Đề Tài : Tế Bào Gốc - Tế Bào Mầm

Chia sẻ: Van Thuong | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:23

Thêm vào BST

Báo xấu

280
lượt xem 74
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tế bào gốc là tế bào có khả năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau trong cơ thể. Là một công cụ trong "hệ thống sửa chữa" của cơ thể, khi được đưa vào các bộ phận khác nhau, tế bào gốc có thể phân chia không giới hạn để lấp đầy những thiếu hụt tế bào của bộ phận đó chừng nào cơ thể còn sống. Tế bào gốc có thể trở thành tế bào cơ, hồng huyết cầu, tế bào não... Tế bào gốc có 2 đặc điểm quan trọng tạo nên sự khác biệt với các loại tế bào khác. Thứ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề Tài : Tế Bào Gốc - Tế Bào Mầm

CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tế Bào Gốc - Tế Đề Tài : Bào Mầm Người Hướng Dẫn : Pgs. Ts Nguyễn Bá Lộc Người Thực Hiện : Phạm Văn Thương KXX – Động Vật Học Huế, tháng 4 - 2012 1
MỤC LỤC I.tổng quan về tế bào gốc .............................................................................. 3 1.1 khái niêm tế bào gốc....................................................................................3 1.2 lược sử hình thành......................................................................................3 1.3 phân loại tế bào gốc....................................................................................5 II.một số ứng dụng của tế bào gốc...............................................................8 2.1 Ghép tế bào gốc trị liệu (stem cell therapy): ..................................8 2.2 Công nghệ mô (tissue engineering) .................................................. 9 2.3 Các ứng dụng tế bào gốc phôi không liên quan đến ghép......................10 2.4 Tế bào gốc tạo máu....................................................................................11 2.5 Các nguồn lấy tế bào gốc tạo máu:.......................................................... 12 2.6 Các ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc tạo máu.....................................12 2.7 Điều trị các bệnh lý ở cơ quan khác (nhồi máu cơ tim, Parkinson…). .13 III. nuôi cấy và biệt hóa tế bào gốc............................................................... 13 1. Thành phần môi trường......................................................................... 13 2. Kỹ thuật nuôi cấy.....................................................................................13 3 .Một số quy trình thu nhận và nuôi cấy và biệt hóa tế bào gốc...........15 3.1 Thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương chuột...................15 3.2 Quy trình thu nhận tế bào gốc từ máu cuống rốn...........................16 3.3 Nghiên cứu nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh từ bệnh nhân azoospermia ................................................................................................16 3.4 Thu nhận và biệt hóa tế bào gốc trung mô từ cuống dốn của người .......................................................................................................................20 3.5 Giai đoạn 2, nuôi cấy thứ cấp: cấy chuyền tăng sinh MSC ...........21 3.6.Biệt hoá MSC .......................................................................................21 3.7 .Biệt hóa MSC thành tế bào tạo mỡ (adipocyte)...............................21 3.8 Biệt hoá MSC thành nguyên bào xương (Osteoblast)......................22 IV kết luận ........................................................................................................22 Tài liệu tham khảo:...........................................................................................23 2
I.tổng quan về tế bào gốc 1.1 khái niêm tế bào gốc Tế bào gốc là tế bào có khả năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau trong cơ thể. Là một công cụ trong "hệ thống sửa chữa" của cơ thể, khi được đưa vào các bộ phận khác nhau, tế bào gốc có thể phân chia không giới hạn để lấp đầy những thiếu hụt tế bào của bộ phận đó chừng nào cơ thể còn sống. Tế bào gốc có thể trở thành tế bào cơ, hồng huyết cầu, tế bào não... Tế bào gốc có 2 đặc điểm quan trọng tạo nên sự khác biệt với các loại tế bào khác. Thứ nhất, tế bào gốc là loại tế bào không chuyên dụng nên có thể tự tái tạo trong một thời gian dài nhờ quá trình phân chia. Thứ hai, trong môi trường sinh lý hoặc thí nghiệm nhất định, tế bào gốc có thể biến đổi trở thành tế bào chuyên dụng như tế bào gây đập của cơ tim hoặc tế bào sản sinh insulin của tuyến tụy. 1.2 lược sử hình thành Các tế bào gốc được tìm thấy trong cơ thể của mọi sinh vật sống. Những tế bào này làm phát sinh các tế bào mà nhiều người khác phân biệt thành các loại tế bào đặc biệt. Năm 1960, Ernest A. McCulloch và James E. Till cho thấy hai loại tế bào gốc động vật có vú. Tế bào gốc phôi được tách ra từ khối tế bào của blastocysts, trong khi các tế bào gốc người lớn được tìm thấy trong các mô chỉ dành cho người lớn Trong phôi thai đang phát triển, các tế bào gốc, được thừa kế, biệt hóa thành các mô phôi thai. Trong khi người lớn tế bào gốc giúp sửa chữa các bộ phận của cơ thể bên cạnh tiền thân. Vai trò cơ bản của tế bào gốc người lớn là để sản xuất một hệ thống sửa chữa, bổ sung các tế bào đặc biệt và duy trì năng suất của các cơ quan được tái sinh trong tự nhiên. Các tế bào gốc trưởng thành và thay đổi thành tế bào chuyên giúp cho việc tạo ra các tế bào của cơ bắp khác nhau và các mô thần kinh. Tủy xương và máu dây rốn được sử dụng trong liệu pháp tế bào gốc người lớn đàn hồi. Trong những năm 1800, các chuyên gia y tế đến để biết rằng một số tế bào có thể tạo ra các tế bào khác và trong những năm 1900, nó đã chứng minh 3
rằng tế bào gốc có thể tạo ra tế bào máu, ngay cả. Các chuyên gia cấy ghép tủy xương vào một bệnh nhân có bệnh bạch cầu. Mặc dù, nó đã không thành công nhưng nó thúc đẩy các chuyên gia để thực hiện cấy ghép thành công tủy xương ở người. Nó đã được thực hiện tại Pháp vào những năm 1950. Jean Dausset nói rằng các protein trên bề mặt của tế bào đã được bạch cầu hoặc kháng nguyên HLA. Với sự trợ giúp của kháng nguyên HLA, hệ thống miễn dịch xác định tình trạng lành mạnh của các tế bào và đồ đạc của họ. Trong thập niên 1960, cấy ghép các tế bào đã được thực hiện giữa anh chị em ruột. Sau này, các quốc gia Organ Transplant Act năm 1984 và quốc gia tài trợ Chương trình tủy thực hiện nó. Hơn 16.000 cấy ghép được thực hiện trong thời gian này, và nó đã được tìm thấy nó chữa các bệnh như immunodeficiencies, dể băng huyết bệnh bạch cầu và ung thư máu hoặc. Tuy nhiên, nhiều câu hỏi cũng được nâng lên về tế bào gốc, đặc biệt là ưu và nhược điểm của họ. Các tế bào gốc là những tế bào không chuyên mà làm phát sinh các tế bào nhiều chuyên ngành. Những tế bào từ phôi thai hoặc thai nhi được coi là tốt nhất vì chúng làm tăng mức độ thành công so với các tế bào gốc lấy từ trẻ em hoặc người lớn. Tuy nhiên, các tế bào gốc ở người lớn có thể được nhận từ tủy xương. Những tế bào gốc được cấy ghép vào bệnh nhân và tạo thuận lợi cho sản xuất các loại tế bào máu. Nó được xem là tốt nhất trong trường hợp bệnh bạch cầu, các loại ung thư hạch được lựa chọn, thiếu máu Aplastic, thalassemia, thiếu máu tế bào hình liềm, và các rối loạn chuyển hóa bẩm sinh nhất định hoặc suy giảm miễn dịch như bệnh granulomatous mãn tính. Người có tủy xương có một lỗi do bất cứ lý do cũng có thể được cấy ghép với các tế bào gốc. Nó cũng rất hữu ích trong điều trị các bệnh như Parkinson và Alzheimer. Các tế bào gốc của chính người được sử dụng, nó được gọi là cấy ghép autologus và khi các tế bào gốc được lấy từ một người nào khác, nó được gọi là cấy ghép allogeneic. Trong autologus, tế bào gốc được thu thập trước khi hóa trị liệu là điều trị có thể thiệt hại các tế bào. Sau khi điều trị, họ lại tiêm vào cơ thể. Trong trường hợp cấy ghép tủy xương, các nhà tài trợ được tiêm một tủy gây mê và sau đó được lấy ra từ xương hông với sự giúp đỡ của các ống tiêm. Quá trình này mất gần một giờ. 4
Trong allogenic, tế bào gốc có thể được thu được từ máu. Người được tặng được cho một loại thuốc mà bản tế bào gốc vào mạch máu và sau đó với sự giúp đỡ của ống thông máu được lấy ra khỏi cánh tay. Những tế bào gốc chiết xuất này sau đó được tiêm vào tĩnh mạch của người nhận và họ giúp đỡ trong nhân tế bào máu. Nó mất khoảng 2-4 giờ sáu phiên trong quá trình 1-2 tuần. Tuy nhiên, các tế bào gốc cũng có thể được bảo quản bằng đông lạnh để sử dụng sau này. Cấy ghép tế bào gốc là nguy hiểm từ điểm nhìn của nhiễm trùng. Các vấn đề của tham nhũng-so-host bệnh trong đó các tế bào thu được tấn công các tế bào của bệnh nhân cũng tồn tại. Tuy nhiên, nó có thể tránh được đến mức độ nào đó bằng cách duy trì vệ sinh xung quanh bệnh nhân. Bệnh nhân chủ yếu là ở lại bệnh viện khoảng 1-2 tháng. Sau khi nhận được thải ra, họ nên đến các bác sĩ cho kiểm tra thường xuyên. Thống kê của cấy ghép tế bào gốc cho thấy tám triệu người trên toàn cầu và bốn triệu người ở Mỹ đã đăng ký bản thân như các nhà tài trợ cho các tế bào gốc. 1.3 phân loại tế bào gốc Chúng ta có thể phân loại và gọi tên “tế bào gốc”theo một số cách sau. a. Theo tiềm năng biệt hóa: - Tế bào toàn năng(totipotent cell):hợp tử, hay Blastomere Là tế bào có khả năng phân chia và biệt hoá thành tất cả các tể bào của cơ thể, có khả năng biệt hoá thành cơ thể hoàn chỉnh. -Một cành cây có Vd: thể phát triển thành một cây hoán chỉnh. 5
-Ở người,Tinh trùng thụ tinh với trứng tạo thành một totipotent cell(hợp tử),vài giờ đầu sau khi thụ tinh , tế bào này phân chia tạo thành những totipotent giống hệt nhau. _ Tế bào Vạn năng(Pluripotent cell): khối tế bào bên trong của Blastocyst Là tể bào có khả năng bịêt hoá thành tẩt cả các tể bào ngoại trừ tế bào phôi. _ Tế bào đa năng (multipotent): Tế bào gốc tạo máu Tương tự như tế bào Vạn năng, thật sự khó có cơ chế chính xác phân biểt hai loại tế bào này _ Ngoài ra còn có một số tế bào gốc vài năng , cũng như đơn năng vd : tế bào gốc tuỷ xương tạo ra các loại tế bào máu. Cơ chất dưỡng bào( Mast cell precursor) chỉ bịêt hoá cho ra dưỡng bào. b. Theo nguồn gốc : _ Tế bào gốc phôi( Embryonic stem cell): được thu nhận từ phôi giai đọan blastocyst. Chúng là khối tế bào bên trong của Blastocyst còn gọi là lớp sinh khối bên trong(ICM_Inner mass cell). Nó tương ứng với tế bào vạn năng theo cách phân loại( 1) _ Tế bào mầm(Embryonic germ cell): Là những tế baò gốc được thu nhận từ rãnh sinh dục, vị trí là tiển thân của cơ quan sinh dục sau này, các tế bào này được chứng minh là vạn năng. _ Tế bào khối u(Embryonic carcinomas): Được thu nhận từ khối u trong tinh hoàn và buồng trứng của chuột, những tế bào này được nuôi cấy nhưng những tế bào gốc phôi. _ Tế bào gốc trưởng thành : chỉ chung những loại tế bào chưa chuyên hoá, được tìm thấy trong những mô ở cơ thể trưởng thành, có thể tự đổi mới và 6
biệt hoá thành những tế bào chuyên biệt từ nguồn gốc của nó. Những tế bào loại này được đặt tên theo nơi hiện diện: tế bào gốc tuỷ xương, tế bào gốc biểu bì,… c. Theo kiểu biệt hoá: Vd: tế bào gốc cơ tim là tế bào sẽ biệt hoá thành tế bào cơ tim, tế bào gốc xương là những tế bào biệt hoá thành những tế bào xương,… Nhưng có một số tác giả cho rằng cách gọi tên này không thật hợp lí vì các tế bào trên( theo họ) là những tế bào tiền thân( progeneotor cell) hay cơ chất( pecuor cell) không phảỉ là những tế bào gốc thực thụ. Nhưng nếu theo cách phân loại theo tiềm năng biệt hóa thì ta cũng có thể xem những tế bào này là những tế bào gốc một năng(unipotent cell). Vậy thật sự tế bào mầm là một trong những loại tế bào gốc , xét về tiềm năng biệt hoá nó không khác gì tế bào gốc phôi(đều là pluripotent cell)  Phân biệt tế bào mầm (Embryonic germ cells) và tế bào gốc (Embryonic stem cells) Tế bào mầm là một trong những loại tế bào gốc, xét về tiềm năng biệt hoá nó không khác gì tế bào gốc phôi (đều là tế bào gốc đa năng (Pluripotent cells). Tế bào mầm (Germ Cells) là khái niệm để chỉ các tế bào thuộc dòng sinh dục (Germline). Tế bào gốc phôi (Embryonic stem cells) và tế bào mầm phôi (Embryonic germ cells) thì khác nhau ở nơi thu nhận và kiểu tế bào biệt hoá. Thứ nhất, về nơi thu nhận, tế bào gốc phôi được thu nhận ở phôi từ giai đoạn phôi nang (blastocyst) trở về trước còn tế bào mầm phôi được thu nhận từ rãnh sinh dục của phôi (genital ridge). Thứ hai, về kiểu tế bào biệt hóa thì tế bào gốc phôi sẽ biệt hóa thành 3 lớp phôi (germ layers) và biệt hóa thành hơn 200 loại tế bào của cơ thể trừ các tế bào nhau thai và cuống rốn. Còn tế bào mầm phôi thì sẽ biệt hóa thành các tế bào sinh dục. 7
II.một số ứng dụng của tế bào gốc 2.1 Ghép tế bào gốc trị liệu (stem cell therapy): Là dùng tế bào gốc để thay thế, sửa chữa các phần c ơ th ể b ị b ệnh và t ổn thương bằng các tế bào mới khỏe mạnh. Kỹ thuật này còn được gọi là kỹ thuật ghép tế bào trị liệu (cell transplantation therapy) hay kỹ thu ật thay thế tế bào trị liệu (cell replacement therapy). 2.1.1 Quy trình ứng dụng tế bào gốc trị liệu bao gồm các khâu sau: - Sản xuất dòng tế bào gốc: + Thu tế bào gốc: từ phôi hoặc từ tổ chức trưởng thành. + Nuôi cấy các tế bào gốc này trong labo nhằm nhân lên về mặt số lượng. - Với tế bào gốc phôi, cần nuôi cấy nhân tạo trong các điều kiện môi trường lý hóa thích hợp để định hướng biệt hóa thành các tế bào mong muốn. - Ghép tế bào gốc, đưa các tế bào gốc này vào các khu v ực t ổn th ương c ần sửa chữa. 2.1.2 Ứng dụng tế bào gốc trưởng thành trong điều trị: Trên lâm sàng, tế bào gốc trưởng thành đã được sử dụng trong điều trị các bệnh tự miễn, tai biến mạch máu não, suy giảm miễn dịch, thiếu máu, nhiễm Estein-barr virus, tổn thương giác mạc, các bệnh máu và bệnh gan, tạo xương không hoàn chỉnh, tổn thương tủy sống, liền vết thương da, điều trị ung thư (kết hợp với hóa chất và tia xạ), u não, u nguyên bào võng mạc, ung thư buồng trứng, các khối u đặc, ung thư tinh hoàn, đa u tủy, lơ- xê-mi, ung thư vú, u nguyên bào thần kinh, u lympho Non-Hodgkin, carcinoma tế bào thận, tái tạo cơ tim sau cơn đau tim, đái đ ường type I, t ổn thương xương và sụn, bệnh Parki 2.1.3 Ứng dụng tế bào gốc phôi trong điều trị Tuy có nhiều triển vọng, hiện nay các tế bào gốc phôi chưa được dùng trong tế bào gốc trị liệu trên người. Các bệnh có th ể được điều trị b ằng ghép các tế bào có nguồn gốc từ tế bào gốc phôi người bao gồm bệnh Parkinson, đái đường, chấn thương tủy sống, suy tim… V ấn đề là khi đi ều trị cho các bệnh này yêu cầu các tế bào gốc phôi ph ải đ ược đ ịnh h ướng biệt hóa thành các chủng loại tế bào đặc thù trước khi ghép. 8
Một ưu điểm của dùng tế bào gốc phôi so với tế bào gốc trưởng thành là các tế bào gốc phôi có khả năng tăng sinh không giới hạn trên in vitro và có khả năng sinh ra nhiều chủng loại tế bào hơn khi được định h ướng bi ệt hóa. Ưu thế này sẽ tăng lên nếu như trong quá trình ghép t ế bào/mô, các t ế bào gốc phôi không gây kích hoạt quá trình thải ghép do mi ễn d ịch. Có th ể tránh tính sinh miễn dịch của các tế bào phát triển từ t ế bào g ốc phôi ng ười bằng chuyển gen cơ thể nhận vào các tế bào gốc phôi làm cho chúng mang các phân tử kháng nguyên hòa hợp tổ chức (MHC) lớp I của cơ th ể nh ận, hoặc bằng kỹ thuật chuyển nhân để tạo ra các tế bào gốc phôi đồng nh ất về gen với người nhận mô ghép. Nhược điểm của dùng tế bào gốc phôi cho ghép trị liệu là dễ hình thành các khối u teratoma. Điều này làm cho tế bào gốc phôi chưa được sử dụng trong ghép tế bào gốc trị liệu trên lâm sàng. Hiện đã có m ột s ố ph ương pháp nhằm loại bỏ các tế bào gốc phôi không biệt hóa trước khi ghép cho phép có thể tránh việc hình thành các khối u teratoma trên cơ thể nhận. 2.2 Công nghệ mô (tissue engineering) Có thể coi công nghệ mô là một ứng dụng của tế bào gốc trị liệu. Các tiến bộ gần đây trong nghiên cứu công nghệ mô và tế bào gốc cho thấy có thể thiết lập tế bào thành các cấu trúc không gian ba chiều dùng để sửa chữa mô tổn thương. Sửa chữa tổ chức bằng công nghệ mô có thể được thực hiện bằng cách nuôi cấy tế bào gốc và sau đó ghép vào mô tổn thương. Trong công nghệ mô có thể sử dụng tế bào gốc trưởng thành đ ể phát tri ển thành mô ghép hoặc có thể dùng tế bào gốc phôi tạo ra trong k ỹ thu ật nhân bản phôi vô tính để sản xuất ra các mô ghép phù hợp v ề m ặt mi ễn d ịch (s ơ đồ B). Một hướng khác có khả năng tạo ra mô ghép phù hợp với bệnh nhân 9
từ nguồn tế bào gốc phôi là dùng kỹ thuật chỉnh sửa gen mã hóa phân t ử hòa hợp tổ chức chính (MHC) (sơ đồ A) Các ứng dụng tế bào gốc phôi không liên quan đến ghép: 2.3 Các ứng dụng không liên quan đến ghép chủ yếu được th ực hi ện trên t ế bào gốc phôi. Có thể kể đến một số ứng dụng sau: Nghiên cứu những sự kiện sớm xảy ra trong quá trình phát triển phôi thai - người như các nguyên nhân có thể gây sinh ra trẻ dị tật bẩm sinh và các b ất thường nhau thai dẫn đến sảy thai. Khám phá ảnh hưởng của các bất thường chrosome trong giai đoạn s ớm - của quá trình phát triển. Ảnh hưởng này có thể là sự hình thành sớm các kh ối u ở trẻ em mà qua nghiên cứu người ta thấy rằng các tế bào kh ối u này ch ủ yếu có nguồn gốc từ phôi. Thử nghiệm các thuốc điều trị. Hiện nay trước khi thử một thuốc mới - trên người tình nguyện, thuốc đó phải được qua thử nghiệm tiền lâm sàng. Trong thử nghiệm tiền lâm sàng có sàng lọc thuốc trên các mô hình động vật – ví dụ các thử nghiệm trên in vitro có dùng tế bào chuột, hoặc các thử nghiệm in vivo liên quan đến việc đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của thuốc. Mặc dù các nghiên cứu dược lấy phương pháp thử nghiệm trên các mô hình động vật làm căn bản, biện pháp này không phải lúc nào cũng cho phép phỏng đoán chính xác các tác dụng có thể có của thuốc trên các tế bào người. Vì lý do này việc nuôi cấy tế bào người thường được sử dụng trong các thử nghiệm tiền lâm sàng. Các dòng tế bào người này thường được duy trì in vitro trong thời gian dài và như vậy thường mang các đặc tính biệt hóa h ơn các tế bào trong cơ thể. Các khác biệt này có thể gây khó khăn trong vi ệc phỏng đoán tác dụng của thuốc trong cơ thể nếu chỉ dựa trên các đáp ứng của các dòng tế bào người trên in vitro. Chính vậy nếu các tế bào gốc phôi có th ể được định hướng biệt hóa thành các loại tế bào đặc thù cho sàng lọc thuốc, các tế bào đặc thù này có lẽ sẽ mô phỏng tốt hơn đáp ứng của các t ế bào/mô trong cơ thể với thuốc và như vậy cũng cung cấp các mô hình sàng lọc thu ốc an toàn, kinh tế và hiệu quả hơn. Sàng lọc các chất có khả năng gây độc. Lý do sử dụng tế bào gốc phôi - người trong sàng lọc độc chất cũng giống như lý do dùng chúng vào việc th ử thuốc như đã nêu trên. Độc chất thường có tác dụng khác nhau trên các loài động vật khác nhau, điều này nói lên tầm quan trọng cần có các mô hình in vitro phù hợp nhất cho đánh giá tác dụng của độc chất trên các tế bào người. Nghiên cứu các phương pháp mới về công nghệ gen (genetic - engineering). Hiện tại việc chỉnh sửa gen cho các tế bào gốc phôi chuột trên in vitro có thể được thực hiện một cách dễ dàng nhờ các kỹ thuật như k ỹ thuật tái tổ hợp gen. Đây là một phương pháp thay thế hoặc thêm các đoạn 10
gen, bằng cách này các phân tử DNA mong muốn được đưa vào bộ gen và sau đó đặc tính được biểu hiện. Dùng ph ương pháp này có th ể đ ưa vào dòng tế bào gốc phôi các gen định hướng tế bào gốc phôi biệt hóa thành các t ế bào đặc thù hoặc các gen giúp cho tế bào bộc lộ các sản phẩm protein mong muốn. Về cơ bản, nếu các kỹ thuật đó có thể phát triển với các tế bào gốc phôi người, nó có lẽ là cuộc cách mạng trong công nghệ gen và tế bào gốc trị liệu. 2.4 Tế bào gốc tạo máu Tế bào gốc tạo máu được xếp vào loại tế bào gốc trưởng thành. Đây là các tế bào được tách ra từ máu hoặc tủy xương, chúng có khả năng tự tái tạo (self renew), có thể biệt hóa thành các tế bào đặc thù, có thể di chuyển từ tủy xương vào máu, và có thể trải qua quá trình apoptosis để loại bỏ đi các tế bào không cần thiết. Các nghiên cứu cơ bản về tế bào gốc tạo máu nở rộ vào nh ững năm 1960. Trong thời gian này các nghiên cứu thực nghiệm cho thấy có hai loại tế bào gốc tạo máu. Hai loại này về thực chất chính là hai giai đoạn biệt hóa khác nhau của tế bào gốc tạo máu: - Các tế bào gốc tạo máu dài hạn (long-term hematopoietic stem cells): đây là các tế bào gốc tạo máu ít biệt hóa hơn, nói cách khác là “non” hơn, có khả năng tự tái tạo và tính đa năng cao. Trên thực nghiệm các tế bào này có thể khôi phục hoàn toàn chức năng tạo máu của chuột bị chiếu xạ liều chí tử sau vài tháng. Một ví dụ về tế bào gốc tạo máu dài hạn là các tế bào gốc tạo máu mang CD34+, tế bào này có thể biệt hóa thành tất cả các chủng loại tế bào máu khác nhau. Trong điều kiện bình thường, các tế bào gốc tạo máu dài hạn có khả năng tự tái tạo trong suốt đời sống cá thể. Hiện nay thuật ngữ “tế bào gốc tạo máu” thường được dùng để đề cập tới loại tế bào gốc tạo máu dài hạn này. - Các tế bào định hướng/tiền thân ngắn hạn (short-term progenitor or precursor cell): đây là các tế bào tạo máu đã khá trưởng thành, không mang CD34, là tiền thân của các tế bào đã biệt hóa đầy đủ của cùng một loại dòng tế bào máu, ví dụ tế bào định hướng dòng hồng cầu, tế bào định hướng dòng lympho, mẫu tiểu cầu…. Các tế bào định hướng/tiền thân ngắn hạn cũng có khả năng tăng sinh, biệt hóa thành các tế bào máu nhưng so với các tế bào gốc tạo máu dài hạn chúng có giới hạn về tính đa năng. Ví dụ một tế bào tiền thân hồng cầu có lẽ chỉ có thể tạo thành một tế bào hồng cầu. 11
2.5 Các nguồn lấy tế bào gốc tạo máu: - Tủy xương: Là nguồn truyền thống để lấy tế bào gốc tạo máu. Người hiến tế bào gốc được gây mê, chọc và hút tủy xương ở vùng xương chậu. Mật độ tế bào gốc trong tủy xương không nhiều, trung bình trong 100,000 t ế bào tủy xương có một tế bào gốc tạo máu, các tế bào khác là t ế bào thân, t ế bào gốc thân, tế bào định hướng dòng máu và các tế bào hồng c ầu, b ạch c ầu trưởng thành - Máu ngoại vi: Là một nguồn lấy tế bào gốc tạo máu dùng cho điều trị. Với mục đích ghép tế bào gốc tạo máu trên lâm sàng, vì lý do an toàn và s ự thuận lợi của kỹ thuật, lấy tế bào gốc tạo máu t ừ máu ngo ại vi th ường được thực hiện nhiều hơn lấy từ tủy xương. Bình thường trong máu ngoại vi chỉ có một lượng ít tế bào gốc tạo máu và tế bào máu tiền thân. Để huy động các tế bào này từ tủy xương vào máu, cần tiêm cho người hiến tế bào gốc các cytokine như yếu tố kích thích quần thể tế bào hạt (G-CSF) vài ngày trước khi thu tế bào gốc. Thu tế bào gốc t ạo máu đ ược th ực hi ện b ằng cách đưa một ống vào trong ven người cho và cho dòng máu đi qua m ột h ệ th ống lọc, hệ thống này cho phép lấy ra các tế bào CD34+ và đưa trở lại cơ th ể các tế bào máu khác. Khoảng 5-20% lượng tế bào CD34+ thu được là t ế bào gốc tạo máu thực sự, số còn lại là các tế bào máu tiền thân, các bạch cầu ở những giai đoạn trưởng thành khác nhau. - Cuống rốn: Từ cuối những năm 1980, đầu những năm 1990 các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra máu cuống rốn và máu nhau thai là những nguồn giầu tế bào gốc tạo máu. Đến nay ghép máu cuống rốn đã có ứng dụng r ộng rãi trong điều trị bệnh máu ác tính. - Các tế bào gốc phôi hoặc tế bào mầm phôi: Trong tương lai, khi ứng dụng của các tế bào gốc phôi trở nên rộng rãi, đây cũng s ẽ là nguồn quan trong để lấy tế bào gốc tạo máu. - Hệ thống tạo huyết thai nhi (gan, lách thai): Là m ột ngu ồn t ế bào g ốc t ạo máu quan trọng cho nghiên cứu nhưng không phải cho sử dụng lâm sàng. 2.6 Các ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc tạo máu a . Điều trị bệnh lơ-xê-mi và u lympho: Các tế bào gốc tạo máu (bị ung thư) của bệnh nhân được phá h ủy b ởi tia xạ và hóa chất và được thay thế bằng ghép tủy xương hoặc bằng ghép tế 12
bào gốc tạo máu lấy từ máu ngoại vi của một người cho phù hợp. Người cho phù hợp thường là anh, chị, em của bệnh nhân, những người này đ ược thừa hưởng kháng nguyên hòa hợp tổ chức tương tự bệnh nhân, do đó có thể giảm thiểu phản ứng thải mô ghép hoặc phản ứng ghép chống chủ. b. Điều trị các rối loạn máu bẩm sinh bao gồm thiếu máu bất sản, beta- thalassemia, hội chứng Blackfan-Diamon, thiếu máu hồng cầu liềm… c. Dùng tế bào gốc tạo máu cứu nguy cho các trường hợp hóa trị liệu và xạ trị liệu trong điều trị ung thư. Biện pháp này còn được gọi là ghép tế bào gốc tự thân. Với mục đích này tế bào gốc được huy động từ tủy xương vào máu rồi được thu giữ, bảo quản trong khi bệnh nhân được điều trị hóa chất hoặc tia xạ để tiêu diệt các tế bào ung thư. Khi cơ thể bệnh nhân đã thanh lọc hết hóa chất/tia xạ, bệnh nhân được nhận lại tế bào gốc tạo máu của chính mình. Với biện pháp điều trị này không có vấn đề bất đồng miễn dịch dẫn đến thải ghép hoặc phản ứng mảnh ghép chống túc chủ. Tuy nhiên vấn đề của ghép tế bào gốc tự thân là đôi khi các tế bào ung thư vô tình được thu gom và truyền trở lại cho bệnh nhân cùng với tế bào gốc. Hiện nay có một số kỹ thuật mới phát minh cho phép tránh được điều này bằng cách tách tinh khiết và chỉ bảo quản các tế bào có CD34+, Thy-1+. Điều trị các bệnh lý ở cơ quan khác (nhồi máu cơ tim, Parkinson…): 2.7 Các nghiên cứu mới đây trên mô hình động vật và một số thử nghiệm lâm sàng cho thấy có thể dùng tế bào gốc tạo máu tiêm trực tiếp vào vùng tổn thương tim để tái tạo lại mô cơ tim và mạch máu tổn th ương trong nh ồi máu cơ tim cũng như có thể tiêm tế bào gốc tạo máu để điều trị bệnh Parkinson. Các nghiên cứu theo hướng này dựa vào khả năng “mềm dẻo” của tế bào gốc tạo máu và gợi mở một tiềm năng ứng dụng mới của tế bào gốc tạo máu. III. nuôi cấy và biệt hóa tế bào gốc 1. Thành phần môi trường • Muối vô cơ • Carbohydrate, acid béo, amino acid • Vitamine • Yếu tố vi lượng • Huyết thanh 2. Kỹ thuật nuôi cấy 13
2.1 Nuôi cấy sơ cấp : là quá trình nuôi cấy được thực hiện trực tiếp từ mảnh mô ban đầu đến khi cấy chuyền lần thứ nhất. • Nuôi cấy sơ cấp gồm các bước: thu nhận mô à tách rời các tế bào à nuôi cấy tế bào • Trong mô, các tế bào liên kết với nhau thành một khối thống nhất thông qua các cầu nối gian bào. Tách các tế bào ra khỏi mô bằng cách phá bỏ những cầu nối gian bào này. Các cầu nối này được phá hủy bằng hai cách: • (1) Tác động cơ học: cắt nhuyễn mô, ép nhuyễn mô và tách bằng lọc tế bào. • (2) Dùng enzyme phân hủy các cầu nối: cầu nối gian bào có bản chất là protein, do đó các enzyme thủy phân protein được sử dụng để tách tế bào, những enzyme thường được sử dụng như trypsin, collagenase, chymotrypsin... 2.2 Nuôi cấy thứ cấp: là quá trình nuôi cấy được thực hiện sau lần cấy chuyền đầu tiên. Cấy chuyền để cung cấp các chất dinh dưỡng tươi và không gian phát triển cho các dòng tế bào phát triển liên tục. Cấy chuyền gồm các thao tác: loại bỏ môi trường cũ à rửa bình/đĩa nuôi à tách các tế bào gốc bám vào đáy đĩa à pha loãng các tế bào gốc bằng môi trường mới 14
3 .Một số quy trình thu nhận và nuôi cấy và biệt hóa tế bào gốc 3.1 Thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương chuột Đùi chuột vừa được thu nhận Rửa bằng dung dịch PBS Lóc bỏ phần cơ và thịt Rửa lại bằng dung dịch PBS Thu nhận xương đùi chuột Cắt bỏ hai đầu xương đùi Rửa tủy xương bằng dung dịch D’MEM và thu nhận huyền phù tế bào bào Nuôi tế bào trong dụng cụ nuôi phù hợp Thay môi trường mới sau 24 giờ 15
3.2 Quy trình thu nhận tế bào gốc từ máu cuống rốn Pha mẫu máu thu được với dung dịch PBS/2mM EDTA theo tỉ lệ 1:1 Dùng pipette hút 15 ml dung dịch Ficoll_Hypaque vào ống ly tâm 50ml Rót nhẹ 30 ml hỗn hợp PBS và máu lên trên lớp dung dịch Ficoll_Hypaque sao cho không làm xáo động bề mặt Ficoll_Hypaque/mẫu Ly tâm 30’ ở 1500v\phút, nhiệt độ phòng Tách tế bào đơn nhân ra từ pha giữa Rửa 2-3 lần với PBS/EDTA Tái huyền phù tế bào trong môi trường nuôi cấy 3.3 Nghiên cứu nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh từ bệnh nhân azoospermia * Phân lập các tế bào dòng tinh - Các nghiên cứu phân lập các tế bào dòng tinh đã được nghiên cứu từ rất lâu. Các nghiên cứu này được tiến hành ở trên cả người và trên động vật. Anna và cs, 1996 đã nghiên cứu và thành công quá trình phân lập các tế bào dòng tinh, 16
đặc biệt là tinh nguyên bào loại A. Quá trình được tiến hành như sau: Chuột Wistar 9 ngày tuổi, trọng lượng cơ thể từ 18-20g được chọn để lấy tinh hoàn. Tinh hoàn được lấy và đặt trong môi trường MEM (minimum essential medium), có bổ sung glutamine (2nM), HEPES (15mM), một số amino acid, penicillin (100IU/ml), streptomycin (100mg/ml), gentamycin (50mg/ml). Sau khi loại bỏ màng trắng của tinh hoàn, mô tinh hoàn được đưa vào dung dịch nuôi cấy có khoảng 0,05% collagenase và dispase và 0,04mg/ml DNase, toàn b ộ s ản phẩm được đặt trong tủ ấm, ở nhiệt độ 32 0C. Sau 10 phút các thành phần như mô liên kết được loại bỏ. Sản phẩm lại tiếp tục được để trong tủ ấm trong 15 phút nhằm tách các tế bào khỏi màng đáy. Sản phẩm lại tiếp tục cho vào môi trường nuôi cấy trong 20 phút, có 0,5 U/ml heparinase III, 0,3 U/ml chondroitinase ABC, 0,5 mg/ml collagenase IV. Sản phẩm thu được lại được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 70mm, sau đó là 50mm. Sau khi rửa 2 lần, ly tâm 800 vòng/phút trong 30 phút, sản phẩm thu được là các tế bào dòng tinh. Tác giả đã nuôi cấy các tế bào ở 320C, nồng độ CO2 là 5%. - Hamra và cs, 2008 tiến hành phân lập các tế bào dòng tinh d ựa vào nguyên tắc: các tế bào thân ở tinh hoàn sẽ gắn chặt với nền collagen trong môi trường nuôi cấy. Trong khi đó, các tế bào dòng tinh, trong môi trường nuôi cấy lại không có đặc tính đó. * Nuôi cấy tế bào dòng tinh - Các nghiên cứu nuôi cấy các tế bào dòng tinh đã có từ rất lâu, Steinberger, 1970; Matte, 1971; Ghatnekar, 1974; Curtis, 1981 là nh ững tác gi ả đầu tiên tiến hành nuôi cấy các tế bào dòng tinh. - Tuy vậy, nuôi cấy các tế bào dòng tinh ch ỉ th ực sự có ý nghĩa t ừ sau những năm 1990, khi kỹ thuật vi thao tác được áp dụng. - Ngày nay nuôi cấy tế bào dòng tinh với 2 mục đích: Biệt hóa các tế bào dòng tinh • Lựa chọn các tế bào khỏe mạnh • + Đối với azoospermia không do tắc: - Zhu, 1996; Liu, 1997; Balaban, 1999; Cremades, 1999 và Sousa, 2002, nuôi cấy các tế bào dòng tinh thu được từ TESE và nhận thấy: sau 24h nuôi cấy trong môi trường có FSH thì tỷ lệ di động và khả năng th ụ tinh của tinh trùng tăng lên. 17
- Aslam và Fishel, 1998; Tesarik, 1998; Cremades, 1999 đã nuôi c ấy các tinh tử của người có quá trình sinh tinh bình thường. Kết quả các tinh tử phát triển nhanh với các biểu hiện: nhân tụ đặc lại, đuôi hình thành và phát triển. - Terarik, 1998 nhận thấy sự có mặt của FSH và testosterone trong môi trường nuôi cấy sẽ làm tăng nhanh tốc độ biệt hóa. - Các nghiên cứu của Tesarik vào năm 1999 và 2000 cũng thu được kết quả tương tự ở bệnh nhân azoospermia không do tắc. - Năm 1999, đứa trẻ đầu tiên ra đời từ tinh tử nuôi cấy (Tesarik). - Cho đến nay, có nhiều phương pháp nuôi cấy các tế bào dòng tinh khác nhau. Tesarik, 2006 tiến hành nuôi cấy các tế bào dòng tinh cùng với các t ế bào Sertoli, trong điều kiện nhiệt độ từ 30-32 0C, cùng với các chất khác như FSH, LH. Sousa, 2006 tiến hành nuôi cấy các tế bào dòng tinh sau khi phân l ập và chọn lựa dựa vào kỹ thuật vi thao tác. Một số các tác giả khác nuôi cấy các t ế bào dòng tinh cùng với tế bào Vero. - Huleihel và cs, 2007 đã tiến hành nuôi cấy tinh nguyên bào cùng với t ế bào Sertoli, dung dịch nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy ngoài các nội tiết tố còn bổ sung các chất như GDNF (glial cell line derived neurotrophic factor), SCF (stem cell factor), LIF (leukemia inhibitory factor). Kết quả nghiên cứu cho th ấy các t ế bào phân chia tốt. - Perrard và cs, 2007 đã tiến tới nuôi cấy các tế bào dòng tinh. K ết qu ả nghiên cứu cho thấy: betaNGF (beta nerve growth factor) có tác dụng trực ti ếp đến lần thứ 2 của phân bào giảm nhiễm để hình thành tinh tử tròn. Chính vì v ậy các tác giả nhận thấy số lượng tinh tử tròn tăng nhanh trong quá trình nuôi cấy. - Zhang, 2008 đã tiến hành nuôi cấy các tinh nguyên bào c ủa chu ột trên nền các tế bào Sertoli. Sau 4 đến 5 ngày nuôi cấy, môi trường nuôi c ấy đ ược thay. Kết quả thí nghiệm cho thấy, sau 24 giờ nuôi cấy đã phát hi ện s ự phân chia tế bào. Quá trình nuôi cấy được kéo dài trên 50 ngày. - Mito Kanatsu và cs, 2008 đã tiến hành nuôi cấy tinh nguyên bào của chuột Hamster trong thời gian kéo dài. Các tinh nguyên bào sau khi được phân lập và nuôi cấy trong môi trường có NGF, kết quả của nghiên cứu thu đ ược tinh tử tròn. 18
- Gần đây một số tác giả đã tiến hành nghiên cứu biệt hoá các tế bào mầm gốc phôi thành noãn và tinh trùng như Lacham-Kaplan, 2008. Các tác gi ả này đã thu được một số thành công, tuy nhiên vẫn còn nhiều tồn tại cần nghiên cứu. + Đối với azoospermia do tắc: - Các bệnh nhân nhóm này có quá trình sinh tinh xảy ra bình thường. Thông thường, các bệnh nhân này có kích thước tinh hoàn, nồng độ FSH, LH và testosterone trong máu bình thường, mào tinh căng, xác định rõ. Đặc biệt, chúng ta có thể thu được tinh trùng và tinh tử trưởng thành t ại mào tinh qua các k ỹ thuật PESA, MESA (Silber, 1994). - Tuy vậy, các tế bào dòng tinh thu được tại đây thường chưa trưởng thành hoàn toàn, hơn nữa lại khó xác định được tế bào sống để lựa chọn. Một số tác giả đã tiến hành nuôi cấy các tế bào này và đạt được kết quả tốt đẹp như: tế bào biệt hóa, trưởng thành hơn, khả năng xác định tế bào sống cao và tỷ lệ th ụ tinh sau ICSI tăng đáng kể (Balaban, 1999). * Đặc điểm của các tế bào thu từ tinh hoàn bệnh nhân azoospermia: - Tinh trùng thường chưa biệt hóa hoàn toàn và không di động nên rất khó xác định tinh trùng sống trong việc chọn tinh trùng để làm ICSI. - Theo Tesarik, 1998; Jurisicova, 1999; Gandini, 2000; Muratori, 2000, tỷ lệ đứt gãy ADN trong các tinh tử thu từ tinh hoàn, đặc biệt là tinh t ử tròn (round spermatid) là rất cao, đây là nguyên nhân làm giảm tỷ lệ thành công. - Nguyên nhân tỷ lệ thụ tinh của tinh tử rất thấp (Tesarik): Sự chưa hoàn thiện của trung thể • • Sự chuyển tiếp các protein nhân (từ histone thành protamine) ch ưa hoàn toàn: thiếu hụt protamine sẽ cản trở sự hình thành các tiền nhân. • Sự thiếu hụt các chất kích hoạt noãn. Không có tinh trùng trong tinh dịch (azoospermia) chiếm một tỷ lệ đáng kể trong các nguyên nhân vô sinh nam và đây là nguyên nhân đáng quan tâm nh ất. Nhóm azoospermia do tắc, các bệnh nhân này sẽ được điều trị bằng ph ương pháp PESA-ICSI hay MESA-ICSI. Nhóm th ứ 2 là nhóm azoospermia không do tắc, các bệnh nhân này cho đến nay khó có khả năng điều trị. TESE-ICSI hoặc xin tinh trùng là hướng giải quyết cho các bệnh nhân nhóm này. 19
Đối với các bệnh nhân azoospermia không do tắc, hướng giải quyết hiện nay vẫn là xin tinh trùng, đây vẫn là một giải pháp tình thế. Chính vì vậy nuôi cấy tinh trùng, tinh tử và các t ế bào gốc - sinh tinh có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao tỷ lệ thụ tinh và mang lại cơ hội làm cha cho những bệnh nhân azoospermia. 3.4 Thu nhận và biệt hóa tế bào gốc trung mô từ cuống dốn của người 3.4.1 .Thu nhận máu cuống rốn Máu cuống rốn được thu nhận từ các sản phụ đã được xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV…ở Bệnh viện Hùng Vương Thành phố Hồ Chí Minh. Sau khi thai nhi vừa được sinh ra, tiến hành kẹp phần cuống rốn gần bụng và cắt trên vị trí kẹp 1 cm. Dùng kim tiêm của túi thu máu (có chứa sẵn chất chống đông máu) đưa vào cuống rốn ở vị trí gần nhau thai. Máu cuống rốn sẽ theo kim và ống dẫn chảy vào túi thu máu. Khi máu hết chảy, rút kim ra và mang túi chứa máu về phòng thí nghiệm (được bảo quản lạnh trong đá gel). Thời gian từ khi thu nhận máu đến khi thao tác trong vòng 2 giờ. 3.4.2 .Giai đoạn 1, nuôi cấy sơ cấp tế bào của máu cuống rốn: chọn lọc MSC Về nguyên tắc, máu trong cuống rốn luôn chứa ba loại tế bào chính: tế bào gốc tạo máu (Hemapoietic Stem Cell_HSC), tế bào máu trưởng thành và MSC. Các MSC và tế bào gốc tạo máu thuộc quần thể các tế bào đơn nhân. Tiến hành thu nhận quần thể tế bào đơn nhân bằng phương pháp li tâm trên gradient nồng độ Ficoll-paque (Sigma) ở tốc độ 2.500 vòng/phút, trong 5 phút. Sau đó, thu nhận phân đoạn chứa các tế bào đơn nhân nằm giữa lớp Ficoll-paque và lớp huyết tương bên trên. Trong quá trình li tâm, các tế bào đã biệt hóa với kích thước lớn hơn sẽ đi xuyên qua lớp Ficoll và lắng ở đáy ống li tâm. Các tế bào hồng cầu không nhân nhẹ, nằm trong lớp huyết tương bên trên. Và các tế bào đơn nhân với kích thước trung bình luôn nằm ở lớp giữa. MSC sẽ được tách khỏi tế bào gốc tạo máu trong quần thể tế bào đơn nhân bằng phương pháp nuôi cấy. Trong nuôi cấy, các MSC sẽ bám dính vào bề mặt (giá thể) nuôi cấy, trong khi đó tế bào gốc tạo máu không có khả năng này. Tế bào đơn nhân sau khi thu nhận được huyền phù trong môi trường nuôi cấy IMDM, 10% FBS, nuôi trong bình nuôi cấy (Nunc, 25 cm2) sao cho đạt mật độ 3.105 tế bào/cm2 ở điều kiện 370C, 5% CO2. Sau 48 giờ, các MSC bắt đầu bám trên bề mặt đáy của bình nuôi, thay môi trường để loại bỏ hết các tế bào không bám (các tế bào chết và tế bào gốc tạo máu), tiếp tục nuôi cho đến khi tế bào 20