Chuyên đề: Ứng dụng của vi sinh vật trong bệnh đái tháo đường

Chia sẻ: Nguyễn Thị Mỹ Hạnh | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:22

Thêm vào BST

Báo xấu

226
lượt xem 45
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Với sự phát triển từng bước của ngành vi sinh vật học, sinh học phân tử và di truyền học, các nhà vi sinh vật học y học đã nghiên cứu, nuôi sống và giữ gìn vi sinh vật có ích trong những điều kiện tối ưu, nhằm lợi dụng những hoạt động có ý nghĩa của nó để tạo ra các chế phẩm có ích như: vacxin, kháng sinh, hoocmon,…

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Chuyên đề: Ứng dụng của vi sinh vật trong bệnh đái tháo đường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM KHOA: MÔI TRƯỜNG VÀ TÀI NGUYÊN BÀI TIỂU LUẬN Chuyên đề: GVHD:Th.S Nguyễn Ngọc Tâm Huyên Tên nhóm: Trần Thị Kim Ngân MSV 10149122 Nguyễn Thị Hồng Nhung MSV 10149137 Trịnh Bửu Hồng Phương MSV 10149152 Cao Thị Thanh Thảo MSV 10149176 Đinh Thị Cẩm Thu MSV 10149190 Phan Thị Ngọc Tuyền MSV 10149236 TP.HCM, tháng 8 năm 2011.
MỤC LỤC 1. Khái quát ........................................................................................................4 1.1. Sơ lược về bệnh tiểu đường ....................................................................4 1.2 Sơ lược về Insulin ................................................................................4 1.2.1. Nguồn gốc.............................................................................................4 1.2.2. Cấu tạo.................................................................................................5 1.2.3. Phân loại...............................................................................................6 1.2.4. Cơ chế ..................................................................................................6 2. Quy trình sản xuất Insulin...........................................................................6 2.1. Quy trình sản xuất Insulin trước đây ........................................................6 2.1.1. Đặc điểm .............................................................................................6 2.1.2. Nhược điểm..........................................................................................7 2.2. Quy trình sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp để sản xuất Insulin.........7 2.2.1. Khái quát quy trình công nghệ ADN tái tổ hợp...................................7 2.2.1.1. Phân lập...........................................................................................8 2.2.1.2. Tạo vector tái tổ hợp......................................................................8 2.2.1.3. Biến nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào.............................................9 2.2.1.4. Chọn lọc, tạo dòng và biểu hiện của gen...................................10 2.2.2. Ý nghĩa sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp sản xuất Insulin.........11 2.2.3. Quy trình sản xuất Insulin bằng công nghệ ADN.............................11 2.2.3.1. Phương pháp 1..............................................................................11 2.2.3.2. Phương pháp 2..............................................................................14 2.2.4. Các phương pháp sản xuất Insulin bằng khác..................................15 3. Ưu và nhược điểm của Insulin..................................................................17 4. Nguyên tắc dử dụng và bảo quản Insulin................................................19 4.1. Nguyên tắc sử dụng.................................................................................19 4.2. Bảo quản Insulin......................................................................................19 5.Kết luận và kiến nghị..................................................................................20 Tài liệu tham khảo..........................................................................................21 2
Như các bạn đã biết vi sinh vật là những sinh vật vô cùng nh ỏ bé không th ể trông thấy bằng mắt thường. Tuy nhỏ, nhưng chúng lại có ảnh hưởng vô cùng to lớn đến đời sống của chúng ta. Với sự phát triển từng bước của ngành vi sinh vật học, sinh học phân tử và di truyền học, các nhà vi sinh vật học y h ọc đã nghiên c ứu, nuôi s ống và gi ữ gìn vi sinh vật có ích trong những điều kiện tối ưu, nhằm lợi dụng nh ững hoạt đ ộng có ý nghĩa của nó để tạo ra các chế phẩm có ích như: vacxin, kháng sinh, hoocmon,…giúp phòng điều trị bệnh cho người. Ngày xưa cũng như ngày nay,có những căn bệnh có lịch sử rất lâu đời, ph ổ bi ến và gây khó khăn,trở ngại cho việc điều trị bằng các dược ph ẩm hoá h ọc, trong đó có bệnh tiểu đường.Vậy có biện pháp nào khác giúp đỡ các bệnh nhân này? Câu tr ả l ời là vi sinh vật. Đối với bệnh tiểu đường, người ta dùng một loại vi sinh vật để điều trị đó là Insulin.Câu hỏi đặt ra ở đây là Insulin co tác dụng gì, v ới nh ững ưu nh ược đi ểm nào. Sau đây,chúng ta hãy cùng nhau bước vào tìm hiểu các vấn đề này nha!  3
GIỚI THIỆU CHUNG Insulin được 2 nhà sinh lý học người Canada là Fred Banting và Charles Best tìm ra năm 1921. Quá trình nghiên cứu sản xuất insulin có s ự đóng góp rất quan tr ọng của các chú chó. Banting và Best đã cắt bỏ tuy ến tụy c ủa nh ững chú chó và h ậu qu ả là chúng bị đái tháo đường. Họ đã cố gắng tinh chiết ra m ột hormone hóa h ọc t ừ t ụy và chiết xuất nhiều thành phần từ tiểu đảo Langerhan. Sau đó, nh ững ch ất này đ ược tiêm vào chú chó bị đái tháo đường để thử nghiệm và họ nh ận thấy bệnh đái tháo đường bị đẩy lùi. Ban đầu, thuốc tiêm lẫn nhiều tạp chất và thường gây nh ững tai biến nguy hiểm, một đội ngũ các nhà khoa h ọc đã phối h ợp nghiên c ứu và t ạo ra được tinh chất chiết xuất từ tiểu đảo Langerhan, bảo đảm đủ độ tinh khiết để thử nghiệm trên người bệnh. Vào 11 tháng 1 năm 1922, Leonard Thomson-14 tuổi đã được điều trị thành công ở bệnh viện Toronto bằng tinh chất này (insulin). Ông đã sống được đến ngày 20 tháng 4 năm 1935, thọ được 27 tuổi (sau 13 năm 3 tháng tiêm insulin). Collip và MacLeod là những người đầu tiên đã dùng chiết xuất t ừ ti ểu đ ảo Langerhan (Insulin) để tiêm cho Leonard Thomson tại Toronto (Canada) ngay sau khi Banting và Best chiết suất được vài ngày Năm 1928, Oskar Wintersteiner đã ch ứng minh rằng insulin là một protein. Năm 1955, Frederick Sanger-người đoạt giải Nobel đã tìm ra chuỗi axit amin c ủa insulin người. Điều này đã cho phép các nhà khoa học tạo ra một gene insulin, dùng để tạo ra chủng vi khuẩn biến đổi di truyền có khả năng sinh ra số l ượng l ớn insulin với độ tinh khiết cao. Insulin người được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền đầu tiên tại Công ty Genetech (Hoa Kỳ) và sản phẩm này được đưa ra thị trường vào năm 1982. Trong lịch sử, đây cũng là lần đầu tiên các nhà nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học vào dược phẩm thành công. 4
MỘT SỐ VI SINH VẬT TRONG ĐỜI SỐNG 1. KHÁI QUÁT: 1.1 Sơ lược về bệnh tiểu đường: -Tiểu đường là một dạng bệnh do rối loạn chuyển hóa carbon hydrate khi hormone insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện ở mức đường máu luôn cao. -Bệnh tiểu đường có 2 thể bệnh chính: bệnh tiểu đường loại 1 do tụy không tiết ra insulin, loại 2 do tiết giảm insulin và đề kháng insulin. -Biểu hiện: gia đoạn mới phát sinh, người bệnh thường đi tiểu nhiều, tiểu vào ban đêm và kèm theo chứng khô miệng, khát nước. -Nguyên nhân phát sinh bệnh: do insulin tiết ra thiếu hoặc không đủ và tế bào có tính mẫn cảm với insulin giảm thấp, dẫn tới sự rối loạn quá trình trao đổi đường, nước, chất béo và chất điện giảm trong cơ thể. 1.2 Sơ lược về Insulin: 1.2.1 Nguồn gốc: - Insulin là một hormon quan trọng, giúp cơ thể h ấp thu glucose - m ột trong những thành phần chính cung cấp năng lượng cho con người. - Nguồn gốc của insulin: • Từ nguồn gốc động vật • Từ tụy của bò hay lợn. Ngày nay, insulin được tinh ch ế bằng phương pháp sắc kí độ tinh khiết hóa rất cao. • Insulin người. - Được sản xuất từ insulin động vật qua các phương pháp: • Bán tổng hợp từ insulin lợn. • Tái tổ hợp gen: là loại insulin trung tính đơn thành phần, đ ược sản xuất bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA, sử dụng nấm men làm cơ thể sinh sản đạt đến độ tinh khiết hóa và chất lượng cao nhất, có cấu trúc giống hệt insulin tự nhiên của người, do v ậy ít tạo kháng thể và thời gian tác dụng ngắn hơn. 5
1.2.2 Cấu tạo: - Là một protein gồm 51 aa tạo thành 2 chuỗi polypeptid. Ở hầu h ết các loài, chuỗi A gồm 21 aa, chuỗi B gồm 30 aa n ối nhau b ằng 2 c ầu n ối S- S(disulfua) - Trọng lượng phân tử khoảng :5800-6000 Dalton Cấu trúc của phân tử insulin Hình 1. Cấu trúc của phân tử insulin Mặc dù trình tự các aaxitamin khác nhau giữa các loài nh ưng một s ố đo ạn nh ất đ ịnh của phân tử có tính bảo tồn cao, các đoạn đó có ch ứa 3 c ầu n ối disulfua, c ả hai đ ầu của chuỗi A và các nhánh bên của đầu COOH của chuỗi B. Sự tương đồng trong tình tự axitamin dẫn đến cấu trúc 3 chiều của Insulin ở các loài khác nhau rất giống nhau. Insulin chiết rút từ động vật có hoạt tính sinh học cao hơn các loài khác 6
CẤU TRÚC KHÔNG GIAN CỦA INSULIN 1.2.3 Phân loại: -Có 4 loại insulin: • Insulin có tác dung nhanh • Insulin tác dụng bán chậm (trung bình) • Insulin tác dụng chậm • Insulin hốn hợp 1.2.4 Cơ chế: - Thời gian bán hủy 3-5 phút - Bị phá hủy tại đường tiêu hóa bởi enzym proteinase tại dạ dày - Hấp thu tốt bằng đường tiêm. Mức độ phụ thuộc vào nồng độ insulin, vị trí tiêm, độ sâu của mũi tiêm, vận động - Insulin bị chuyển hóa tại gan, thận, cơ. Trong đó 50% tại gan - Đào thải qua thận 2. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN: 2.1 Quy trình sản xuất Insulin trước đây: 2.1.1. Đặc điểm quy trình: Sau khi hai nhà khoa học người Canada ( Frederick G. Bantingvà Charles H. Best )phát hiện ra insulin và vai trò của chúng t ừ thí nghi ệm v ề nh ững chú chó, từ những thập niên 1920 cho đến những năm đầu của th ập niên 1980, insulin được tao ra băng cach cô lâp từ tuyên tuy cua đông vât như ̣ ̀ ́ ̣ ́ ̣ ̉ ̣ ̣ heo và bo. Tuy nhiên, insulin người có sự khac biêt trong thanh phân acid ̀ ́ ̣ ̀ ̀ amin so với insulin bò (hai vị trí trong chuôi A và môt vi ̣ tri ́ trong chuôi B) ̃ ̣ ̃ và insulin heo (môt vị trí trong chuôi B). Do đó gây ra những tac dung ̣ ̃ ́ ̣ không mong muôn (như dị ứng) khi sử dung insulin có nguôn gôc từ heo ́ ̣ ̀ ́ 7
hay bo. Ngoài ra, quá trình sản xuất và tinh sạch insulin từ động vật còn ̀ gặp nhiều khó khăn. Sau đó, cac phương phap ban tông h ợp insulin ng ười ́ ́ ́ ̉ từ insulin heo và bò đã được phat triên băng cac sử dung phan ứng chuyên ́ ̉ ̀ ́ ̣ ̉ ̉ peptide (transpeptidation) sử dung trypsin. ̣ Nhược điểm của việc sản xuất Insulin dùng trong lâm sàng chủ yếu có nguồn gốc động vật ( bò và lợn). Tụy của động vật này sẽ được dùng đ ể tách chiết insulin , vì thế cần một lượng lớn tụy mới có thể sản xuất một lượng nhỏ insulin. Việc insulin được sản xuất trực tiếp từ tụy động vật thường có cấu trúc không hoàn toàn giống với insulin người, hoạt động chức năng trong cơ thể kém hơn so với insulin người , kh ả năng h ấp th ụ kém, có thể gây ra những phản ứng phụ. Mặt khác trong quá trình tách chiết, không thể loại bỏ hết đươc những tác nhân gây b ệnh c ủa động vật, quá trình tách chiết này đòi hỏi kỷ thuật cao, chi phí đắt, không thể sản xuất với qui mô rộng lớn, giá thành cao. 2.1.2. Nhược điểm quy trình sản xuất Insulin chiết xuất từ động vật: - Insulin động vật (bò và lợn) có cấu trúc không hoàn toàn gi ống c ấu trúc Insulin ở người - Hoạt động chức năng trong cơ thể kém hơn so với insulin của người’ - Khả năng hấp thụ kém - Có thể gây ra phản ứng miễn dịch trong cơ thể người( gây dị ứng) - Trong quá trình tách chiết, không loại bỏ hết các tác nhân gây bệnh từ đông vật - Quá trình tách chiết đòi hỏi kỹ thuật cao - Chi phí đắt (do cần lượng lớn tụy để sản xuất insulin) -Không thể sản xuất lượng lớn trên quy mô lớn -Giá thành cao. 2.2 . Quy trình sử dụng công nghệ AND tái tổ hợp để sản xuất Insulin: 2.2.1. Khái quát về công nghệ AND tái tổ hợp: - Kỹ thuật AND tái tổ hợp là tập hợp nhiều kỹ thuật để tạo ra một gen hoặc cả hệ gen ; cải biến cấu trúc của gen, nhằm tạo ra các gen mới rồi chuyển chúng vào trong tế bào, cơ thể chủ nhằm mục đích sản xuất các sản phẩm ( protein, enzym,…), các tế bào, cơ thể có tính trạng mới theo mong muốn 8
- Những hiểu biết sâu sắc về các đại phân tử sinh học là cơ sở khoa h ọc của kỹ thuật gen( kỹ thuật di truyền) mà khởi đầu là k ỹ thu ật AND tái t ổ hợp - Kỹ thuật AND tái tổ hợp gồm các bước cơ bản sau: • Tách chiết tạo ra AND, ARN theo mong muốn ( phân lập gen) • Tạo vector tái tổ hợp ( chuẩn bị vector tách dòng, enzym cắt giới hạn và enzym nối) • Chuyển ( biến nạp) AND tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng gen • Sàng lọc và theo dõi sự hoạt động của gen được chuy ển vào trong tế bào chủ, tạo số lượng lớn đoạn AND theo mong muốn để sử dụng vào mục đích khác nhau. 2.2.1.1. Phân lập gen: * Tách chiết AND:tùy theo nguồn axit nucleic,có nh ững kiểu tách chiết khác nhau: - Đối với vi khuẩn, nuôi vi khuẩn thu sinh kh ối lớn, phá vỡ màng, loại bỏ protein bằng enzim, kết tủa và tinh sạch AND bằng hóa chất, dung môi, dịch chiết thích hợp. - Đối với mô, tế bào động thực vật, nguyên tắc tách chiết AND như trên. Tuy nhiên chúng ta trực tiếp lấy các mẫu sinh phẩm như lông, tóc, thịt, máu, nước bọt., mô thân , rễ, lá…. * Tách chiết ARN: quy trình tương tự tách chiết AND, dịch chi ết sau khi làm sạch protein, sử dụng enzim phân hủy AND, kết t ủa thu ARN. * Định lượng AND, ARN: sản phẩm sau khi tách chiết cần có độ tinh sạch và hàm lượng đủ cho nghiên cứu, dùng phương pháp đo quang phổ để xác định chỉ số hấp phụ, tù đó đánh giá độ tinh sạch và hàm lượng cần thiết. Hoặc dùng phương pháp điện di trên gel thạch xác định băng AND, ARN, suy ra độ tinh s ạch và hàm l ượng cần thiết cho nghiên cứu. 2.2.1.2. Tạo vector tái tổ hợp: 9
► Vector tách dòng: là phân tử AND có kích thước nhỏ, có khả năng gắn các gen cần thiết, tự tái bản, tồn tại trong tế bào chủ và đặc biệt phải mang tín hiệu nhận biết trong tế bào chủ đã mang vector tái tổ hợp -Các loại vector tách dòng thường dùng :  Plasmid : phân tử AND dạng vòng, xoắn kép, có trong tế bào chất của vi khuẩn.  Phagơ : phần lớn là phagơ Lamda, có hệ gen chứa v ị trí thu ận lợi cho cài các gen khác nhau, giúp các gen này dễ dàng xâm nhập vào vi khuẩn có khả năng và có khả năng sao chép nhanh.  Virut của tế bào nhân thực : virut SV40, adenovirut, retrovirut, virut herpes…được sử dụng trong tách dòng và chuyển gen ở tế bào động vật, thực vật ► Enzym cắt giới hạn: là enzym có khả năng nhận biết một đoạn trình tự trên phân tử AND và cắt AND ở những điểm đặc hiệu. Đồng thời cắt gen từ hệ gen nào đó, cắt vector tách dòng hoặc vector tái t ổ hợp, tạo điều kiện gắn các đoạn gen cần thiết. ► Enzym nối Ligasa: là những enzym quan trọng trong tế bào, chúng xúc tác hình thành các liên kết photphodieste để nối các đo ạn axit nucleic với nhau. -Có 3 loại enzym nối quan trọng trong Công nghệ di truyền: enzym E.Coli AND tách chiết từ vi khuẩn E.Coli, enzym T 4 AND và enzym T4 ARN tách chiết từ phage T4 . Ngoài ra, ngày nay người ta còn sử dụng các đoạn nối (đầu dính - adaptor ) cho các enzym đầu bằng. Adaptor xúc tác nối các đoạn ADN do các enzym cắt đầu bằng từ đó t ạo nên đầu sol. Các adaptor đặc trưng riêng cho mỗi loại enzym. Dùng enzym cắt hạn chế từ hai nguồn AND khác nhau, qua khâu nối trộn lẫn sẽ tạo ra sản phẩm AND tái tổ hợp 2.2.1.3. Biến nạp AND tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng gen: - Đưa AND tái tổ hợp vào tế bào chủ theo kỹ thuật biến nạp( chuy ển trực tiếp AND tái tổ hợp vào tế bào chủ) – tế bào chủ có th ể là vi khuẩn, tế bào động vật, tế bào thực vật; nhờ bộ máy di truyền của tế bào chủ nhân bản AND tái tổ hợp, tạo sinh khối lớn. 10
- Những tế bào chủ chính thường dùng:  Vi khuẩn E.Coli: dễ thao tác, ít tốn kém, sinh s ản nhanh, tạo dòng AND tái tổ hợp nhanh.  Tế bào nấm men, tế bào động vật, thực vật nuôi cấy Invitro; loại tế bào này thường dùng vào mục đích cụ thể; nh ư nghiên cứu điều hòa hoạt động của gen, đột biến gen… - Những phương pháp chủ yếu được dùng để đưa AND tái tổ hợp vào tế bào nhận:  Kỹ thuật siêu âm: chuyển gen vào tế bào trần ( không có thành Xelulose) trong môi trường thích hợp  Kỹ thuật xung điện: sử dụng dòng điện cao áp ( khoãng 500V/cm) tạo lỗ thủng nhỏ trên tế bào trần, tạo điều kiện gen xâm nhập vào hệ gen tế bào chủ  Kỹ thuật vi tiêm: tiêm lượng nhỏ AND vào tế bào chủ hoặc tế bào trứng đã thụ tinh ở giai đoạn phôi 4-8 tế bào  Kỹ thuật bắn gen: dùng thiết bị bắn vi đạn mang gen cần chuyển ( súng bắn gen) vào hệ gen của tế bào chủ. Vi đạn là các h ạt Volfram hoặc vàng trộn với gen cần chuyển và phụ gia, vi đ ạn đ ược bắn vào viên đạn lớn hơn, khi bắn, viên đạn lớn được giữ lại, vi đ ạn bắn vào tế bào nhận với gia tốc lớn. 2.2.1.4. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện của gen: Việc chọn lọc đúng dòng tế bào như ý không đơn giản và t ốn nhi ều công sức. Khi xác nhận ADN tái tổ hợp đã xâm nhập vào tế bào và mang đúng gen cần thiết thì chúng được sinh sản để tạo dòng và tạo điều kiện cho gen biểu hiện  Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmit tái tổ hợp: sau khi biến nạp ADN vào tế bào nhận, tạo nhiều dòng tế bào vi khuẩn khác nhau. Chúng được nuôi cây thành những dòng khuẩn lạc vi khuẩn (gồm dòng tế bào vi khuẩn không nhận được plasmit, dòng nh ận được plasmit không có gen lạ và dòng nhận đúng plasmit tái tổ hợp). Do đó muốn nhận đúng và tách đúng dòng gen từ thư viện ADN, người ta sử dụng phương pháp: 11
- Lai axit nucleic: làm tan tại chỗ các khuẩn lạc vi khuẩn trên giấy lọc nitrocellulose và ADN thoát ra gắn với mẫu thử axit nucleic có mang dấu phóng xạ với độ dài hàng trăm nu. Nếu hiện tượng bắt c ặp bổ sung xảy ra có nghĩa là gen đã được chuyển vào tế bào nhận - Phát hiện kiểu hình: đòi hỏi dòng mục tiêu phải có biểu hiện ra ở dạng protein dễ phát hiện bằng các phép thử. - Phản ứng miễn nhiễm: khi tế bào nhận được plasmit có gắn đoạn ADN lạ thì tế bào vi khuẩn mất hoạt tính kháng tetracyclin, do đó khuẩn lạc chỉ mọc được trên môi trường có ampicilin, không mọc được trên môi trường có tetrecyclin. Đây là dòng tế bào cần chọn  Sự biểu hiện của gen được tạo dòng: nói chung gen lạ sau khi được đưa vào tế bào nhận, muốn gen có biểu hiện tổng h ợp protein cần cấu tạo vector có đủ các yếu tố phiên mã và dịch mã phù hợp trên cơ sở là cơ chế điều hòa biểu biểu hiện của gen. Các vector này gọi là vector biểu hiện. 2.2.2. Ý nghĩa của sử dụng công nghệ AND tái tổ hợp để sản xuất insulin: Sản xuất Insulin bằng công nghệ tái tổ hợp là một bước nhảy vọt trong việc chữa trị bệnh tiểu đường. Ngoài ra một ý nghĩa khá quan trong khi s ử dụng công nghệ này để sản xuất Insulin, đó là hiệu quả kinh t ế, khi s ử dụng công nghệ này, giá thành sản phẩm hạ khá nhiều mà ch ất l ượng s ản phẩm vẫn bảo đảm, chính là nhờ ý nghĩa sản xuất sinh kh ối cao c ủa t ế bào nhân tham gia quy trình con nghệ ADN tái tổ hợp. 2.2.3. Quy trình sản xuất Insulin bằng công nghệ AND tái tổ hợp: Tổng hợp Insulin người là một quá trình sinh hóa gồm nhiều bước, gồm hai phương pháp 2.2.3.1. Phương pháp 1: Tạo ra các chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học hoặc tạo một tiền chất chuỗi đơn proinsulin người, sau đó phân cắt để t ạo thành insulin hoàn chỉnh.  Bước 1: Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học phân tử tách được gen mã hoá proinsulin người trên nhiễm sắc thể số 11. Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người. Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen, loại 12
bỏ protein. Do hầu hết các mARN của người đều có đuôi polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với đuôi polyA đó. Sử dụng sắc kí ái lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho quá trình dịch mã; còn lại loại bỏ ADN và các ARN khác. Cắt bỏ cầu nối A - T thu được mARN. H8 . Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người  Bước 2: Tách và thiết kế plasmit tái tổ hợp. - Cắt gen mã hoá proinsulin và plasmit bằng một loại enzym giới hạn. Nối bằng ADN ligase của phageT4. Trong thành phần của vector biểu hiện phải có các promoter mạnh giúp gen biểu hiện được trong vi khuẩn. -Thiết kế các trình tự mã hoá cho các protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin ra ngoài tế bào chất. Nếu sử dụng mARN tách được từ trên tiến hành như sau: - Sao mARN tinh khiết thành ADN (cADN) nhờ enzym phiên mã ngược và nhờ các dNTP (trong phản ứng RT - PCR) - Cài đoạn cADN mã hoá insulin hoàn chỉnh vào plasmit đứng sau một promoter mạnh. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli.  Bước 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện. 13
H9 . Tách và biến nạp Plasmic tái tổ hợp vào E.Coli Sau quá trình biến nạp, cần chọn lọc được những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn. Qúa trình chọn lọc phụ thuộc vào quy trình và gen đánh dấu trên vector được sử dụng. Thông thường là sử dụng laoij gan kháng sinh Ampixilin hoặc Tetraxilin để chọn lọc. Sau đó kiểm tra dòng chọn lọc theo nhiều cách khác nhau bằng cách giải đoạn trình tự nucleotic của đoạn gen cài vào vector tái tổ hợp và so sánh với trình tự gốc.  Bước 4: Các vi khuẩn chuyển gen sau đó được đưa vào nồi lên men. Nuôi chúng trong các nồi lên men với các điều kiện tối ưu. Sử dụng các phương pháp nuôi cấy liên tục, theo đó các chất dinh dưỡng liên tục được bổ sung để đảm bảo sự tăng trưởng của vi khuẩn theo hàm mũ. Cứ 20 phút lại có hàng triệu vi khuẩ H10- Qúa trình lên men được nhân lên qua nguyên phân. Như vậy, chỉ sau một thời gian ngắn, sinh khối sẽ tăng  Bước 5: Tiền tinh sạch Sau khi lên men cần tách tế bào và khử trùng nhiệt. - Dùng enzym lizozyme phá vỡ màng tế bào, sau đó dùng h ỗn hợp chất t ẩy rửa để tách lớp màng lipit.  Bước 6: Hoạt hoá. 14
Do hệ thống E.coli có khả năng biểu hiện gen insulin nhưng không có khả năng hoạt hoá insulin. Hoạt hoá proinsulin invitro bằng cách xử lý dung dịch đệm, giúp nó đạt cấu trúc bậc 4, sau đó dùng enzym đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin. Khi đó sản phẩm thu được mới có hoạt tính cần thiết. Hình 11:Hoạt hoá proinsulin thành insulin hoàn chỉnh  Bước 7: Hỗn hợp tinh sạch chỉ còn có insulin. Bằng phương pháp sắc ký, tách và phương pháp miễn dịch gắn enzym. Độ tinh sạch của insulin được đánh giá qua mỗi giai đoạn trung gian của quá trình sản xuất nhờ phòng thí nghiệm chuyên hoá. Cuối cùng insulin được tinh thể hoá. Hình 12: Các tinh thể insulin 2.2.3.2. Phương pháp 2: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B. Phương pháp này sẽ tránh được việc sản xuất enzim đặc hiệu cần thiết để biến proinsulin thành insulin. 15
Nhà sản xuất cần hai gen nhỏ đẻ sản xuất hai chuỗi A và B. Xác định trình tự ADN để qua đó tổng hợp và tách hai dòng gen này. Mỗi ADN được chèn vào plasmit. Sau đó sản xuất tương tự như sản xuất proinsulin. Cuối cùng hai chuỗi A và B được trộn với nhau và hình thành cầu nối đisulfua qua phản ứng tái oxi hoá khử nhờ một chất oxi hoá nhất định. Hình 13.Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A và chuỗi B riêng biệt Hình 14: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B. 2.2.4 Các phương pháp sản xuất khác: • Ngày nay, nấm men cũng được sử dụng thay thế cho vi khuẩn E.Coli để sản xuất insulin. Có nhiều ưu điểm: tế bào nấm men tạo phân tử insulin ng ười gần như hoàn chỉnh với cấu trúc không gian hoàn hảo. Điều đó làm giảm tối 16
đa tính phức tạp và giá thành của các giai đoạn tinh s ạch. Sản xuất insulin dựa trên công nghệ gene và công nghệ sinh học mang lại rất nhiều lợi ích và tính năng vượt trội hơn so với việc thu nhận từ động vật. Insulin được s ản xuất trên nhiều hệ thống khác nhau như tế bào E. coli, tế bào Saccharomyces và ngay cả tế bào thực vật, đều có những thành công đáng k ể. Tuy nhiên khi t ạo ra insulin trên các hệ thống trên gặp một số h ạn ch ế. Novo Nordisk là m ột trong những công ty hàng đầu thế giới bán insulin với chất lượng đáng tin cậy, công ty này sản xuất insulin thương mại trên h ệ th ống t ế bào Saccharomyces. Nhóm nghiên cứu của Novo Nordisk tạo insulin trong h ệ thống t ế bào n ấm men nhưng là Pichia cho thấy hệ thống này có nhiều ưu điểm hơn so với hệ thống Saccharomyces. Hiện nay Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh đang nghiên cứu tạo ra insulin theo phương pháp này. Đối tượng được ch ọn đ ể s ản xuất insulin là tế bào nấm men Pichia. Trong giai đoạn đầu nghiên cứu, nhóm thực hiện tổng hợp gene mã hóa cho insulin. Hiện t ại nhóm đang ti ến hành nhân dòng gene mã hóa cho insulin trên plasmid mang pBluescript. Plasmid pBluescript mang gene mã hóa cho insulin sẽ được chuyển nạp vào E. coli. Khi thành công quá trình nhân dòng gene mã hóa cho insulin, gene mã hóa cho insulin sẽ được biểu hiện trong tế bào Pichia. Kiểm tra quá trình biểu hiện protein bằng kháng thể chuyên biệt. Tiến hành thu nhận và tinh sạch protein tái tổ hợp. Bước đầu kiểm tra hoạt tính insulin trên chuột thí nghiệm. • Giả insulin : Cải tiến phương thức hoạt động của insulin trong cơ th ể ng ười b ằng cách thay đổi trình tự axitamin của nó và tạo ra chất tương tự. Insulin giả ít k ết dính v ới nhau hơn và khuếch tán vào máu dễ dàng hơn. Quy trình sản xuất Insulin giả cũng tương tự như quy trình sản xuất insulin trên • phương phap san xuât cua Tâp đoan Eli Lilly: phương phap san xuât nay biêu ́ ̉ ́ ̉ ̣ ̀ ́ ̉ ́ ̀ ̉ hiên chuôi A và chuôi B riêng biêt băng cach sử dung Escherichia coli, sau đó ̣ ̃ ̃ ̣ ̀ ́ ̣ thu chuôi A và chuôi B, trôn với nhau in vitro tao câu nôi disulfur. Phương phap ̃ ̃ ̣ ̣ ̀ ́ ́ nay có hiêu quả san xuât thâp. Do đo, Eli Lilly phat triên môt phương phap cai ̀ ̣ ̉ ́ ́ ́ ́ ̉ ̣ ́ ̉ tiên hơn, phương phap nay biêu hiên proinsulin thay vì biêu hiên chuôi A và B ́ ́ ̀ ̉ ̣ ̉ ̣ ̃ riêng biêt như phương phap cu, tao câu nôi disulfur in vitro, sau đó phân căt ̣ ́ ̃ ̣ ̀ ́ ́ peptide C khoi hai chuôi A và B băng trypsin và carboxypeptidase, tao thanh ̉ ̃ ̀ ̣ ̀ insulin. 17
• Môt phương phap khac được phat triên bởi tâp đoan Novo Nordisk, ph ương ̣ ́ ́ ́ ̉ ̣ ̀ phap nay biêu hiên miniproinsulin bao gôm chuôi B và chuôi A nôi với nhau ́ ̀ ̉ ̣ ̀ ̃ ̃ ́ băng 2 acid amin, được biêu hiên trong nâm men, sau đó xử lý miniproinsulin in ̀ ̉ ̣ ́ vitro băng trypsin tao thanh insulin. Phương phap nay có nhiêu thuân lợi như ̀ ̣ ̀ ́ ̀ ̀ ̣ câu nôi disulfur được hinh thanh trong quá trinh biêu hiên và quá trinh tiêt ̀ ́ ̀ ̀ ̀ ̉ ̣ ̀ ́ miniproinsulin, và miniproinsulin nay được tach chiêt và tinh sach dễ dang do ̀ ́ ́ ̣ ̀ được tiêt thăng ra môi trường nuôi cây. ́ ̉ ́ • Mới đây nhât, Công ty Bio-Technology General đã đưa ra môt ph ương phap ́ ̣ ́ mới. Trong phương phap nay, môt dang protein dung hợp (fusion protein) bao ́ ̀ ̣ ̣ gôm superoxide dismutase (SOD) găn với proinsulin được biêu hiên trong tế ̀ ́ ̉ ̣ bao E.coli. Băng cach nay, hiêu suât cua quá trinh biêu hiên protein và hiêu quả ̀ ̀ ́ ̀ ̣ ́ ̉ ̀ ̉ ̣ ̣ cua quá trinh hinh thanh cac câu nôii. Sau đo, proinsulin được chuyên thanh ̉ ̀ ̀ ̀ ́ ̀ ́ ́ ̉ ̀ insulin nhờ xử lý với trypsin và carboxypeptidase B. • Các nhà khoa học Anh và Mỹ cho biết họ có thể sử dụng tế bào gốc lấy t ừ máu trong dây rốn của trẻ sơ sinh để giúp bệnh nhân tiểu đường loại 1 khôi phục khả năng sản xuất insulin trong cơ thể. • Ưu thế của phương pháp mới Insulin tạo ra gần như hoàn chỉnh với cấu trúc Insulin ở người. Tạo ra một số lượng lớn Insulin trong một thời gian ngắn. Năng suất cao. Nguồn nguyên liệu dễ tìm ,không nguy hại đến môi trường. Trong quá trình tách chiết: dễ thao tác kĩ thuật và chuẩn hóa trong phòng thí nghiệm. Ít tốn kém chi phí. Giá thành rẻ. 3. ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA INSULIN: Insulin tác dụng nhanh Ưu điểm: - Là loại duy nhất dùng trong cấp cứu do tác dụng hạ đường huyết nhanh chóng. - Có thể trộn lẫn với insulin chậm tùy theo mục đích và nhu cầu đi ều trị. - Có thời gian tác dụng ngắn và mạnh để làm giảm đường huyết sau khi ăn. 18
Nhược điểm : Thời gian tác dụng ngắn nên phải tiêm nhiều lần trong ngày (4 mũi tiêm dưới da, thực tế không dùng riêng insulin tác dụng nhanh để đi ều trị mà ph ải kết hợp thêm insulin tác dụng bán chậm hoặc chậm). Insulin tác dụng bán chậm (dịch tiêm đục như sữa) Để làm giảm bớt số lần tiêm trong ngày, người ta đã sản xuất ra lo ại insulin có tác dụng dài hơn gồm 2 loại insulin là NPH (Neutral Protamine Hagedorn) hay IZS (Insulin Zinc Suspension) hay lent để sử dụng trong ch ế độ đi ều trị v ới 2 hay 3 mũi tiêm trong ngày. Ưu điểm: của các loại insulin tác dụng trung bình là có nhiều loại với thời gian tác dụng khác nhau tùy thuộc vào yêu cầu điều trị và sự thuận lợi của bệnh nhân. Nhược điểm: có thể gây đau khi trộn với insulin nhanh. Insulin trộn sẵn (dịch tiêm đục như sữa) Là loại insulin trộn lẫn giữa 2 loại nhanh và trung bình theo tỷ lệ nhất định. - Có tỷ lệ 30% insulin nhanh và 70% insulin trung bình. - Có tỷ lệ 50% insulin nhanh và 50% insulin trung bình. Ngoài ra còn tiến hành trộn theo những tỷ lệ khác mà trong đó loại nhanh chiếm 10- 20- 40%. Ưu điểm: tiện dùng, phù hợp hơn với sinh lý mà không đòi hỏi phải tự trộn lấy liều khi dùng riêng từng loại nhanh chậm. Nhược điểm: vì tỷ lệ pha trộn là cố định nên khó điều chỉnh cho phù hợp với từng tình huống cụ thể: ăn bữa no nếu tăng liều cả insulin nhanh và chậm sẽ gây hạ đường huyết muộn. Trong khi lẽ ra chỉ tăng từ 2 đến 6 đơn vị loại insulin nhanh. Insulin tác dụng chậm (dịch tiêm đục như sữa) Ưu điểm: Chỉ cần một mũi tiêm có tác dụng trong cả 24 giờ trong ngày. Có thể dùng trong kỹ thuật 4 mũi tiêm/ ngày, 3 mũi nhanh vào tr ước các b ữa ăn và một mũi vào lúc đi ngủ (22 giờ) 19
Nhược điểm: Tại chỗ: đỏ, đau nơi tiêm. Hạ đường huyết không lường trước do tác dụng kéo dài chồng chéo với các mũi tiêm khác. Thường không làm giảm được đường máu sau ăn do thời gian hấp thu vào máu chậm 4.NGUYÊN TẮC SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN INSULIN: 4.1 Nguyên tắc sử dụng: Đối với người mắc bệnh tiểu đường loại 2 có thể chọn dùng insulin có hiệu quả trung bình, trước bữa ăn sáng khoảng 30 phút tiêm dưới da (1 lần trong ngày, lượng thuốc bắt đầu khoảng 4-8u) cũng có thể sử dụng hỗn hợp insulin hiệu quả trung bình kết hợp với insulin hiệu quả nhanh trước bữa ăn sáng, cách mấy ngày lại điều chỉnh lượng thuốc. Đối với người mắc bệnh tiểu đường loại 1: dùng phương pháp ở trên thường không đạt được mục đích khống chế bệnh cần phải dùng phương pháp trị liệu cường hóa insulin 4.2 Bảo quản: •Giữ các lọ hay ống bút insulin còn nguyên nắp trong tủ lạnh. Không để insulin kết đông. •Sau khi mở, insulin có thể được giữ ở nhiệt độ nhà (dưới 300) trong 1 tháng và sau đó loại bỏ. •Insulin có thể được di chuyển an toàn trong túi hay túi xách. •Insulin có thể bị hư do nhiệt độ quá cao. Không để nơi nhiệt độ trên 30o hoặc ở ngoài ánh sáng mặt trời. Không dùng insulin nếu: •Insulin màu trong chuyển sang đục. •Quá hạn sử dụng. •Insulin đã đông cứng hoặc tiếp xúc với nhiệt độ cao. •Có đóng cục hay lợn cợn trong insulin. •Thấy có cặn insulin bên trong lọ và không tan ra được khi lắc (tròn) nhẹ lọ. •Lọ đã mở quá 1 tháng. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: 20