Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài cấp nhà nước: Nghiên cứu sản xuất Bộ sinh phẩm để chẩn đoán nhanh bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue và bệnh Viêm đường hô hấp cấp (SARS) ở Việt Nam.

Chia sẻ: Minh Nguyet | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:305

Thêm vào BST

Báo xấu

94
lượt xem 17
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu xây dựng được quy trình kỹ thuật chuẩn đoán nhanh và chính xác sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue và bệnh Viêm đường hô hấp cấp (SARS); sản xuất Bộ sinh phẩm chất lượng cao, dễ sử dụng cho việc chuẩn đoán bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue và bệnh Viêm đường hô hấp cấp (SARS). Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài cấp nhà nước: Nghiên cứu sản xuất Bộ sinh phẩm để chẩn đoán nhanh bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue và bệnh Viêm đường hô hấp cấp (SARS) ở Việt Nam.

Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ Ch−¬ng tr×nh KC- 04 B¸o c¸o tæng kÕt khoa häc vµ kü thuËt §Ò tµi cÊp nhµ n−íc §Ò tµi: KC 04 - 32 Nghiªn cøu s¶n xuÊt Bé sinh phÈm ®Ó chÈn ®o¸n nhanh bÖnh sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue vµ bÖnh Viªm ®−êng h« hÊp cÊp (SARS) ë ViÖt Nam. GS.TS. Tr−¬ng uyªn Ninh ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ Trung −¬ng 6701 24/12/2007 Hµ Néi, 9- 2007 B¶n quyÒn thuéc VVSDTTW- Bé Y TÕ
Nh÷ng ch÷ viÕt t¾t trong b¸o c¸o ☯ ARN Axit ribonucleic ADN Axit deoxyribonucleic CID Center of Infection Diseases Trung t©m c¸c bÖnh nhiÔm trïng CDC Center of Diseases Control Trung t©m kiÓm so¸t bÖnh tËt ELISA Enzym linked Immunosorbent Assay Thö nghiÖm miÔn dÞch men GAC- ELISA IgG Capture ELISA Kü thuËt miÔn dÞch enzym ph¸t hiÖn IgG HI Hemagglutination Inhibition test HT HuyÕt thanh FBS Fetal Bovin Serum IFAT (Immunofluorescent indirect Antibody Technique) Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp IFDT (Immunofluorescent direct Antibody Technique) Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang trùc tiÕp IFA (Immunofluorescent Indirect Antibody Technique) Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp MAC - IgM Capture ELISA ELISA Kü thuËt miÔn dÞch enzym ph¸t hiÖn IgM ML Maximum Likelihood Ph−¬ng ph¸p ch¾c ch¾n tèi ®a MP Maximum Pasimony
Ph−¬ng ph¸p chi li tèi ®a NJ Neighbor Joining Ph−¬ng ph¸p kÕ cËn liÒn kÒ NNKHC Ng¨n ng−ng kÕt hång cÇu (HI) Primer §äan måi ADN PRNT Plaque Assay and Plaque Reduction Neutralization tests. Kü thuËt trung hoµ vµ Kü thuËt Trung hoµ gi¶m ®¸m ho¹i tö PCR Polymerase Chain Reaction Ph¶n øng chuçi Polymeraza RT- PCR Reverse transcriptase- Polymerase chain reaction Ph¶n øng dao chÐp ng−îc khuÕch ®¹i chuçi SARS Severe Acute Respiratory Syndrome Héi chøng viªm ®−êng h« hÊp cÊp tÝnh SARS-CoV Severe Acute Respiratory Syndrome associated Corona virus Virus Corona g©y bÖnh SARS SD Sèt Dengue SXHD Sèt xuÊt huyÕt Dengue TCYTTG Tæ chøc Y tÕ ThÕ giíi VVSDTTW ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ Trung ¦¬ng VCNSH ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc WHO World Health Organization (Tæ chøc Y tÕ ThÕ giíi) WB Western Blot
Môc lôc Sè TT Néi dung Trang §Æt vÊn ®Ò 1 Ch−¬ng I. Tæng quan tµi liÖu A. Nghiªn cøu virus Dengue g©y nªn bÖnh Sèt Dengue/ Sèt xuÊt huyÕt Dengue ë ViÖt Nam 1.1 BÖnh sèt Dengue vµ sèt xuÊt huyÕt Dengue 5 1.1.1 BiÓu hiÖn l©m sµng 1.1.2 T¸c nh©n truyÒn bÖnh 6 1.1.3 T×nh h×nh dÞch bÖnh trªn thÕ giíi 8 1.1.4 T×nh h×nh dÞch bÖnh ë ViÖt Nam 11 1.2 Virus Dengue 11 1.2.1 §Æc ®iÓm h×nh th¸i vµ cÊu tróc 13 1.2.2 Genome cña virus 13 1.2.3 Chu tr×nh nh©n lªn vµ c¬ chÕ g©y bÖnh cña virus Dengue 15 1.2.4 §Æc ®iÓm kh¸ng nguyªn 17 1.2.4.1 Ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ 18 1.2.4.2 Ph©n lËp virus 20 B. nghiªn cøu virus corona g©y bÖnh viªm ®−êng h« hÊp cÊp SARS ë ViÖt Nam 1.1 T×nh h×nh nghiªn cøu trªn thÕ giíi 26 1.2 C¸c nghiªn cøu t¹i ViÖt nam 42 Ch−¬ng II §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu A. Bé sinh phÈm chÈn ®o¸n nhanh bÖnh Sèt Dengue/
Sèt xuÊt huyÕt Dengue 2.1 §èi t−îng vµ vËt liÖu 44 2.1.1 §èi t−îng 2.1.2 VËt liÖu 2.1.3 Ho¸ chÊt 49 2.2 Trang thiÕt bÞ 54 2.3 Ph−¬ng ph¸p 55 C¸c ph−¬ng ph¸p s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn vµ Kh¸ng huyÕt thanh 2.3.1 S¶n xuÊt kh¸ng nguyªn 55 2.3.2 Ph−¬ng ph¸p s¶n xuÊt kh¸ng huyÕt thanh 58 2.3.3 Ph−¬ng ph¸p ELISA ph¸t hiÖn IgM 59 2.3.4 Kü thuËt trung hoµ (Neutralization Test - NT) 59 2.3.5 Ph−¬ng ph¸p miÔn dÞch hÊp phô liªn kÕt men 60 ph¸t hiÖn KT IgG (GAC- ELISA) 2.4 C¸c ph−¬ng ph¸p ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh type virus 60 2.4.1 CÊy truyÒn trªn n·o chuét æ (1-3 ngµy tuæi) 60 2.4.2 Ph−¬ng ph¸p ph©n lËp virus trªn tÕ bµo muçi 61 Aedes. albopictus dßng C6/36. 2.4.3 Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang trùc tiÕp 64 (Direct ImmunoFluorescent Antibody Assay – DFA). 2.4.4 Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp 65 (Indirect ImmunoFluorescent AntibodyAssay – IFA). 2.4.5 Kü thuËt Trung hoµ gi¶m ®¸m ho¹i tö 66 ( Plaque Reduction Neutralization Test - PRNT ) 2.4.6 Ph−¬ng ph¸p tæng hîp d©y chuyÒn chuçi nhê polymerase 68 (RT-PCR - Polymerase Chain Reaction) C. Bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bÖnh Viªm ®−êng h« hÊp cÊp SARS 2.1 §èi t−îng nghiªn cøu 73 2.2 VËt liÖu 74 2.2.1 MÉu bÖnh phÈm 74 2.2.2 TÕ bµo 74 2.2.3 Sinh phÈm kh¸c 74
2.2.4 M«i tr−êng vµ ho¸ chÊt 75 2.2.5 Trang thiÕt bÞ vµ dông cô 76 2.3 Ph−¬ng ph¸p 78 2.3.1 Ph©n lËp virus SARS-CoV 78 2.3.2 T¹o plasmid t¸i tæ hîp. 78 2.3.3 BiÓu lé vµ tinh s¹ch kh¸ng nguyªn . 79 2.3.4 Ph−¬ng ph¸p hÊp phô miÔn dÞch liªn kÕt enzyme tãm b¾t 80 kh¸ng thÓ IgM (MAC- ELISA) 2.3.5 Ph−¬ng ph¸p Western Blot. 81 Ch−¬ng III KÕt qu¶ vµ Bµn luËn A. KÕt qu¶ s¶n xuÊt bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bÖnh sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue. 3.1 Nu«i cÊy virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus 82 Dengue type III (D3) vµ virus Dengue type IV (D4) trªn tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/36. 3.1.1 Nh©n virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus 82 Dengue type III (D3) vµ virus Dengue type IV (D4) vµo tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/36 ®Ó t¸ch chiÕt ARN. 3.1.2 Quan s¸t sù nh©n lªn cña virus Dengue trong tÕ bµo muçi Aedes 100 albopictus dßng C6/ 36 d−íi kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö 3.2 Nghiªn cøu qui tr×nh c«ng nghÖ biÓu hiÖn, t¸ch chiÕt, tinh chÕ kh¸ng 106 nguyªn Dengue t¸i tæ hîp c¸c type. 3.2.1 Kh¸ng nguyªn Dengue th« 106 3.2.2 Kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp. 108 3.2.3 Quy tr×nh t¸ch chiÕt vµ tinh chÕ kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp cña virus 109 dengue tõ chñng E. coli cho c¶ bèn typ virus dengue 3.3 T¸ch dßng vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù ®äan gen PreM vµ E cña 4 type virus 117 Dengue. 3.3.1 T¸ch RNA tæng sè cña tÕ bµo muçi C6/36 117 3.3.2 KhuÕch ®¹i ®o¹n gene PreM vµ E b»ng ph−¬ng ph¸p RT-PCR 118
3.3.3 BiÓu hiÖn kh¸ng nguyªn mµng vµ vá cña virus Dengue type 1, 2, 3, 4 148 trong hÖ nÊm men Pichia pastoris 3.3.4 BiÓu hiÖn gen m· ho¸ kh¸ng nguyªn preM-E (gen preM-env) trong 163 Pichia pastoris 3.3.5 KiÓm tra ph¶n øng cña kh¸ng nguyªn DxME t¸i tæ hîp víi kh¸ng thÓ 167 kh¸ng virus Dengue tù nhiªn b»ng Western Blot 3.4 ThiÕt kÕ cÆp måi vµ x©y dùng kÕ häach t¸ch dßng gen m· hãa kh¸ng 168 nguyªn vá cña virus Dengue c¸c type I, II, III, IV. 3.5 ChÕ t¹o céng hîp (Gold monoclonal antibodies) g¾n kh¸ng nguyªn vµo 173 gi¸ thÓ (mµng thÊm Nitrocellulo membrane) 3.6 Nghiªn cøu dung dÞch ®Öm buffer tèi −u 179 dïng trong ph¶n øng 3.7 Hoµn thiÖn Bé sinh phÈm 183 3.8 Thö nghiÖm Bé sinh phÈm trong phßng thÝ nghiÖm 198 3.8.1 Th−êng qui sö dông Bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bÖnh sèt Dengue/ 200 sèt xuÊt huyÕt Dengue 3.8.2 So s¸nh kÕt qu¶ thö nghiÖm trong phßng thÝ nghiÖm 204 3.9 øng dông Bé sinh phÈm trong thùc ®Þa 210 3.9.1 KÕt qu¶ kiªm tra t¹i phßng thÝ nghiÖm Sèt xuÊt huyªt Arbovirus, ViÖn 210 VÖ sinh DÞch tÔ Trung −¬ng 3.9.2 Gi¸ thµnh vµ chÊt l−îng Bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bÖnh sèt 211 Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue 3.9.3 Mét sè h×nh ¶nh khi tiÕn hµnh thÝ nghiÖm t¹i c¸c ®iÓm nghiªn cøu 213 B. KÕt qu¶ s¶n xuÊt Bé sinh phÈm chÈn ®o¸n nhanh bÖnh viªm ®−êng h« hÊp cÊp (SARS) 3.1 Kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp protein N - SARS-CoV 217 3.2 X¸c ®Þnh c¸c th«ng sè c¬ b¶n cho bé sinh phÈm MAC-ELISA chÈn 218 ®o¸n nhiÔm virus SARS-CoV 3.2.1 X¸c ®Þnh thêi gian sö dông tèi −u cña bé sinh phÈm. 219 3.2.2 X¸c ®Þnh ®é ®Æc hiÖu cña Bé sinh phÈm 220 3.2.3 X¸c ®Þnh ®é nh¹y cña sinh phÈm. 220 3.3 Thµnh phÇn bé sinh phÈm. 221 3.4 Ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ IgM trong huyÕt thanh bÖnh nh©n SARS vµ nh©n 221
viªn y tÕ cã tiÕp xóc trùc tiÕp víi bÖnh nh©n SARS. Bµn luËn 1 Mét ph−¬ng ph¸p chÈn ®o¸n sím trong phßng thÝ nghiÖm cã hiÖu qu¶ 226 2 Trong giai ®o¹n ®Çu cña dÞch SARS, mét sè ph−¬ng ph¸p ELISA ®−îc 234 giíi thiÖu 3 Bé sinh phÈm MAC- ELISA ph¸t hiÖn sím nhiÔm virus SARS 236 4 Toµn bé bÖnh nh©n ®−îc x¸c ®Þnh nhiÔm virus SARS-CoV trªn l©m 239 sµng ®· ®−îc kh¼ng ®Þnh l¹i khi ph¸t hiÖn ®−îc kh¸ng thÓ IgM kh¸ng ®Æc hiÖu virus SARS –CoV th«ng qua ph−¬ng ph¸p MAC-ELISA. 5 Sù xuÊt hiÖn cña KT kh¸ng ®Æc hiÖu virus SARS-CoV trªn mét sè 239 ng−êi kh«ng cã biÓu hiÖn l©m sµng KÕt luËn 241 Tµi liÖu tham kh¶o 244
§Æt vÊn ®Ò Trong vßng 15 n¨m gÇn ®©y, nhiÒu dÞch bÖnh nguy hiÓm ë qui m« khu vùc còng nh− toµn cÇu ®· x¶y ra vµ lÇn ®Çu tiªn g©y ¶nh h−ëng lín ®Õn nÒn kinh tÕ thÕ giíi. TÊt c¶ c¸c bÖnh dÞch nguy hiÓm nµy (nh− dÞch h¹nh Ên §é vµo n¨m 1994, dÞch cóm gia cÇm t¹i Hång K«ng 1997, dÞch viªm n·o Nipah t¹i Malaysia, dÞch SARS hay héi chøng h« hÊp cÊp tÝnh ë Trung Quèc tõ n¨m 2002 ®Õn 2003, vµ cóm gia cÇm ë vïng §«ng Nam ¸ tõ n¨m 2003 ®Õn2007)… ®Òu cã mÇm bÖnh tõ ®éng vËt vµ ph¸t sinh t¹i ¸ Ch©u vµ dÇn dµ l©y lan lµm ¶nh h−ëng ®Õn nÒn kinh tÕ thÕ giíi. Víi tiÕn tr×nh toµn cÇu ho¸ hiÖn nay, chóng t«i thiÕt nghÜ trong t−¬ng lai sÏ x¶y ra nhiÒu dÞch bÖnh ë tÇm møc t−¬ng tù. H¬n n÷a, do c¸c yÕu tè x· héi, v¨n ho¸ vµ nh©n khÈu ë Ch©u ¸… cã lÏ vÉn lµ n¬i tiÕp tôc xuÊt hiÖn c¸c dÞch bÖnh b¾t nguån tõ ®éng vËt… ViÖc ph¸t hiÖn æ dÞch trong ch−¬ng tr×nh “chiÕn l−îc dù phßng sím” t¹i ¸ ch©u sÏ gióp chóng ta chñ ®éng ph¸t hiÖn vµ ng¨n chÆn kÞp thêi c¸c bÖnh dÞch ®· biÕt ®Õn còng nh− c¸c bÖnh dÞch míi ph¸t sinh. Trong c¸c bÖnh dÞch míi gÇn ®©y, næi lªn cã dÞch SD/ SXHD vµ Viªm ®−êng h« hÊp cÊp SARS.... Sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue (SD/ SXHD) lµ mét bÖnh nhiÔm trïng cÊp tÝnh do virus Dengue g©y ra. BÖnh kh«ng cã vacxin vµ thuèc ®iÒu trÞ. BiÓu hiÖn l©m sµng cña SD/ SXHD rÊt ®a d¹ng tõ sèt cao ®ét ngét kÐo dµi 2-7 ngµy kÌm theo triÖu chøng ®au ®Çu, ®au c¬, ®au x−¬ng, ®au khíp, ®au bông cho tíi buån n«n, ph¸t ban... Sau ®ã cã thÓ cã biÓu hiÖn xuÊt huyÕt d−íi da, xuÊt huyÕt néi t¹ng (ch¶y m¸u cam, ch¶y m¸u lîi, n«n ra m¸u, ®i ngoµi ra m¸u...). Ngoµi ra cßn cã thÓ cã thªm c¸c dÊu hiÖu kh¸c nh− gan to, sèc, huyÕt ¸p h¹ vµ cã thÓ dÉn tíi tö vong (Barnes W. J. S. vµ Rosen L., 1974). BÖnh SD/ SXHD lµ bÖnh do muçi (Aedes aegypti, Aedes albopictus) [33] truyÒn v× vËy bÖnh th−êng dÔ dµng ph¸t triÓn thµnh dÞch. Virus Dengue ®−îc Sabin ph©n lËp ®Çu tiªn ë Calcuta, Ên 1
®é, New-Guinea vµ Hawaii (Sabin A. vµ cs, 1952)... Sau nµy ®−îc x¸c ®Þnh lµ virus Dengue type 1-Hawaii vµ virus Dengue type 2-New-Guinea. C¸c type virus Dengue 3 vµ virus Dengue 4 ®−îc Hammon W.M. vµ cs ph©n lËp ë Philippines vµo n¨m 1956 (Hammon W.M. vµ cs 1960). TiÕp ®ã nhiÒu chñng virus Dengue ®· ®−îc ph©n lËp tõ nhiÒu vïng kh¸c nhau trªn thÕ giíi nh−ng ®Òu ®−îc x¸c ®Þnh lµ thuéc 4 type huyÕt thanh nªu trªn (Anonymous, 1986). Tíi n¨m 1997 bÖnh SD/ SXHD ®· lan réng trªn ph¹m vi toµn thÕ giíi. Theo Gubler, D.J. (1997) th× hiÖn nay cã tíi h¬n 2,5 tû ng−êi ®ang sèng trong khu vùc cã l−u hµnh SD/ SXHD vµ hµng n¨m cã kho¶ng 100 triÖu ng−êi m¾c bÖnh nµy. §Ó cã thÓ phßng chèng bÖnh mét c¸ch hiÖu qu¶ th× viÖc chñ ®éng gi¸m s¸t huyÕt thanh häc, dÞch tÔ häc, c«n trïng häc virus Dengue g©y nªn bÖnh sèt Dengue/sèt xuÊt huyÕt Dengue lµ hÕt søc cÇn thiÕt. C¸c ph−¬ng ph¸p chñ yÕu chÈn ®o¸n huyÕt thanh häc cña virus Dengue bao gåm: Ph¶n øng Ng¨n ng−ng kÕt hång cÇu (HI), ph¶n øng kÕt hîp bæ thÓ (CF), ph¶n øng trung hßa gi¶m ®¸m ho¹i tö (PRNT), ph¶n øng miÔn dÞch hÊp phô g¾n enzym ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ IgM (MAC-ELISA) vµ ph¶n øng miÔn dÞch hÊp phô g¾n enzym ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ IgG (GAC-ELISA), kü thuËt RT- PCR Ngoµi bÖnh SD/ SXHD, Héi chøng viªm ®−êng h« hÊp cÊp tÝnh nÆng (SARS) lµ mét bÖnh dÞch míi xuÊt hiÖn trªn ph¹m vi toµn cÇu. SARS ®· xuÊt hiÖn t¹i 23 Quèc gia: Trung Quèc, Hång K«ng, Singapore, Canada, Hoa Kú, ViÖt Nam, Malaysia, Th¸i Land… TÝnh ®Õn th¸ng 04 n¨m 2004 trªn toµn thÕ giíi ®· cã tæng sè m¾c/ tæng sè chÕt lµ: 3169/ 144 ng−êi (Theo Tæ chøc Y tÕ ThÕ giíi- WHO) [39]. T¸c nh©n g©y bÖnh SARS lµ mét biÕn thÓ hä Corona (Coronaviridae); Mét nhãm virus cã thÓ g©y bÖnh cho c¶ ng−êi vµ ®éng vËt [41]. Trªn ng−êi, Corona th−êng g©y ra viªm ®−êng h« hÊp trªn, chñ yÕu ng−êi tr−ëng thµnh. Ngoµi ra 2
còng cÇn chó ý tíi mét sè lo¹i vi khuÈn, virus c¬ héi th−êng xuyªn cã mÆt ë ®−êng h« hÊp cña ng−êi; Cã thÓ gãp phÇn g©y ra c¸c béi nhiÔm ®−êng h« hÊp d−íi vµ viªm phæi kh«ng ®iÓn h×nh trªn bÖnh nh©n SARS. Virus nµy cã søc ®Ò kh¸ng yÕu, tån t¹i víi ®éng lùc lín trong kh«ng khÝ m¸t l¹nh kho¶ng 2- 5 giê. Virus SARS nh¹y c¶m víi nhiÖt ®é cao, tia cùc tÝm, c¸c ho¸ chÊt khö trïng… Nguån bÖnh vµ æ chøa virus SARS: Ch−a biÕt râ rµng. Ng−êi cã thÓ lµ nguån bÖnh chÝnh trong chuçi m¾t xÝch l©y truyÒn Ng−êi- Ng−êi. Ng−êi bÖnh SARS, nhÊt lµ bÖnh nh©n nÆng ®ang trong giai ®o¹n khëi ph¸t vµ toµn ph¸t lµ nguån truyÒn nhiÔm nguy hiÓm. Theo qui luËt chung cña c¸c bÖnh do virus th× SARS cã thÓ th¶i mÇm bÖnh tõ 5 ®Õn 15 ngµy sau khëi ph¸t. Thêi gian ñ bÖnh trung b×nh 7 ngµy; Mét sè tr−êng hîp cã thÓ kÐo dµi tíi 14- 15 ngµy [32]. TriÖu chøng: H¾t h¬i, ch¶y n−íc mòi, ng¹t mòi, ho, ®au häng hoÆc khã thë…Cã thÓ dÉn ®Õn biÕn chøng nh−: NhiÔm khuÈn huyÕt, viªm mµng n·o do béi nhiÔm vi khuÈn… §Ó chÈn ®o¸n bÖnh nµy, ng−êi ta th−êng: Ph¸t hiÖn trùc tiÕp virus hoÆc kh¸ng nguyªn virus. Cã thÓ cã kÕt qu¶ trong vµi giê nÕu bÖnh phÈm lÊy tèt; Råi tiÕn hµnh c¸c kü thuËt: - MiÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp lµ ph−¬ng ph¸p nh¹y c¶m ®Ó ph¸t hiÖn virus trong mÉu bÖnh phÈm l©m sµng vµ nu«i cÊy tÕ bµo. Tû lÖ d−¬ng tÝnh lµ 30%. - C¸c ph−¬ng ph¸p kh¸c: Ph¶n øng chuçi polymerase (PCR) dïng trong nghiªn cøu. Kü thuËt nµy kh¸ chÝnh x¸c nh−ng ®ßi hái c¸c trang bÞ kü thuËt ®¾t tiÒn còng nh− tay nghÒ cña c¸n bé kü thuËt ViÖc ph¸t hiÖn nhanh virus Dengue g©y bÖnh SD/ SXHD hay bÖnh Viªm ®−êng h« hÊp cÊp SARS sÏ gióp cho c¸c b¸c sü l©m sµng cã h−íng ®iÒu trÞ thÝch hîp vµ 3
c¸c nhµ DÞch tÔ häc ®−a ra c¸c gi¶i ph¸p h÷u hiÖu, lµm gi¶m tû lÖ m¾c vµ tû lÖ chÕt v× bÖnh nµy. Cã nhiÒu ph−¬ng ph¸p chÈn ®o¸n hai bÖnh trªn trong phßng thÝ nghiÖm, tuy nhiªn ®Òu tu©n thñ nguyªn t¾c: - Ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ (IgG, IgM) kh¸ng virus Dengue hay virus Corona trong huyÕt thanh bÖnh nh©n. - X¸c ®Þnh virus trong huyÕt thanh hoÆc trong c¸c tæ chøc cã kh¶ n¨ng nhiÔm virus. Dùa vµo c¸c ®iÒu kiÖn trªn mµ chóng t«i ®−a ra môc tiªu cña Ch−¬ng tr×nh nghiªn cøu nµy lµ: 1. X©y dùng ®−îc qui tr×nh kü thuËt chÈn ®o¸n nhanh vµ chÝnh x¸c sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue vµ bÖnh Viªm ®−êng h« hÊp cÊp (SARS). 2. S¶n xuÊt Bé sinh phÈm chÊt l−îng cao, dÔ sö dông cho viÖc chÈn ®o¸n bÖnh sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue vµ bÖnh Viªm ®−êng h« hÊp cÊp (SARS). 4
Ch−¬ng I. Tæng quan tµi liÖu A. Nghiªn cøu virus dengue g©y bÖnh Sèt Dengue/ Sèt xuÊt huyÕt Dengue ë ViÖt Nam 1.1 BÖnh sèt Dengue vµ sèt xuÊt huyÕt Dengue 1.1.1. BiÓu hiÖn l©m sµng Sèt Dengue/ Sèt xuÊt huyÕt Dengue ®−îc chia thµnh nhiÒu cÊp ®é kh¸c nhau tuú theo møc ®é nÆng cña bÖnh mµ bÖnh nh©n cã nh÷ng biÓu hiÖn nh−: sèt cao tõ 38 0C ®Õn 40 0C, thêi gian kÐo dµi 2-7 ngµy kÌm theo c¸c triÖu chøng ®au ®Çu, ®au c¬, buån n«n, ph¸t ban, cã thÓ kÌm theo rÐt tuy kh«ng thµnh c¬n, cho¸ng v¸ng, chãng mÆt, xuÊt huyÕt d−íi da, xuÊt huyÕt niªm m¹c, xuÊt huyÕt phñ t¹ng. ë thÓ nÆng bÖnh nh©n cã thÓ bÞ sèc hay cßn gäi lµ héi chøng sèc Dengue (HCSD). HCSD x¶y ra víi trÎ em nhiÒu h¬n ë ng−êi lín, phæ biÕn nhÊt vµo ngµy sèt thø 4 ®Õn thø 6, ë bÖnh nh©n nÆng cã dÊu hiÖu suy tuÇn hoµn, ®au bông, bån chån, vËt v·, nÕu kh«ng ®−îc can thiÖp sím bÖnh nh©n cã thÓ bÞ tö vong sau tõ 12 ®Õn 24 giê [8]. C¸c triÖu chøng cña bÖnh th−êng rÊt ®a d¹ng nh−ng l¹i kh«ng cã tÝnh chÊt ®Æc tr−ng. Do ®ã, kh«ng thÓ ph©n biÖt ®−îc sù kh¸c biÖt vÒ l©m sµng gi÷a c¸c bÖnh nh©n nhiÔm c¸c type virus Dengue kh¸c nhau. MÆt kh¸c, c¸c triÖu chøng nµy còng t−¬ng tù nh− c¸c triÖu chøng gÆp ph¶i khi bÞ nhiÔm c¸c lo¹i virus g©y bÖnh kh¸c nh− cóm, sëi, viªm n·o…. C¨n cø theo biÓu hiÖn l©m sµng cña bÖnh SD/ SXHD cã thÓ chia thµnh 3 cÊp ®é sau ®©y : + Sèt Dengue (SD): cßn gäi lµ sèt Dengue cæ ®iÓn, th−êng cã c¸c triÖu 5
chøng nh− c¸c bÖnh nhiÔm virus kh¸c lµ: sèt tõ 38 0 C- 40 0 C, ®au mái c¬ vµ c¸c khíp x−¬ng, ®au ®Çu vïng tr¸n vµ th¸i d−¬ng, rÊt Ýt gÆp m¶ng xuÊt huyÕt d−íi da, tØ lÖ tö vong thÊp (kho¶ng 0.018%) [21]. + Sèt xuÊt huyÕt Dengue: Sèt cÊp tÝnh cao, kÐo dµi 2-7 ngµy kÌm theo nhøc ®Çu, ®au khíp, ®au c¬, xuÊt hiÖn m¶ng hoÆc chÊm xuÊt huyÕt d−íi da, niªm m¹c, xuÊt huyÕt néi t¹ng, h¹ sèt do xuÊt huyÕt nhiÒu, xuÊt hiÖn c¸c biÓu hiÖn nh− ch¶y m¸u mòi, ch¶y m¸u ch©n r¨ng ... nhiÒu vµ kÐo dµi [21] + Héi chøng sèc Dengue: cã c¸c biÓu hiÖn t−îng tù nh− SXHD nh−ng cßn kÌm theo hiÖn t−îng m¹ch ®Ëp nhanh, huyÕt ¸p tôt, da l¹nh vµ −ít. Khi sèc s©u, kÐo dµi cã thÓ dÉn tíi suy thËn cÊp, rèi lo¹n tiªu ho¸, ngõng tim, xuÊt huyÕt néi t¹ng vµ tö vong sau 12-24 giê [30]. ë ng−êi m¾c sèt Dengue th−êng thÊy c¸c ®Æc ®iÓm nh−: H¹ch lympho s−ng ®au toµn th©n, l−îng tiÓu cÇu Ýt gi¶m, gi·n m¹ch ngo¹i vi, b¹ch cÇu gi¶m, hematocrit t¨ng nhÑ. §èi víi tr−êng hîp m¾c SXHD th× cã thªm c¸c ®Æc ®iÓm kh¸c n÷a nh−: gan to, tiÓu cÇu gi¶m, hematocrit t¨ng h¬n 20% so víi b×nh th−êng, cã biÓu hiÖn vµng da, xuÊt huyÕt phñ t¹ng hÖ tiªu ho¸ vµ ngoµi tiªu ho¸ nh− n·o, mµng n·o ... nÆng cã thÓ chuyÓn sang c¸c giai ®o¹n kh¸c nghiªm träng h¬n nh− SXHD thÓ n·o (héi chøng n·o cÊp), SXHD thÓ suy gan cÊp .... 1.1.2 T¸c nh©n truyÒn bÖnh BÖnh SD vµ SXHD l©y qua ®−êng m¸u. C¸c nghiªn cøu vÒ trung gian truyÒn bÖnh ®· x¸c ®Þnh muçi v»n Aedes aegypti (A.aegypti) lµ vector chñ yÕu, ngoµi ra c¸c lo¹i muçi kh¸c nh− Aedes albopictus, Aedes polynesiens còng cã thÓ truyÒn bÖnh SXHD. Muçi A.aegypti lµ lo¹i muçi sèng ë trong nhµ hoÆc xung quanh nhµ. ChØ cã muçi c¸i ®èt ng−êi vµo ban ngµy, chñ yÕu vµo s¸ng sím vµ chiÒu tèi [35]. Muçi c¸i cã thÓ truyÒn bÖnh sau thêi kú ñ bÖnh 3 ®Õn 10 ngµy hoÆc cã thÓ truyÒn bÖnh ngay nÕu ®ang hót m¸u bÖnh nh©n dë dang råi ®èt sang ng−êi kh¸c. N¬i ®Ëu cña muçi lµ nh÷ng chç tèi t¨m trong nhµ nh−: hèc tñ, gÇm gi−êng, gÇm 6
bµn, chç treo quÇn ¸o, ch¨n mµn (80.5%) vµ nh÷ng vËt dông kh¸c. Mét ®iÓm ®¸ng l−u ý lµ muçi A.aegypti cã kh¶ n¨ng truyÒn virus Dengue qua l¨ng qu¨ng, nghÜa lµ virus Dengue cã chu kú xuyªn qua trøng. §©y còng lµ mét yÕu tè quan träng trong c«ng t¸c phßng chèng bÖnh, diÖt muçi tr−ëng thµnh ph¶i ®i ®«i víi diÖt l¨ng qu¨ng trong c¸c vËt chøa n−íc. §iÒu nµy chÝnh lµ c¬ së cña ph−¬ng ph¸p qu¶n lý muçi dùa vµ céng ®ång. Vßng ®êi cña muçi A.aegypti ®−îc thÓ hiÖn ë H×nh 1.1. H×nh 1.1. Vßng ®êi cña Muçi Sau khi bÞ nhiÔm virus, muçi sÏ bÞ nhiÔm suèt ®êi. Muçi c¸i cã thÓ truyÒn virus Dengue cho trøng vµ trøng l¹i cã kh¶ n¨ng tån t¹i rÊt l©u trong ®iÒu kiÖn kh« h¹n (cã thÓ trªn 1 n¨m) [24], ®©y lµ mét yÕu tè khã kh¨n cho viÖc diÖt muçi. Muçi sinh s¶n vµo mïa m−a, ë nh÷ng n¬i chøa n−íc nh©n t¹o (vòng n−íc ®äng, chum, v¹i ...v.v). Thêi gian virus nh©n lªn trong h¹ch n−íc bät muçi lµ tõ 3 – 10 ngµy tuú theo nhiÖt ®é m«i tr−êng. Muçi c¸i cã thÓ truyÒn däc virus Dengue sang thÕ hÖ sau tuy nhiªn ®−êng truyÒn däc nµy kh«ng cã vai trß lín trong c¬ chÕ l©y truyÒn Dengue sang ng−êi, ng−êi vÉn lµ vËt chñ chÝnh nh©n virus Dengue. 1.1.3 T×nh h×nh dÞch bÖnh trªn thÕ giíi Sèt Dengue/ Sèt xuÊt huyÕt Dengue lµ bÖnh nhiÔm virus cÊp tÝnh ®ang lan trµn réng trªn thÕ giíi... BÖnh th«ng th−êng lµ nhÑ (sèt Dengue - SD) nh−ng cã thÓ 7
nÆng nÕu cã xuÊt huyÕt (Sèt xuÊt huyÕt Dengue- SXHD). BÖnh hay bïng næ thµnh dÞch lín ë nh÷ng vïng ch−a tõng bÞ nhiÔm virus Dengue vµ cã ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho sù ph¸t triÓn lan trµn cña vect¬ truyÒn bÖnh. DÞch Sèt Dengue lÇn ®Çu tiªn ®−îc Y v¨n ghi nhËn lµ vµo mïa hÌ n¨m 1780 t¹i Philadenphia, Hoa Kú. Sau ®ã bÖnh ®−îc thÊy ë nhiÒu n−íc nhiÖt ®íi vµ cËn nhiÖt ®íi... T¹i ch©u A, n¨m 1953, SXHD xuÊt hiÖn lÇn ®Çu tiªn ë Manila (philipin). Råi Th¸i Lan, Indonexia, Singapore, India, Banglades... ë vïng T©y Th¸i B×nh D−¬ng, cã tõ 28 ®Õn 35 n−íc ®· tr¶i qua c¸c vô dÞch SD/ SXHD. Sèt Dengue vµ sèt xuÊt huyÕt Dengue ®· ®−îc c¸c n−íc trªn thÕ giíi c«ng nhËn lµ mét vÊn ®Ò Y tÕ c«ng céng quan träng [34]. T¹i ViÖt Nam, SXHD ®−îc ph¸t hiÖn lÇn ®Çu tiªn ë miÒn B¾c vµo n¨m 1958; Cßn miÒn Nam lµ n¨m 1960. Sau ®ã dÞch lan réng tíi hÇu hÕt c¸c tØnh trong c¶ n−íc...Nh÷ng n¨m cã dÞch lín lµ: 1969,1977,1978,1979,1980,1983,1987,1991, 1994, 1998. HiÖn nay bÖnh SD/ SXHD kh«ng chØ l−u hµnh ë thµnh thÞ, khu vùc ®«ng d©n c− mµ cßn lan trµn c¶ c¸c vïng n«ng th«n ®ång b»ng, trung du vµ miÒn nói [26]. Theo thèng kª cu¶ TCYTTG th× ë ViÖt Nam tõ n¨m 1963 ®Õn n¨m 1988 cã sè bÖnh nh©n m¾c trªn sè bÖnh nh©n chÕt vÒ SD/ SXHD lµ 1.111.734/ 10.415; ®©y lµ sè l−îng bÖnh nh©n m¾c vµ chÕt lín nhÊt so víi c¸c n−íc trong khu vùc §«ng Nam A vµ T©y Th¸i B×nh D−¬ng, tÝnh trung b×nh hµng n¨m cã 50.000 - 100.000 ng−êi m¾c SD/ SXHD. BÖnh c¶nh l©m sµng cña sèt Dengue kÌm theo xuÊt huyÕt ®−îc Hamon vµ CS m« t¶ n¨m 1953 ë Manila (Philippine). §Õn n¨m 1956, còng t¹i Manila, virus Dengue ®· ®−îc Sabin ph©n lËp tõ m¸u bÖnh nh©n vµ muçi. Tõ n¨m 1979 ®Õn n¨m 1980 dÞch lan sang vïng nam Th¸i B×nh D−¬ng, B¾c Qeensland (Australia)... 8
ë ch©u Mü, sau vô dÞch ®Çu tiªn t¹i Philadenphia n¨m 1780 th× m·i ®Õn n¨m 1826-1828, ng−êi ta l¹i ghi nhËn cã nh÷ng trËn dÞch t−¬ng tù x¶y ra t¹i vïng biÓn Caribe (Nam Mü). Trong thËp kû tõ 1950 ®Õn 1960, t¹i vïng nµy cã nh÷ng chiÕn dÞch lín nh»m lo¹i trõ muçi truyÒn bÖnh ®· ®−îc tiÕn hµnh ë Mexico, Panama... Nh−ng sau ®ã muçi l¹i xuÊt hiÖn ë hÇu hÕt c¸c n−íc trong vïng. Tõ ®ã tÇn sè c¸c vô dÞch SXHD l¹i t¨ng lªn víi ®Çy ®ñ c¶ 4 type virus Dengue. Trong 15 n¨m gÇn ®©y do sù giao l−u thuËn tiÖn nªn chØ tõ th¸ng 1 ®Õn th¸ng 10/1995 ®· cã 200.000 bÖnh nh©n sèt Dengue vµ 5.500 bÖnh nh©n sèt xuÊt huyÕt Dengue ®−îc b¸o c¸o tõ c¸c n−íc: Brazin, Hondurat, Nicaragoa, Venezuela. Nh×n vµo H×nh 1.2. B¶n ®å dÞch tÔ vÒ t×nh h×nh m¾c SD/ SXHD trªn thÕ giíi cã thÓ nhËn thÊy r»ng dÞch SD/SXHD cã xu h−íng lan réng kh«ng nh÷ng trong mçi n−íc mµ cßn ra nhiÒu n−íc kh¸c; N¨m 1970- 1980 SD/ SXHD lan ra c¸c n−íc trong khu vùv §«ng Nam A; TiÕp theo 1980- 1997, dÞch SD/ SXHD lan sang ¢n §é….Tõ ®ã hµng n¨m cã sù gia t¨ng sè n−íc b¸o cã dÞch vµ sè tr−êng hîp m¾c bÖnh. Råi tiÕp ®Õn c¸c n−íc vïng T©y Th¸i B×nh D−¬ng vµ Trung Mü ®ang lµ vïng ho¹t ®éng m¹nh cña virus Dengue g©y nªn bÖnh SD/ SXHD. Theo thèng kª cña WHO tõ n¨m 1995 ®Õn nay, mçi n¨m cã kho¶ng 50 triÖu ng−êi bÞ nhiÔm virus Dengue víi kho¶ng 500.000 tr−êng hîp ph¶i nhËp viÖn do m¾c SXHD, trong ®ã cã kho¶ng 12.000 tr−êng hîp tö vong hoÆc cao h¬n n÷a nÕu nh− bÖnh nh©n kh«ng ®−îc chÈn ®o¸n vµ ®iÒu trÞ kÞp thêi. §Æc biÖt vµo nh÷ng th¸ng ®Çu n¨m 2004, t¹i In®«nªxia dÞch SD/SXHD ®· bïng ph¸t m¹nh víi tæng sè tr−êng hîp bÞ nhiÔm h¬n 80.000, sè tö vong lµ h¬n 1000 tr−êng hîp [17]. 9
H×nh 1.2. B¶n ®å dÞch tÔ vÒ t×nh h×nh m¾c SD/ SXHD trªn thÕ giíi Nh×n vµo H×nh 1.3, ta thÊy bÖnh SD/ SXHD hiÖn ®ang l−u hµnh t¹i vïng Trung, Nam Mü vµ vïng §«ng Nam A. H×nh 1.3. Vïng l−u hµnh bÖnh SD/ SXHD hiÖn nay 10
BÖnh SD/ SXHD hiÖn ®ang ®e däa tÝnh m¹ng vµ søc kháe têi hµng tû ng−êi n»m trong khu vùc nhiÖt ®íi, A nhiÖt ®íi [14]. 1.1.4 T×nh h×nh dÞch bÖnh ë ViÖt Nam ë ViÖt Nam, tõ n¨m 1913, Gaide ®· th«ng b¸o vÒ bÖnh Dengue cæ ®iÓn ë miÒn B¾c vµ miÒn Trung. N¨m 1929, Boye cã viÕt vÒ mét vô dÞch Dengue cæ ®iÓn x¶y ra ë miÒn Nam ViÖt nam vµo n¨m 1927. MiÒn B¾c ViÖt Nam, vô dÞch SXHD ®©u tiªn ®−îc Mirosky. J, F. Vymola, Hoang Thuc Thuy ghi nhËn vµo mïa hÌ n¨m 1958 [19]. NhiÒu t¸c gi¶ ®· m« t¶ c¸c ®Æc ®iÓm l©m sµng cña 68 bÖnh nh©n n»m viÖn gièng hÖt nh− c¸c nÐt l©m sµng cña nh÷ng tr−êng hîp m¾c SXHD ë c¸c n−íc kh¸c trong vïng ®· ®−îc x¸c minh vÒ mÆt virus häc. TiÕp ®ã, n¨m 1969, ®· cã dÞch lín x¶y ra ë 19 tØnh, thµnh phè miÒn B¾c [23]. Theo Tr−¬ng Uyªn Ninh vµ CS [27]: N¨m 1976 cã 11 tØnh th× ®Õn 1987 lªn ®Õn 17 tØnh thµnh miÒn B¾c cã SD/ SXHD. MiÒn Nam ViÖt Nam, dÞch SXHD ®−îc m« t¶ ®Çu tiªn vµo n¨m 1960 víi 60 bÖnh nh©n tö vong. TiÕp theo, tõ th¸ng 6 ®Õn th¸ng 10 n¨m 1963, cã 331 bÖnh nh©n nhËp ViÖn vµ tö vong 116 tr−êng hîp do virus Dengue type 2 ®· ®−îc Halstead ghi nhËn. Sau ®ã, liªn tôc n¨m nµo còng cã bÖnh nh©n th−êng x¶y ra hµng n¨m ë c¸c tØnh, thµnh phè ®«ng ng−êi, miÒn ®ång b»ng ch©u thæ vµ c¸c vïng ven biÓn. BÖnh ®· lan réng ®Õn c¸c thÞ x·, thÞ trÊn, huyÖn lþ miÒn nói, trªn c¸c trôc ®−êng giao th«ng chÝnh liªn tØnh. Sè m¾c trung b×nh hµng n¨m tõ 50.000 - 100.000 ng−êi. Trong giai ®o¹n 1980-1989, SD/ SXHD cã tû lÖ chÕt ®øng ®Çu: 0,84/100.000 d©n. Tõ 1985-1989 tû lÖ m¾c cao thø ba trong c¸c bÖnh truyÒn nhiÔm: 201,5/ 100.000 d©n, sau héi chøng cóm vµ Øa ch¶y [9]. Theo Lª Hång Hinh vµ CS [10] th× SD/ SXHD lµ mét trong 10 bÖnh truyÒn nhiÔm cã tû lÖ m¾c vµ chÕt cao nhÊt ë ViÖt Nam (1994). 11
1.2. ViruS Dengue M E Lipids từ vật chủ Capsid Hệ gen ssRNA ~ 11 kb Sợi ARN đơn chứa khoảng 11,000 bazơ 5’ Vùng cấu Vùng không N.R. CAP N.C.R ~ 100 nt trúc cấu trúc 650 3 C prM E NS 2a 2b NS 4a 4b NS Enzymes liên quan : NS2B/NS3 serine protease complexe đến quá trình dịch : Furin-like Golgi protease mã : ER signalases H×nh 1.4. H×nh th¸i cÊu tróc cña virus Dengue Vïng NS1..NS5: Khu vùc cã cÊu tróc gièng c¸c virus thuéc hä Flaviviridae (ChiÕm >50% sè l−îng nucleotid trong chuçi ARN) Vïng C-prM-E: Khu vùc cã cÊu tróc riªng biÖt (Khu vùc më) 1.2.1 §Æc ®iÓm h×nh th¸i vµ cÊu tróc Virus Dengue thuéc hä Flaviridae, gièng Flavivirus bao gåm 4 type huyÕt thanh lµ Dengue1, Dengue2, Dengue3, Dengue4. Virus Dengue h×nh khèi cÇu cã ®−êng kÝnh kho¶ng 40-50 nm, chøa mét sîi ARN ®¬n-d−¬ng (kho¶ng 10200 nucleotide). Còng nh− c¸c Flavivirus kh¸c virus Dengue cã mét líp vá 12