zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Luận Văn - Báo Cáo

» Y khoa - Dược

Báo cáo thực tập tốt nghiệp: Một số kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán các bệnh

Chia sẻ: Ngo Quoc Nguyen | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:45

Báo xấu

679
lượt xem 38
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Báo cáo thực tập tốt nghiệp: Một số kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán các bệnh được nghiên cứu với các nội dung: Tổng quan tài liệu, vật liệu và phương pháp, kết quả và biện luận, kết luận. Để hiểu rõ hơn mời các bạn tham khảo tài liệu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo thực tập tốt nghiệp: Một số kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán các bệnh

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH…………………………………………………………………...3 CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………………………………6 LỜI MỞ ÐẦU…………………………………………………………………………7 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………..8 1.1.Giới thiệu về khoa xét nghiệm di truyền y học bệnh viện Từ Dũ………………….8 1.2.Tổng quan về các phương pháp…………………………………………………...11 1.2.1.Karyotype……………………………………………………………………….11 1.2.2.Sinh học phân tử………………………………………………………………...14 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP…………………………………...22 2.1. Karyotype.………………………………………………………………………..22 2.1.1.Vật liệu ………………………………………………………………………….22 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị……………………………………………………………..22 2.1.3.Hóa chất…………………………………………………………………………22 2.1.4.Quy trình………………………………………………………………………...22 2.2.Sinh học phân tử…………………………………………………………………27 2.2.1.QF-PCR………………………………………………………………………...28 2.2.2.FISH……………………………………………………………………………31 2.2.3.Real time PCR…………………………………………………………………33 GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 1 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN………………………………………37 3.1. Karyotype………………………………………………………………………...37 3.2.Sinh học phân tử…………………………………………………………………..38 3.2.1. QF PCR………………………………………………………………………...38 3.2.2. FISH……………………………………………………………………………41 3.2.3.Realtime PCR chẩn đoán HPV………………………………………………….42 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN…………………………………………………………...44 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………...45 GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 2 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ DANH MỤC HÌNH Hình 1. Các giai đoạn của 1 phản ứng PCR……………………………………17 Hình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nền……………………………………………………………………………..20 Hình 3. FISH chẩn đoán nhanh hội chứng Down, Patau, Edward, Turner, Kleinerfelter trong chẩn đoán trước sinh. Thai nhi mắc hội chúng Patau (trisomy 13)……………………………………………………………………………………..23 Hình 4. Lấy máu ngoại vi ở người lớn………………………………………….24 Hình 5. Lấy máu ngoại vi ở trẻ…………………………………………………24 Hình 6. Cấy máu………………………………………………………………...25 Hình 7. Dung dịch Demecolcine………………………………………………..26 Hình 8. Ly tâm 1800 rpm trong 8 phút………………………………………….26 Hình 9. Nhỏ KCl vào mẫu trong ống ly tâm………………………………….....26 Hình 10. Nhỏ axit acetic vào mẫu đã được ly tâm………………………………27 Hình 11. Sau khi cho dung dịch carnoy vào lần 2………………………………27 Hình 12. Dung dịch có màu trắng khi nhỏ dung dịch Carnoy lần 3…………….27 Hình 13. Nhỏ lame (kiểu nhỏ ngang)…………………………………………...28 Hình 14. Nhỏ lame cao (kiểu nhỏ cao)………………………………………….28 Hình 15. Nhuộm lame bằng Giemsa: buffer…………………………………….28 Hình 16. Quan sát NST dưới kính hiển vi………………………………………29 Hình 17. Ống type được đánh số theo mã số của ống chứa dịch ối…………….31 GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 3 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ Hình 18. Mẫu được lắc ủ 990C 800rpm trong 10 phút………………………….31 Hình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọc………………………………….31 Hình 20. Nhỏ dung dịch wash buffer type 6………………………………….....31 Hình 21. Máy PCR………………………………………………………..…….32 Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm…………………………………………...33 Hình 23. Cho vào máy lai PCR…………………………………………………35 Hình 24. Gỡ keo sau lai…………………………………………………………35 Hình 25. Đánh mã số cho mẫu…………………………………………………..36 Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2……………………….37 Hình 27. Máy trích ly DNA tự động…………………………………………….38 Hình 28. Nhỏ mẫu vào Plate………………………………………………….....38 Hình 29. Plate đựng mẫu và dung dịch AW1…………………………………...38 Hình 30. Kết quả NST trên màn hình vi tính chưa sắp xếp…………………….39 Hình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếp………………….39 Hình 32. Kết quả NST in trên giấy……………………………………………...40 Hình 33. Kết quả Trisomy XXX………………………………………………...41 Hình 34. Kết quả bị hội chứng Turner…………………………………………..41 Hình 35. Kết quả bị hội chứng Klinefelte……………………………………....41 Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)……………………....……….42 Hình 37. Kết quả Trisomy 13 (hội chứng Patau)……………………………....42 Hình 38. Kết quả Trisomy 18 (hội chứng Edward)…………………………....42 GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 4 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ Hình 39. Kết quả FISH NST 21 và NST 13 bình thường……………….………43 Hình 40. Kết quả FISH 3 NST 21 hội chứng down….………………………….43 Hình 41. Kết quả FISH NST XX và NST 18 bình thường…….………………..43 Hình 42. Kết quả FISH NST XY và NST 18 bình thường………….…………..43 Hình 43. Kết quả âm tính………………………………………………….…….45 Hình 44. Kết quả dương tính…………………………………………................45 GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 5 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT TẮT NỘI DUNG NST Nhiễm sắc thể GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 6 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ LỜI MỞ ÐẦU Trong sự phát triển của mỗi quốc gia hiện nay, ngành Y nắm một vai trò vô cùng quan trọng. Không những đóng góp to lớn cho nền kinh tế mà ngành Y còn góp phần củng cố mặt đời sống nhân sinh cho quốc gia đó. Với một quốc gia khỏe mạnh về thể chất người lao động, quốc gia đó mới có chỗ dựa vững chắc để phát triển mạnh mẽ nền kinh tế của mình. Cùng với sự tiến triển của khoa học, bệnh di truyền ngày càng được mọi người chú ý. Theo thống kê của nhi khoa, gần 20 năm nay, tỉ lệ trẻ em chết vì bệnh di truyền đã giảm mạnh, cò tỉ lệ trẻ phát bệnh và tỷ lệ tử vong do dị tật bẩm sinh và bệnh di truyền dần dần tăng cao. Trong quá trình phát triển tự nhiên của nhân loại, do ảnh hưởng của các nhân tố, làm cho chất di truyền trong cơ thể biến đổi. Trong những biến đổi này có một loại biến đổi về con số và kết cấu của nhiễm sắc thể nhân tế bào được gọi là dị dạng nhiễm sắc thể, một loại khác là đột biến gen. Vì vậy tất cả bệnh do nhiễm sắc thể và gen trong nhân tế bào biến dạng gây cản trở cho sự thay thế, gây ra sự thiếu hụt dung môi có liên quan dẫn đến cơ thể di truyền sang đời sau, tạo nên sự hỗn hợp về sinh lý nhân thể, cơ năng sinh hóa, gây cản trở quá trình thay thế, loại bệnh này uy hiếp sức khỏe của con người. Vì thế việc xét nghiệm sớm trước sinh là việc rất quan trọng nhằm ngăn chặn việc sinh con bị tật gây nên gánh nặng cho gia đình và xã hội. Với nội dụng thực tập tốt nghiệp: “một số kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán các bệnh” tại khoa xét nghiệm di truyền y học bệnh viện Từ Dũ TpHCM. Chúng em đã hiểu rõ hơn các kỹ thuật xét nghiệm một số bệnh và quan trọng hơn là đã trải nghiệm thực tế nâng cao tay nghề hơn biết được sự khác nhau giữa lý thuyết và thực tế. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 7 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Giới thiệu về khoa xét nghiệm di truyền y học bệnh viện Từ Dũ Bệnh viện Từ Dũ là bệnh viện đầu ngành về sản phụ khoa của cả nước, đồng thời là trung tâm sản phụ khoa lớn nhất khu vực phía Nam tọa lạc tại 284 Cống Quỳnh, phường Phạm Ngũ Lão, quận 1, Tp.HCM. Trong đó khoa xét nghiệm di truyền y học tự hào là đơn vị đi đầu cả nước về di truyền người và chẩn đoán trước sinh. Di truyền và sinh học phân tử là chuyên khoa mũi nhọn của bệnh viện Từ Dũ, là lĩnh vực tiên phong trong xu hướng phát triển y học của thế giới. Khoa có đội ngũ cán bộ y tế trẻ giỏi, có đầy đủ các thiết bị xét nghiệm sàng lọc và chẩn đoán gen hiện đại. Khoa xét nghiệm di truyền y học được thành lập ngày 8/10/2010 từ tiền thân là buồng di truyền thuộc khoa giải phẫu bệnh - tế bào - di truyền, gồm 2 bộ phận chính: -Xét nghiệm sàng lọc: sàng lọc trước sinh (double test và combined test, triple test) và sàng lọc sơ sinh (thiếu G6PD, suy giáp bẩm sinh, tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh). -Xét nghiệm gen và nhiễm sắc thể: karryotube, QF-PCR, FISH, đột biến gen Thalassemia, loạn dưỡng cơ Duchenne, Digeorge, AZF, SRY, Hemophilia, nhận dạng gen người, đột biến gen sẩy thai, HPV, Rubella PCR, CMV PCR, Toxoplasma PCR và nhiều bệnh khác (nguồn: http://tudu.com.vn/vn/gioi-thieu/cac-chuyen-khoa/khoa-can- lam-sang/khoa-xet-nghiem-di-truyen-y-hoc/) Sơ đồ quy trình xét nghiệm của khoa - Sơ đồ quy trình xét nghiệm karyotube +Lấy mẫu: Tiếp nhận bệnh nhân, ghi thông tin, lấy mẫu hoặc nhận mẫu lừ các nơi gửi đến, và ký nhận. +Kiểm tra: Kiểm tra mẫu máu lấy có đạt yêu cầu thực hiện xét nghiệm không. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 8 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ +Nhập liệu: Nhập thông tin bệnh nhân và bệnh phẩm, ghi nhận chất lượng mẫu. +Thực hiện xét nghiệm: Thực hiện xét nghiệm theo quy trình kỹ thuật xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ máu gồm các bước nuôi cấy 72 giờ, thu hoạch và chuẩn bị lam 2 ngày, đọc và phân tích. Lấy mẫu Không đạt Kiểm tra Đạt Nhập liệu Thực hiện xét nghiệm Ra kết quả Không đạt Kiểm tra kết quả Đạt Nhập kết quả Tư vấn Trả về nơi giới thiệu hoặc điều trị chuyên khoa Lưu hồ sơ Kết thúc +Ra kết quả xét nghiệm. +Kiểm tra kết quả, nếu không đạt thì lấy mẫu lại. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 9 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ +Nhập kết quả xét nghiệm và in phiếu trả kết quả qua phần mềm nhiễm sắc thể đồ máu cho bệnh nhân. +Tư vấn về mặt di truyền cho bệnh nhân: Tranh ảnh, tài liệu tư vấn. +Chuyển bệnh nhân về lại nơi chỉ định xét nghiệm hoặc nơi có điều trị chuyên khoa phù hợp. +Lưu hồ sơ. -Sơ đồ quy trình xét nghiệm sinh học phân tử Nhận mẫu Kiểm tra thông tin Nhập liệu Ly trích DNA PCR Chạy điện di Ra kết quả và phân tích Trả kết quả bệnh nhân +Nhận mẫu: Nhận mẫu dịch ối, mẫu máu, gai nhau từ các khoa khác tại bệnh viện. +Kiểm tra thông tin: Thông tin trên ống chứa mẫu với thông tin trên giấy, nếu không khớp thì báo lại. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 10 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ +Nhập liệu: Nhập thông tin bệnh nhân và bệnh phẩm, ghi nhận chất lượng mẫu. +Ly trích DNA: Dùng các bộ kit để thu được DNA. +Chạy PCR: Cho DNA vào máy chạy PCR +Điện di: Tùy xét nghiệm mà chạy điện di gel hoặc điện di mao quản từ sản phẩm PCR +Ra kết quả và phân tích: Nếu đạt yêu cầu in trả kết quả bệnh nhân, nếu kết quả bị nghi ngờ là sai thì chạy mẫu lại. 1.2.Tổng quan về các phương pháp 1.2.1.Karyotype Xét nghiệm karyotube hay Lập bộ nhiễm sắc thể là xét nghiệm khảo sát bộ nhiễm sắc thể trong 1 tế bào. Xét nghiệm được thực hiện bằng cách nuôi cấy tế bào trong môi trường đặc biệt. Sau thời gian thích hợp tế bào được thu hoạch và được nhuộm đặc trưng. Kỹ thuật nhuộm hiện nay là GTG (Giemsa trypsin G-banding). Người bình thường có 46 nhiễm sắc thể, chia thành 22 cặp thường và 1 cặp giới tính. Mỗi cặp có kích thước, hình dạng và cấu trúc đặc trưng. Sau khi nhuộm, số lượng và cấu trúc của các cặp nhiễm sắc thể được khảo sát bằng kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần và được phân tích, xếp thành bộ hoàn chỉnh bằng phần mềm chuyên dụng. Loại mẫu có thể sử dụng cho kỹ thuật này gồm: máu, dịch ối, gai nhau, dây rốn, máu dây rốn. Karyotube được chỉ định xét nghiệm cho tất cả các đối tượng nghi ngờ bị rối loạn di truyền, dị tật bẩm sinh, chậm phát triển tâm thần, vô sinh – hiếm muộn, sẩy thai liên tiếp… Tiêu chuẩn để xếp loại nhiễm sắc thể trong lập karyotube GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 11 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ Lúc đầu người ta chỉ căn cứ vào chiều dài của NST để căn cứ và đặt tên cho chúng từ 1 đến 23 theo thứ tự từ dài đến ngắn (công ước Denver 1960), nhưng ngay sau đó cũng năm 1960 Patau không đồng ý và đề xuất thêm tiêu chuẩn vị trí phần tâm, sau này được quốc tế chính thức chấp nhận. Phân loại nhiễm sắc thể Ở người bộ NST 2n = 46 trong đó có 22 cặp NST thường (autochromosome) và 1 cặp NST giới tính (sex chromosome). Dựa vào đặc điểm hình thái như độ dài, vị trí tâm động người ta sắp xếp các NST thành từng nhóm. 46 NST người được chia thành 7 nhóm, kí hiệu là A, B, C, D, E, F và G trên nguyên tắc dài trước ngắn sau, nếu các NST bằng nhau thì tâm giữa đặt trước, tâm lệch đặt sau: -Nhóm A có 3 cặp NST có kích thước lớn nhất, gọi tên từ số 1 đến 3, cặp số 1 tâm giữa, cặp số 2 tâm lệch, cặp số 3 tâm giữa. - Nhóm B có 2 cặp NST số 4 và 5. Các NST này có kích thước lớn và đều có tâm lệch. -Nhóm C có 7 cặp từ số 6 đến 12 có chiều dài trung bình. NST X cũng được xếp vào nhóm này. Tất cả đều tâm gần giữa và khó phân biệt. -Nhóm D có 3 cặp từ số 13 đến 15 gồm các NST có nhánh ngắn rất ngắn, gần như không đáng kể gọi là các NST tâm đầu (acrocentric). Tất cả 3 cặp NST này đều có vệ tinh ở nhánh ngắn. -Nhóm E có 3 cặp 16, 17,18 tương đối ngắn. NST số 16 tâm giữa, 17 và 18 tâm lệch. -Nhóm F có 2 cặp NST 19 và 20, ngắn và có tâm giữa. -Nhóm G có 2 cặp 21 và 22, kích thước ngắn và tâm đầu, có vệ tinh. NST Y cũng được xếp vào nhóm này nhưng không có vệ tinh. Các rối loạn về bộ nhiễm sắc thể người Rối loạn số lượng GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 12 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ -Đa bội thể: là hiện tượng tăng chẵn hoặc tăng lẻ cả bộ NST. Ví dụ: ở người 3n = 69 NST là thể tam bội (3n) thuộc dạng thể đa bội lẻ, 4n = 96 NST = thể tứ bội (4n) thuộc dạng thể đa bội chẵn. Ở người, các trường hợp đa bội phần lớn phôi thai chết ở giai đoạn trước sinh, một vài trường hợp sống đến khi sinh hoặc sau sinh nhưng hầu hết là các sơ sinh bị dị tật. -Lệch bội: là hiện tượng số lượng NST của tế bào tăng lên hoặc giảm đi một hoặc vài NST so với bộ NST lưỡng bội. Rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể -Mất đoạn (deletion): là hiện tượng NST bị đứt rời ra một hoặc nhiều đoạn, đoạn bị đứt rời ra không có tâm sẽ tiêu biến đi hoặc gắn sang NST khác, phần còn lại mang tâm trở lên ngắn hơn bình thường. Mất đoạn gồm các dạng: mất đoạn cuối đơn, mất đoạn cuối kép, mất đoạn giữa. -Chuyển đoạn (Translocation) Chuyển đoạn là hiện tượng trao đổi các đoạn của NST. Chuyển đoạn NST đã được xác định là hay gặp nhất trong rối loạn cấu trúc của NST [63]. Có hai kiểu chuyển đoạn là chuyển đoạn tương hỗ (reciprocal translocation) và chuyển đoạn hòa hợp tâm (Robertsonian translocation). -Lặp đoạn (duplication) là hiện tượng một đoạn nào đó của NST được nhân đôi lên. Lặp đoạn xảy ra khi 2 NST tương đồng ghép đôi với nhau không tương xứng trong kỳ đầu của phân bào giảm phân, có sự đứt của 2 NST và trao đổi đoạn giữa 2 đoạn khác nhau của 2 NST trong cặp tương đồng. Trong trường hợp này có 2 NST bị thay đổi cấu trúc, nhưng không mất đi hoặc tăng thêm vật liệu di truyền trong tế bào. Khi các NST trong cặp tương đồng này phân ly nhau trong giảm phân sẽ tạo ra hợp tử mang NST lặp đoạn (trisomi từng phần) hoặc NST thiếu một đoạn có liên quan (monosomi từng phần)… -Đảo đoạn (invertion) là sự bất thường cấu trúc do NST bị đứt ở hai điểm, đoạn giữa hai điểm đứt quay ngược 1800 rồi nối lại, do đó một số gen bị đảo ngược thứ tự so với đoạn ban đầu. Có ba kiểu đảo đoạn: đảo đoạn ngoài tâm, đảo đoạn quanh tâm đối xứng, đảo đoạn quanh tâm không đối xứng. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 13 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ +Đảo đoạn ngoài tâm: hai chỗ đứt ở cùng một nhánh của NST và đoạn đảo không chứa tâm, NST không thay đổi hình thái. +Đảo đoạn quanh tâm đối xứng: hai chỗ đứt ở hai nhánh và cách đều tâm, NST không thay đổi hình thái. + Đảo đoạn quanh tâm không đối xứng: hai chỗ đứt ở hai nhánh, khoảng cách tâm không đều nhau, NST có cấu trúc lại và thay đổi hình thái. 1.2.2.Sinh học phân tử 1.2.2.1.QF-PCR QF-PCR là PCR huỳnh quang định lượng (Quantitative Fluorescence PCR). Đây là một kỹ thuật PCR dùng để khuếch đại các đoạn DNA ngắn lặp lại đặc hiệu (STR), đánh dấu bằng tín hiệu huỳnh quang và định lượng bằng điện di mao quản. QF-PCR được dùng để kiểm tra liều gen, ví dụ: số lượng bản sao của gen trong 1 mẫu khảo sát, số lượng của các đoạn nhiễm sắc thể. Các nhiễm sắc thể thường được khảo sát bằng QF-PCR là nhiễm sắc thể (NST) 13, 18, 21, X, Y. Mỗi NST sẽ được khảo sát tại nhiều đoạn STR khác nhau. Do các locus STR thường được chọn có đặc tính đa hình cao nên ít khi xảy ra trường hợp trisomy cho kết quả dạng đồng hợp tử ở tất cả các đoạn STR không thể kết luận được. Prenatal Lab sử dụng QF-PCR khảo sát 32 đoạn STR khác nhau trên các NST 13, 18, 21, X và Y. Hiện nay QF-PCR thường được chỉ định trong chẩn đoán nhanh trước sinh rối loạn nhiễm sắc thể cho các trường hợp thai nguy cơ cao bị Hội chứng Down, Hội chứng Edwards, Hội chứng Turner, Hội chứng Klinefelter… Loại mẫu có thể sử dụng cho kỹ thuật này gồm: máu, dịch ối, gai nhau, dây rốn, máu dây rốn, mô thai sảy… -Nguyên tắc của phương pháp PCR: Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 14 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase. Thật vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với 2 đầu của 1 trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa 2 mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại 1 trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt; các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và mồi ngược (antisens primer). -Thực nghiệm: Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94-950C trong vòng 30 giây – 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính. Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Các mồi được thiết kế sao cho đầu 3’ định hướng đoạn trình tự cần nhân nên quá trình tổng hợp ADN sẽ diễn ra trên cả hai mạch, qua suốt vùng trình tự đó; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 400C – 700C, tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây – đến 1 phút. Đây là giai đoạn lai. Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. ADN polymerase gắn vào đầu 3’ tự do của mồi và sử dụng dNTP để tổng hợp các mạch mới theo chiều 5’ – 3’. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài. Một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là kỹ thuật khuếch đại theo cấp số nhân; theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu (Nguồn: Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục). GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 15 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ Hình 1. Các giai đoạn của 1phản ứng PCR (Nguồn: http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=9925 -Các điều kiện của phản ứng PCR Muốn tiến hành phản ứng PCR cần có các thành phần sau: ADN khuôn, mồi, DNA polymerase, các deoxyribonucleotit triphosphat (dNTP), dung dịch đệm (buffer). -Điện di mao quản: +Nguyên tắc của sự tách Dựa trên cơ sở tính chất điện di của các phần tử chất phân tích trong mao quản (ɸ:25-100mm) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một nguồn thế cao một chiều (V: 10-30kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là CE là kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển sự tách của các chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các hoá chất khác phục vụ cho sự tách, số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xẩy ra nhanh và hiệu quả cao. +Cơ chế điện di: Dưới tác dụng của lực điện trường E (Electric Field Force: EFF) và dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), các phân tử chất tan sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau vì điện tích, kích thước và độ linh động của chúng khác nhau. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 16 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ 1.2.2.2.Real time PCR (xét nghiệm HPV) Siêu vi sinh dục papilom ở người (Human Papillomavirus) còn gọi là siêu vi HPV, là siêu vi thông thường gây nhiễm trùng tế bào da. Thông thường, cơ thể sẽ tự chống lại siêu vi HPV trước khi chúng có thể gây ra những vấn đề sức khỏe. Vì lý do này, hầu hết những người bị nhiễm siêu vi HPV không có triệu chứng và không biết mình đã bị nhiễm bệnh. Nhưng đôi khi cơ thể không tự chống lại siêu vi HPV. Trong những trường hợp này, siêu vi HPV có thể gây ra các vấn đề cho sức khỏe, như: Mụn cóc sinh dục ở đàn ông và phụ nữ; ung thư cổ tử cung ở phụ nữ; những loại ung thư ít phổ biến khác ở đàn ông và phụ nữ, như ung thư hậu môn. Siêu vi HPV làm cho những tế bào bình thường trong cơ thể trở nên bất thường. Người ta không thể nhìn thấy hay cảm thấy những tế bào bất thường này. Hầu hết các trường hợp, cơ thể sẽ tự chống lại siêu vi HPV và các tế bào sẽ trở lại bình thường. Nhưng nếu không thì siêu vi HPV có thể biến tế bào thành ung thư theo thời gian. Sau nhiều năm thì ung thư mới phát triển ở một người bị nhiễm siêu vi HPV. (Nguồn: Marina D.M Limaa, b, Paulo Henrique Braz-Silvaa, c, Sônia M. Pereirad, Catalina Rierae, Ariane C. Coelhof, Marina Gallottinia 2014, “Oral and cervical HPV infection in HIV-positive and HIV-negative women attending a sexual health clinic in São Paulo, Brazil”) Giới thiệu chung Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ sự phân tích đầu cuối (end-point) bằng cách chạy điện di DNA trên agarose gel sau khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, phương pháp real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang. Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, và các probe hoặc primer đặc hiệu chuỗi (trình tự) được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR). Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module phát hiện tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 17 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Real-time PCR có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép chúng ta định lượng số copy khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao trên một phạm vi động học lớn. Các kết quả của real-time PCR có thể là chất lượng (sự có mặt hoặc không của trình tự đích) hoặc định lượng (số bản copy của DNA). Real-time PCR định lượng còn được biết như là qPCR. Số liệu của real-time PCR có thể đánh giá mà không cần điện di gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưa vào quá trình được tăng lên. Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và số liệu được đánh giá trong một hệ thống tube đóng kín, nên các cơ hội nhiễm bẩn được giảm thiểu và sự cần thiết của các thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ. Phân tích tổng quát một phản ứng Real-time PCR Để hiểu được real-time PCR như thế nào, chúng ta bắt đầu bằng một đường cong khuếch đại mẫu. Trong hình này, số chu kỳ PCR được trình bày trên trục x, và tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng khuếch đại, tỷ lệ với số lượng sản phẩm được khuếch đại trong tube, được trình bày trong trục y. Đường cong khuếch đại có 2 pha, 1 pha hàm mũ được tiếp theo bởi một pha ổn định. Trong suốt pha hàm mũ, số lượng PCR xấp xỉ gấp đôi trong mỗi chu kỳ. Tuy nhiên, khi phản ứng diễn ra thành phần phản ứng sẽ bị tiêu hao, cuối cùng làm cho một hoặc nhiều thành phần bị hạn chế. Ở điểm nàu phản ứng chậm lại và đi vào pha ổn định (các chu kỳ 28-29). Hình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nền GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 18 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ Đầu tiên tín hiệu huỳnh quang duy trì ở mức độ nền, và việc tăng tín hiệu huỳnh quang là không thể phát hiện được (các chu kỳ 1-18) cho dù sản phẩm tích lũy theo hàm mũ. Sau đó, sản phẩm khuếch đại tích lũy đủ để đạt tới một hiệu suất cho phép phát hiện được tín hiệu huỳnh quang. Số chu kỳ để đạt được hiệu suất này gọi là chu kỳ ngưỡng (CT). Do đó giá trị CT được đo trong pha hàm mũ khi các tác nhân phản ứng không bị hạn chế, nên real-time PCR có thể được sử dụng để tính toán chính xác và tin cậy số lượng khởi đầu của khuôn mẫu hiện diện trong phản ứng. CT được xác định chủ yếu bởi số lượng của khuôn mẫu hiện diện ở lúc bắt đầu phản ứng khuếch đại. Khi lượng khuôn mẫu nhiều thì chỉ cần một vài chu kỳ khuếch đại để tích lũy sản phẩm đủ cho một tín hiệu huỳnh quang ở trên background. Vì vậy, phản ứng sẽ có CT thấp hơn hoặc sớm. Ngược lại, nếu lượng khuôn mẫu lúc bắt đầu phản ứng quá ít, thì số chu kỳ khuếch đại cần nhiều hơn để tín hiệu huỳnh quang tăng trên background. Vì vậy phản ứng sẽ có CT cao hoặc muộn. Các dạng quan hệ này là cơ sở cho hướng định lượng của real-time PCR. Một số ứng dụng chính của real-time PCR -Nghiên cứu biểu hiện gen. Xác định sự hoạt động của gen và định lượng mức độ biểu hiện của nó thông qua RNA bằng kỹ thuật RT-PCR -Chuẩn đoán phân tử. Nghiên cứu mức độ nhiễm virus và vi khuẩn để chuẩn đoán các bệnh viêm nhiếm. -Xét nghiệm phân biệt allele. Là phương pháp xét nghiệm đầu cuối được dùng để xác định kiểu gen của mẫu vật (đồng hợp tử: chỉ có allele 1 hoặc chỉ có allele 2, dị hợp tử: có cả 2 allele 1 và 2) và phân biệt sự đa hình nucleotide đơn. 1.2.2.3.Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH): FISH (Fluorescent insitu hybridization) là kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào và di truyền phân tử, sử dụng một đoạn mồi đặc hiệu (probe) gắn tín hiệu huỳnh quang, để phát hiện sự có mặt hoặc vắng mặt của một đoạn gen nào đó trên nhiễm sắc thể, với ưu điểm nhanh, đặc hiệu và chính xác. FISH đặc biệt có hiệu quả trong việc phát hiện những mất đoạn gen nhỏ (microdeletion), hoặc để khẳng định nguồn gốc của các loại chuyển đoạn đặc GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 19 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ biệt. Ngoài ra interphase FISH (FISH nhanh) còn được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán trước sinh, để phát hiện những bất thường số lượng của một số nhiễm sắc thể thường gặp (13,18,21,X,Y) Kỹ thuật FISH được chỉ định trong các trường hợp sau: Chẩn đoán trước sinh các bất thường số lượng NST ở thai nhi, phát hiện các mất đoạn nhỏ ở một số hội chứng di truyền, xác định các đoạn nhiễm sắc thể chưa rõ nguồn gốc, phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu trong ung thư. Kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trƣớc sinh: Kỹ thuật interphase FISH (FISH nhanh) được sử dụng để sàng lọc một số hội chứng di truyền thường gặp: hội chứng Down (trisomy 21), hội chứng Patau (trisomy 13), hội chứng Edward (trisomy 18), hội chứng Turner (monosomy X), hội chứng Kleinerfelter (XXY)… với ưu điểm: -Nhanh: Thời gian xét nghiệm trong vòng 48h kể từ khi nhận mẫu dịch ối. Hoàn thành các thủ tục quản lý chất lượng xét nghiệm sau 4 ngày. Chú ý: Các quyết định đình chỉ thai nghén không nên chỉ dựa vào một mình kết quả FISH -Độ chính xác cao -Yêu cầu chỉ 10-20ml dịch ối. -Có thể thực hiện trên mẫu bệnh phẩm gai nhau. GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 20 LẠI ĐÌNH BIÊN

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.01: Bộ Luận Văn Thạc Sĩ Quản Trị Kinh Doanh MBA

165 tài liệu

2070 lượt tải

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.