghiệm trong chậu đã cho thấy hạt đậu tương nhiễm với chủng CB1809 khi phát triển trong môi trường cát vô trùng đã cho nhiều nốt sần hơn so sánh với 3 chủng địa phương (bảng 1). Khả năng của các chủng khác nhau sinh trưởng trên điều kiện lên men khác nhau cũng đã được thử nghiệm tại IFS (xem phần 5.1.1.3). Bảng 1: Sự hình thành nốt sần của CB1809 và của các chủng địa phương trên đậu tương Số thứ Chủng Số nốt sần/cây tự Tổng số Trên rễ chính Trên rễ phụ nốt sần 1 Đối chứng không nhiễm 0 0 0 2 CB1809 50 25 25 3 Chủng địa phương SL1 32 13 19 4 Chủng địa phương SL2 39 13 26 5 Chủng địa phương SL3 32 11 22 Thí nghiệm đồng ruộng cũng đã được thực hiện trong năm 2007-08 để đánh giá hiệu quả của các chủng và ảnh hưởng của sự nhiễm chế phẩm đến nốt sần, sinh khối và năng suất hạt. Có tất cả 29 thí nghiệm đã được tiến hành trong 10 tỉnh thành; 23 thí nghiệm đã thu hoạch; 6 thí nghiệm sẽ thu hoạch trong tháng 7/2008 (2 ở Bình Thuận, 1 ở Trà Vinh và 3 ở Sơn La). Tại mỗi điểm thí nghiệm, có ít nhất 3 chủng rhizobium được đánh giá (CB1809 hoặc NC9 và 2 chủng địa phương) cho cây đậu tương và lạc. Các nghiệm thức thí nghiệm là đối chứng không nhiễm và không bón phân đạm, nghiệm thức đối chứng không nhiễm và bón phân đạm, nghiệm thức nhiễm với CB1809 hoặc NC92 và các nghiệm thức với các chủng 7
rhizobium địa phương. Tóm tắt các thí nghiệm đồng ruộng trong thời gian 2007–08 và ảnh hưởng của nhiễm của CB1809 hoặc NC92 đến nốt sần, sinh khối và năng suất hạt được chỉ ra trong phụ lục 1. Hiệu quả thấp của sự nhiễm được xác định là tăng so với đối chứng nhỏ hơn 20%, từ 20% đến 40% là hiệu quả trung bình và lớn hơn 40% là hiệu quả cao. Đồ thị 1,2 và 3 tóm tắt hiệu quả nhiễm với chủng CB1809 (đậu tương) hoặc NC92 (lạc) về nốt sần, sinh khối và năng suất hạt, theo thứ tự. Hiệu quả phân bố từ thấp tới cao tuỳ thuộc vào vùng thí nghiệm. Đồ thị 1. Hiệ u quả nhiễ m rhizobium - nốt sầ n 200 150 %Hiệu quả 100 50 0 0 5 10 15 20 -50 Điể m thí nghiệ m Hiệu quả của nhiễm chế phẩm về nốt sần cao ở 70% số điểm thí nghiệm (đồ thị 1). Ở các điểm này nốt sần tăng 43–166%. Nốt sần tăng trung bình ở một điểm (34%) và nốt sần tăng thấp ở 25% số điểm thí nghiệm với trung bình tăng 10%. Nốt sần tăng trung bình khi sử dụng các chủng có hiệu quả cao của Úc là 62%. Đồ thị 2. Hiệ u qu ả n hiễ m rhizobium - Sinh kh ố i 70 60 50 % Hiệu quả 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 25 Điể m thí nghiệ m Đối với sinh khối, có sự tăng cao sinh khối do nhiễm (44-60%) tại 50% số điểm thí nghiệm, tăng trung bình (22-37%) tại 30% điểm thí nghiệm và tăng ít (5-19%) tại 20% điểm thí nghiệm (đồ thị 2). Tăng năng suất do sử dụng chế phẩm thì thấp hơn so với tăng sinh khối và nốt sần. (đồ thị 3). Năng suất tăng cao (40-68%) ở 20 điểm thí nghiệm. Hiệu quả nhiễm trung bình về năng suất (20-37%) ở 55% điểm thí nghiệm và hiệu quả nhiễm thấp (4-19%) ở 25% 8
điểm thí nghiệm. Khi sử dụng các chủng của Úc năng suất sinh khối và năng suất hạt tăng trung bình là 34% và 27% theo thứ tự. Đồ th ị 3. Hiệ u qu ả nhiễ m Rhizobium - Năng su ất h ạt 80 70 60 % Hiệu quả 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 Điể m thí nghiệ m Có sự khác biệt lớn về sự hình thành nốt sần, năng suất sinh khối và năng suất hạt ở các chủng rhizobium khác nhau. Các chủng sản xuất thương mại của Úc CB1809 (đậu tương) và NC92 (lạc) có hiệu quả cố định đạm cao hơn các chủng địa phương Việt nam ở hầu hết tất cả các điểm thí nghiệm (Phụ lục 2). Phân tích số liệu cho thấy khi cây được nhiễm với CB1809 hoặc NC92, trọng lượng nốt sần, sinh khối và năng suất hạt tăng tương đối so với các chủng địa phương ở 85%, 85% và 90% các điểm thí nghiệm theo thứ tự. Tuy nhiên mức độ tăng thì phụ thuộc vào các điểm và các chủng khác nhau. Đồ thị 4, 5 và 6 cho thấy sự tăng về nốt sần, sinh khối và năng suất của đậu tương và lạc khi nhiễm với CB1809 và NC92 so sánh với các chủng địa phương. Đồ thị 4. Sự tă ng của nốt sầ n khi nhiễ m CB1809 và NC92 so với chủng đị a phương 80 Local strain1 70 60 Local strain 2 50 % tăng 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 Điể m thí nghiệ m Hai chủng của Úc, CB1809 và NC92, tăng nốt sần của đậu tương và lạc trung bình 26%, so với các chủng địa phương Việt nam (Đồ thị 4). Năng suất sinh khối tăng trung bình 11% (Đồ thị 5) và năng suất hạt tăng trung bình 10% (Đồ thị 6) so với các chủng địa phương Đối với mỗi chỉ tiêu có sự thay đổi lớn phụ thuộc vào điểm thí nghiệm. Đối với nốt sần, mức độ là 0-70%, đối với năng suất sinh khối là 0-30% và đối với năng suất hạt là 0-32%. 9
Đồ thị 5. Sự tă ng của sinh khối khi nhiễ m Cb1809 và NC92 so với các chủng đị a phương 35 Local strain1 30 Local strain2 25 % tăng 20 15 10 5 0 0 5 10 15 20 Điể m thí nghiệ m Đồ thị 6. Sự tă ng nă ng suấ t khi nhiễ m CB1809 và NC92 so với các chủng đị a phương 35 Local strain1 30 Local strain2 25 20 % tăng 15 10 5 0 0 5 10 15 20 Điể m thí nghiệ m 5.1.1.2 Duy trì hoạt tính Rhizobium Cần thiết phải chắc chắn rằng các chủng dùng trong sản xuất cần phải được duy trì về tính đúng về chủng loại, không bị tạp nhiễm và có hoạt tính cố định đạm sinh học. Tổng kết về QA của các chủng sản xuất ở mỗi viện (OPI, IAS, SFI) trong suốt chuyến thăm làm việc tại Việt nam vào tháng 2 năm 2008, cho thấy rằng cần phải đào tạo hơn nữa về nhân diện và duy trì các chủng thuần chủng dùng cho sản xuất. Sự thiếu hụt hiểu biết sâu về nhận diện hình thái của các chủng rhizobium có thể đã là kết quả trong việc sản xuất chế phẩm ở một số mẻ có chất lượng chưa cao. Do đó đã có gợi ý cần thực hiện cho nghiên cứu trong tương lai (phòng thí nghiệm, phòng sinh trưởng cây và ngoài đồng ruộng). Chỉ sử dụng các chủng thương mại của Úc trong các thí nghiệm. Đây là các chủng mà đã cho hiệu quả cao trong hầu hết các thí nghiệm đồng ruộng thực hiện trong 2007/2008. Bởi vì nghi ngờ tính thuần chủng của các mẫu giống NC92 và CB1809 được dùng trước kia cho nghiên cứu, quyết định rằng tất cả các mẫu giống đang có của các chủng này phải bị loại bỏ. OPI đã được chọn như là nơi quản lý chủng giống sản xuất chế phẩm vi sinh cố định đạm 10
tại Việt nam. ALIRU sẽ cung cấp lại cho OPI các giống trong ống nghiệm và trong ống đông khô của 2 chủng CB1809 và NC92. Chúng tôi đã quyết định: • Khi nhận được các giống từ ALIRU, cán bộ nghiên cứu của OPI sẽ kiểm tra tính thuần chủng của các chủng bằng cách cấy ria trên mội trường YMA và CRYMA. Một khi sự thuần chủng của các chủng đã được xác nhận, các chủng sẽ được cấy chuyền và các phiên bản sẽ được gởi đến các viện khác. • Khi OPI chuyển giống đến các viện khác, chúng phải được đi kèm với hình ảnh của giống chỉ ra hình ảnh khuẩn lạc trên đĩa petri. Kết hợp với sự nhận diện các chủng, mỗi viện sẽ cấy ria các chủng mà họ dùng cho lên men sinh khối starter, chụp ảnh hình thái khuẩn lạc và gởi chúng đến các viện khác bao gồm cả ALIRU. Kiểm tra chéo giữa các viện nghiên cứu như vậy sẽ chắc chắn rằng chủng giống dùng trong sản xuất chế phẩm là đúng. 5.1.1.3 Công nghệ sản xuất chế phẩm và thí nghiệm Các thí nghiệm về sản xuất chế phẩm đã được thực hiện tại SFI, IAS và OPI. Ở mỗi viện sản xuất chế phẩm dựa trên các nguồn than bùn khác nhau và xác định khả năng tồn tại theo thời gian. Tại IAS xác định khả năng tồn tại của rhizobia trên chất mang than bùn bổ sung phân trùn và bụi xơ dừa do đó đã thay đổi khả năng giữ nước của than bùn. Cả OPI và IAS đều khảo sát ảnh hưởng của các chất thêm vào khác nhau trong công thức dịch thể, một công nghệ mà có thể giảm giá thành sản phẩm do tiêu tốn cho khử trùng chất mang than bùn, trong khi đó khảo sát khả năng sử dụng các thành phần môi trường rẻ hơn thực hiện tại SFI. SFI sản xuất chế phẩm sử dụng than bùn khử trùng sử dụng 3 chủng rhizobium địa phương cho đậu tương và 2 chủng cho lạc. Chủng CB1809 (cho đậu tương) và NC92 (cho lạc) cũng được khảo sát như là các đối chứng. Giống được nhân trong môi trường lỏng trong các bình erlen sau đó chuyển qua các bình lên men. Dịch sinh khối lỏng được kiểm tra sau khi sinh trưởng trong erlen và bình lên men. Than bùn được thu thập, xay, trộn với vôi và khử trùng bằng autoclave trong các túi. Than bùn ban đầu có pH khoảng 3-4 sau đó tăng lên 6.8 đến 7.0 sau khi bổ sung vôi. Sau khi khử trùng than bùn được được pha loãng trong nước vô trùng đến 10-6 và cấy trên môi trường glucose-peptone để kiểm tra tạp nhiễm. Các túi sau đó được dán lại và tiêm vào đó dịch sinh khối theo tỷ lệ là 1 dịch và 4 than bùn. Ẩm độ ban đầu của than bùn nhỏ hơn 10% và tăng lên đến 40% sau khi tiêm nhiễm. Chế phẩm được ủ trong 1 tuần sau đó bảo quản ở nhiệt độ phòng. Số lượng rhizobia được xác định tại các thời điểm cho tới 6 tháng, ngay sau khi sản xuất, sau 2 tuần, 1, 2, 3, và sau 6 tháng (bảng 2). Số lượng tế bào ban đầu cho rhizobium đậu tương, CB1809, và các chủng địa phương SL1, SL2, SL3 là 5 x 109, 2.3 x 109, 1.8 x 109 và 2.1 x 109 theo thứ tự và giảm đến 2.7 x 108, 2.5 x 108, 1.2 x 108 và 1.3 x 108 sau 6 tháng. Tại thời điểm 3 tháng thì số lượng tế bào sống rhizobium vẫn ở mức trên 109 và trong khoảng 1.1 đến 2.2 x 109. Tuy nhiên, tất cả số lượng tế bào này được xác định trưc tiếp thông qua xác định khuẩn lạc phát triển trên môi trường dinh dưỡng CRYMA mà không xác định số lượng rhizobium thông qua nhiễm chế phẩm vào hạt và xác định gián tiếp qua sự hình thành nốt sần để mà chắc chắn sự hiện diện của rhizobium. Số lượng rhizobium đếm được trên CRYMA có thể sẽ vượt hơn số lượng có thực bỏi vì rất khó phân biệt khuẩn lạc của rhizobium và khuẩn lạc của các vi khuẩn tạp nhiễm. Mặc dù sự táp nhiễnm trong than bùn là thấp sau khi khử trùng 11
nhưng các vi sinh vật tạp nhiễm có thể phát triển rất nhanh chóng sau đó phụ thuộc vào ẩm độ và sự cạnh tranh với rhizobia. Bảng 2. Số lượng của rhizobia trong than bùn trong suốt quá trình bảo quản Các chủng rhizobium Số lượng của rhizobia (CFU/g) Innitial 2 weeks 1 month 2 month 3 month 6 month 9 9 9 9 9 8 CB1809 5.0 x 10 6.2 x 10 5.6 x 10 3.5 x 10 2.2 x 10 2.7 x 10 2.3 x 109 4.8 x 109 2.9 x 109 3.0 x 109 1.3 x 109 2.5 x 108 Chủng địa phương SL1 1.8 x 109 3.4 x 109 2.2 x 109 2.0 x 109 1.3 x 109 1.2 x 108 Chủng địa phương SL2 9 9 9 9 9 8 Chủng địa phương SL3 2.1 x 10 3.2 x 10 3.0 x 10 1.8 x 10 1.1 x 10 1.3 x 10 Thành phần môi trường cho sinh trưởng rhizobium khi sản xuất lớn có thể là đắt tiền. SFI nghiên cứu sự thay thế yeast extract của phòng thí nghiệm và nước chiết nấm men và nước chiết đậu tương. Tất cả các chủng rhizobium phát triển số lượng đến 109 cfu/ml chỉ ra rằng môi trường lên men có thể được thay thế bằng cách sử dụng các chất rẻ tiền hơn (bảng 3). Bảng 3. Số lượng rhizobia sinh trưởng trên các môi trường khác nhau Chủng Môi trường YEM Nước chiết đậu tương Nước chiết nấm men 9 9 9 CB1809 6.1 x 10 4.2 x 10 2.8 x 10 9 9 9 SL1 3.1 x 10 1.6 x 10 3.4 x 10 9 8 9 SL2 6.6 x 10 2.7 x 10 5.6 x 10 3.8 x 109 2.6 x 108 5.2 x 109 SL3 So sánh sức chịu đựng với nhiệt độ và pH đã cho thấy ít có sự khác nhau về sinh trưởng của các chủng rhizobium khác nhau trong môi trường dinh dưỡng ở các nhiệt độ và pH nuôi cấy khác nhau và sinh trưởng tốt nhất của các chủng là ở nhiệt độ 30oC. Số lượng tế bào thấp ở nhiệt độ 25oC và thấp nhất ở 37oC. Không có tế bào nào được xác định ở nhiệt độ >45oC (Bảng 4). Sự khác nhau đã được quan sát về tăng trưởng cao hơn 10 lần của các chủng Việt nam hơn các chủng của Úc trong môi trường acid chỉ ra rằng tính chịu đựng acid có thể là một thuận lợi trong điều kiện đất chua (Bảng 5). Bảng 4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của các chủng Nhiệt độ (0C) Sự tăng trưởng CB1809 SL1 SL2 SL3 25 ++ +++ + + 30 +++ +++ +++ +++ 37 ++ ++ ++ ++ >45 - - - - 4 5 6 7 - không tăng trưởng; + tăng trưởng yếu:10 – 10 CFU/ml; ++ tăng trưởng trung bình: 10 – 10 CFU/ml 8 9 +++ tăng trưởng tốt 10 – 10 CFU/ml Bảng 5. Ảnh hưởng của pH đối với tăng trưởng của rhizobium pH Sự tăng trưởng của các chủng CB1809 SL1 SL2 SL3 4.0 - - - - 4.5 - - - - 5.0 - - - - 12
5.5 + ++ ++ ++ 6.0 ++ ++ ++ ++ 6.5 +++ +++ +++ +++ 7.0 +++ +++ +++ +++ 7.5 ++ ++ ++ ++ 8.0 - - - - 8.5 - - - - 4 5 6 7 - không tăng trưởng; + tăng trưởng yếu:10 – 10 CFU/ml; ++ tăng trưởng trung bình: 10 – 10 CFU/ml +++ tăng trưởng tốt 108 – 109 CFU/ml Mục tiêu thí nghiệm tại IAS là đẩ xác định các yếu tố ảnh hưởng đến số lượng sống của các chủng rhizobium trong chế phẩm. Số lượng tế bào rhizobium trong chế phẩm cao hơn sẽ có khả năng cạnh tranh tốt hơn với các quần thể rhizobium sống tự do trong đất. Giá thành của chế phẩm cũng sẽ giảm bởi vì chỉ cần dùng số lượng chế phẩm nhỏ hơn. IAS so sánh chế phẩm dùng các chủng của Úc NC92 (lạc) và CB1809 (đậu tương). Các thí nghiệm thực hiện để xác định ảnh hưởng của pha loãng dịch sinh khối đến số lượng cuối cùng của của rhizobium trong cơ chất than bùn trộn lẫn với phân trùn và bụi xơ dừa sau khi ủ (Bảng 6). Sự tăng trưởng trong hỗn hợp của dịch sinh khối pha loãng dùng môi trường lỏng yeast extract manitol (YMB, cho ra các nồng độ sau cùng là 0.1%, 1%, 10% và 30%) được so sánh với dịch sinh khối không pha loãng có số tế bào là 109cfu/mL. Hỗn hợp than bùn này (70 g) được trộn với 38 mL dịch sinh khối. Sau 4 tuần sinh trưởng, kết quả chỉ ra rằng tiêm lượng dịch không pha loãng thì cần thiết để thu được số lượng tế bào tối đa 6.18 x 107 đối với NC92 và 5.85 x 108 đối với CB1809 trong hỗn hợp than bùn. Tỷ lệ tế bào sống của CB1809 được tiêm nhiễm ở 0.1%, 1 % dịch sinh khối pha loãng với dịch không pha loãng cho thấy không có sinh trưởng xảy ra trong hỗn hợp than bùn. Điều này có thể là do sự hiện diện của vi sinh vật tạp nhiễm ( 106 /g hỗn hợp than bùn). Tạp nhiễm có thể tăng lên khi pha loãng với môi trường YMB trước khi tiêm nhiễm vào hỗn hợp than bùn. Tất cả các lần xác định số lượng rhizobium đều sử dụng môi trường yeast mannitol agar có hoặc không có Congo red (YMA và CRYMA) và hình thái tế bào của các khuẩn lạc được quan sát sau khi nhuộm gram dưới kính hiển vi. Bảng 6. Số lượng tế bào rhizobium ở các nộng độ pha loãng dịch sinh khối khác nhau Số tế bào (CFU/g) Số thứ tự Chủng rhizobium Dịch sinh khối pha loãng (%) 5.23 x 105 1 NC 92 0,1 8.78 x 105 2 NC 92 1,0 4.25 x 106 3 NC 92 10 6.90 x 106 4 NC 92 30 6.30 x 107 5 NC 92 100 4.68 x 105 6 CB 1809 0,1 9.95 x 105 7 CB 1809 1,0 4.73 x 106 8 CB 1809 10 6.18 x 107 9 CB 1809 30 5.85 x 108 10 CB 1809 100 13
Nhiều nhà sản xuất đã pha loãng dịch sinh khối trước khi tiêm dịch vào than bùn như là một cách để nhân nhiều lên dịch sinh khối và giảm đòi hỏi sử dụng các nồi lên men thể tích lớn. Số lượng lớn dịch sinh khối dùng trong sản xuất thì mắc tiền hơn và rất dễ bị tạp nhiễm trong quá trình sản xuất. Do đó, lượng nhỏ sinh khối dùng trong sản xuất thì rất hiệu quả đặc biệt đối với các nước đang phát triển. Ở Thái lan, chế phẩm được sản xuất bằng cách pha loãng dịch sinh khối đến 1/1000. Gợi ý cần thực hiện cho các thí nghiệm của IAS là cần lập lại thí nghiệm với lưu ý đặc biệt đến khử trùng than bùn và pha loãng dịch sinh khối trong nước. Tại SFI than bùn thấp hơn 10% ẩm độ trước khi khử trùng nhưng ở IAS ẩm độ chỉ đạt 1% Điều này đã được nhận diện như là một vấn đề tiềm tàng mà nó dẫn đến kến quả khử trùng cơ chất không hiệu quả. Nên điều chỉnh ẩm độ của than bùn 20% trước khi khử trùng. Tuy nhiên không phải tất cả than bùn và hỗn hợp than bùn có khả năng giữ 20% ẩm độ do đó cần thiết lựa chọn than bùn có khả năng giữ nước cao hơn và/hoặc sử dụng các chất thêm vào (như là bụi xơ dừa). Trong thí nghiệm khác của IAS, sự tồn tại của rhizobium được xác định sau khi tiêm nhiễm dịch sinh khối vào hỗn hợp của phân trùn và bụi xơ dừa (Bảng 7).Số lượng tế bào sống của rhizobium trong than bùn, than bùn (70%) trộn với phân trùn (30%), than bùn (40%) trộn với phân trùn (30%) và bụi xơ dừa (30%) đã được xác định sau 1 tháng phát triển trong chất mang. Kết quả cho thấy là cả phân trùn và bụi xơ dừa đều làm tăng khả năng giữ nước của than bùn. Chỉ có 15ml dịch sinh khối được thêm vào 70 than bùn trong lúc đó 35 ml được thêm vào hỗn hợp than bùn, phân trùn và bụi xơ dừa (không đo trực tiếp ẩm độ). Cũng quan sát thấy rằng bụi xơ dừa hấp thu nước mạnh nhưng cũng mất nước rất dễ dàng. Sự tồn tại của rhizobium được cải thiện khi than bùn được trộn cùng với phân trùn và bụi xơ dừa. Mặc dù chất mang được tiêm nhiễm với các thể tích dịch sinh khối khác nhau số lượng rhizobium sau 1 tháng không phản ánh tỷ lệ nhiễm ở lúc tiêm nhiễm. Tuy nhiên, số lượng tế bào tạp nhiễm trong hỗn hợp than bùn thì cao hơn trong than bùn một mình và bởi vì số lượng tế bào được đếm bởi phương pháp đếm khuẩn lạc nên kết quả không chắc chắn về số lượng rhizobium dẫn đến có thể bởi sự nhầm lẫn khi nhân diện khuẩn lạc. Gợi ý cần thực hiện tiếp theo thí nghiệm về chất mang này là cần điều chỉnh chất mang đến các ẩm độ khác nhau sử dụng hướng dẫn trình bày dưới đây của báo cáo này. Tất cả các thí nghiệm cần thiết phải có sự khẳng định về sự hiên diện của rhizobium sử dụng phương pháp nhiễn lên cây cũng trình bày dưới đây. Bảng 7. Số lượng tế bào rhizobium trong các chất mang khác nhau sau 1 tháng Số lượng tế bào rhizobium (CFU/g) STT Chủng rhizobium Chất mang 2.7 x 107 1 NC 92 Than bùn 6 2 CB 1809 Than bùn 5.4 x 10 8.3 x 108 3 NC 92 Than bùn + phân trùn 8 4 CB 1809 Than bùn + phân trùn 5.4 x 10 9 5 NC 92 Than bùn + phân trùn + Bụi xơ dừa 2.5 x 10 6.8 x 108 6 CB 1809 Than bùn + phân trùn + Bụi xơ dừa Chế phẩm dạng lỏng ở IAS được chuẩn bị bằng sự thêm vào PVA (0.5%), gum Arabic (0.17%) và sodium alginate (0.5%) vào dịch thể lỏng như là chất kết dính cho sự tồn tại tốt hơn của rhizobium trên hạt. Sau 1 tháng số lượng tế bào cao nhất trong PVA (4.15 x 108 /ml đối với NC92 và 6.88 x 107 /ml đối với CB1809) và Na alginate (1.04 x 108 /ml cho NC92 14
and 5.38 x 107 /ml cho CB1809) và thấp hơn trong gum Arabic (4.42 x 106 /ml - NC92 và 8.73 x 107 /ml - CB1809) (Bảng 8) Table 8. Ảnh hưởng của các chất thêm vào khác nhau đến số lượng tế bào rhizobium Chủng STT rhizobium Chất thêm vào Lượng chất thêm vào Số tế bào (CFU/ml) 4.15 x 108 1 NC 92 PVA 0,5 7 2 CB 1809 PVA 0,5 6.88 x 10 6 3 NC 92 Gum Arabic 0,17 4.42 x 10 8.73 x 107 4 CB 1809 Gum Arabic 0,17 1.04 x 108 5 NC 92 Sodium Aginate 0,5 7 6 CB 1809 Sodium Aginate 0,5 5.38 x 10 5.1.1.4 Công nghệ sản xuất chế phẩm – các vấn đề nẩy sinh trong hội thảo giai đoạn của dự án vào, OPI, Tp Hồ Chí Minh Tham dự trong hội thảo này có các thành viên của tất cả các viện tham gia trong dự án – OPI, IAS và SFI (Việt nam) và Sở các nghành cơ bản NSW và Trường Đại học Sydney. Tại hội thảo các viện trình bày các báo cáo về nghiên cứu 2007-2008. Kết quả chính của hội thảo này và các thảo luận theo sau đó đã xác định rõ ràng kế hoạch nghiên cứu R&D cho sản xuất chế phẩm, và các yêu cầu về phương pháp để thực hiện các thí nghiệm. Phần tiếp theo này trình bày tóm tắt các gợi ý đó liên quan đến thiết kế thí nghiệm và bước tiến hành để thử nghiệm các chế phẩm rhizobium trên cơ chất than bùn. Một số gợi ý là để cải thiện thiết kế thí nghiệm đã được trình bày tại hội thảo dự án tại OPI vào ngày 18 và 19 tháng 2/2008. Các chủng mới của CB1809 và NC92 sẽ được cung cấp bởi ALIRU đến OPI. Các chủng này sau đó được phân phối cho tất cả các nghiên cứu năm 2008. Than bùn khử trùng của Úc sẽ được cung cấp cho các viện để dùng như là đối chứng so sánh chất lượng với than bùn Việt nam. Tất cả các thí nghiệm trình diễn sẽ được thiết kế sử dụng chế phẩm của Úc với CB1809 và NC92. Thông tin chung về than bùn Chất lượng chế phẩm tại Úc đã được cải thiện sau các thất bại bằng cách nghiên cứu thông qua 5 yếu tố chính ảnh hưởng đến sự tồn tại của rhizobium trên chất mang than bùn. (Roughley and Vincent, 1967). Đầu tiên, nguồn gốc than bùn thì quan trọng. Sự tồn tại của rhizobium clover, lucerne và cowpea thay đổi tuỳ thuộc vào vùng, chiều sâu của mỏ than bùn. Than bùn thử nghiệm thì khác nhau về màu sắc và cấu trúc nhưng không có giải thích nào của các tác giả về nguyên nhân dẫn đến sự tồn tại khác nhau của rhizobium trên than bùn. Yếu tố thứ hai là pH, tính acid của than bùn cần được trung hoà bằng calcium hoặc magnesium carbonate. Thứ ba, khử trùng than bùn, sử dụng chiếu xạ tia gamma, được cho là quan trọng đặc biệt đối với sự tăng trưởng và phát triển đối với các rhizobium sinh trưởng chậm bởi vì cho phép chúng vượt qua sự cạnh tranh với các vi sinh vật tạp nhiễm phát triển nhanh. Yếu tố thứ tư là nếu rhizobium được trộn vào trong than bùn mà trước đó than bùn đã được sấy khô ở 100oC, chúng sẽ tồn tại kém bởi vì do cả nguyên nhân là nâng nhiệt cơ chất ướt và vì các chất ức chế tạo thành từ sự sử lý nhiệt. Yếu tố cuối cùng là ẩm độ, 40 đến 50% cho thấy là phù hợp cho sinh trưởng và tồn tại của rất nhiều chủng rhizobium trên chất mang 15
than bùn. Các phát hiện sau này, sự tích luỹ của muối trong các mỏ than bùn gây ra bởi các mùa khô đã ảnh hưởng âm tính đấn sự tồn tại của rhizobium (Steinborn and Roughley, 1975). Có thể có các yếu tố ảnh hưởng khác nữa đến chất lượng than bùn sử dụng cho sản xuất chế phẩm do ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tồn tại của các chủng rhizobium. Điều chỉnh pH than bùn Điều chỉnh pH cần phải được làm rất cẩn thận, tính đến thời gian cho sự cân bằng. Phàn ứng giữa vôi và H+ trong than bùn sẽ phụ thuộc vào kích thước của cả than bùn và vôi. Kích cỡ này càng nhỏ thì phản ứng càng nhanh. Ẩm độ than bùn cũng là yếu tố quan trọng đối với phản ứng này. Lượng vôi đòi hỏi để làm thay đổi pH sẽ phụ thuộc vào lượng chất hữu cơ và sét cũng như khả năng đệm của than bùn. Sau khi trộn than bùn và vôi cần để phản ứng trong vài tuần trước khi đo pH. Củng có thể cần thiết đo pH trong thời gian dài hơn. Vôi nông nghiệp mịn (Aglime, calcium carbonat, cần loại các chất không phải vôi, qua rây 150 micro meter) là loại tốt nhất sử dụng để điều chỉnh pH. Vôi xây dựng thì quá mạnh và các loại khác thì lại quá yếu. Khả năng giữ nước của than bùn và tối ưu hoá ẩm độ Kích cỡ hạt, chất hữu cơ và hàm lượng sét sẽ đóng vai trò quan trọng trong khả năng giữ nước. Khả năng giữ nước càng cao thì lượng dịch sinh khối càng có thể đưa vào nhiều trong than bùn. Thiết kế thí nghiệm để thử nghiệm khả năng tồn tại của rhizobium ở các ẩn độ khác nhau được trình bày chi tiết như sau: Nâng cao ẩm độ than bùn hay là hỗn hợp các chất mang (than bùn và các chất mang khác) cần được xác định ở cả IAS và SF, sử dụng một chủng rhizobium để giảm thiểu số lượng mẫu và treatment như trình bày trong bảng 9 dưới đây. Trước khi trộn dịch sinh khối với than bùn, than bùn phải được khử trùng trước ở ẩm độ 20%. Hiệu quả của khử trùng cần được xác định bằng cách tiêm vào than bùn dịch nuôi cấy và xác định mức độ nhiễm theo thời gian trong vòng 1 tháng. Pha loãng khi xác định tạp nhiễm và dủng môi trường glucose peptone agar. Ghi nhận ở các mức pha loãng một khi tạp nhiễm xuất hiện tại các mức độ pha loãng đó. Bảng 9. Các nghiệm thức để xác định ẩm độ phù hợp cho chế phẩm rhizobium Dịch sinh khối thêm Thể tích của dịch sinh Thể tích của nước vô Ẩm độ (%) vào (ml) khối (mL) trùng (ml) 40 29.5 29.5 0 50 52.5 29.5 23 60 87.5 29.5 58 Tính toán này dựa vào 70 g than bùn khô sau khi điều chỉnh đến 20% ẩm độ cho sự khử trùng. Cân bằng [1] được dùng cho tính toán ẩm độ của 70 g than bùn khô. Cân bằng giống như vậy cũng sẽ được sử dụng cho bất cứ số lượng than bùn nào nhưng nếu than bùn ẩm thì khối lượng than bùn khô cần được tính toán trước x y = [1] 70 + x 100 Trong đó x là lượng dịch thêm vào và y là ẩm độ cuối cùng (ví dụ là 50). Để điều chỉnh 70 g than bùn khô đến 20% cho sự khử trùng thì 17.5 ml nước cần thêm vào 16
Ví dụ: Bao nhiêu dịch nghĩa là sinh khối lỏng được thêm vào 150g than bùn với 20% ẩm độ để có được ẩm độ là 35%? a) Khối lượng của than bùn khô 20 x 150 g = 30 g 100 150 g – 30 g = 120 g b) Ẩm độ thêm vào cho than bùn khô x 35 = 120 + x 100 x = 0.35(120 + x) x = 42 + 0.35 x x − 0.35 x = 42 0.65 x = 42 x = 64.6 64.6 g ẩm cần thêm vào 120 g than bùn khô để thu được 35%. Nếu than bùn đã có ẩm độ là 30 g thì 64.6 g – 30 g = 34.6 g cần thêm vào cho 150 g than bùn. Thí nghiệm thử nghiệm hiệu quả của hỗn hợp than bùn, phân trùn và bụi xơ dừa cần có thiết kế như trình bày trong Bảng 10. Tất cả các chất mang cần phải được mang về ẩm độ 20% trước khi khử trùng và hiệu quả của khử trùng cũng phải được xác định như trong mô tả phần 2.1. Số lượng tế bào sống/g trong chất mang cần được xác định ở 1 tuần và 1 tháng. Phương pháp cần được xác định bởi đếm khuẩn lạc và MPN bằng cách nhiễm 2 cây cho pha mỗi nồng độ loãng 10-5 và 10-6 (nghĩa là 4 chất mang x 3 ẩm độ x 3 lập lại). Bảng 10. Thiết kế thí nghiệm xác định hiệu quả của các chất mang khác nhau Ẩm độ (%) Chất mang 40 50 60 Than bùn Cần có 3 lần lập lại cho mỗi treatment. Số lượng tế bào đếm Than bùn + phân trùn sau 1 tuần và 1 tháng. Phương pháp đếm là đếm khuẩn lạc và xác định bằng nhiễm vào cây. Hai cây cần được nhiễm Than bùn + bụi xơ dừa -5 -6 cho mỗi pha loãng 10 và 10 . Than bùn + phân trùn + bụi xơ dừa Đếm số lượng rhizobium và xác định rhizobium trong các chế phẩm than bùn như sau: pha loãng chế phẩm trong nước vô trùng (10g chế phẩm trong 90 ml nước), sau đó chuẩn bị các dịch pha loãng cho đến 10-6. Cấy trải trên đĩa petri có môi trường CRYMA và đếm số khuẩn lạc phát triển đồng thời nhiễm vào cây ở hai nồng độ pha loãng 10-5 và 10-6, lập lại hai lần cho mỗi nồng độ. Quan sát sự hình thành nốt sần. 17
Carrier suspended in sterile water (10 g in 90 mL, 10-1 dilution) Inoculate 2 plants from each of the Prepare dilution series to 10-6 10-5 and 10-6 dilutions and check for nodules to confirm colonies are rhizobia on the corresponding 10 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 plates Spread 0.1 mL on the surface of duplicate CRYMA plates and count colonies after growth taking note of diltuions with contamination Hình 7. Xác định số lượng và rhizobium sống trong chế phẩm trên nền than bùn tạp nhiễm Nguồn than bùn Ngoài đặc trưng của nguồn than bùn là độ măn, sét, chất hữu cơ hay nhiễm với các chất hoá học hay là một số các yếu tố chưa xác định khác sẽ ảnh hưởng đến chất lượng than bùn cho sản xuất chế phẩm. Than bùn từ các nguồn khác nhau cần điều chỉnh đến cùng kích cỡ hạt và độ ẩm như nhau (nếu có thể được). Không thể chọn than bùn dựa vào màu sắc và kết cấu bề ngoài của nó. Khử trùng than bùn Ở Úc, than bùn được đóng bao và sau đó khử trùng bằng tia gamma. Hiệu quả của việc khử trùng phụ thuộc sự sắp xếp các túi khi nó được chiếu cobalt 60 rods, độ ẩm của than bùn trong quá trình khử trùng và mức độ nhiễm. Nếu than bùn bị ướt trong thời gian dài sau khi khai thác thì có khả năng phát triển nhiều vi sinh vật tạp nhiễm. Một số vi sinh vật này có khả năng kháng với nhiệt và sự chiếu xạ và do đó trở thành trở ngại cho sản xuất. Khử trùng bằng tia gamma thì tăng đáng kể giá thành sản phẩm. Khử trùng bằng nhiệt có thể là phương pháp thay thế. Tuy nhiên có thể phương pháp này có thể tích luỹ một số chất độc. Nếu điều này xảy ra thì khử trùng theo chế độ nhiệt độ thấp và lập lại vài lần có thể là một giải pháp. Độ ẩm than bùn trước khi khử trùng nên là 20%. Lên men trong chất mang cứng Để xác định số lượng tế bào tối thiểu đòi hỏi cho phát triển tối đa trong than bùn thì sinh khối lỏng cần được pha loảng với nước vô trùng để thu được pha loãng 1:10, 1:100 và 1:1000. Lập lại 3 lần (3 túi cho 1 nghiệm thức), dùng dịch sinh khối không pha loãng làm đối chứng. Lượng dịch cho vào các túi than bùn thì phụ thuộc vào ẩm độ thích hợp và tính toán sao cho đã có 20% ẩm độ cho vào trước khi khử trùng. Số lượng tế bào sống cần được xác định sau 1 18