Các quá trình và thiết bị công nghệ sinh học : MÁY ĐIỆN DI part 2

Chia sẻ: Safskj Aksjd | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

85
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nhanh, điện áp cao Những ứng dụng nào đó, như là kiểm tra các mẫu, có thể thực hiện nhanh dưới điều kiện điện áp cao. Làm lạnh (−200C ) và giới hạn thời gian vận hành 5 phút hoặc ít hơn ở điện áp 500 V. Chậm hơn, điện áp cao hơn Một gradient điện áp 12V/cm (150V) trong 30 ÷ 40 phút (sử dụng dung dịch đệm 1% gel agaroza và 0,5 X TBE) cắt Hind III của lamda ADN thành các đoạn 0,1 ÷ 23 kb

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Các quá trình và thiết bị công nghệ sinh học : MÁY ĐIỆN DI part 2

Nhanh, âiãûn aïp cao Nhæîng æïng duûng naìo âoï, nhæ laì kiãøm tra caïc máùu, coï thãø thæûc hiãûn nhanh dæåïi âiãöu kiãûn âiãûn aïp cao. Laìm laûnh (−200C ) vaì giåïi haûn thåìi gian váûn haình 5 phuït hoàûc êt hån åí âiãûn aïp 500 V. Cháûm hån, âiãûn aïp cao hån Mäüt gradient âiãûn aïp 12V/cm (150V) trong 30 ÷ 40 phuït (sæí duûng dung dëch âãûm 1% gel agaroza vaì 0,5 X TBE) càõt Hind III cuía lamda ADN thaình caïc âoaûn 0,1 ÷ 23 kb. Hoàûc, duìng dung dëch nhæ váûy, máùu naìy coï thãø chaûy åí 24 V/cm (300V) thç coï thãø phán càõt trong 20 ÷ 30 phuït. Laìm laûnh thiãút bë træåïc khi tiãún haình. Chuï yï: - Nãúu khäng âäø thãm maìu vaìo cháút loíng laìm nguäüi thç âàût trãn nãön täúi âãø quan saït dãù daìng hån. - Âàût thiãút bë coìn noïng lãn nãön âæåüc laìm laûnh coï thãø aính hæåíng âãún nhiãût âäü xung quanh. Nãúu sæû quaï nhiãût khäng âæåüc kiãøm soaït, gel seî tan hoàûc thiãút bë seî cong. - Etydi bromua laì cháút àn da maûnh, nãn cáön mang bao tay. - Âeo kênh chàõn tia UV vaì baío vãû da khi sæí duûng âeìn UV. - Tênh gradient âiãûn aïp, chia âiãûn aïp âàût vaìo cho khoaíng caïch giæîa caïc cæûc 12,7 cm. (1) Baíng 15.2. Âiãûn aïp âàût vaìo vaì thåìi gian âãö nghë Âiãûn aïp, V Gradient, V/cm Thåìi gian, phuït 5 (1) 500 40 10 (1) 400 31 20 (1) 300 24 30 ÷ 40 200 16 30 ÷ 60 150 12 Ghi chuï: (1) Âãø thåìi gian chaûy êt hån hoàûc bàòng 20 phuït, sæí duûng 0,5X TBE vaì laìm laûnh nãön âãún −200C træåïc khi sæí duûng. Sau khi phán ly 1- Ngàõt âiãûn, thaïo dáy dáùn, thaïo nàõp. 2- Nãúu khäng thãm etydi bromua vaìo gel hoàûc máùu træåïc khi chaûy, nhuäüm gel trong dung dëch 0,5 ÷ 1 mg/ml etydi bromua trong næåïc hoàûc âãûm. 3- Laìm saûch thiãút bë. 327
Váûn haình Caïc loaûi gel agaroza âæåüc chuáøn bë láön âáöu trong khuän âuïc gel. Nhæîng máùu âæåüc naûp vaìo trong caïc bãø chæïa vaì âæåüc phán ly. Thuäúc nhuäüm huyình quang C12H20BrN3 coï thãø âæåüc thãm vaìo cháút âãûm âiãûn di hoàûc gel hoàûc caí hai âãø tçm ra dáúu hiãûu cuía quaï trçnh phán ly. Sau khi âiãûn di, gel coï thãø cho maìu, ghi laûi maìu, tháúm maìu thãm hoàûc sáúy tæû âäüng. - Âäø âáöy läù våïi cháút taíi laûnh. Duì khäng laìm laûnh âi næîa thç âiãöu quan troüng laì phaíi âäø âáöy läù våïi dung dëch laìm laûnh âàûc træng træåïc khi sæí duûng vç dung dëch cung cáúp nguäön nhiãût cáön thiãút. Chuáøn bë 600 ml våïi 50/50 C2H2(OH)2/H2O - Âãø giuïp xem caïc bãø chæïa âæåüc roî raìng hån trong khi naûp máùu, thãm 1 hoàûc 2 gioüt thuäúc nhuäüm hoaì tan hoàûc maìu thæûc pháøm vaìo dung dëch laìm laûnh. Tçm ra hai läù hoíng naûp næåïc åí pháön trãn cuía läù. Âäø âáöy läù hoíng âãún mæïc coï thãø nhæ cháút laìm laûnh bàòng äúng phun hoàûc maïy båm våïi 50 ml. Báúm nuït caosu maìu náu vaìo mäùi läù. - Sàõp xãúp dung dëch âaî chuáøn bë trong thuìng âaï hoàûc bãn trong maïy laûnh hoàûc tuí laûnh âãø khäng dæåïi 200C trong khoaíng 1 giåì træåïc khi sæí duûng (hoaï cháút âæåüc dæû træî trong phoìng laûnh hay tuí laûnh). Chuï yï: - Khäng âäø âáöy läù våïi cháút chäúng âäng thæång maûi, dung mäi hæîu cå hoàûc næåïc cáút. - Khäng cáön thiãút thay thãú cháút laìm laûnh. 15.3.4. Tênh kãút quaí Hiãûn tæåüng âiãûn di cháút gel coï thãø sæí duûng nhæîng maính nhoí ADN khoaíng 0,1 kb hay nhoí hån loaûi gel polyacrylamit thæåìng sæí duûng nhæîng maính nhoí hån 1 kb. Tênh âiãûn di cuía ADN. Näöng âäü agaroza qui âënh cho quaï trçnh phán ly thaình nhæîng maính våî våïi nhæîng kêch thæåïc khaïc nhau âæåüc cho trong baíng 15.3. Baíng 15.3. Näöng âäü âãø âiãûn di cuía caïc maính våî ADN âäúi våïi caïc loaûi cháút khaïc Hiãûu quaí cuía nhæîng âoaûn thàóng âäúi Âiãûn di, % våïi sæû phán giaíi 1,0 ÷ 3,0 0,5 0,8 ÷ 12 0,7 0,5 ÷ 10 1,0 0,4 ÷ 7 1,2 0,2 ÷ 3 1,5 328
Nhæîng nhán täú khaïc aính hæåíng âãún kãút quaí quaï trçnh phán ly bao gäöm: cháút âãûm, âiãûn aïp âàût vaìo, nhiãût âäü , cáúu taûo vaì sæû coï màût cuía etydi brommua, caïc agaroza âàûc biãût coï sàôn. Tiãu chuáøn chung cho âoaûn Hind III phage λ. Loaûi cho 8 maính våî sàõp xãúp trong khoaíng tæì 0,1 âãún 23 kb cho mäùi càûp 2 såüi. Âãø phán giaíi täút, di chuyãøn trãn âoaûn 10 cm máút 45 phuït 1% gel agaroza trong gel 0,5 X TBE åí âiãûn aïp 150V. Tênh âiãûn di cuía ARN ARN coï thãø phán chia âæûa theo kêch thæåïc cå baín. Âãø traïnh taïc âäüng âãún thåìi kyì chuyãøn hoaï cáúu truïc ARN âæåüc biãún tênh træåïc hay suäút thåìi gian âiãûn di. Vê duû: âoaûn ARN âaî biãún tênh træåïc våïi glyoxal vaì âimetyl sunfoxit coï thãø gel agaroza âäüc láûp, hay ARN coï thãø bë càõt phán âoaûn. Gel agaroza chæïa hydroxyt thuyí ngán II metyl hay focmaldehyt. 15.3.5 Sæû phaït hiãûn ADN ADN coï thãø âæåüc phaït hiãûn nhåì sæû phaït huyình quang cuía liãn kãút etydi bromua (C2H10BrN3) hay nhåì phæång phaïp chuûp aính bàòng tia X cuía âäöng vë phoïng xaû ADN. Etydi bromua (0,5 µg/ml) coï thãø âæåüc thãm vaìo dung dëch âãûm di chuyãøn, âãø quan saït sæû biãún âäüng cuía máùu, vç sæû phaït huyình quang cuía thuäúc nhuäüm dæåïi taïc duûng cuía tia cæûc têm seî âæåüc biãøu hiãûn åí daûng daíi (âãø xaïc âënh âæåüc sæû biãún âäøi âoï; tàõt nguäön cung cáúp nàng læåüng vaì chuyãøn âäøi thaình pháön agaroza cuî ra nàõp thiãút bë âënh tia cæûc têm gáön khay váûn haình. Âàût nàõp laûi vaì báût âeìn âãø bàõt laûi sæû âiãûn di). Ngoaìi ra, sau khi âiãûn di, gel biãún maìu trong dung dëch hoaì tan (etydi bromua 10,5 µg/ml H2O) khoaíng tæì 10 âãún 60 phuït räöi quan saït vaì chuûp aính máùu bàòng phæång phaïp chiãúu tia cæûc têm. Âãø chuûp aính gel, duìng phæång phaïp chiãúu tia cæûc têm trãn bãö màût taûi mäùi vë trê åí âéa váûn haình hoàûc di chuyãøn nheû baín gel trãn bãö màût seî quan saït âæåüc täúi âa (Âéa váûn haình coï 95 % aïnh saïng tràõng våïi bæåïc soïng 254 nm vaì 40 % aïnh saïng tràõng våïi bæåïc soïng 254 nm). Quan saït máùu bàòng tia cæûc têm åí bæåïc soïng 366 nm hoàûc laìm giaím cæåìng âäü tia cæûc têm xuäúng 302 nm âãø giaím sæû phaït huyình quang cuía etydi bromua khäng liãn kãút, gel coï thãø bë máút maìu båíi sæû huït áøm cuía noï trong 5 phuït våïi MgCl2 0,01M hoàûc trong 1 giåì våïi MgSO4 0,001M. Sæû máút maìu âaî taûo âiãöu kiãûn dãù daìng âãø phaït hiãûn haìm læåüng ADN nhoí. 15.3.6. Nhæîng chuï yï cáön thiãút Nàõp an toaìn phaíi âæåüc làõp træåïc khi näúi nguäön âiãûn våïi nguäön cung cáúp nàng læåüng. 329
Tàõt táút caí caïc cäng tàõc âiãûn vaì ngàõt nguäön cung cáúp âiãûn træåïc khi thaïo nàõp an toaìn. Træåïc khi sæí duûng láön âáöu, laìm âáöy läù våïi 1 læåüng 600 ml 50/50 etylen glycol/ næåïc âãø ngàn chàûn sæû täøn tháút khäng thãø häöi phuûc cho thiãút bë. Läù chæïa læåüng trãn coï thãø âäø âáöy ngay caí khi khäng cáön laìm laûnh theo yãu cáöu. Khäng sæí duûng næåïc cáút, cháút chäúng âäng thæång maûi hoàûc báút kyì dung mäi hæîu cå naìo âãø âäø vaìo läù âoï. Næåïc âæåüc láúy ra khi âoïng bàng. Nãúu khäng noï bë huït vaìo bãn trong dung dëch vaì phaï våî liãn kãút. Dung mäi hæîu cå seî gáy ra sæû täøn tháút hoaï cháút khäng thãø häöi phuûc cho thiãút bë. Khäng laìm laûnh læåüng dung dëch cho vaìo läù âoï dæåïi −200C (−40F). Coï thãø laìm laûnh læåüng dung dëch âoï trong thuìng âaï, maïy laìm laûnh hoàûc trong tuí laûnh. Khäng âiãöu chènh nhiãût âäü dung dëch âãûm hoàûc gel trãn 500C. Ngàn chàûn sæû âun noïng quaï nhiãût bàòng caïch laìm laûnh læåüng dung dëch âoï træåïc khi sæí duûng. Âãø ngàn chàûn sæû âun noïng quaï nhiãût trong quaï trçnh keïo daìi chaûy âiãûn aïp cao, thay thãú læåüng dung dëch thæï nháút bàòng læåüng dung dëch thæï 2 âaî âæåüc laìm laûnh. Sæû âun noïng quaï nhiãût seî gáy ra sæû täøn tháút khäng thãø häöi phuûc cho thiãút bë Laìm saûch Sau mäùi láön sæí duûng, laìm saûch thiãút bë bàòng cháút táøy nheû vaì næåïc, suïc cáøn tháûn våïi næåïc cáút vaì laìm khä bàòng khäng khê. Khäng âæåüc âàût thiãút bë vaìo dung dëch hoàûc khê thåm hoàûc caïc hydrocacbon halogen hoaï, xeton, este, alcol (trãn 30%) hoàûc axit âàûc (trãn 25%). Âãø traïnh laìm báøn DNaza vaì ARNza, ngám caïc khoang chæïa âãûm hoàûc khuän âuïc khoaíng 10 phuït trong dung dëch H2O2 3%, sau âoï suïc cáøn tháûn våïi DEPC âæåüc xæí lyï räöi cho vaìo näöi háúp (duìng næåïc âaî âæåüc ion hoaï âãø háúp). Thay thãú miãúng boüt âãûm Thaïo nhæîng miãúng boüt âãûm moìn. Thaïo voí miãúng âãûm måïi. Sàõp âãûm cho thàóng vaì âãø noï vaìo vë trê cuäúi cuía khay doüc theo caûnh ngàõn (7 cm), màût sau cuía tæåìng vaì sau âoï eïp vaìo âuïng vë trê. Làûp laûi våïi miãúng âãûm thæï hai trãn tæåìng âäúi diãûn våïi miãúng âãûm thæï nháút. 15.3.7. Âiãöu chènh thiãút bë âiãûn di Bãø chàõn máùu. Âãø cho gel âàûc laûi täúi thiãøu laì 30 phuït vaì giæî åí nhiãût âäü phoìng træåïc khi thaïo læåüc. Khi thaïo læåüc giæî åí caûnh ngàõn vaì náng nheû âãø traïnh gáùy gel. Giæî âãø khäng hoíng bãø chæïa, duìng pipet âãø láúy máùu, cäú gàõng cho vaìo giæîa bãø vaì khäng laìm thuíng âaïy bãø. 330
Máùu thæí khäng chaûy doüc theo cäüt Nãúu chaíy thaình såüi trãn khay bë hoíng thç phaíi thay thãú. Giaím âiãûn aïp. Choün cháút âãûm våïi näöng âäü vaì haìm læåüng dung dëch âãûm thêch håüp (læåüng dung dëch âãûm TBE chæïa nhiãöu hån loaûi TAE). Nãúu cháút âãûm bë thaïo ra hãút thç ngæng hoaût âäüng, thaïo nàõp, duìng äúng huït láúy cháút âãûm tæì läù khaïc cho vaìo bãn trong läù âäúi diãûn âãún khi âáöy cháút âãûm. Nãúu cháút gel khäng âäöng nháút, âàût khuän âuïc nàòm ngang træåïc khi âäø däön gel (âãø laìm hoaì láùn vaìo nhau). Càûp khuän âuïc Læåüc phaíi âàût thàóng âæïng âãø traïnh laìm biãún daûng bãø chæïa. Giaím låïp âãûm 1 mm tæì bãö màût åí phêa trãn gel, giaím gradien nhiãût âäü. Taïi taûo gel khäng âuí cháút læåüng Thãm ficoll, glyxerol hay âæåìng (mêa) vaìo nhiãöu dung dëch láúy máùu âãø baío âaím máùu làõng xuäúng âaïy bãø (choün cháút ficoll) Chàõc chàõn máùu thæí âæåüc hoaì tan hoaìn toaìn. Giaím âiãûn thãú. Giaím näöng âäü máùu thæí. Giaím thãø têch máùu. Cáön êt nháút 1 mm gel dæåïi âaïy læåüc âãø traïnh máùu rè ra tæì âaïy bãø. Giaím näöng âäü muäúi trong máùu thæí. Kiãøm tra âäü enzim, máùu thæí coï thãø cáön taïc âäüng láu (xuïc taïc xaíy ra quaï trçnh) vaì mäüt loaûi cháút âãûm khaïc haûn chãú sæû di chuyãøn. Pha chãú máùu måïi nãúu nghi ngåì máùu bë nhiãùm báøn. Choün loaûi agaroza våïi täúc âäü tháøm tháúu cháûm. Âàût khay âuïng vë trê, khäng áún maûnh vaìo bãn trong. 331