Đánh giá khả năng đáp ứng in vitro của cryptococcus neoformans đối với các thuốc kháng nấm

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012<br /> <br /> ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG IN VITRO CỦA CRYPTOCOCCUS<br /> NEOFORMANS ĐỐI VỚI CÁC THUỐC KHÁNG NẤM<br /> Nhữ Thị Hoa, Phạm Quốc Trung*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đánh giá khả năng đáp ứng in vitro của các chủng C. neoformans phân lập từ bệnh nhân viêm<br /> não-màng não đối với amphotericin B (AMB), fluconazol (FLU) và flucytosine (5-FU) bằng phương pháp khuếch<br /> tán trên thạch.<br /> Phương pháp: thử nghiệm in vitro được tiến hành trên 107 loài C. neoformans được phân lập từ bệnh<br /> nhân và lưu trữ tại bộ môn Ký Sinh-Vi Nấm Học, trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch. Phục hồi các loài<br /> C. neoformans trên môi trường SDA hoặc trên chuột bạch đã gây suy giảm miễn dịch và định danh kiểm tra<br /> bằng môi trường Staib-Ajello. Xác định bước sóng và ngưỡng OD tương đương 106 CFU/ml để định lượng dịch<br /> treo nấm bằng quang phổ kế. Môi trường Muller Hinton có bổ sung glucose và methylen blue được sử dụng<br /> trong đánh giá đáp ứng thuốc. Đường kính vòng sạch nấm được đo sau 2 ngày. Phân tích số liệu bằng phần<br /> mềm Stata 10.0.<br /> Kết quả: bước sóng thích hợp để định lượng nồng độ nấm C. neoformans là 640nm; OD tương đương 106<br /> CFU/ml là 0,06. Trong 107 mẫu được khảo sát, 8,4% thuộc var. gattii, 91,6% thuộc var. neoformans. Tỉ lệ C.<br /> neoformans nhạy với amphotericin B, fluconazol, flucytosine lần lượt là 76,6% , 71% , 0,9%; nhạy kém là<br /> 23,4%, 16,8% và 0%. Không ghi nhận trường hợp kháng amphotericin B, trong khi đó, 12,2% C. neoformans<br /> kháng fluconazol và 99% C. neoformans kháng flucytosine. Các chủng kháng tập trung ở nhóm var. neoformans.<br /> Chưa phát hiện mối liên quan giữa khả năng đáp ứng thuốc in vitro với chủng (variety) cũng như việc sử dụng<br /> fluconazol dự phòng.<br /> Kết luận và đề xuất: bước sóng 640nm (máy spectro SC) là bước sóng thích hợp để định lượng nồng độ<br /> dịch treo nấm C. neoformans. Mức độ nhạy của C. neoformans đối với amphotericin B và fluconazol có khuynh<br /> hướng giảm. Cần tiến hành khảo sát MIC của các hoạt chất kháng nấm trên các chủng phân lập từ môi trường<br /> và bệnh nhân nhằm đưa ra kết luận chính xác và cụ thể hơn.<br /> Từ khóa: C. neoformans, bước sóng 640nm, amphotericin B, fluconazol, flucytosine, tỉ lệ kháng, tỉ lệ nhạy.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> IN VITRO SUSCEPTIBILITY OF CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS TO ANTIFUNGALS<br /> Nhu Thi Hoa, Pham Quoc Trung<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 - Supplement of No 1 - 2012: 70 - 75<br /> Objectives: to assess in vitro susceptibility of C. neoformans isolated from meningo-encephalitic patients to<br /> amphotericin B, fluconazol, flucytosine by disk diffusion method.<br /> Method: in vitro susceptibility to amphotericin B, fluconazol, flucytosine of 107 C. neoformans isolates,<br /> preserved in 10% glycerine solution at Pham Ngoc Thach University of Medicine, was assessed by disk diffusion<br /> method. The strains were recovered by inoculating into SDA (Sabouraud dextrose agar) or intra-peritoneal<br /> injection to immunosuppressed mice and identified via Staib-Ajello culture. Optimal wavelength and OD<br /> Bộ môn Ký Sinh-Vi Nấm Hoc, trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch<br /> Tác giả liên lạc: Ths. Nhữ Thị Hoa<br /> ĐT: 0903379566<br /> Email: drnhuhoa@yahoo.com<br /> <br /> 70<br /> <br /> Chuyên Đề Ký Sinh Trùng<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> equivalent to 106 CFU/ml were determined for quantification of yeast cells suspension by spectrophotometry.<br /> Muller-Hinton media supplemented with glucose and methylen blue was used for assessing susceptibility of the<br /> yeast to antifungi. Diameter of antifungal zone was recorded after 48 hours. Data were analyzed with Stata10.0<br /> Results: the optimal wavelength to defining the density of cryptococcal suspension is 640 nm, and OD being<br /> equivalent to 106 CFU/ml is 0.06. Among 107 isolates evaluated, there were 8.4% var. gattii, and 91.6% var.<br /> neoformans. In vitro susceptibility of C. neoformans to amphotericin B, fluconazol, and flucytosine are<br /> respectively: susceptible: 76.6%, 71% and 0.9%; intermediate: 23.4%, 16.8% and 0%. No resistant strains to<br /> amphotericin B were observed, but 99.07% and 12.15% of isolates were readily resistant to flucytosine and<br /> fluconazol respectively. Most of strains resisting to fluconazol and flucytosine belong to var. neoformans. No<br /> correlation between in vitro susceptibility and fungal variety, together with the prophylactic use of fluconazol<br /> were found.<br /> Conclusions and recommendations: wavelength of 640nm (Spectro SC apparatus) is optimal for<br /> determining density of cryptococcal suspension. In vitro susceptibility to fluconazol, amphotericine B tends to<br /> decline. It is really necessary to conduct research on amphotericin B, fluconazol and flucytosine MICs of isolates<br /> from environment and patients.<br /> Key words: C. neoformans, spectrophotometry, amphotericin B, fluconazol, flucytosine, resistance,<br /> susceptibilty.<br /> trong một số C. neoformans gây bệnh trên<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> người(6).<br /> C. neoformans là một trong những tác nhân<br /> Tại Việt Nam, trong khảo sát về viêm nãogây nhiễm trùng cơ hội, đặc biệt trên cơ địa<br /> màng não do C. neoformans năm 2004, N.Q.<br /> HIV/AIDS, do đó, kháng nấm dự phòng đã<br /> Trung ghi nhận 12/15 trường hợp nhập viện lần<br /> được khuyến cáo áp dụng trên các đối tượng<br /> 2 khi đang điều trị duy trì với fluconazol(12).<br /> nguy cơ cao. Ngoài ra trong điều trị, sau đợt tấn<br /> N.L.H. Anh và L.G. Hiếu cũng trình bày 3<br /> công, phác đồ kéo dài cũng được đòi hỏi để<br /> trường hợp tương tự vào năm 2009(11). Tuy<br /> ngăn ngừa tái phát(2). Các phương pháp xử trí<br /> nhiên, việc sử dụng các thuốc kháng retrovirus<br /> này có thể dẫn đến nguy cơ thay đổi ngưỡng<br /> ở Việt Nam chưa bao phủ đều khắp các đối<br /> đáp ứng của C. neoformans đối với thuốc kháng<br /> tượng HIV/AIDS. Như vậy, hiện tượng giảm<br /> nấm(13, 15).<br /> đáp ứng của C. neoformans đối với các hoạt chất<br /> Thật vậy, trước thập niên 90, ngưỡng MIC<br /> kháng nấm là thật sự hay chỉ là hậu quả của tình<br /> của fluconazol luôn ổn định(3). Sau đại dịch<br /> trạng suy giảm miễn dịch không được cải thiện<br /> HIV/AIDS, nhiều tác giả ghi nhận tình trạng<br /> của bệnh nhân? Trên cơ sở đó, khảo sát tác dụng<br /> giảm tác dụng của fluconazol trên C.<br /> in vitro của thuốc kháng nấm trên C. neoformans<br /> neoformans(7, 8, 13). Borann phát hiện ngưỡng MIC<br /> đã được tiến hành.<br /> của fluconazol tăng dần từ năm 2000 đến năm<br /> ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2002, và số trường hợp kháng fluconazol cũng<br /> tăng 5,6 lần: 2,5% trong năm đầu so với 14% vào<br /> Phương pháp khuếch tán trên thạch được sử<br /> 13)<br /> (<br /> năm thứ 2 (p0,05<br /> <br /> Không: nhạy kém và kháng; Có: nhạy.<br /> <br /> *<br /> <br /> Sự đáp ứng in vitro với các thuốc kháng nấm<br /> tương tự ở cả 2 chủng.<br /> Bảng 5: khả năng đáp ứng với AMB phân bố theo<br /> thời gian và việc dùng FLU dự phòng<br /> <br /> Thời gian<br /> (năm 2000)<br /> Dùng FLU<br /> dự phòng<br /> *<br /> <br /> Trước<br /> Sau<br /> Không<br /> Có<br /> <br /> Đáp ứng* (n, %)<br /> Không<br /> Có<br /> 5 (31,3)<br /> 11 (68,8)<br /> 20 (22,0) 71 (78,0)<br /> 23 (22,6) 79 (77,5)<br /> 2 (40,0)<br /> <br /> 2<br /> (Fisher)<br /> p > 0,5<br /> p > 0,3<br /> <br /> 3 (60,0)<br /> <br /> Không: nhạy kém và kháng; Có: nhạy.<br /> <br /> Chưa ghi nhận sự khác biệt về việc dùng<br /> FLU dự phòng và các chủng trước hoặc sau 2008<br /> trong đáp ứng in vitro đối với AMB của C.<br /> neoformans.<br /> Bảng 6: khả năng đáp ứng với FLU phân bố theo thời<br /> điểm thu thập chủng và việc dùng FLU dự phòng:<br /> *<br /> <br /> Thời gian (năm Trước<br /> 2008)<br /> Sau<br /> Dùng FLU dự Không<br /> phòng<br /> Có<br /> <br /> 2<br /> <br /> Đáp ứng ( n, %)<br /> χ (Fisher)<br /> Không<br /> Có<br /> 2 (12,5)<br /> 14 (87,5)<br /> p > 0,1<br /> 29 (31,9)<br /> 28 (27,5)<br /> <br /> 62 (68,1)<br /> 74 (72,6)<br /> <br /> 3 (60,0)<br /> <br /> 2 (40,0)<br /> <br /> p >0,1<br /> <br /> *Không: nhạy kém và kháng; Có: nhạy.<br /> Việc đáp ứng in vitro đối với fluconazol<br /> không phụ thuộc thời điểm phân lập các chủng<br /> nấm cũng như việc dùng fluconazol dự phòng.<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> Đặc điểm của mẫu nghiên cứu<br /> Tổng mẫu nghiên cứu bao gồm 107 loài<br /> Cryptococcus neoformans phân lập từ bệnh nhân,<br /> trong đó 96,1% từ cơ địa nhiễm HIV/AIDS, chủ<br /> yếu sau năm 2008, nhưng chỉ 5,1% trường hợp<br /> <br /> Chuyên Đề Ký Sinh Trùng<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> được điều trị dự phòng với fluconazol (Bảng 1),<br /> chứng tỏ việc dự phòng nhiễm nấm cơ hội ở<br /> bệnh nhân HIV/AIDS chưa được quan tâm đúng<br /> mức. Tình trạng này có thể bị tác động bởi các lý<br /> do như : 1) những khó khăn về kinh tế không<br /> cho phép bệnh nhân tuân thủ điều trị fluconazol<br /> dự phòng; 2) sự tương tác giữa fluconazol với<br /> các thuốc điều trị khác, như rifampicin; 3) nhiều<br /> đối tượng nguy cơ cao chỉ được phát hiện<br /> nhiễm HIV vào thời điểm chẩn đoán viêm nãomàng não do vi nấm; 4) việc dự phòng<br /> fluconazol có thể dẫn đến kháng thuốc(9).<br /> Về phân bố chủng (variety), 91,6% C.<br /> neoformans thuộc var. neoformans (Bảng 1), phù<br /> hợp với đặc điểm sinh học của Cryptococcus<br /> neoformans: var. neoformans tấn công chủ yếu trên<br /> người suy giảm miễn dịch(9). Swinne so sánh<br /> trước và sau 1986, cho thấy tỉ lệ nhiễm C.<br /> neoformans var. neoformans gia tăng cùng với đại<br /> dịch HIV(13). Ngoài ra, sự phân bố các C.<br /> neoformans phân lập từ bệnh nhân ở các nước<br /> Đông Nam Á nói chung cũng nghiêng về var.<br /> neoformans(10, 13), do vậy, Việt Nam, một nước<br /> trong khu vực, ít nhiều sẽ mang dáng dấp của<br /> mô hình này.<br /> Hầu hết các chủng phân tích đều được lưu<br /> trữ từ năm 2008 (Bảng 1), các chủng trước 2008<br /> chỉ bằng 1/6, vì vậy bản chất của sự thay đổi<br /> mức đáp ứng với thuốc kháng nấm theo thời<br /> gian, nếu tồn tại, có thể chưa được bộc lộ rõ<br /> trong khảo sát này.<br /> <br /> Xác định bước sóng và OD thích hợp trong<br /> việc định lượng nồng độ nấm thông qua<br /> phương pháp quang phổ kế<br /> Mật độ nấm là một trong những yếu tố có<br /> thể ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng in vitro<br /> của vi nấm đối với thuốc kháng nấm, do vậy<br /> cần đảm bảo chính xác số lượng tế bào nấm<br /> trong dịch treo thử nghiệm. Hiện nay có nhiều<br /> phương pháp xác định nồng độ dịch treo, trong<br /> đó định lượng bằng quang phổ kế ở bước sóng<br /> thích hợp là phổ biến nhất. Tuy nhiên, bước<br /> sóng tối ưu đối với C. neoformans chưa được đề<br /> cập trong các danh mục chuẩn nên việc xác định<br /> <br /> 73<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012<br /> <br /> bước sóng đã được tiến hành dựa trên mức độ<br /> hấp thu sóng ở một nồng độ nhất định của C.<br /> neoformans tại nhiều bước sóng khác nhau. Biểu<br /> đồ 1 cho thấy bước sóng 640nm cho giá trị OD<br /> cao nhất ở cả 2 chủng quốc tế: var. neoformans<br /> ATCC 28957 và var. gattii ATCC 76108. Đây là<br /> những chủng có bao nang dày rõ rệt. Ngược lại,<br /> bao nang của C. neoformans từ các bệnh nhân<br /> được phân lập trên canh cấy SDA thường trở<br /> nên mỏng hơn, thậm chí không thể nhìn thấy. Vì<br /> thế, C. neoformans phân lập từ bệnh nhân có bao<br /> nang mỏng được dùng để kiểm chứng và cho<br /> kết quả bước sóng tương tự. Qua đó chứng tỏ<br /> khả năng hấp thụ sóng của các loại tế bào hạt<br /> men Cryptococcus neoformans không bị ảnh<br /> hưởng bởi bao nang. Do vậy, bước sóng 640nm<br /> được sử dụng để định lượng nồng độ dịch treo<br /> tế bào C. neoformans trong nghiên cứu này, khác<br /> với bước sóng 625nm dùng cho vi nấm nói<br /> chung được ghi nhận trên y văn(15). Sự khác biệt<br /> này là tất yếu do khác biệt tùy loại máy quang<br /> phổ, loại Cuvet, loại vi nấm được sử dụng …<br /> Sử dụng bước sóng 640nm để xác định OD ở<br /> nồng độ 106 CFU/ml dịch treo tế bào nấm, bảng<br /> 2 cho thấy: OD = [0,058 – 0,065] tương ứng với<br /> mật độ nấm dao động trong khoảng (0,9 – 1,3) x<br /> 106 CFU/ml. Bên cạnh đó, sự chênh lệch OD<br /> trung bình giữa 2 var. hầu như không tồn tại,<br /> 0,062 và 0,060. Vì vậy để thuận tiện cho việc tính<br /> toán, đo đạc, OD = 0,06 được chọn làm OD<br /> chuẩn, tương đương với nồng độ 106 CFU/ml<br /> dịch treo nấm cho cả var. neoformans và var.<br /> gattii.<br /> <br /> Đánh giá khả năng đáp ứng In vitro của C.<br /> neoformans đối với các thuốc kháng nấm<br /> Theo bảng 3, 76,6% C. neoformans nhạy với<br /> Amphotericin B, thấp hơn nghiên cứu của<br /> Espinel(4) (96,4%); tỉ lệ cao hơn kết quả của<br /> Gomez(5) (23,4% so với 5,8%). Sự khác biệt này<br /> không thể quy cho môi trường cấy khác nhau<br /> hoặc lượng nấm tiêm vào vì ở mỗi điều kiện đều<br /> được quy định ngưỡng đánh giá tương ứng.<br /> Những sai sót trong đo đạc vòng kháng nấm có<br /> thể xảy ra nhưng chỉ xuất hiện khi đường kính<br /> <br /> 74<br /> <br /> vòng ức chế mập mờ tại ranh giới của 2 phân<br /> lớp: nhạy– nhạy kém hoặc nhạy kém – kháng. Vì<br /> vậy, bảng 3 gợi ý một sự thay đổi về khả năng<br /> đáp ứng của C. neoformans đối với Amphotericin<br /> B .Những thử nghiệm về MIC cần được thực<br /> hiện trên các chủng phân lập trước, trong và tái<br /> phát sau điều trị để khẳng định hiện tượng này.<br /> Trong thử nghiệm đối với Fluconazol, tỉ lệ<br /> nhạy, nhạy kém và kháng lần lượt là 71%, 20,5%<br /> và 14%, khá tương đồng với nghiên cứu của<br /> Borann(13). Tuy nhiên tỉ lệ nhạy kém lại thấp hơn<br /> nhiều so với nghiên cứu của Aller, 55% (1) và<br /> Koletar, 20%(8). Nhiều khảo sát về MIC cũng ghi<br /> nhận khuynh hướng tăng dần đối với<br /> Fluconazol so với trước đại dịch AIDS. Tuy<br /> nhiên mức độ đáp ứng thay đổi tùy thuộc vào<br /> thời gian sử dụng Fluconazol nên kết quả thay<br /> đổi theo từng báo cáo.<br /> Xét tính đáp ứng của các chủng đối với hoạt<br /> chất kháng nấm, bảng 4 chưa thể hiện sự khác<br /> biệt, tương tự báo cáo của George(15). Tuy nhiên<br /> Gomez(5), T.T.H.Chau(17) phát hiện var. gattii đáp<br /> ứng với amphotericin B tốt hơn var. neoformans,<br /> nhưng không khác biệt đối với fluconazole.<br /> Theo Luciana, amphotericin B tác dụng như<br /> nhau trên cả 2 var. nhưng var. gattii kém nhạy<br /> với fluconazol hơn(18). Lý do có thể bắt nguồn từ<br /> cỡ mẫu giữa 2 chủng: hoặc tập trung chủ yếu<br /> vào var. neoformans trong số liệu của George,<br /> Gomez, T.T.H. Châu và khảo sát hiện tại; hoặc<br /> lệch về phía var. gattii trong đánh giá của<br /> Luciana. Do đó, để khẳng định, cần có một<br /> nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn và cân đối hơn<br /> giữa hai chủng.<br /> Xét về thời điểm thu thập mẫu, không tìm<br /> thấy sự thay đổi về khả năng đáp ứng In vitro<br /> của C. neoformans theo thời gian (bảng 5, bảng 6).<br /> Nguyên nhân có thể do mầm bệnh không phát<br /> tán vào môi trường và không lan truyền một<br /> cách tự nhiên từ người sang người qua đường<br /> không khí cũng như qua các chất tiết, chất thải,<br /> do đó sự đột biến gây kháng thuốc của tế bào<br /> nấm, cũng ít cơ hội được “di truyền”. Vì thế,<br /> hiện tượng kháng thuốc hoặc kém nhạy của một<br /> <br /> Chuyên Đề Ký Sinh Trùng<br /> <br />