ĐỊNH LƢỢNG AMH (ANTI-MULLERRIAN HORMONE) MÁU
theo kỹ thuật hóa phát quang/điện hóa phát quang
AMH (Anti Mulerian Hormone), có bản chất là glycoprotein, lưu hành trong máu
người. Ở phụ nữ, các tế bào hạt granulosa trong tiền nang noãn của buồng trứng chế
xuất ra AMH. Nồng độ AMH trong máu phản ánh trữ lượng tiền nang noãn và khả
năng sinh trứng của buồng trứng. AMH cung cấp một dấu hiệu của số lượng trứng
được sản xuất rụng vào chu kỳ hàng tháng của phụ nữ. Mức độ AMH trong máu là
một chỉ số giúp đánh giá về dự trữ buồng trứng của phụ nữ và hữu ích trong việc
đánh giá tình trạng sinh sản. Sự giảm tiết AMH trong đời sống sinh sản của người
phụ nữ phản ánh sự suy giảm số lượng trứng/nang noãn theo tuổi và theo sự lão hóa
của buồng trứng. Mặc dù nồng độ AMH giảm theo tuổi, nhưng sự dao động theo
ngày của nồng độ hormone trong chu kỳ kinh nguyệt ở phụ nữ rất nhỏ, do đó có thể
đo nồng độ AMH trong ngày bất kỳ của chu kỳ kinh.
Ở nam giới, AMH do tế bào Sertoli sản sinh, là những tế bào sinh tinh trong tinh
hoàn. Nồng độ AMH trong máu phản ánh trữ lượng tiền tinh trùng và khả năng sinh
tinh của tinh hoàn.
I. NGUYÊN LÝ
Định lượng AMH dựa trên nguyên lýmiễn dịch kiểu “Sandwich”. Có thể sử dụng
hai phương pháp:
Theo phương pháp hóa phát quang –CLIA:
Định lượng AMH dựa trên phương pháp miễn dịch enzyme một bước đồng thời
(kiểu “Sandwich”). Mẫu bệnh phẩm được thêm vào giếng phản ứng cùng với
chất cộng hợp kháng thể (đơn dòng, chuột) kháng AMH – phosphatase kiềm
trong đệm MES, protein trong đệm muối TRIS vàcác hạt thuận từ phủ kháng thể
(đơn dòng, chuột) kháng AMH trong đệm TRIS. Sau khi ủ trong giếng phản ứng,
các chất gắn với pha rắn sẽ được giữ lại trong từ trường, các thành phần không
gắn sẽ bị rửa trôi. Tiếp đó, chất nền quang hóa Lumi-Phos 530 được thêm vào
giếng phản ứng và ánh sáng tạo ra bởi phản ứng được đo bằng bộ phận đo quang
(luminometer). Cường độ ánh sáng tạo ra tỷ lệ thuận với nồng độ AMH có trong
mẫu phản ứng. Lượng chất cần phân tích trong mẫu được xác định dựa trên
đường cong chuẩn đa điểm đã được lưu trong máy.
Theo phương pháp điện hóa phát quang - ECLIA):
Nguyên lý bắt cặp. Tổng thời gian xét nghiệm: 18 phút.
▪ Giai đoạn ủ đầu: 50 μL mẫu thử, kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng AMH
đánh dấu biotin, và kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng AMH đánh dấu phức hợp
rutheniuma* tạo thành phức hợp bắt cặp.
▪ Giai đoạn ủ thứ hai: Sau khi thêm các vi hạt phủ streptavidin, phức hợp miễn
dịch trên trở nên gắn kết với pha rắn thông qua sự tương tác giữa biotin và
streptavidin.
▪ Hỗn hợp phản ứng được chuyển tới buồng đo, ở đó các vi hạt đối từ được bắt
giữ trên bề mặt của điện cực. Những thành phần không gắn kết sẽ bị thải ra ngoài
buồng đo bởi dung dịch ProCell/ProCell M. Cho điện áp vào điện cực sẽ tạo nên
sự phát quang hóa học được đo bằng bộ khuếch đại quang tử.
▪ Các kết quả được xác định thông qua một đường chuẩn xét nghiệm trên máy
được tạo nên bởi xét nghiệm 2‑điểm chuẩn và thông tin đường chuẩn chính qua
mã vạch trên hộp thuốc thử hoặc mã vạch điện tử.
Ghi chú:* Tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II)-complex (Ru(bpy) )
II. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
01 cán bộ đại học có thẩm quyền ký kết quả. 01 kỹ thuật viên chuyên ngành Hóa
sinh hoặc người thực hiện phân tích có trình độ phù hợp, đã được đào tạo sử
dụng máy hóa sinh tự động
2. Phƣơng tiện hóa chất
2.1. Phương tiện:
- Máy miễn dịch tự động như: Unicel DxI 800 , máy e 170, E601, E602 và
một số máy miễn dịch khác
- Máy ly tâm,
- Tủ lạnh đựng hóa chất, tủ lạnh bảo quản QC, mẫu bệnh phẩm
- Pipep các loại, đầu côn xanh, côn vàng
- Giá đựng ống nghiệm, các ống lấy mẫu, ống sample cup
2.2. Hóa chất
Các hóa chất cần thiết cho phân tích trên máy Unicel DxI 800 gồm:
- Hóa chất chính Access AMH: Hóa chất tích hợp sẵn sàng cho sử dụng,
đóng gói 100 xét nghiệm/hộp. Bảo quản ở 2-8oC.
- Chất hiệu chuẩn Access AMH Calibrators: dùng để xây dựng đường cong
chuẩn cho xét nghiệm AMH. Chất hiệu chuẩn có 6 mức, dạng bột đông
khô. Được bảo quản ở 2- 10oC. Sau khi hoàn nguyên, chất chuẩn ổn định
trong 90 ngày ở 2-10oC.
- Chất kiểm chứng Access AMH QC: Dùng để kiểm tra tính chính xác của
kết quả xét nghiệm AMH.
- Access Substrate: Cơ chất phát quang
- Sample diluent A: dùng để pha loãng mẫu khi cần thiết.
- Unicel DxI Wash buffer II: Dung dịch rửa phản ứng
- Unicel DxI Reaction Vessel: Giếng phản ứng
Các hóa chất cần thiết cho phân tích trên máy máy e 170, e601, e602 gồm:
- M Vi hạt phủ Streptavidin (nắp trong), 1 chai, 6.5 mL: Vi hạt phủ
Streptavidin 0.72 mg/mL; chất bảo quản.
- R1 Anti-AMH-Ab~biotin (nắp xám), 1 chai, 8 mL: Kháng thể đơn dòng
kháng AMH đánh dấu biotin (chuột) 1.0 mg/L, đệm phosphate 50 mmol/L,
pH 7.5; chất bảo quản.
- R2 Anti-AMH-Ab~Ru(bpy) (nắp đen), 1 chai, 8 mL: Kháng thể đơn
dòng kháng AMH (chuột) đánh dấu phức hợp ruthenium 1.0 mg/L, đệm
phosphate 50 mmol/L, pH 7.5; chất; chất bảo quản.
3. Ngƣời bệnh
Cần giải thích cho người bệnh và người nhà người bệnh hiểu về mục đích của
việc lấy máu làm xét nghiệm
4. Phiếu xét nghiệm
- Phiếu xét nghiệm theo đúng quy định của Bộ Y tế và bệnh viện
- Trên phiếu xét nghiệm cần ghi đầy đủ thông tin của người bệnh: họ và tên,
tuổi, giới tính, số giường, khoa phòng, chẩn đoán, xét nghiệm cần làm.
- Trên phiếu xét nghiệm cần có: chữ ký và họ tên bác sĩ chỉ định xét nghiệm,
họ tên người lấy mẫu, thời gian chỉ định xét nghiệm và thời gian lấy mẫu
bệnh phẩm.
III. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
- Có thể sử dụng mẫu bệnh phẩm huyết thanh hoặc huyết tương. Lấy 3 mL
máu tĩnh mạch vào ống không có chất chống đông hoặc ống có chất chống
đông thích hợp như lithium heparin. Không sử dụng chất chống đông
EDTA.
- Mẫu được tiến hành phân tích ngay theo quy trình.
- Mẫu máu được tách riêng huyết thanh, huyết tương ổn định trong 3 ngày ở
20‑25 °C, 5 ngày ở 2‑8 °C và 6 tháng ở nhiệt độ -20 °C (± 5 °C). Mẫu chỉ
nên đông lạnh một lần.
2. Tiến hành kỹ thuật
- Máy phân tích cần chuẩn bị sẵn sàng để thực hiện phân tích mẫu: Máy đã được
cài đặt chương trình xét nghiệm AMH. Máy đã được chuẩn với xét nghiệm
AMH. Kết quả kiểm tra chất lượng với xét nghiệm AMH đạt yêu cầu: không
nằm ngoài dải cho phép và không vi phạm luật kiểm tra chất lượng.
- Người thực hiện phân tích mẫu nhập dữ liệu về thông tin người bệnh và chỉ
định xét nghiệm vào máy phân tích hoặc hệ thống mạng (nếu có).
- Nạp mẫu bệnh phẩm vào máy phân tích.
- Ra lệnh cho máy thực hiện phân tích mẫu bệnh phẩm.
- Đợi máy phân tích mẫu theo protocol của máy.
- Khi có kết quả cần xem xét đánh giá kết quả sau đó in báo cáo hoặc ghi kết quả
vào phiếu xét nghiệm để trả cho người bệnh.
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
AMH có liên quan với số lượng nang noãn nguyên thủy của buồng trứng. Nếu dự
trữ buồng trứng càng tốt thì khả năng sinh sản của buồng trứng càng cao, ngược
lại nếu dự trữ buồng trứng yếu sẽ gây ra tình trạng hiếm muộn ở phụ nữ. Nồng
độ AMH không thay đổi đáng kể trong suốt chu kỳ kinh và giảm dần theo tuổi
tác.
2. Giá trị tham chiếu
Khả năng sinh sản của buồng
trứng
ng / mL
pmol / L
Khả năng sinh sản tối ưu
4,0 - 6,8
28,6 - 48,5
Khả năng sinh sản tốt
2.2 - 4.0
15,7 - 28,6
Khả năng sinh sản kém
0,3 - 2,2
2.2 - 15.7
Khả năng rất kém
0,0 - 0,3
0,0 - 2,2
Hội chứng buồng trứng đa
nang
> 6,8
> 48,5
- AMH giúp đánh giá dự trữ và đáp ứng buồng trứng trong khi thực hiện thụ
tinh trong ống nghiệm.
- Tiên lượng được những yếu tố có lơi cho người bệnh. Phụ nữ có nồng độ
AMH thấp thường là đáp ứng kém với thuốc kích thích buồng trứng và phải
sử dụng rất nhiều thuốc để kích thích buồng trứng.
- Nếu AMH nhỏ hơn 3, khả năng đáp ứng kém với thuốc khi kích thích buồng
trứng làm thụ tinh trong ống nghiệm là rất cao và kết quả thành công bị ảnh
hưởng rất nhiều. Ngược lại nếu AMH cao, khả năng bị hội chứng quá kích
buồng trứng sẽ rất cao.
V. NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG VÀ XỬ TRÍ
Không sử dụng mẫu bệnh phẩm máu bị vỡ hồng cầu, cần loại bỏ và lấy lại mẫu
- Mẫu thực hiện xét nghiệm AMH không nên rã đông quá 2 lần.
- Tránh sử dụng mẫu nhiễm mỡ (mẫu bị đục quá) hoặc vỡ hồng cầu.
- Các yếu tố có nguy cơ gây nhiễu khác trong mẫu bệnh phẩm có thể xuất hiện và
gây ra kết quả sai trong xét nghiệm miễn dịch. Một số mẫu chứa yếu tố dạng thấp,
phosphatase kiềm nội sinh, fibrin, và protein có khả năng liên kết với phosphatase
kiềm có thể ảnh hưởng đến kết quả. Đánh giá cẩn thận kết quả xét nghiệm của
những người bệnh nghi ngờ có những yếu tố gây nhiễu này.
- Mẫu cần thực hiện ly tâm đủ thời gian để tách huyết thành/huyết tương hoàn
toàn, tránh hiện tượng đông dây làm sai lêch kết quả phân tích