Đánh giá sinh khả dụng của G-Rb1 trong pellet nhân sâm trên chó thực nghiệm

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016<br /> <br /> ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA G-Rb1 TRONG PELLET<br /> NHÂN SÂM TRÊN CHÓ THỰC NGHIỆM<br /> Phạm Thành Suôl*; Nguyễn Văn Bạch **<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đánh giá sinh khả dụng của ginsenosid - Rb1 (G-Rb1) trong pellet Nhân sâm thông<br /> qua xác định một số thông số dược động học (Cmax, AUC0-∞ Tmax, MRT,…) của G-Rb1 trên chó<br /> thực nghiệm. Phương pháp: định lượng G-Rb1 trong huyết tương chó bằng phương pháp<br /> HPLC; chiết G-Rb1 từ huyết tương chó bằng phương pháp chiết pha rắn. Thiết kế nghiên cứu:<br /> bằng phương pháp chéo đôi đơn liều hai giai đoạn trên chó thực nghiệm; xác định các thông số<br /> dược động học bằng phần mềm dược động học Kinetica Version 5.0. Kết quả: các thông số<br /> dược động học (AUC0-∞, Cmax, Tmax, MRT...) và sinh khả dụng của G-Rb1 từ dạng pellet tương<br /> đương với dạng cao Nhân sâm 2:1. Kết luận: trên chó thực nghiệm, sinh khả dụng, mức độ và<br /> tốc độ hấp thu của G-Rb1 từ pellet Nhân sâm và cao Nhân sâm 2:1 tương đương nhau.<br /> * Từ khóa: G-Rb1; Pellet; Nhân sâm; Sinh khả dụng; Thông số dược động học.<br /> <br /> Evaluation of Bioavailability of G-Rb1 in Radix Ginseng Pellets on<br /> Experimental Dogs<br /> Summary<br /> Objectives: To evaluate bioavailability of radix ginseng pellets and pharmacokinetic<br /> parameters (AUC0-∞, Cmax, Tmax , MRT...) of ginsenosid - Rb1 (G-Rb1) in experimental dogs.<br /> Methods: To quantify G-Rb1 in dogs plasma by HPLC; extraction of G-Rb1 in dogs plasma by<br /> solid phase extraction; experimental design by a single-dose, cross-over design method in<br /> experimental dogs. Kinetica Version 5.0 software was applied to evaluate pharmacokinetic<br /> parameters. Results: The pharmacokinetic parameters (AUC0-∞, Cmax, Tmax, MRT...) and<br /> bioavailability of G-Rb1 in pellets were as equivalent as radix ginseng extract 2:1. Conclusion: In<br /> the experimental dogs, bioavailability, the extent of absorption and rate of absorption of G-Rb1<br /> in radix ginseng pellets were as equivalent as radix ginseng extract 2:1.<br /> * Key words: G-Rb1; Pellets; Gingseng; Bioavailability; Pharmacokinetic parameters.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Nhân sâm (Radix Ginseng) là vị thuốc<br /> quý, có tác dụng tăng lực, sinh thích nghi,<br /> chống oxy hóa, kích thích hệ thần kinh<br /> trung ương, làm tăng hoạt tính vận động<br /> tự nhiên, chống mệt mỏi và bảo vệ tế bào<br /> <br /> gan [4, 5]. Thành phần hóa học có hoạt<br /> tính sinh học của Nhân sâm là nhóm hợp<br /> chất ginsenosid có cấu trúc khung<br /> dammaram, chủ yếu là dẫn xuất của<br /> triterpenoid. Trong đó, G-Rb1 là hoạt chất<br /> có hàm lượng cao trong Nhân sâm [3, 4, 7].<br /> <br /> * Trường Đại học Y Dược Cần Thơ<br /> ** Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Phạm Thành Suôl (suolpt@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 10/06/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 01/09/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 20/09/2016<br /> <br /> 5<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016<br /> Hiện nay trên thế giới, theo kinh nghiệm<br /> cổ truyền, người ta thường sử dụng Nhân<br /> sâm dưới dạng thuốc sắc, ngâm rượu,<br /> dịch chiết cồn… Tuy các dạng thuốc này<br /> mang lại hiệu quả tốt khi sử dụng Nhân<br /> sâm, nhưng khó bảo quản, chưa được<br /> tiêu chuẩn hóa chất lượng, khó vận<br /> chuyển và chưa thuận tiện cho người sử<br /> dụng. Vì vậy, chúng tôi đã bào chế viên<br /> nang cứng pantogin mà thành phần chủ<br /> yếu là pellet Nhân sâm. Vì pellet có nhiều<br /> ưu điểm như: nâng cao sinh khả dụng<br /> của dạng bào chế, không gây kích ứng<br /> niêm mạc dạ dày, phân tán tự do trong<br /> đường tiêu hóa, hấp thu thuốc ở mức tối<br /> đa, đồng thời làm giảm dao động nồng độ<br /> cực đại trong huyết tương [1, 6]. Để góp<br /> phần đánh giá khả năng hấp thu của<br /> G-Rb1 trong pellet Nhân sâm, chúng tôi<br /> tiến hành đánh giá sinh khả dụng của<br /> G-Rb1 trong pellet Nhân sâm trên chó<br /> thực nghiệm.<br /> NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên liệu, thiết bị và đối tượng<br /> nghiên cứu.<br /> * Dung môi, hóa chất:<br /> <br /> - Thuốc đối chiếu: cao Nhân sâm 2:1<br /> đạt TCCS (hàm lượng G-Rg1 0,7%).<br /> * Thiết bị và dụng cụ:<br /> - Máy HPLC (Hitachi, Nhật Bản).<br /> - Bộ chiết pha rắn SPE: Supelco (Mỹ).<br /> - Cân phân tích Sartorius: có độ chính<br /> xác 0,1 mg (Đức).<br /> - Tủ lạnh sâu (-40oC): Sanyo MDF-236<br /> (Nhật Bản).<br /> - Các dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn<br /> dùng cho phân tích.<br /> - Phần mềm dược động học Kinetica<br /> Version 5.0.<br /> * Đối tượng nghiên cứu: chó ta, giống<br /> đực khỏe mạnh, cân nặng từ 10 - 12 kg,<br /> đạt tiêu chuẩn thí nghiệm.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Định lượng nồng độ G-Rb1 trong<br /> huyết tương chó:<br /> Định lượng nồng độ G-Rb1 trong<br /> huyết tương chó bằng phương pháp<br /> HPLC với chất chuẩn nội là digoxin [2].<br /> Trước khi đánh giá sinh khả dụng của GRb1 trong pellet Nhân sâm trên chó thực<br /> nghiệm, chúng tôi thẩm định lại phương<br /> pháp theo hướng dẫn của US-FDA [8].<br /> <br /> - G-Rb1 chuẩn: Hãng Wako đạt tiêu<br /> chuẩn BP 98 (Nhật).<br /> <br /> * Thiết kế nghiên cứu - bố trí thí<br /> nghiệm:<br /> <br /> - Chất nội chuẩn digoxin: Hãng Merck,<br /> đạt tiêu chuẩn BP 98 (Nhật).<br /> <br /> - Phương pháp thiết kế chéo đôi, đơn<br /> liều, hai thuốc, hai giai đoạn.<br /> <br /> - Acetonitril: đạt tiêu chuẩn cho sắc ký<br /> lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Merck, Đức).<br /> <br /> - Chó được theo dõi trước khi tiến<br /> hành thí nghiệm 1 tuần, không cho ăn<br /> trước khi thí nghiệm 12 giờ, cho uống<br /> nước tự do. Chia 6 chó thành hai nhóm<br /> (mỗi nhóm 3 con) ngẫu nhiên với 2 giai<br /> đoạn thử như sau:<br /> <br /> - Methanol: đạt tiêu chuẩn tinh khiết<br /> phân tích.<br /> - Thuốc thử: pellet Nhân sâm tự bào<br /> chế đạt tiêu chuẩn cơ sở (TCCS).<br /> 6<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016<br /> Giai đoạn<br /> Giai đoạn 1<br /> <br /> Nhóm<br /> <br /> Giai đoạn 2<br /> Nghỉ 10 ngày<br /> <br /> 1<br /> <br /> Cao Nhân sâm (2:1)<br /> <br /> Pellet Nhân sâm<br /> <br /> 2<br /> <br /> Pellet Nhân sâm<br /> <br /> Cao Nhân sâm (2:1)<br /> <br /> - Giai đoạn 1: chó ở nhóm 1 uống cao<br /> Nhân sâm (thuốc đối chiếu): mỗi chó<br /> trong nhóm này uống cao Nhân sâm 2:1<br /> với liều 0,5 g/kg thể trọng. Nhóm 2 uống<br /> pellet Nhân sâm (thuốc thử nghiệm): mỗi<br /> chó trong nhóm này uống pellet Nhân<br /> sâm với liều 2 g/kg (tương ứng với liều<br /> 0,5 g cao nhân sâm 2:1/kg thể trọng).<br /> Thời gian nghỉ giữa 2 giai đoạn 10 ngày.<br /> - Giai đoạn 2: đổi ngược lại. Sau khi<br /> lấy máu ở thời điểm 0, cho chó uống<br /> thuốc với 50 ml nước trong tình trạng<br /> không gây mê. Cho chó ăn nhẹ sau 2 giờ<br /> và ăn chính sau 4 giờ uống thuốc. Trong<br /> quá trình thí nghiệm, bổ sung chất điện<br /> giải (dung dịch NaCl 0,9%) và glucose<br /> 20% bằng đường uống.<br /> * Lấy, bảo quản và xử lý mẫu huyết<br /> tương chó:<br /> Lấy máu trước khi cho chó uống thuốc<br /> và tại các thời điểm sau uống thuốc 0,5;<br /> 0,75; 1; 1,5; 2; 3; 4; 6; 8; 12 và 24 giờ.<br /> Mỗi lần lấy khoảng 3 ml máu từ tĩnh mạch<br /> khoeo chân và cho vào ống nghiệm có<br /> tráng heparin. Lắc nhẹ, ly tâm 3.000<br /> vòng/phút trong 15 phút. Thu phần huyết<br /> tương bảo quản trong tủ đông ở -35oC<br /> cho đến khi định lượng. Trước khi đưa<br /> vào phân tích, rã đông mẫu và đưa về<br /> nhiệt độ phòng. Chiết G-Rb1 bằng<br /> phương pháp chiết pha rắn (SPE): hút<br /> 1 ml huyết tương, trộn với 20 µl axít<br /> <br /> phosphoric 85% và 10 µl dung dịch nội<br /> chuẩn (dung dịch digoxin 5 µg/ml), trộn<br /> đều trong 30 giây, thêm vào 1 ml<br /> methanol. Khuấy trong 1 phút, ly tâm với<br /> tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút.<br /> Hút lấy lớp dung dịch phía trên, nạp vào<br /> cột SPE. Cột SPE được rửa trước ba lần<br /> bằng 2 ml methanol và 2 ml nước. Rửa<br /> giải pha rắn bằng 2 ml nước, cuối cùng<br /> rửa bằng 1 ml methanol 90%. Bốc hơi<br /> dung dịch rửa giải bằng khí nitơ ở 40°C,<br /> thu được cắn. Hoà tan cắn trong 200 µl<br /> acetonitril và nước (30:70). Lọc qua màng<br /> lọc 0,45 µm. Thu lấy dịch lọc, lấy 10 µl<br /> tiêm vào hệ thống HPLC.<br /> * Xác định các thông số dược động<br /> học:<br /> Từ nồng độ G-Rb1 trong các mẫu<br /> huyết tương đã định lượng được, vẽ<br /> đường cong nồng độ thuốc-thời gian của<br /> từng cá thể. Xác định các thông số dược<br /> động học của G-Rb1 trong pellet Nhân<br /> sâm và cao Nhân sâm 2:1 gồm có: Cmax ,<br /> Tmax, t1/2, λz, AUC0-∞, MRT và AUMC bằng<br /> phần mềm Kinetica 5.0.<br /> So sánh sinh khả dụng của G-Rb1<br /> trong pellet Nhân sâm với cao Nhân sâm<br /> 2:1 thông qua các thông số: với AUC0-∞,,<br /> Cmax và MRT, sử dụng phương pháp<br /> “khoảng tin cậy 90%” của tỷ lệ hai giá trị<br /> trung bình, với Tmax so sánh theo phương<br /> pháp thống kê không tham số (Wilcoxon<br /> 7<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016<br /> signed - rank test). Hai chế phẩm được<br /> coi tương đương sinh học nếu khoảng tin<br /> cậy 90% của tỷ lệ các giá trị trung bình<br /> của AUC0-∞, Cmax và MRT (đã chuyển<br /> logarit) giữa thuốc thử và thuốc đối chiếu<br /> nằm trong khoảng 0,8 - 1,25 và Tmax khác<br /> nhau không có ý nghĩa thống kê.<br /> <br /> 1,0<br /> <br /> 347,33 ± 47,33<br /> <br /> 349,33 ± 35,11<br /> <br /> 1,5<br /> <br /> 446,16 ± 60,01<br /> <br /> 464,66 ± 52,78<br /> <br /> 2,0<br /> <br /> 521,00 ± 41,05<br /> <br /> 545,83 ± 44,37<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> 518,50 ± 72,72<br /> <br /> 508,67 ± 73,26<br /> <br /> 4,0<br /> <br /> 455,33 ± 68,11<br /> <br /> 432,50 ± 58,67<br /> <br /> 6,0<br /> <br /> 370,00 ± 67,04<br /> <br /> 352,66 ± 44,46<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> <br /> 8,0<br /> <br /> 299,16 ± 54,00<br /> <br /> 285,33 ± 44,04<br /> <br /> 12,0<br /> <br /> 219,50 ± 36,13<br /> <br /> 202,16 ± 31,99<br /> <br /> 24,0<br /> <br /> 121,00 ± 11,75<br /> <br /> 125,53 ± 10,82<br /> <br /> 6145 ± 596<br /> <br /> 5899 ± 602<br /> <br /> 1. Kết quả xác định nồng độ G-Rb1<br /> trong huyết tương chó.<br /> Tiến hành phân tích nồng độ G-Rb1<br /> trong các mẫu huyết tương chó thực<br /> nghiệm ở cả 2 nhóm (pellet Nhân sâm và<br /> cao Nhân sâm 2:1) ở những thời điểm<br /> khác nhau theo phương pháp chiết pha<br /> rắn và định lượng G-Rb1 bằng phương<br /> pháp HPLC với chuẩn nội là digoxin. Xác<br /> định nồng độ G-Rb1 trong huyết tương<br /> chó dựa vào đường chuẩn, tiến hành<br /> đồng thời trong ngày.<br /> Kết quả phân tích nồng độ G-Rb1<br /> trong huyết tương chó ở 2 nhóm được<br /> thể hiện ở bảng 1. Kết quả biến thiên<br /> nồng độ G-Rb1 trong huyết tương chó<br /> theo thời gian được ghi ở hình 1.<br /> Bảng 1: Nồng độ G-Rb1 trong huyết<br /> tương chó sau khi uống pellet Nhân sâm<br /> và cao Nhân sâm 2:1 (n = 6).<br /> Nồng độ (ng/ml) của G-Rb1 trong<br /> Thời<br /> gian<br /> (giờ)<br /> <br /> 8<br /> <br /> huyết tương chó (<br /> <br /> ± SD)<br /> <br /> Pellet Nhân sâm<br /> <br /> Cao Nhân sâm<br /> 2:1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0,5<br /> <br /> 128,33 ± 10,33<br /> <br /> 123,33 ± 7,68<br /> <br /> 0,75<br /> <br /> 222,66 ± 31,45<br /> <br /> 233,67 ± 20,59<br /> <br /> AUC0 – 24giờ<br /> (ng/ml)<br /> <br /> Hình 1: Đường cong biểu diễn biến thiên<br /> nồng độ G-Rb1 trong huyết tương chó<br /> theo thời gian.<br /> 2. Phân tích dược động học và so<br /> sánh sinh khả dụng của pellet Nhân<br /> sâm với cao Nhân sâm 2:1.<br /> * Xác định thông số dược động học:<br /> Từ kết quả xác định nồng độ G-Rb1<br /> trong huyết tương chó ở cả lô chó uống<br /> pellet Nhân sâm và cao Nhân sâm 2:1<br /> (bảng 1) và với sự hỗ trợ của phần mềm<br /> Kinetica 5.0, chúng tôi xác định một số<br /> thông số dược động học của G-Rb1 từ<br /> pellet Nhân sâm và cao Nhân sâm 2:1.<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016<br /> Bảng 2: Các thông số dược động học của G-Rb1 trên chó sau khi uống pellet Nhân<br /> sâm và cao Nhân sâm 2:1 (n = 6,<br /> Các thông số dược động học<br /> <br /> ± SD).<br /> Pellet Nhân sâm<br /> <br /> Cao Nhân sâm 2:1<br /> <br /> 567,00 ± 38,66<br /> <br /> 573,16 ± 30,81<br /> <br /> Cmax (ng/ml)<br /> Tmax (giờ)<br /> <br /> 2,25 ± 0,64<br /> <br /> 2,08 ± 0,49<br /> <br /> AUC0-24 h (ng/ml)<br /> <br /> 6145 ± 596<br /> <br /> 5899 ± 202<br /> <br /> AUC0-∞ (ng/ml)<br /> <br /> 8230 ± 812<br /> <br /> 8085 ± 755<br /> <br /> λ2 (1/giờ)<br /> <br /> 0,052 ± 0,004<br /> <br /> 0,053 ± 0,005<br /> <br /> t1/2 (1/giờ)<br /> <br /> 12,57 ± 1,18<br /> <br /> 12,99 ± 1,18<br /> <br /> 146651 ± 11963<br /> <br /> 128679 ± 11969<br /> <br /> 17,88 ± 1,27<br /> <br /> 18,44 ± 1,10<br /> <br /> AUMC0-∞ (ng/ml)<br /> MRT (giờ)<br /> <br /> * Phân tích thống kê và so sánh sinh khả dụng:<br /> Từ kết quả xác định thông số dược động học, chúng tôi tiến hành so sánh sinh khả<br /> dụng và một số thông số dược động học của G-Rb1 từ pellet Nhân sâm và cao Nhân<br /> sâm 2:1.<br /> Bảng 3: Phân tích phương sai với các biến phụ thuộc ln[AUC0-∞], ln[Cmax] và ln[MRT].<br /> Nguồn biến<br /> thiên<br /> <br /> Bậc tự do<br /> <br /> Tổng bình<br /> phương<br /> <br /> Trung bình bình<br /> phương<br /> <br /> F<br /> <br /> p<br /> <br /> Biến phụ thuộc là ln[AUC0-∞]<br /> Trình tự thử<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0,003333<br /> <br /> 0,0033<br /> <br /> 0,2894<br /> <br /> 0,619119<br /> <br /> Động vật thí<br /> nghiệm<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0,0461<br /> <br /> 0,0115<br /> <br /> 2,0688<br /> <br /> 0,249350<br /> <br /> Giai đoạn<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0,0192<br /> <br /> 0,0192<br /> <br /> 3,4491<br /> <br /> 0,136849<br /> <br /> Thuốc<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0,000833<br /> <br /> 0,0008<br /> <br /> 0,1497<br /> <br /> 0,718526<br /> <br /> Sai số<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0,022267<br /> <br /> 0,0056<br /> <br /> Tổng cộng<br /> <br /> 11<br /> <br /> 0,0917<br /> <br /> F<br /> <br /> P<br /> <br /> Căn bậc 2 của trung bình bình phương sai số<br /> Nguồn biến<br /> thiên<br /> <br /> Bậc tự do<br /> <br /> Tổng bình<br /> phương<br /> <br /> 0,075<br /> Trung bình bình<br /> phương<br /> <br /> Biến phụ thuộc là ln[Cmax]<br /> Trình tự thử<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0,0048<br /> <br /> 0,0048<br /> <br /> 0,9143<br /> <br /> 0,39314<br /> <br /> Động vật thí<br /> nghiệm<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0,021<br /> <br /> 0,0052<br /> <br /> 1,4928<br /> <br /> 0,35366<br /> <br /> Giai đoạn<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0,0003<br /> <br /> 0,0003<br /> <br /> 0,0853<br /> <br /> 0,784754<br /> <br /> Thuốc<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0,000833<br /> <br /> 0,000833<br /> <br /> 0,237<br /> <br /> 0,651879<br /> <br /> Sai số<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0,014067<br /> <br /> 0,0035<br /> <br /> 9<br /> <br />