Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Kỹ thuật xét nghiệm y học: Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết từ cây hậu phác (Magnolia officinalis) lên dòng tế bào u thần kinh đệm C6

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:52

Thêm vào BST

Báo xấu

8
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài "Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết từ cây hậu phác (Magnolia officinalis) lên dòng tế bào u thần kinh đệm C6" nghiên cứu nhằm 3 mục tiêu: Đánh giá độc tính của dịch chiết trên dòng tế bào C6; đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết lên DNA của tế bào; đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết lên ty thể của tế bào.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Kỹ thuật xét nghiệm y học: Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết từ cây hậu phác (Magnolia officinalis) lên dòng tế bào u thần kinh đệm C6

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ĐỖ THỊ HUYỀN ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT TỪ CÂY HẬU PHÁC (MAGNOLIA OFFICINALIS) LÊN DÒNG TẾ BÀO U THẦN KINH ĐỆM C6 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Hà Nội – 2023
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ĐỖ THỊ HUYỀN ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT TỪ CÂY HẬU PHÁC (MAGNOLIA OFFICINALIS) LÊN DÒNG TẾ BÀO U THẦN KINH ĐỆM C6 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Khóa: QH 2019.Y Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Thuỳ Dương TS. Phạm Thị Hồng Nhung Hà Nội – 2023
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội. Trong suốt thời gian em học tập và rèn luyện tại trường, thầy cô là những người đã dạy dỗ, truyền đạt cho em nhiều tri thức quý báu, cũng như nhân cách đạo đức để trở thành một người công dân tốt. Em cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô, cán bộ phòng Sinh hoá thực vật - Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi, tận tình hướng dẫn và hỗ trợ em trong quá trình thực tập, nghiên cứu. Em xin gửi gửi cảm ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Thuỳ Dương người đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, nhiệt tình hướng dẫn em các thí nghiệm và chỉ dạy kiến thức chuyên môn giúp em hoàn thành tốt khoá luận. Sự động viên và khích lệ của cô đã giúp em có thêm động lực tìm tòi, khám phá, tự tin sáng tạo và kiên trì với những ý tưởng của mình. Đó là điều may mắn lớn nhất mà em có được trong những bước đầu của con đường nghiên cứu khoa học. Em xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Thị Hồng Nhung và các thầy cô trong Bộ môn Y Dược học cơ sở đã dành nhiều thời gian và tâm huyết, quan tâm giúp đỡ em. Các thầy cô là tấm gương sáng về tác phong làm việc và lối sống đạo đức cho em học tập, noi theo. Tiếp đó, em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể Ban giám hiệu, các thầy cô trong Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội, Bộ môn Y dược học cơ sở đã tạo điều kiện cho em làm khoá luận tốt nghiệp và giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới anh Vũ Mạnh Cường – cán bộ Phòng Sinh hoá Thực vật – Viện Công nghệ sinh học, đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình em thực tập và nghiên cứu tại phòng. Cám ơn anh Mạnh, chị Thuỷ, chị Diệp, Kim Anh đã luôn ở bên cạnh đông viên, khích lệ để em hoàn thành các thí nghiệm và khoá luận. Cuối cùng, con xin cảm ơn bố mẹ, anh chị đã luôn ở bên cạnh con, tin tưởng, động viên và luôn ủng hộ con thực hiện những mơ ước của mình. Đối với con, gia đình luôn là điểm tựa vững chắc nhất, là động lực để con cố gắng và phấn đấu trên con đường học tập và nghiên cứu phía trước. Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2023 Đỗ Thị Huyền i
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphate DAPI Thuốc nhuộm DNA (4′,6-diamidino-2-phenylindole) DMEM Môi trường nuôi cấy tế bào (Dulbecco's modified Eagle's medium) DMSO Dimethyl sulfoxide FBS Huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum) GBM Glioblastomas MTS 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium NADH Nicotinamide adenine dinucleotide NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate PBS Phosphate Buffer Saline ROS Reactive Oxygen Species SCCHN Ung thư biểu mô tế bào vẩy và cổ ii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 3.1. Chỉ số tăng sinh A(%) của dòng tế bào C6 sau 72 giờ ủ dịch chiết .............................................................................................................. 25 iii
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình1.1. Một số hình ảnh cây hậu phác ...................................................... 3 Hình 3.1. Mật độ tế bào ở các nồng độ dịch chiết khác nhau sau khi ủ dịch chiết....................................................................................................... 21 Hình 3.2. Hình ảnh tế bào C6 ủ dịch với dịch chiết ở các nồng độ khác nhau sau 24 giờ và mẫu đối chứng ........................................................................ 22 Hình 3.3. Hình ảnh tế bào C6 sau khi ủ dịch chiết nồng độ 0, 1, 5 µg/ml ... 23 Hình 3.4. Hình ảnh tế bào C6 sau khi ủ dịch chiết nồng độ 10, 20, 40 µg/ml ........................................................................................................ 24 Hình 3.5. Khả năng tăng sinh của tế bào C6 với dịch chiết ở các nồng độ .. 25 Hình 3.6. Kết quả điện di trên gel đơn tế bào ............................................... 27 Hình 3.7. Tỉ lệ DNA% đuôi ở các nồng độ dịch chiết khác nhau ................ 28 Hình 3.8. Ty thể và nhân trên kính hiển vi huỳnh quang ............................ 29 Hình 3.9. Cường độ huỳnh quang ty thể sau khi ủ dịch chiết ở các nồng độ 0, 5, 10, 20 µg/ml trong 24 giờ ................................................................ 31 iv
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. i DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................. ii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU .................................................................. vi MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1.1. Một số đặc điểm về cây hậu phác .................................................... 3 1.2. Một số tác dụng của dịch chiết từ cây hậu phác ............................ 4 1.3. Tác dụng chống ung thư của dịch chiết từ tự nhiên ...................... 6 1.3.1. Độc tính tế bào của một số dịch chiết từ tự nhiên ........................... 7 1.3.2. Ảnh hưởng của các dịch chiết lên DNA tế bào ............................... 8 1.3.3. Ảnh hưởng của các dịch chiết tự nhiên lên ty thể của tế bào .......... 9 1.4. U nguyên bào thần kinh đệm ......................................................... 11 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 14 2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 14 2.2. Hoá chất, dụng cụ, trang biết bị nghiên cứu chính ...................... 14 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................... 15 2.3.1. Nuôi cấy dòng tế bào C6 ............................................................... 15 2.3.2. Định lượng tế bào nuôi cấy ........................................................... 16 2.3.3. Phương pháp thử độc tính tế bào MTS .......................................... 16 2.3.4. Xét nghiệm điện di đơn tế bào....................................................... 18 2.3.5. Phương pháp nhuộm huỳnh quang ty thể ...................................... 19 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ............................................................................... 21 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lên sự tăng sinh của dòng tế bào C6 ........................................................................................... 21 3.2. Khảo sát độc tính của dịch chiết lên dòng tế bào C6 ................... 22 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết lên DNA tế bào .. 26 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết lên ty thể tế bào . 29 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................ 32 4.1. Ảnh hưởng của dịch chết lên sự tăng sinh dòng tế bào u thần kinh đệm C6 ............................................................................................... 32 4.2. Đánh giá độc tính của dịch chiết lên dòng tế bào C6 ................... 33 4.3. Ảnh hưởng của dịch chiết lên DNA tế bào ................................... 34 4.4. Ảnh hưởng của dịch chiết lên ty thể tế bào .................................. 35 v
KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 39 PHỤ LỤC ...................................................................................................... 44 vi
MỞ ĐẦU Ung thư là sự nhân lên không kiểm soát của một số tế bào trong cơ thể, dẫn đến sự hình thành khối u. Đó là nguyên nhân gây chết hàng đầu ở các nước phát triển và đứng thứ hai ở các nước đang phát triển. Theo thống kê của Globocan năm 2020 tỉ lệ tử vong do ung thư có xu hướng tăng. Trên toàn thế giới, ước tính có khoảng 19,3 triệu trường hợp ung thư mới và gần 10 triệu trường hợp tử vong do ung thư vào năm 2020. Gánh nặng ung thư toàn cầu dự kiến sẽ là 28,4 triệu ca vào năm 2040, tăng 47% so với năm 2020 [2]. Trong đó u nguyên bào thần kinh đệm được phát triển từ tế bào thần kinh đệm chưa biệt hoá trong não, 100% là ác tính được WHO xếp vào nhóm u ác tính độ IV và chiếm tỷ lệ cao nhất trong các loại u não ác tính nguyên phát. Có thể thấy ung thư là vấn đề lớn đối với nền y học, là yêu cầu cấp thiết cần tìm ra những phương pháp điều trị giúp giảm bớt gánh nặng ung thư. Mặc dù vậy các phương pháp điều trị ung thư hiện nay như xạ trị, hóa trị liệu, phẫu thuật, liệu pháp miễn dịch... vẫn còn nhiều mặt hạn chế như thiếu tính đặc hiệu, gây độc tính, gây chết các tế bào khỏe mạnh, cũng như tỷ lệ tái phát cao. Trong hơn một thập kỉ trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của y sinh học phân tử, người ta đi sâu vào nghiên cứu cơ chế phát sinh ung thư. Ty thể là một bào quan có vai trò quan trọng trong các quá trình chuyển hoá năng lượng khác nhau. Ngoài vai trò then chốt của chúng trong quá trình chuyển hoá năng lượng sinh học, chúng còn kiểm soát cân bằng nội môi oxy hoá khử, sinh tổng hợp các đại phân tử và tín hiệu apoptosis liên quan đến quá trình sinh ung thư cho thấy ty thể là bào quan quan trọng liên quan đến tất cả các giai đoạn sinh ung thư. Sự mất cân bằng trong nội môi ty thể gây ra sản xuất quá mức các loại oxy hoá phản ứng, dẫn đến tổn thương DNA, chết theo chương trình, lão hoá và tiến triển ung thư. Với các chức năng quan trọng như vậy, ty thể được các nhà nghiên cứu quan tâm như một đích trong điều trị ung thư. Từ nhiều thế kỷ nay, thực vật không chỉ là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho con người mà còn là những phương thuốc chữa bệnh hết sức quý giá bao gồm thuốc chống ung thư nói riêng và các bệnh khác nói chung. Trong đó cây hậu phác là một loài thực vật ngày càng nhận được nhiều sự quan tâm bởi những công dụng và chức năng của nó. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh khả 1
năng phòng ngừa ung thư và ngăn khối u tăng trưởng của các dịch chiết từ cây hậu phác với thành phần honokiol cao đối với ung thư da, vú, tuyến tiền liệt và phổi. Bởi vậy, nghiên cứu tìm ra các hợp chất từ nguồn dược liệu thiên nhiên có khả năng chữa bệnh ung thư luôn là một hướng nghiên cứu thu hút nhiều nhà khoa học. Trong nghiên cứu này chúng tôi sẽ tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết từ cây hậu phác (Magnolia officinalis) lên dòng tế bào u thần kinh đệm C6” với các mục tiêu: 1. Đánh giá độc tính của dịch chiết trên dòng tế bào C6. 2. Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết lên DNA của tế bào. 3. Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết lên ty thể của tế bào. Để thực hiện mục tiêu của để tài, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu như sau: 1. Nuôi cấy tế bào 2. Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết từ cây hậu phác lên sự tăng sinh và độc tính tế bào; 3. Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết từ cây hậu phác với DNA tế bào; 4. Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết từ cây hậu phác lên sự biểu hiện của ty thể. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Một số đặc điểm về cây hậu phác Hậu phác (danh pháp khoa học: Magnolia officinalis Rehd. et Wils) thuộc họ Mộc Lan, chi Magnolia. Chi Magnolia được phân bố rộng rãi trên khắp thế giới với trung tâm chính ở Đông Á và Đông Nam Á. Một số loại thường được sử dụng như Magnolia Officinalis và Magnolia Obovata [3]. A B Hình 1.1. Một số hình ảnh cây hậu phác. (A)Cành lá, hoa ; (B) Vỏ cây [1] Cho đến nay, hơn 250 loại thành phần đã được phân lập từ nón, vỏ cây, hoa và lá của chi Magnolia [4]. Các nghiên cứu hóa học về vỏ cây hậu phác (M. officinalis) đã dẫn đến việc phân lập một số hợp chất phenolic chính, đáng chú ý là các dẫn xuất neolignan magnolol (5,5'-diallyl-2,2'-dihydroxybiphenyl) và honokiol (5,3' -dallyl-2,4'-dihydroxybiphenyl) được coi là hai hợp chất phenolic chính trong vỏ cây và là thành phần hoạt động chính [5]. Cũng như các lignans magnolol và honokiol, các alkaloid là một nhóm các chất chuyển hóa thứ cấp thú vị của loài này, chúng tạo ra chủ yếu các alkaloid loại isoquinoline, phần lớn trong số đó là các dẫn xuất aporphine và benzylisoquinoline [6]. Các thành phần cụ thể trong vỏ cây và tỷ lệ của các thành phần đó khác nhau đáng kể tùy thuộc vào địa điểm và thời gian thu hoạch [7]. Có nhiều phương pháp tách chiết vỏ cây hậu phác để thu dịch chiết với các nồng độ khác nhau. Quá trình chiết xuất thường được thực hiện bằng cách sử dụng các dung môi hữu cơ bao gồm methanol, ethanol, n – hexan. Dịch chiết 3
thu được từ mỗi phương pháp sẽ có thành phần và hàm lượng các chất khác nhau nên tuỳ vào mục đích nghiên cứu dịch chiết sẽ có tác dụng khác nhau. Nghiên cứu về chiết xuất ethanol của cây hậu phác thu được thành phần phần honokiol và magnolol lần lượt là 55,4% và 40,1% [4]. Các thành phần hoạt tính sinh học quan trọng chính được phân lập từ M. officinalis là các neolignans polyphenolic, magnolol và honokiol. Honokiol được đặt tên theo "Honoki", một tên tiếng Nhật của M. obovata Thunb [8]. Chiết xuất vỏ cây Magnolia có bán trên thị trường dựa trên hàm lượng phenolic cao của chúng, với honokiol nằm trong khoảng từ 40% đến 90% tổng số polyphenol. Nhiều nghiên cứu cho thấy Honokiol có tác dụng sinh học và lâm sàng trên phạm vi rộng mà không có độc tính đáng kể. Các nghiên cứu trong ống nghiệm cho thấy honokiol có khả năng tăng cường các hoạt động điều trị ung thư bằng cách ức chế thành mạch, thúc đẩy quá trình chết theo chương trình, cung cấp hoạt động gây độc tế bào trực tiếp, điều chỉnh giảm các con đường truyền tín hiệu của tế bào ung thư. Honokiol cũng cho thấy tiềm năng điều trị các đặc tính sinh học khác như chống trầm cảm, chống oxy hoá, chống huyết khối, chống tạo mạch, chống lo âu,…Hơn nữa, nó cũng đã được phát hiện là có tác dụng mạnh với nhiều loại vi sinh vật khác nhau bao gồm vi khuẩn, vi rút và nấm [9]. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu đã tập trung vào khả năng chống ung thư của honokiol, nhiều nghiên cứu thực nghiệm trên các mô hình in vitro và in vivo đã được tiến hành bằng những phương pháp khác nhau, nhằm nhấn mạnh tiềm năng chống ung thư [3]. 1.2. Một số tác dụng của dịch chiết từ cây hậu phác Vỏ cây hậu phác đã được sử dụng trong các phương thuốc truyền thống của châu Á. Các chiết xuất khác nhau có nguồn gốc từ vỏ cây Magnoliae officinalis cũng được phổ biến rộng rãi trong các sản phẩm bổ sung chế độ ăn uống với liều khuyến cáo phù hợp với từng loại bệnh. Dịch chiết từ cây hậu phác có một số công dụng chính như rối loạn tiêu hoá, điều trị chứng lo âu, hen suyễn, trầm cảm…[3]. Hơn nữa một số thành phần chính trong dịch chiết có tác dụng chống oxy hoá, chống viêm, chống co thắt, kháng sinh,…Trong đó các bệnh về đường tiêu hoá rất phổ biến và đa dạng, hậu phác thường được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các rối loạn tiêu hoá như vậy, làm giảm 4
đáng kể bệnh loét dạ dày, bệnh tiêu chảy. Các alkaloid có trong thành phần dịch chiết của vỏ cây có tác dụng chống co thắt khi được sử dụng dưới dạng thuốc sắc liều cao để làm giảm co thắt tiểu phế quản và co thắt ruột [10]. Vỏ cây M. officinalis là một trong những loại thuốc thảo dược truyền thống để sử dụng để điều trị trầm cảm lâm sàng và các rối loạn lo âu. Các thành phần đã được báo cáo là có tác dụng dược lý đối với hệ thần kinh là-eudesmol, α-và-pinen và bornyl axetat dưới dạng tinh dầu; magnolol và honokiol ở dạng hợp chất diphenyl và magnocurarine dưới dạng alkaloid. Nó được chứng minh là có khả năng ức chế sự hình thành các hóa chất trung gian gây viêm, từ đó giúp làm giảm tình trạng viêm. Trong nghiên cứu của Joel M. Walker và các cộng sự đã đánh giá khả năng chống viêm của chiết xuất vỏ cây Magnolia officinalis và một số dịch chiết khác [11]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chiết xuất M. officinalis có tác dụng chống oxy hóa tốt, có thể ngăn ngừa peroxid hóa lipid, trì hoãn lão hóa. Các chiết xuất của magnolia có tác dụng chống oxy hóa chủ yếu bằng cách nhặt rác gốc tự do (DPPH, OH-), tăng cường hoạt động của các enzyme chống oxy hóa và ngăn chặn cơ chế peroxid hóa lipid [12]. Theo nghiên cứu của Yuelan Pang về tác dụng của chiết xuất từ vỏ cây M. officinalis với thành phần honokiol cao có tác dụng với hoạt động của các enzyme chống oxy hoá trong huyết tương của chuột. Dịch chiết thô trong nghiên cứu thu được với độ tinh khiết của honokiol lên đến 80,3%. Kết quả cho thấy chiết xuất honokiol với liều lượng thích hợp làm tăng hoạt động của cả hệ thống phòng chống oxy hóa không enzyme và enzyme và có tiềm năng sử dụng như một chất chống oxy hóa tự nhiên [13]. Ngoài ra các dịch chiết từ cây hậu phác còn có tác dụng chống ung thư. Đặc biệt các nghiên cứu trong ống nghiệm và mô hình động vật đã chỉ ra rằng các thành phần của M.officinali, đặc biệt là neolignans honokiol có thể nhắm mục tiêu vào nhiều con đường liên quan đến bệnh lý. Đáng chú ý các nghiên cứu cơ học đã được thực hiện trên honokiol để hỗ trợ phát triển các chất tương tự tổng hợp và cung cấp các yếu tố cho sự kết hợp hợp lý với hóa trị hoặc xạ trị thông thường [14]. Một số thành phần của M. officinalis , chủ yếu là lignans, đã được báo cáo rộng rãi là gây độc tế bào, đây có thể là ưu điểm cho các hợp chất chống ung thư mới [11]. 5
1.3. Tác dụng chống ung thư của dịch chiết từ tự nhiên Một số thành phần trong dịch chiết của cây hậu phác được báo cáo rộng rãi là gây độc tế bào. Ung thư tiến triển thông qua một loạt sai lệch di truyền và biểu sinh dẫn đến rối loạn điều hòa các con đường truyền tín hiệu tế bào quan trọng liên quan đến sự tăng trưởng, hành vi ác tính và kháng trị liệu tế bào [15]. Các dịch chiết từ cây hậu phác có thành phần honokiol cao được nhắm vào nhiều con đường truyền tín hiệu, bao gồm yếu tố hạt nhân kappa B (NF- κB), bộ chuyển đổi tín hiệu và bộ kích hoạt phiên mã 3 (STAT3), yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR), đích rapamycin ở động vật có vú (mTOR tham gia tập trung vào việc kiểm soát chuyển hóa, tăng trưởng và tăng sinh tế bào) và con đường chung qua trung gian caspase, điều chỉnh sự khởi đầu và tiến triển của ung thư. Các yếu tố phiên mã NF-κB và STAT3 kiểm soát sự biểu hiện của một loạt các gen liên quan đáng kể đến sự phát triển, tăng trưởng và biệt hóa tế bào, miễn dịch, chuyển hóa, viêm nhiễm và ung thư. Yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) là một glycoprotein có có hoạt tính tyrosine kinase, thường được biểu hiện quá mức hoặc được khuếch đại trong các loại ung thư khác nhau. Bên cạnh đó honokiol có thể ngăn chặn sự kích hoạt của mTOR và tín hiệu xuôi dòng của nó, dẫn đến cảm ứng chết theo chương trình, bằng cách ức chế các con đường kinase được điều hòa tín hiệu ngoại bào [16]. Trong thành phần của dịch chiết, honokiol được nghiên cứu là có thành phần hoạt tính gây độc cao trong việc gây ra quá trình chết theo chương trình [10]. Gần đây, hoạt động của honokiol được phát hiện có hoạt tính chống khối u bằng cách nhắm mục tiêu vào con đường chết theo chương trình, là mục tiêu cho các liệu pháp điều trị ung thư. Honokiol tác động lên các con đường chết theo chương trình ở bệnh ung thư đã được nghiên cứu bao gồm con đường qua trung gian thụ thể, con đường qua trung gian ty thể, con đường chung qua trung gian caspase và điều hòa các protein liên quan đến quá trình chết theo chương trình. Ngoài ra dịch chiết từ cây hậu phác với thành phần honokiol cao còn gây hoại tử tế bào. Bên cạnh quá trình apoptosis, Hono cũng được phát hiện có thể gây hoại tử tế bào ung thư vú MCF-7 (honokiol ở nồng độ 40 μg /mL) [29] Dịch chiết từ cây hậu phác tác động đến ung thư bằng nhiều cơ chế khác nhau như apoptosis, hoại tử tế bào, bắt giữ chu kỳ tế bào. Chẳng hạn như đối 6
với ung thư biểu mô vảy, tế bào ung thư tuyến tiền liệt, ung thư da, quá trình dị hóa Autophagy, hay khả năng ức chế di cư, xâm lấm và hình thành mạch của tế bào ung thư. Nhưng cơ chế quan trọng nhất, thường xuất hiện trong điều trị ung thư đó là quá trình ức chế sự tăng sinh tế bào, sự thúc đẩy quá trình sản xuất trong ty thể. Ty thể là dạng bào quan của ROS và các chất oxy khác, có thể phá hủy DNA hoặc các phân tử khác dẫn đến quá trình apoptosis. Trong quá trình oxy hóa, các electeron thoát ra khỏi chuỗi vận chuyển electeron của ty thể, rồi phản ứng với oxi để tạo thành O - [17]. Sau đó chuyển thành 2 hydropeoxid và các loại oxy trong phản ứng khác (ROS). Mức độ ROS nội bào không cân bằng có thể dẫn đến quá trình stress oxy hóa, gây tổn thương DNA, peroxy hóa lipid, cuối cùng gây ra quá trình apoptosis [18]. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá một số ảnh hưởng của dịch chiết từ cây hậu phác trên dòng tế bào u thần kinh đệm C6. 1.3.1. Độc tính tế bào của một số dịch chiết từ tự nhiên Độc tính tế bào chỉ đặc tính chung gây độc cho tế bào có thể do kích thích hoá học, tiếp xúc với các tế bào khác, các hoạt chất khác nhau hoặc điều kiện vật lí, môi trường khác nhau. Một hợp chất gây độc tế bào có thể xảy ra theo nhiều cách: phá vỡ các mục tiêu hoặc con đường sinh học phân tử cụ thể (ví dụ như tác dụng đối kháng thụ thể, khích hoạt/ ức chế enzyme) hoặc phá vỡ bộ máy tổng quát bộ máy tế bào dẫn đến căng thẳng tế bào và gây độc tế bào [15, 19]. Các quá trình phá vỡ tế bào bao gồm phản ứng protein, DNA hoặc lipid; sự phá vỡ các tính chất hoá lý của protein hoặc màng hoặc quá trình chết theo chương trình, phản ứng oxy hoá, gián đoạn ty thể. Nghiên cứu độc tính tế bào là một bước khởi đầu hữu ích trong việc xác định các độc tính tiềm tàng của các dịch chiết từ cây hậu phác. Một số thành phần của M. officinalis đã được báo cáo là là gây độc tế bào, đây có thể là một manh mối cho các hợp chất chống ung thư mới để điều trị các tế bào đích ung thư. Nồng độ được sử dụng trong các nghiên cứu trong ống nghiệm nằm trong khoảng 0 – 150 µM, đa số ở các khoảng nồng độ này honokiol đã được chứng minh là có ức chế đáng kể sự tăng sinh tế bào và khả năng sống của tế bào trên các dòng tế bào ung thư khác nhau. Xu hướng giá trị IC50 của nhiều dòng tế bào ung thư phụ 7
thuộc vào thời gian nên các giá trị IC50 giảm khi thời gian thử nghiệm tăng lên [20]. Để xác định độc tính của honokiol với các tế bào u nguyên bào thần kinh Neuro-2A, Juei- Tai Chen và các cộng sự đã tiến hành nuôi cấy và xử lý honokiol ở các nồng độ khác nhau trong 72 giờ. Hình thái của tế bào được quan sát dưới kính hiển vi, xét nghiệm 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) được tiến hành để xác định nồng độ ức chế tối đa một nửa (IC50). Kết quả cho thấy sau khi điều trị ở các nồng độ trên và trong thời gian 72 giờ làm giảm số lượng tế bào và gây co rút tế bào. Phân tích về khả năng tồn tại của tế bào khi xử lý honokiol là 63,3 µM. Mặt khác tác giả đã theo dõi sự tiếp xúc của các tế bào thần kinh – 2a ở nồng độ 40 µM honokiol trong 24, 48 và 72 nhận thấy khả năng sống sót của các tế bào thần kinh đã giảm lần lượt là 23%, 32% và 44% [21]. Trong một nghiên cứu khác của Chung- Ching Chio và các cộng sự đã tiến hành kiểm tra độc tính của honokiol trên dòng tế bào u thần kinh đệm U87- MG ở người và tế bào u thần kinh đệm GL261 ở chuột. Các tế bào được ủ honokiol ở các nồng độ khác nhau, xét nghiệm MTT được tiến hành cho kết quả IC50 là 63,8 µM [22]. 1.3.2. Ảnh hưởng của các dịch chiết lên DNA tế bào Bên cạnh việc đánh giá độc tính tế bào của dịch chiết từ cây hậu phác, độc tính gen là một khía cạnh khác để đánh giá độc tính. Độc tính gen là khả năng của một hợp chất gây ra thiệt hại hoặc thay đổi vật chất di truyền (DNA hoặc nhiễm sắc thể). Tổn thương DNA là bất kì sửa đổi nào của DNA làm thay đổi thuộc tính mã hoá của nó do đó ảnh hưởng của việc truyền thông tin bình thường. Việc biến đổi cấu trúc tự nhiên của DNA có thể xảy ra thông qua hai cơ chế chính: ảnh hưởng tự phát do các nguồn bên trong tế bào gây ra hoặc do các nguồn bên ngoài như hoá chất, chất phóng xạ gây ra [23]. Do đó việc đánh giá chính xác ảnh hưởng của gen bị tổn thương sẽ là một thông tin có giá trị để cân nhắc về tình trạng của tế bào [24]. Trong các bệnh về thần kinh, tổn thương DNA đã được nhắc đến từ lâu như một đóng góp vào sự khởi phát và tiển triển của bệnh. Trong nghiên cứu thử nghiệm của Huanli Xu và các cộng sự về tác dụng ức chế của lapahol đối với u thần kinh đệm C6 của chuột. Lapachol có một lịch 8
sử lâu dài về hoạt động chống ung thư kéo. Độc tính tế bào của lapachol và các dẫn xuất của nó đã được đánh giá trong nhiều tế bào khối u, chẳng hạn như tế bào ung thư thực quản, ung thư biểu mô Ehrlich, ung thư phổi không phải tế bào nhỏ A549, ung thư tuyến tiền liệt PC-3, các dòng tế bào ung thư ruột kết và các dòng u thần kinh đệm ở người (U373 và Hs683). Nghiên cứu này đã đánh giá mức độ gây tổn thương DNA của lapahol trên dòng tế bào C6 bằng cách đánh giá thông qua chiều dài đuôi DNA ở các nồng độ khác nhau và cho thấy mức độ tổn thương DNA tăng theo nồng độ hoá chất được thử [25]. Theo nghiên cứu của Sung Huyn Choi và các cộng sự, dòng tế bào C2H12 (tế bào nguyên bào cơ) sau khi được nuôi cấy và xử lý honokiol. Xét nghiệm điện di đơn tế bào đã được tiến hành để khảo sát mức độ tổn thương DNA của honokiol. Kết quả cho thấy tương tự như các mẫu đối chứng không có ảnh hưởng gì về DNA, các tế bào được xử lý bằng honokiol chiều dài đuôi đã được phát hiện cho thấy honokiol có thể gây ra tổn thương DNA và dẫn đến quá trình chết theo chương trình [26]. 1.3.3. Ảnh hưởng của các dịch chiết tự nhiên lên ty thể của tế bào Ty thể có trong hầu hết các tế bào của con người, đóng vai trò cực kỳ quan trọng đối với sự sống của mỗi chúng ta. Khác với các cơ quan tế bào khác, chúng gồm 2 màng gồm một lớp bên trong và một lớp bên ngoài với các chức năng khác nhau. Trong đó ở màng ngoài các phần tử nhỏ có thể tự do đi qua màng ngoài phần này bao gồm các protein được gọi là porins, tạo thành các kênh cho phép protein đi qua. Chúng có màng kép bên trong là những nếp gấp, được gọi là “cristase”, chứa các protein liên quan đến quá trình chuyển tiếp điện tử. Màng trong là nơi tạo hầu hết ATP trong ty thể [27]. Ty thể trong y học được coi như những nhà máy điện của tế bào trong cơ thể. Chúng giúp biến đổi năng lượng chúng ta lấy trong thức ăn chuyển hoá thành nguồn năng lượng mà tế bào có thể sử dụng. Vai trò chính của ty thể là sản xuất ATP, thể hiện qua một lượng lớn protein tại màng. ATP được sử dụng làm nguồn năng lượng chính cho hầu hết các quá trình sinh hóa và sinh lý chẳng hạn như tăng trưởng, vận động và cân bằng nội môi. Bên cạnh chức năng chính là tạo năng lượng ATP cho cơ thể, ty thể cũng có vai trò quan trọng trong cân bằng nội môi ion, trong một số con đường trao đổi chất, trong quá trình chết theo chương trình và 9
tế bào chết theo chương trình cũng như trong sản xuất và tiêu thụ ROS. Tất cả các chức năng này có ý nghĩa trong quá trình lão hóa hoặc gây rối loạn ty thể. Các ảnh hưởng này có thể khiến ty thể tích lũy các thành phần rối loạn chức năng do chính ty thể tạo ra. Nó có thể được gây ra bởi các lỗi trình tự hoặc quy định sau đột biến DNA nhân hoặc ty thể là kết quả của một loạt các tác động bên trong hoặc môi trường bên ngoài chẳng hạn như da tiếp xúc với bức xạ tia cực tím [28]. Ngoài ra trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa (OXPHOS) tạo ATP thì sản phẩm phụ của quá trình này tạo ra ROS. Trong GSC, ROS hiện diện ở mức thấp do hệ thống gốc tự do. Hơn nữa, mức độ ROS thấp có liên quan đến khả năng ác tính của tế bào cao hơn. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng độ ROS cao có thể ngăn chặn sự tiến triển của ung thư [29]. Do đó việc mất cấu trúc ty thể bình thường, sự ổn định và chức năng trong tế bào có khả năng dẫn đến sự bất thường của quá trình chuyển hoá axit béo, gây lượng ROS cao [60]. Ty thể tham gia vào quá trình điều hoà tăng sinh tế bào và chết theo chương trình. Đây là hai vai trò quan trọng khác của ty thể trong u thần kinh đệm [28]. Con đường tăng sinh tế bào là một phần quan trọng của cả con đường apoptosis bên ngoài và bên trong. Nó được kích hoạt bởi sự gắn kết của các yếu tố tăng trưởng với thụ thể tyrosine kinase (RTK) tương ứng của chúng được tìm thấy trên bề mặt tế bào. Các thành phần của con đường tăng sinh cũng bị ảnh hưởng bất lợi trong u thần kinh đệm, tạo ra một kích thích tăng sinh và chống apoptotic tổng thể. Sự biểu hiện quá mức của RTK đối với yếu tố tăng trưởng biểu bì khoảng 20 – 40% trong u thần kinh đệm cấp độ cao và đối với yếu tố tăng trưởng bắt nguồn từ tiểu cầu (PDGF) trong khoảng 25% trường hợp [30]. Ty thể còn có vai trò quan trọng trong quá trình chết theo chương trình của các tế bào thần kinh. Chết theo chương trình là một loạt các phản ứng sinh hoá dẫn đến sự thay đổi về hình thái của tế bào và dẫn đến cái chết của tế bào đó. Những thay đổi bao gồm việc hình thành những chỗ phồng, tế bào bị mất phần bất đối xứng và các thành phần gắn lên màng tế bào, tế bào bị co rút và nhân bị phân chia thành nhiều mảnh và DNA trong nhiễm sắc thể bị xắt nhỏ. Quá trình này có thể được kích hoạt thông qua con đường apoptosis bên ngoài và bên trong. Con đường apoptosis bên ngoài được kích hoạt bởi hệ thống miễn 10
dịch sau khi phát hiện các dấu hiệu bề mặt bất thường trên tế bào. Con đường nội bào được kích hoạt bởi tổn thương trực tiếp đến tế bào do nhiều nguyên nhân khác nhau bao gồm thiếu oxy, xạ trị, hoá trị, tạo ra ROS và tổn thương DNA trực tiếp [31]. 1.4. U nguyên bào thần kinh đệm Theo thống kê của GLOBOCAN ung thư là nguyên nhân dẫn đến tử vong đứng thứ hai trên toàn thế giới với hơn 10 triệu ca tử vong vào năm 2020. Trong đó, ung thư não cũng là một căn bệnh rất nguy hiểm gây tỉ lệ tử vong cao. Theo Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ ước tính có khoảng 22,850 người trưởng thành (12,630 nam và 10,280 nữ) được chẩn đoán ung thư não hay hệ thần kinh khác trong năm 2015 [32]. Tỷ lệ mới mắc của u nguyên bào thần kinh đệm là 2-3/100000 người trưởng thành và chiếm khoảng 52% tất cả các khối u não nguyên phát. Nhìn chung, u nguyên bào thần kinh đệm chiếm 17% tổng số u não. Ung thư não từ lâu đã được biết đến là căn bệnh ác tính đe dọa tính mạng con người. Mặc dù thực tế là tất cả các tổn thương ác tính nội sọ đều được gọi là u não, nhưng vị trí giải phẫu cụ thể, mức độ xâm lấn và hình thái học dẫn đến việc phân loại ung thư não thành các loại phụ khác nhau. Hầu hết các khối u tế bào song song độ I và II là các khối u cấp thấp không ác tính, trong khi các khối u tế bào song song độ III và IV là các khối u ác tính cao [33]. U tế bào hình sao độ III được gọi là u tế bào hình sao anaplastic (AAs), trong khi tất cả các loại u tế bào hình sao độ IV được gọi là u nguyên bào thần kinh đệm (GBM). Glioblastomas là khối u không đồng nhất và luôn gây chết người. Chúng được đặc trưng bởi các biến thể di truyền và biểu sinh giữa các tế bào khối u, khiến cho việc phát triển các liệu pháp tiêu diệt tất cả các tế bào khối u là một thách thức rất lớn. Ngày này các phương pháp điều trị đầu tay cho bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm bao gồm phẫu thuật, sau đó là xạ trị phân đoạn khu trú với việc sử dụng đồng thời và bổ trợ hoá trị liệu. Tuy nhiên các phương pháp trị liệu này vẫn còn nhiều rủi ro trong quá trình điều trị, có thể không điều trị được hoàn toàn di căn hoặc tái phát lại. Với sự phát triển của ngành sinh học phân tử bước đầu sử dụng phương pháp can thiệp sinh học, dựa vào cơ chế sinh ung thư trong các u não các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu các phương pháp khác như can thiệp vào hoạt động của các gen, ức chế sự sinh sản của các 11
tế bào u. Có nhiều nhiều dòng tế bào mô phỏng GBM của con người và được sử dụng trong nghiên cứu. Các dòng tế bào có nguồn gốc từ người như U251 và U87, dòng tế bào chuột GL261 và các dòng tế bào chuột 9L/LacZ, F98, RG2, CNS-1 và C6 [34]. Các dòng tế bào được sử dụng in vitro để cung cấp các nghiên cứu trị liệu như mô hình tăng trưởng, xâm lấn, mô hình tạo mạch và miễn dịch, cũng như nhiều mục tiêu phân tử và di truyền cho các tác nhân dược lý mới hơn. Dòng tế bào C6 được phát triển ở chuột Wistar-Furth trưởng thành vào cuối những năm 1960 sau khi chuột tiếp xúc nhiều lần với N -Nitroso- N - methylurea [35]. Dòng tế bào u thần kinh đệm này bao gồm các tế bào đa hình với các nhân có hình dạng khác nhau. Các tế bào C6 là các tế bào giống như trục chính mô phỏng GBM của con người khi được tiêm vào não của chuột sơ sinh. Các mô hình u thần kinh đệm đã được phát triển ở chuột Wistar và thể hiện các đặc điểm mô học giống như GBM người, chẳng hạn như hoại tử khối u, đa hình hạt nhân [36]. Mô hình u thần kinh đệm C6 đã được chứng minh là thể hiện sự đa dạng của protein, yếu tố tăng trưởng hoặc thụ thể của chúng, tạo thành mục tiêu cho nghiên cứu khối u. Trong số các mục tiêu phổ biến nhất là các yếu tố tạo mạch như VEGF và bFGF và các thụ thể của nó là thụ thể của yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGFR) và thụ thể của yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGFR) tương ứng. Các mục tiêu phức tạp hơn là IGF và các thụ thể của nó chịu trách nhiệm cho sự tăng sinh tế bào và ức chế sự chết của tế bào [37]. Ức chế tăng trưởng khối u là mục tiêu chính của nghiên cứu mô hình u thần kinh đệm C6. Một số hoạt chất như ibuprofen, dopamine và aspirin đã được thử nghiệm trên các mô hình như vậy, trong đó aspirin làm giảm sự xâm lấn của u thần kinh đệm [38]. Các mô hình u thần kinh đệm C6 cũng là một mô hình thường được sử dụng cho các liệu pháp thử nghiệm với các hạt nano. Các phương pháp trị liệu kết hợp cũng đã được thử nghiệm đối với các mô hình u thần kinh đệm C6. Những sự kết hợp này đã cho thấy sự ức chế tăng trưởng của tế bào u thần kinh đệm. C6 được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu môi trường miễn dịch khối u vì nó sử dụng các chiến lược xâm nhập miễn dịch tương tự như GBM của con người. Do đó, dòng tế bào C6 cung cấp nhiều 12