Nghiên cứu định lượng đồng thời paracetamol và diclofenac natri trong chế phẩm bằng HPLC

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PARACETAMOL VÀ<br /> DICLOFENAC NATRI TRONG CHẾ PHẨM BẰNG HPLC<br /> NGUYỄN HỮU TIẾN - NGUYỄN VIẾT KHẨN<br /> Trường Đại học Y Dược - Đại học Huế<br /> PHẠM VIỆT TÝ<br /> Trường Đại học Sư phạm - Đại học Huế<br /> Tóm tắt: Trên thị trường dược phẩm hiện nay xuất hiện rất nhiều chế phẩm<br /> đa thành phần, trong đó có sự kết hợp giữa paracetamol (PAR) và diclofenac<br /> natri (DS). Điều này đặt ra yêu cầu cần có quy trình phân tích chính xác và<br /> đơn giản xác định hai hoạt chất trên. Bài báo này trình bày kết quả xây dựng<br /> quy trình phân tích paracetamol (PAR) và diclofenac natri (DS) bằng<br /> phương pháp HPLC. Kết quả nghiên cứu đã lựa chọn được điều kiện sắc ký:<br /> Cột sắc ký HiQ Sil C18 (250 x 4,6mm, 3µm), pha động gồm MeOH – đệm<br /> acetat pH 5,0 (80 : 20 v/v), tốc độ dòng: 0,7ml/phút và phát hiện ở bước<br /> sóng 281 nm. Phương pháp có độ chính xác và độ đúng cao, vì vậy quy trình<br /> có thể sử dụng để định lượng nhanh paracetamol (PAR) và diclofenac natri<br /> (DS) trong chế phẩm, dược phẩm.<br /> Từ khóa: Paracetamol, Diclofenac natri, HPLC.<br /> <br /> 1. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Paracetamol (N-(4-hydroxyphenyl) acetamide) là thuốc giảm đau hạ sốt được ưu tiên<br /> chọn lựa điều trị các chứng đau nhẹ và trung bình. Diclofenac natri (Sodium [o-(2,6dichloroanilino) phenyl] acetate) là dạng muối của diclofenac, thuốc kháng viêm nonsteroid. Trên thị trường hiện nay xuất hiện một số chế phẩm kết hợp hai hoạt chất trên,<br /> được chỉ định trong các trường hợp viêm khớp hay đau cơ xương… Tuy nhiên hiện tại<br /> dược điển Việt Nam 4 cũng như dược điển Mỹ 32 chỉ mới có các chuyên luận định<br /> lượng riêng lẻ từng hoạt chất [1], [7]. Một số bài báo công bố phương pháp định lượng<br /> đồng thời hai hoạt chất trên bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao, sắc ký lỏng siêu tới<br /> hạn [2], [3], sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao [4] hay phương pháp quang phổ UV-Vis<br /> [5]. Vì vậy, chúng tôi xây dựng quy trình phân tích paracetamol (PAR) và diclofenac<br /> natri (DS) bằng phương pháp HPLC. Quy trình đã được ứng dụng phân tích đồng thời<br /> paracetamol (PAR) và diclofenac natri (DS) trong các loại thuốc viên nén được sử dụng<br /> phổ biến hiện nay.<br /> 2. MẪU PHÂN TÍCH, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Mẫu phân tích<br /> - Chế phẩm thử : 2 chế phẩm viên nén bao phim có hàm lượng ghi nhãn 500mg<br /> Paracetamol và 50 mg Diclofenac natri : viên Zengesic có số lô 040613, hạn dùng<br /> <br /> Tạp chí Khoa học và Giáo dục, Trường Đại học Sư phạm Huế<br /> ISSN 1859-1612, Số 03(39)/2016: tr. 86-92<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PARACETAMOL VÀ DICLOF...<br /> <br /> 87<br /> <br /> 29/06/2015 của công ty TNHH Stada và viên Padinas có số lô 1303, hạn dùng<br /> 10/06/2015 của công ty Dược phẩm Trường Thọ.<br /> 2.2. Hóa chất - dung môi<br /> - Chất chuẩn thứ cấp Paracetamol (PAR): hàm lượng 100,3%, độ ẩm 0,09%, SKS :<br /> 041323 của trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm TT-Huế.<br /> - Chất chuẩn thứ cấp Diclofenac natri (DS): hàm lượng 97,22%, độ ẩm 0,23%, SKS :<br /> 051107 của trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm TT-Huế.<br /> - Methanol (MeOH); Natri acetat, acid phosphoric, NaOH sử dụng trong nghiên cứu của<br /> Merck, Đức.<br /> 2.3. Thiết bị<br /> - Hệ thống HPLC – detector PDA Shimadzu 20AD, Nhật.<br /> - Cân phân tích Mettler Toledo, Thụy Sĩ (d = 0,1mg), máy đo pH Oakton pH700 (Nhật).<br /> 2.4. Phương pháp nghiên cứu<br /> Chuẩn bị các dung dịch:<br /> - Dung dịch chuẩn gốc DS: Cân chính xác khoảng 50 mg DS vào bình định mức 50 ml,<br /> hòa tan và định mức đến vạch bằng MeOH.<br /> - Dung dịch chuẩn gốc PAR: Cân chính xác khoảng 50 mg PAR vào bình định mức 50<br /> ml, hòa tan và định mức đến vạch bằng MeOH.<br /> - Dung dịch chuẩn hỗn hợp : Từ các dung dịch chuẩn gốc pha loãng bằng pha động<br /> thành các dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa PAR nồng độ khoảng 100 µg/ml và DS nồng<br /> độ khoảng 10 µg/ml.<br /> - Dung dịch thử : Cân chính xác 20 viên chế phẩm thử, tính khối lượng trung bình viên.<br /> Nghiền mịn, cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 100 mg PAR cho vào<br /> bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml MeOH, siêu âm trong 15 phút. Thêm MeOH<br /> đến vạch, lắc đều. Ly tâm. Lấy chính xác 10 ml dịch trong ở trên cho vào bình định mức<br /> 100 ml, pha loãng bằng pha động đến vừa đủ thể tích. Lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm.<br /> 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> 3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký<br /> - Qua tham khảo tài liệu và với điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, chúng tôi sử<br /> dụng cột HiQ Sil C18 (250 x 4,6mm, 3µm) trong nghiên cứu này. Nghiên cứu khảo sát<br /> trên nhiều dung môi pha động với các tỷ lệ khác nhau : MeOH, acetonitril, đệm acetat<br /> pH 7,0, đệm phosphat pH 5,0. Kết quả cho thấy với hệ dung môi MeOH – đệm acetat<br /> pH 5,0 pic hai hoạt chất sắc đẹp, cân đối. Để lựa chọn tỷ lệ pha động cho thời gian phân<br /> tích hợp lý, nghiên cứu đã khảo sát các tỷ lệ khác nhau của 2 dung môi trên và lựa chọn<br /> được hệ pha động: MeOH – đệm acetat pH 5,0 (80 : 20 v/v).<br /> <br /> 88<br /> <br /> NGUYỄN HỮU TIẾN và cs.<br /> <br /> - Để lựa chọn bước sóng định lượng thích hợp, chúng tôi phân tích phổ UV của hai hoạt<br /> chất bằng detector DAD. Do DS trong chế phẩm có hàm lượng bằng 1/10 so với PAR<br /> nên ưu tiên bước sóng cho đáp ứng cao của DS. Từ đó chúng tôi lựa chọn bước sóng<br /> 281nm làm bước sóng định lượng trong nghiên cứu này.<br /> Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi đã chọn được điều kiện sắc ký tối ưu như đã trình<br /> bày.<br /> 3.2. Thẩm định phương pháp<br /> Tính tương thích của hệ thống sắc ký<br /> Tính tương thích của hệ thống sắc ký được xác định bởi tiến hành tiêm lặp lại 6 lần<br /> dung dịch chuẩn của PAR 95,94 µg/ml và DS 10,96 µg/ml. Kết quả khảo sát tính thích<br /> hợp của hệ thống sắc ký được trình bày tại bảng 1.<br /> Bảng 1. Khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký<br /> Thông số sắc ký<br /> Thời gian lưu<br /> Diện tích peak<br /> Số đĩa lý thuyết<br /> <br /> PAR<br /> <br /> DS<br /> <br /> TB<br /> <br /> 3,739<br /> <br /> 5,167<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 0,08<br /> <br /> 0,37<br /> <br /> TB<br /> <br /> 1608209<br /> <br /> 179274,5<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 0,35<br /> <br /> 0,06<br /> <br /> TB<br /> <br /> 4963,2<br /> <br /> 7820,1<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 0,76<br /> <br /> 0,88<br /> <br /> Các số liệu thu được cho thấy hệ thống sắc ký chọn lựa là tương thích cho việc phân<br /> tích định lượng đồng thời PAR và DS.<br /> 3.3. Tính chọn lọc và khoảng tuyến tính<br /> Tính chọn lọc<br /> Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu trắng và dung dịch chuẩn hỗn hợp. Sắc ký đồ được<br /> trình bày ở hình 1a, 1b<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PARACETAMOL VÀ DICLOF...<br /> <br /> 89<br /> <br /> Hình 1. Sắc ký đồ các mẫu: a. hỗn hợp chuẩn; b. mẫu trắng;c. định lượng viên ZENGESIC;<br /> d. định lượng viên PADINAS<br /> <br /> Kết quả ở hình 1 cho thấy trên sắc ký đồ mẫu trắng tại vị trí tương ứng thời gian lưu của<br /> PAR và DS (3,739 và 5,167 phút) không có píc. Kiểm tra phổ UV bằng detector PDA<br /> mẫu thêm chuẩn và đánh giá độ tinh khiết píc (purity index) cho thấy píc có độ tinh<br /> khiết cao. Do vậy, phương pháp có tính chọn lọc.<br /> Khoảng nồng độ tuyến tính<br /> Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng bằng dung môi pha động thành các dung dịch chuẩn<br /> thứ cấp có nồng độ chính xác khoảng 57,56 – 134,31 µg/ml đối với PAR và 6,58 –<br /> 15,34 µg/ml đối với DS.<br /> Tiến hành sắc ký, kết quả được trình bày ở bảng 2 và hình 2.<br /> Bảng 2. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính<br /> C (µg/ml)<br /> <br /> 57,56<br /> <br /> A (mAU.s)<br /> <br /> 2<br /> 981330 1300031 1615148 1942169 2294077 r = 0,9995<br /> <br /> C (µg/ml)<br /> <br /> 6,58<br /> <br /> A (mAU.s)<br /> <br /> 109958 145241<br /> <br /> PAR<br /> <br /> 76,75<br /> <br /> 8,77<br /> <br /> 95,94<br /> <br /> 115,13<br /> <br /> 134,319<br /> <br /> y = 17029x -7265<br /> <br /> 10,96<br /> <br /> 13,15<br /> <br /> 15,34<br /> <br /> y = 16532x + 238<br /> <br /> 179661<br /> <br /> 217199<br /> <br /> 255190<br /> <br /> r2 = 0,9995<br /> <br /> DS<br /> <br /> Hình 2. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của PAR và DS<br /> <br /> 90<br /> <br /> NGUYỄN HỮU TIẾN và cs.<br /> <br /> Kết quả cho thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ<br /> giữa nồng độ với diện tích píc.<br /> Độ chính xác<br /> Đánh giá độ chính xác của phương pháp trên chế phẩm viên bao Zengesic. Chuẩn bị<br /> dung dịch mẫu đánh giá độ chính xác như đối với chuẩn bị dung dịch thử tiến hành trên<br /> 6 mẫu cân riêng biệt. Kết quả được trình bày ở bảng 3.<br /> Bảng 3. Kết quả đánh giá độ chính xác của phương pháp<br /> STT<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> Trung bình<br /> RSD %<br /> <br /> Khối lượng bột PAR<br /> (mg)<br /> S (mAu.s)<br /> 128,3<br /> 1610232<br /> 134,5<br /> 1679682<br /> 136,8<br /> 1677093<br /> 132,0<br /> 1621559<br /> 128,6<br /> 1599432<br /> 132,4<br /> 1639453<br /> <br /> HL %<br /> 102,04<br /> 101,66<br /> 99,28<br /> 99,65<br /> 100,58<br /> 100,74<br /> 100,66<br /> 1,08<br /> <br /> DS<br /> S (mAu.s)<br /> 154072<br /> 161616<br /> 169133<br /> 159900<br /> 160284<br /> 161436<br /> <br /> HL %<br /> 99,96<br /> 100,17<br /> 102,54<br /> 100,61<br /> 103,19<br /> 101,57<br /> 101,34<br /> 1,30<br /> <br /> Kết quả ở bảng 3 cho thấy phương pháp có độ lặp lại cao với RSD đều nhỏ hơn 2,0%.<br /> Độ đúng<br /> Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn. Thêm chính xác lượng chuẩn<br /> PAR và DS vào mẫu thử đã nghiền mịn có khối lượng tương ứng 1 viên, lượng hoạt<br /> chất thêm vào tương ứng với 10% lượng hoạt chất trong viên (khoảng 50 mg PAR và 5<br /> mg DS), 20% lượng hoạt chất trong viên (khoảng 100 mg PAR và 10 mg DS). Mẫu<br /> được thêm chuẩn 6 lần. Kết quả được trình bày ở bảng 4.<br /> Bảng 4. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp<br /> <br /> % tìm lại<br /> 98,43<br /> <br /> DS<br /> Lượng thêm (mg)<br /> 5,3<br /> <br /> % tìm lại<br /> 99,25<br /> <br /> 49,2<br /> <br /> 101,42<br /> <br /> 4,8<br /> <br /> 100,21<br /> <br /> 3<br /> <br /> 48,7<br /> <br /> 100,82<br /> <br /> 5,1<br /> <br /> 100,39<br /> <br /> 4<br /> <br /> 100,2<br /> <br /> 99,50<br /> <br /> 10<br /> <br /> 99,30<br /> <br /> 5<br /> <br /> 99,4<br /> <br /> 100,40<br /> <br /> 9,9<br /> <br /> 98,59<br /> <br /> 6<br /> <br /> 101,1<br /> <br /> 99,70<br /> <br /> 9,4<br /> <br /> STT<br /> 1<br /> 2<br /> <br /> PAR<br /> Lượng thêm (mg)<br /> 51,1<br /> <br /> TB<br /> <br /> 100,05<br /> <br /> 99,47<br /> 99,53<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 1,06<br /> <br /> 0,67<br /> <br />