Bước đầu nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B bằng phương pháp tiêm ethanol

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br /> <br /> BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME<br /> AMPHOTERICIN B BẰNG PHƢƠNG PHÁP TIÊM ETHANOL<br /> Nguyễn Tuấn Quang*; Phạm Thúy Ngọc**<br /> Vũ Thị Hồng Hạnh**; Nguyễn Văn Lâm**; Phạm Thị Minh Huệ**<br /> TÓM TẮT<br /> Nghiên cứu đã xây dựng quy trình bào chế liposome amphotericin B (AmB) bằng phương<br /> pháp tiêm ethanol (pha loãng ethanol). Hoà tan hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC),<br /> o<br /> cholesterol, AmB trong hỗn hợp ethanol và N,N-dimethylacetamid (DMA) ở 60 C, tiêm nhanh<br /> dung dịch này vào pha nước với tỷ lệ thể tích khác nhau để tạo liposome. Khảo sát ảnh hưởng<br /> của tỷ lệ ethanol/nước, nhiệt độ phối hợp 2 pha và tốc độ khuấy trộn 2 pha thông qua các đặc tính<br /> về kích thước tiểu phân, độ đồng nhất, hình thái và hiệu suất liposome hóa. Kết quả: đã bào chế<br /> được hỗn dịch liposome AmB 50 mg/10 ml có kích thước nhỏ (khoảng 190 nm), đồng nhất (PDI =<br /> 0,136), hiệu suất liposome hóa > 70%, cấu trúc đa khoang đa lớp.<br /> * Từ khoá: Liposome; Amphotericin B; Phương pháp tiêm ethanol; Bào chế.<br /> <br /> INITIAL STUDY OF PREPARATION OF THE LYPOSOME<br /> AMPHOTERICIN B USING ETHANOL INJECTION METHOD<br /> SUMMARY<br /> Liposome amphotericin B (AmB) is prepared by the ethanol injection method (diluting ethanol).<br /> Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC), cholesterol, amphotericin B are dissolved<br /> 0<br /> in the mixture of ethanol and N,N-dymethilacetamid (DMA) at 60 C, then this solution is quickly<br /> injected into water phase with different volumes to create liposome. An investigation has been<br /> made on the effects of the proportion of ethanol phase over water phase, the combining temperature<br /> and the stirring speed of the two phases, basing on the characteristics of the subdivision dimension,<br /> the homogeneity, the morphology and the percentage of entrapment of AmB. The result is a<br /> suspension of liposome AmB 50 mg/10 ml with small dimension (about 190 nm), morphology<br /> (PDI = 0.136), percent of entrapment of AmB (above 70%) and multi-cavity, multi-layer structure.<br /> * Key words: Liposome; Amphotericin B; Ethanol injection method; Preparation.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Amphotericin B là một trong những hệ<br /> mang thuốc mới được nhiều nhà khoa học<br /> trên thế giới quan tâm nhờ có những ưu<br /> <br /> điểm nổi bật về khả năng mang thuốc,<br /> kiểm soát giải phóng thuốc và khả năng<br /> đưa thuốc tới cơ quan đích. Liposome được<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Đại học Dược Hà Nội<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang (dsquang2000@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 25/06/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/09/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 23/07/2014<br /> <br /> 7<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br /> <br /> ứng dụng trong điều trị bệnh ký sinh trùng,<br /> nhiễm khuẩn và điều trị ung thư [1, 4].<br /> AmB là thuốc điều trị nhiễm nấm toàn<br /> thân phổ rộng, được sử dụng từ rất lâu,<br /> chủ yếu dưới dạng tiêm tĩnh mạch trong<br /> trường hợp nhiễm nấm nặng toàn thân.<br /> Tuy nhiên, hạn chế của dược chất này hầu<br /> như không tan trong nước nên sinh khả<br /> dụng thấp và thuốc gây nhiều tác dụng<br /> phụ, đặc biệt là gây độc cho thận. Vì vậy,<br /> việc nghiên cứu dược chất amphotericin B<br /> trong liposome nhằm kiểm soát giải phóng<br /> dược chất, tăng sinh khả dụng là một vấn<br /> đề rất có ý nghĩa. Bài báo này, chúng tôi<br /> trình bày một số kết quả nghiên cứu bước<br /> đầu về bào chế liposome AmB bằng<br /> phương pháp tiêm ethanol.<br /> NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên liệu và thiết bị.<br /> - Nguyên liệu: AmB, hydrogenated soybean<br /> phosphatidylcholin (HSPC), cholesterol,<br /> ethanol, đường sucrose, dinatrisuccinat<br /> hexahydrat và các hóa chất khác theo tiêu<br /> chuẩn USP hoặc tiêu chuẩn nhà sản xuất.<br /> Acetonitril, methanol dùng cho HPLC.<br /> - Thiết bị: máy đồng nhất hoá Unidrive<br /> X1000 (Mỹ), thiết bị lọc tiếp tuyến<br /> MicroKros Filter Moducles (Mỹ), hệ thống<br /> thiết bị phân tích kích thước Zetasizer<br /> nano ZS90 (Anh); hệ thống máy sắc ký<br /> lỏng hiệu năng cao Waters e2695 (Mỹ),<br /> hệ thống kính điện tử truyền qua JEOL<br /> 1010 (Nhật Bản).<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Phương pháp bào chế liposome AmB:<br /> <br /> 8<br /> <br /> Theo phương pháp được Batzri và Korn<br /> mô tả năm 1973, với thành phần lựa chọn<br /> gồm: AmB 50 mg, HSPC 213 mg, cholesterol<br /> 84 mg, succrose 900 mg, dinatri succinat<br /> 27 mg, ethanol tuyệt đối và DMA vđ [3].<br /> Quá trình bào chế theo các bước sau:<br /> - Chuẩn bị pha ethanol: hòa tan HSPC<br /> và cholesterol vào 5 ml ethanol ở 60oC,<br /> điều chỉnh pH bằng axít HCl 2,5N đến pH<br /> 1,0 - 3,0. Hòa tan 50 mg AmB vào 3 ml<br /> hçn hợp dùng môi DMA:EtOH (1:1 v/v).<br /> Phối hợp dung dịch AmB vào dung dịch<br /> phospholipid. Đun cách thuỷ ở 60oC đến<br /> khi thu được pha ethanol màu vàng da cam<br /> trong suốt.<br /> - Chuẩn bị pha nước: đệm dinatri succinat<br /> 9 mM pH 5 - 6 + sucrose 7,5%.<br /> - Phối hợp pha ethanol với pha nước:<br /> tiêm nhanh pha ethanol vào pha nước,<br /> khuấy bằng máy khuấy tốc độ cao với tốc<br /> độ khuấy và nhiệt độ nhất định trong thời<br /> gian 10 phút.<br /> - Lọc tiếp tuyến để cô đặc dung dịch<br /> về thể tích 10 ml. Tiếp tục lọc rửa tiếp<br /> tuyến bằng 100 ml dung dịch pha nước<br /> để thu được hỗn dịch chứa liposome AmB.<br /> Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ<br /> lệ thể tích pha ethanol/pha nước, nhiệt độ<br /> phối hợp 2 pha và tốc độ khuấy trộn 2 pha<br /> đến đặc tính của liposome.<br /> * Phương pháp đánh giá một số đặc<br /> tính của liposome:<br /> - Xác định kích thước tiểu phân (KTTP)<br /> và độ đồng nhất: bằng phương pháp tán<br /> xạ ánh sáng động với thiết bị Zetasizer<br /> ZS90. Pha loãng hệ phân tán liposome<br /> 100 lần bằng nước cất, tiến hành đo KTTP.<br /> Đánh giá kết quả thông qua đồ thị phân<br /> bố kích thước theo thể tích, Zaverage, chỉ số<br /> đa phân tán (PDI).<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br /> <br /> - Xác định hình thái cấu trúc tiểu phân<br /> bằng phương pháp chụp hiển vi điện tử<br /> truyền qua (TEM) với kỹ thuật nhuộm soi<br /> âm bản.<br /> - Xác định hiệu suất liposome hóa:<br /> định lượng AmB trong liposome thô và<br /> liposome sau lọc tiếp tuyến bằng phương<br /> pháp HPLC với điều kiện sắc ký: cột<br /> Cosmosil 5C18-MS-II, kích thước cột 250<br /> <br /> × 4,6 nm; đường kính hạt nhồi 5 µm. Pha<br /> động: hỗn hợp acetonitril (ACN) và natri<br /> EDTA 0,02M (pH 5,0) với tỷ lệ 40:60 (v/v).<br /> Tốc độ dòng 0,8 ml/phút. Thể tích tiêm<br /> mẫu 20 µl. Detector UV tại bước sóng<br /> 405 nm. Hiệu suất liposome hóa (H%)<br /> được tính theo công thức:<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Kết qu¶ khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nƣớc tới đặc<br /> tính của liposome.<br /> Bào chế các mẫu liposome theo quy trình và điều kiện lựa chọn. Cố định nhiệt độ phối<br /> hợp 2 pha là 60oC và tốc độ khuấy trộn 3.900 vòng/phút để khảo sát ảnh hưởng của tỷ<br /> lệ thể tích pha ethanol/pha nước tới đặc tính của liposome. Các mẫu được bào chế với<br /> tỷ lệ thể tích ethanol/nước là 4/100, 6/100, 8/100, 10/100, 15/100 và 20/100 (v/v) tương ứng.<br /> Bảng 1: Đặc tính của các mẫu liposome theo tỷ lệ thể tích ethanol/nước.<br /> MÉu<br /> <br /> ThÓ tÝch pha<br /> ethanol (ml)<br /> <br /> ThÓ tÝch pha<br /> n-íc (ml)<br /> <br /> Zaverage (d.nm)<br /> <br /> PDI<br /> <br /> HiÖu suÊt<br /> liposome hãa (%)<br /> <br /> M4<br /> <br /> 4<br /> <br /> 100<br /> <br /> 235,1<br /> <br /> 0,120<br /> <br /> 69,21<br /> <br /> M6<br /> <br /> 6<br /> <br /> 100<br /> <br /> 227,7<br /> <br /> 0,174<br /> <br /> 68,94<br /> <br /> M8<br /> <br /> 8<br /> <br /> 100<br /> <br /> 204,3<br /> <br /> 0,120<br /> <br /> 73,53<br /> <br /> M10<br /> <br /> 10<br /> <br /> 100<br /> <br /> 157,8<br /> <br /> 0,222<br /> <br /> 67,98<br /> <br /> M15<br /> <br /> 15<br /> <br /> 100<br /> <br /> 194,2<br /> <br /> 0,278<br /> <br /> Không đánh giá<br /> <br /> M20<br /> <br /> 20<br /> <br /> 100<br /> <br /> 176,0<br /> <br /> 0,208<br /> <br /> Không đánh giá<br /> <br /> (a)<br /> <br /> (b)<br /> <br /> Hình 1: Phân bố thể tích các công thức có tỷ lệ thể tích<br /> ethanol/nước trên 10/100 (a) và dưới 10/100 (b).<br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br /> <br /> Kết quả cho thấy: các mẫu khảo sát đều<br /> <br /> 3.900 vòng/phút để khảo sát ảnh hưởng của<br /> <br /> tạo được liposome với kích thước nhỏ<br /> <br /> nhiệt độ phối hợp tới đặc tính của liposome.<br /> <br /> (Zaverage < 300 nm) và tương đối đồng đều<br /> <br /> Các mẫu được bào chế ở nhiệt độ: 30, 45,<br /> <br /> (PDI < 0,3). Tuy nhiên, khi đánh giá về phân<br /> <br /> 60 và 750C.<br /> <br /> bố KTTP ở hình 1, có sự khác biệt rõ ràng<br /> giữa các công thức có tỷ lệ thể tích ethanol<br /> nước từ 10/100 trở lên và công thức có tỷ lệ<br /> <br /> Bảng 2: Đặc tính các mẫu liposome<br /> được bào chế ở nhiệt độ phối hợp khác<br /> nhau.<br /> <br /> thể tích pha ethanol/pha nước dưới 10/100.<br /> ethanol/nước từ 10/100 trở lên có KTTP lớn<br /> <br /> HiÖu suÊt<br /> <br /> NhiÖt ®é<br /> <br /> Theo hình 1 (a) công thức với tỷ lệ thể tích<br /> MÉu<br /> <br /> Zaverage<br /> phèi hîp<br /> o<br /> <br /> (d.nm)<br /> <br /> PDI<br /> <br /> ( C)<br /> <br /> (> 1.000 nm) chiếm đa số thể tích, các tiểu<br /> <br /> lyposome<br /> hãa (%)<br /> <br /> phân có kích thước nhỏ chiếm thể tích không<br /> <br /> M8-30<br /> <br /> 30<br /> <br /> 363,4<br /> <br /> 0,283<br /> <br /> 54,89<br /> <br /> đáng kể. ë hình 1b, các công thức với tỷ lệ<br /> <br /> M8-45<br /> <br /> 45<br /> <br /> 230,3<br /> <br /> 0,142<br /> <br /> 71,02<br /> <br /> M8-60<br /> <br /> 60<br /> <br /> 204,3<br /> <br /> 0,120<br /> <br /> 73,53<br /> <br /> M8-75<br /> <br /> 75<br /> <br /> 239,3<br /> <br /> 0,216<br /> <br /> 67,47<br /> <br /> thể tích pha ethanol/pha nước dưới 10/100,<br /> tiểu phân kích thước nhỏ chiếm đa số,<br /> không xuất hiện tiểu phân kích thước lớn<br /> (>1.000 nm).<br /> <br /> Có sự khác nhau về KTTP và phân bố<br /> <br /> Về hiệu suất liposome hóa: tiến hành<br /> <br /> KTTP các mẫu liposome khi bào chế ở nhiệt<br /> <br /> định lượng và tính hiệu suất liposome hóa<br /> <br /> độ khác nhau. Mẫu M8-60 cho KTTP nhỏ<br /> <br /> của các công thức có tỷ lệ thể tích pha<br /> <br /> nhất và độ đồng nhất cao nhất (Zaverage<br /> <br /> ethanol/pha nước từ 10/100 trở xuống. Kết<br /> <br /> 204,3 nm, PDI = 0,12). Trong khi đó, các<br /> <br /> quả cho thấy các mẫu liposome đều có hiệu<br /> <br /> mẫu liposome bào chế ở nhiệt độ 30oC và<br /> <br /> suất liposome hóa khá cao (> 67%). Trong đó,<br /> <br /> 75oC cho liposome có KTTP và chỉ số PDI<br /> <br /> công thức M8 cho hiệu suất liposome hóa<br /> <br /> lớn hơn. Mặc dù sự khác biệt của chỉ số ở<br /> <br /> cao nhất (73,53%) và công thức M10 cho<br /> <br /> các mẫu không nhiều, nhưng kết quả này<br /> <br /> hiệu suất thấp nhất (67,98%).<br /> <br /> đã chứng minh nhiệt độ chuyển dạng Tc của<br /> <br /> Kết hợp với tài liệu tham khảo [2, 5], lựa<br /> <br /> phospholipid HSPC (khoảng 53oC) có liên<br /> <br /> chọn tỷ lệ thể tích ethanol/nước là 8/100 thu<br /> <br /> quan đến đặc tính của liposome. Ở nhiệt độ<br /> <br /> được mẫu có hiệu suất liposome hóa cao<br /> <br /> thấp (dưới nhiệt độ Tc), phospholipid có cấu<br /> <br /> nhất để tiếp tục nghiên cứu.<br /> <br /> trúc gel bền vững, kém linh hoạt nên làm<br /> <br /> 2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ<br /> phối hợp gi÷a 2 pha tới đặc tính của<br /> liposome.<br /> <br /> giảm khả năng tạo và tái tạo liposome. Vì<br /> vậy, khi tăng nhiệt độ, mẫu M8-30, M8-45<br /> có xu hướng giảm KTTP và tăng độ đồng<br /> nhất. Khi so sánh mẫu M8-75 với mẫu M8-<br /> <br /> Bào chế mẫu liposome theo quy trình và<br /> <br /> 60 (ở trên nhiệt độ T c), KTTP tăng lên và<br /> <br /> điều kiện lựa chọn. Cố định tỷ lệ thể tích<br /> <br /> độ đồng nhất có xu hướng giảm xuống.<br /> <br /> ethanol/nước là 8/100 và tốc độ khuấy trộn<br /> 10<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br /> <br /> Điều này cũng phù hợp với tài liệu tham<br /> <br /> Có sự khác biệt rõ ràng về KTTP và độ<br /> <br /> khảo [6]: nên bào chế liposome ở nhiệt độ<br /> <br /> đồng nhất giữa các công thức khi bào chế<br /> <br /> cao hơn T c của phospholipid, nhưng cũng<br /> <br /> với tốc độ khuấy trộn khác nhau. Công thức<br /> <br /> không nên bào chế liposome ở nhiệt độ quá<br /> <br /> không kết hợp lực phân tán (M8-0) cho tiểu<br /> <br /> cao, vì khi đó, lớp màng phospholipid quá lỏng<br /> <br /> phân có kích thước rất lớn và không đồng<br /> <br /> lẻo, khó tạo liposome.<br /> <br /> nhất (Zaverage = 985,1 nm, PDI = 0,465). Công<br /> <br /> Hiệu suất liposome hóa cho thấy: khi<br /> <br /> thức M8-39, M8-69 và M8-99 đều cho<br /> <br /> nhiệt độ gần kề với nhiệt độ chuyển dạng<br /> <br /> liposome có kích thước tương đối nhỏ và<br /> <br /> của phospholipid, liposome không những<br /> <br /> độ đồng nhất cao. Trong đó, công thức<br /> <br /> đạt kết quả tốt về KTTP, độ đồng nhất mà<br /> <br /> M8-39 tạo liposome có KTTP nhỏ nhất và<br /> <br /> còn đạt hiệu suất cao hơn các nhiệt độ khác.<br /> <br /> độ đồng nhất cao nhất. Đồng thời, hiệu suất<br /> <br /> Từ kết quả trên, lựa chọn nhiệt độ phối<br /> hợp 2 pha là 60oC trong bào chế liposome để<br /> tiếp tục nghiên cứu.<br /> <br /> liposome hóa của công thức M8-39 cũng<br /> cao hơn khi so sánh với công thức M8-69<br /> và M8-99. Do đó, lựa chọn tốc độ khuấy<br /> trộn 2 pha là 3.900 vòng/phút để tiến hành<br /> <br /> 3. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tốc<br /> khuấy trộn tới đặc tính của liposome.<br /> Bào chế các mẫu liposome theo quy trình<br /> và điều kiện lựa chọn. Cố định tỷ lệ thể tích<br /> ethanol/nước là 8/100 và nhiệt độ phối hợp<br /> 2 pha là 600C để khảo sát ảnh hưởng của<br /> tốc độ khuấy trộn khi phối hợp tới đặc tính<br /> của liposome. Mẫu được bào chế với tốc độ<br /> khuấy trộn là 0, 3.900, 6.900 và 9.900<br /> vòng/phút.<br /> <br /> bào chế liposome AmB.<br /> 4. Kết quả đánh giá đặc tính của mẫu<br /> liposome AmB đã lựa chọn.<br /> Tiến hành bào chế 3 mẫu liposome AmB<br /> theo công thức và quy trình bào chế như ở<br /> phần phương pháp nghiên cứu với các<br /> thông số lựa chọn: tỷ lệ thể tích pha<br /> ethanol/pha nước là 8/100, nhiệt độ phối<br /> hợp 2 pha là 600C và tốc độ khuấy trộn<br /> 3.900 vòng/phút<br /> <br /> Bảng 3: Đặc tính các mẫu liposome<br /> được bào chế với tốc độ khuấy trộn khác<br /> <br /> Bảng 4: Đặc tính các mẫu liposome<br /> AmB.<br /> <br /> nhau.<br /> HiÖu suÊt<br /> <br /> TèC ®é<br /> MÉu<br /> <br /> Zaverage<br /> khuÊy trén<br /> <br /> (d.nm)<br /> <br /> PDI<br /> <br /> (v/ph)<br /> <br /> M8-0<br /> <br /> Không<br /> khuấy trộn<br /> <br /> MÉu<br /> <br /> liposome<br /> <br /> 693,1<br /> <br /> 0,509<br /> <br /> l-îng<br /> <br /> lIposome<br /> <br /> AmB (mg)<br /> <br /> hãa (%)<br /> <br /> 204,3<br /> <br /> 0,120<br /> <br /> 32,19<br /> <br /> 73,53<br /> <br /> đánh giá<br /> <br /> M8-2<br /> <br /> 177,8<br /> <br /> 0,128<br /> <br /> 33,67<br /> <br /> 73,98<br /> <br /> 189,1<br /> <br /> 0,159<br /> <br /> 32,53<br /> <br /> 72,10<br /> <br /> 190,4 ±<br /> <br /> 0,136 ±<br /> <br /> 32,80 ±<br /> <br /> 73,20 ±<br /> <br /> 13,3<br /> <br /> 0,02<br /> <br /> 0,78<br /> <br /> 0,98<br /> <br /> 204,3<br /> <br /> 0,120<br /> <br /> 73,53<br /> <br /> M8-3<br /> <br /> M8-69<br /> <br /> 6.900<br /> <br /> 220,2<br /> <br /> 0,242<br /> <br /> 73,11<br /> <br /> X + SD<br /> <br /> 11<br /> <br /> PDI<br /> <br /> HiÖu suÊt<br /> <br /> M8-1<br /> <br /> Không<br /> <br /> 3.900<br /> <br /> 9.900<br /> <br /> (d.nm)<br /> <br /> Hµm<br /> <br /> hãa (%)<br /> <br /> M8-39<br /> <br /> M8-99<br /> <br /> Zaverage<br /> <br /> 289,3<br /> <br /> 0,312<br /> <br /> 69,10<br /> <br />