Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành part 5

Chia sẻ: Afsjkja Sahfhgk | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

268
lượt xem 77
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nhiệm vụ của Vi sinh vật học: - Nghiên cứu các đặc điểm cơ bản về hình thái, cấu tạo, di truyền hoạt động sinh vật hóa học. - Sự phân bố của vi sinh vật trong tự nhiên và mới quan hệ giữa chúng với môi trường và các sinh vật khác. - Nghiên cứu các biện pháp thích hợp để có thể sử dụng một cách có hiệu quả nhất vi sinh vật có lợi cũng như các biện pháp tích cực nhằm ngăn ngừa các vi sinh vật có hại....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành part 5

Cùng m t dung d ch cơ ch t pha loãng có th phân tích nhi u m t như n m, x khu n và các lo i vi khu n … b ng cách c y vào môi trư ng thích h p. Môi trư ng có th là d ch th , có th là th ch b ng và t nh ng khu n l c ñã m c trên môi trư ng th ch b ng và nh ng ñ c trưng c a môi trư ng d ch th , chúng ta có th tính s lư ng c a vi sinh v t. 3. Tính s lư ng vi sinh v t 3.1. Phương pháp th ch b ng ( trên môi trư ng th ch ) - M i t bào vi sinh v t trên môi trư ng thích h p s phát tri n và cho chúng ta m t khu n l c. Do ñó s lư ng khu n l c cho ta bi t s lư ng vi sinh v t trong m t gam cơ ch t. - Sau khi VSV ñã m c trên môi trư ng th ch ñĩa (h p l ng), ñem ñ m s lư ng khu n l c ñư c hình thành b ng máy ñ m khu n l c, ho c ñ m tr c ti p theo phương pháp chia ô trên ñĩa môi trư ng. K t qu ñư c tính theo công th c sau: S = T x 10 x N x K S: S lư ng vi sinh v t trong m t gam cơ ch t. T: S khu n l c trung bình trong m t h p petri 10: S khu n l c qui ra 1 ml ( vì lúc nuôi c y trong h p l ng chúng ta dùng 0,1 ml dung d ch cơ ch t ) N: S ngh ch ñ o c a n ng ñ pha loãng K: h s khô ki t (N u không quy ñ i t khô sang tươi) 3.2 Tính s lư ng vi sinh v t trong môi trư ng l ng ( phương pháp ñ nh tính ) Có nh ng lo i vi khu n không th dùng m t thư ng quan sát khu n l c ho c s n ph m sinh ra cũng không có màu gì ñ c bi t ñ ñánh giá vi khu n ho t ñ ng. Trong trư ng h p này ph i dùng ph n ng màu ñ xác ñ nh. C m i ng nghi m có ph n ng màu g i là ng ( + ). D a vào các ng dương tính, căn c vào b ng Mc.Crady chúng ta tính ra s lư ng vi sinh v t. Ví d : 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 ð pha loãng 3+ 3+ 3+ 2+ 1+ S ng 0 dương - Tìm s ch tiêu: 321 S ch tiêu là con s có 3 hàng s . Hàng s ñ u là s bi u hi n n ng ñ loãng nh t các ng nghi m ñ u dương. Hai s ti p theo là s ng dương 2 n ng ñ ti p theo sau. - ðem s ch tiêu này tra b ng Mc.Crady ta s có s lư ng vi khu n tương ng: 15 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………39
- T con s này ta tính ra s lư ng vi khu n trong m t gam cơ ch t theo công th c: S = t x 10 x n x k S: S lư ng vi sinh v t. t: S lư ng vi khu n tra b ng 10: S lư ng vi khu n qui ra 1 ml n: S ngh ch ñ o c a n ng ñ pha loãng k: H s khô ki t S= 15 x 10 x 103 x 1,52 = 2,28 . 105 t bào/1g * Câu h i ôn t p: Bài s 6 1. Trình bày phương pháp pha loãng? 2. Nh ng d ng c c n thi t ñ làm dãy pha loãng là gì? 3. Nguyên t c cơ b n nh t c a phương pháp pha loãng ñ nuôi c y VSV là gì? 4. Phương pháp và cách tính s lư ng VSV trên môi trư ng ñ c, môi trư ng l ng? Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………40
Bài s 7 ðÁNH GIÁ ð C TÍNH SINH H C C A VI SINH V T M c ñích: - Giúp cho h c viên hi u rõ t m quan tr ng ph i ñánh giá ñ c tính sinh h c c a các VSV - Bi t ñư c các phương pháp cơ b n ñ ñánh giá ñ c tính sinh h c c a VSV N i dung: - ðánh giá th i gian m c c a ch ng gi ng c n nghiên c u - ðánh giá ñư ng kính khu n lc c c a ch ng gi ng c n nghiên c u - Xác ñ nh kh năng thích ng môi trư ng pH c a ch ng gi ng c n nghiên c u - Kh năng c nh tranh c a ch ng gi ng c n nghiên c u - Ho t tính c a ch ng gi ng c n nghiên c u 1. D ng c và nguyên v t li u 1.1 D ng c : ðĩa Petri, c n 760, nư c vô trùng, bình tam giác ho c bình c u 100, 250, 500, 1000 ml. Bình tia, lam kính, ñèn c n, thu c nhu m, kính hi n vi. … Môi trư ng nuôi c y ch ng gi ng VSV nghiên c u 2. ðánh giá ñ c tính sinh h c theo t ng ch tiêu: Vi c ñánh giá ñ c tính sinh h c c a các vi sinh v t ñ c tuy n ch n d a vào các ch tiêu sau: 2.1. Xác ñ nh th i gian m c c a các VSV Theo phương pháp nuôi c y trên môi trư ng th ch b ng ho c trong môi trư ng dung d ch (tùy t ng gi ng VSV) t ñ nh ôn nhi t ñ t 28 - 600c (tùy thu c vào ñ c ñi m c a t ng lo i vi sinh v t). Theo dõi t ng th i gian khác nhau t 24, 48 ,72, 96, 120, 144, 168 gi …. T ng th i gian trên quan sát khi VSV ñã m c ñư c trong th i gian nuôi t ñ nh ôn, thì tính gi . Xác ñ nh xem ch ng gi ng ñó thu c nhóm m c nhanh hay m c ch m (< 72 gi thu c nhóm m c nhanh; > 72 gi thu c nhóm m c ch m) 2.2. Xác ñ nh kích thư c khu n l c ño tr c ti p b ng thư c (mm). Do nhi u khu n l c sau ñó tính trung bình trung (t t nh t nuôi 5 ngày m i ño) 2.3. Xác ñ nh kích thư c t bào b ng phương pháp do tr c ti p b ng kính hi n vi (àm) Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………41
C ñ nh tiêu b n, nhu m t bào sau ñó do b ng d ng c ño chuyên d ng dư i kính hi n vi 2.4. Xác ñ nh kh năng thích ng môi trư ng pH khác nhau B ng phương pháp nuôi c y tr c ti p các m c pH khác nhau, c th là: pH = 4,0; pH = 5,0; pH = 6,0; pH = 7,0; pH = 8,0. (pHkcl) Cách làm như sau: - Pha dung d ch ñ m Sorensen 1: + Cân chính xác 9,078 g KH2PO4 1/15 M. + Cân chính xác 11,876g Na2HPO4. 2H2O hoà vào 1 lít nư c c t ñư c dung d ch Na2HPO4 1/25 M. Sau ñó pha 2 dung d ch này theo t l nh sau: (ñ i v i 1000ml môi trư ng). pH T l trong dung d ch (ml) Na2HPO4 KH2PO4 4,0 0 100 5,0 5 95 6,0 30 70 7,0 80 20 8,0 99 1 pH chính xác c a môi trư ng ñư c t o ra nh s giúp ñ c a dung d ch ñ m photphat ñ c b sung vào môi trư ng vô trùng v i s lư ng 10% so v i th tích c a môi trư ng. - Chu n b môi trư ng chuyên tính c a các ch ng vi sinh v t sau ñó pha môi trư ng v i các n ng ñ pH khác nhau, ñem h p kh trùng (1at, 20 phút), ñ ra ñĩa pettri (15 - 20 ml/1 ñĩa pettri). Thí nghi m ñư c nh c l i 4 l n 5 m c pH khác nhau. - Môi trư ng d ch th ñư c cho vào các bình tam giác 100 ml ( 50 ml môi trư ng d ch th / 1 bình tam giác). C y 1 ml d ch khu n chuyên tính c a t ng ch ng vi sinh v t vào các bình tam giác ñã chu n b trên r i ñưa lên máy l c (150 vòng/ phút, trong vòng 48 gi ). Sau ñó l y 0,05 ml d ch vi khu n ñó c y vào môi trư ng th ch b ng (ñã ñư c chu n b trên), dùng que g t (ñã kh trùng) g t ñ u d ch vi khu n trên b m t th ch. Sau ñó ñem nuôi trong t ñ nh ôn (nhi t ñ t 28 - 300c). Sau 48 gi nuôi c y ñưa ra ñ m s lư ng khu n l c m c t ng n ng ñ pH khác nhau. Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………42
2.5. Xác ñ nh kh năng kháng kháng sinh (kh năng c nh tranh) Theo phương pháp nuôi c y tr c ti p trên môi trư ng có Steptomixin v i các n ng ñ khác nhau: 300, 500, 600, 800, 1000 mg/1lít môi trư ng (Obtin,1971). Cách làm như sau: Pha thu c kháng sinh theo n ng ñ ñã ñ nh s n cho vào môi trư ng chuyên tính c a t ng ch ng vi sinh v t ( môi trư ng ñã ñư c kh trùng 1at, 30'). Sau ñó chia ra các ñĩa pettri r i ñ ngu i. C y 0,05 ml d ch khu n chuyên tính c a t ng ch ng vi sinh v t ñĩa pettri, ñem nuôi trong t ñ nh ôn (nhi t ñ t 28 - 300c). Sau 3 ngày nuôi c y ñưa ra ñ m và quan sát s lư ng khu n l c m c t ng n ng ñ kháng sinh khác nhau. 2.6. ðánh giá ho t tính c a các ch ng gi ng VSV Ch tiêu này ph thu c vào t ng VSV khác nhau, mà ñánh giá ho t tính c a chúng khác nhau. Ví d : Nghiên c u v ho t tính phân h y cellulô, ho t tính c ñ nh nitơ, ho t tính phân huye chuy n hóa phospho khó tan… Thí nghi m v xác ñ nh ho t tính phân h y chuy n hóa lân, thì: xác ñ nh cư ng ñ phân gi i lân khó tan Dùng vi sinh v t: T1, T2. Nguyên li u: Apatit, photphorit, canxiphotphat. Vi c ñánh giá c ng ñ phân gi i lân khó tan theo 2 phơng pháp sau: ðo ñư ng kính vòng phân gi i c a vi sinh v t, cách làm như sau: Cân 10g các ch t trên l n lư t cho vào t ng lo i môi trư ng chuyên tính. ðem kh trùng ( 1at, 45') r i ñ ra ñĩa pettri (kho ng 20 - 25 ml/1 ñĩa) sau ñó ñ ngu i. Các ch ng vi sinh v t ñư c hoà tan thành d ch huy n phù b ng nư c c t vô trùng. Dùng que c y l y d ch ñó c y ñi m vào môi trư ng th ch b ng có apatit, photphorit, canxiphotphat - Ca3(PO4)2. ðem nuôi trong t ñ nh ôn (nhi t ñ t 28 - 300c). Theo dõi sau 3 ngày/ 1 l n ño ñư ng kính vòng phân gi i c a t ng ch ng vi sinh v t. Xác ñ nh cư ng ñ phân gi i lân khó tan trên môi trư ng d ch th b ng phương pháp Oniani trên máy so m u. Cân 20g các ch t trên l n lư t cho vào t ng lo i môi trư ng d ch th , kh trùng ( 1at, trong vòng 45'), sau ñó ñ ngu i. Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………43
C y gi ng vi sinh v t vào t ng môi trư ng chuyên tính trên và ñưa lên máy l c (150 vòng/phút). C sau 3, 7, 15, 21, 30 ngày thì ño 1 l n trên máy so m u. * Câu h i ôn t p: Bài s 7 1. Trình bày nh ng ch tiêu cơ b n ñ ñánh giá ñ c tính sinh h c c a các ch ng gi ng VSV c n nghiên c u? 2. Phương pháp ch n và ñánh giá t ng ñ c tính sinh h c c a VSV ñ tuy n ch n làm gi ng cho h c t p và nghiên c u? Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………44
Bài s 8 PHÂN L P TUY N CH N VI KHU N AZOTOBACTER T ðT M c ñích: - Gi i thi u cho h c viên bi t cách phân l p tuy n ch n ch ng gi ng VSV thu n khi t t ñ t, mà c th trong bài là gi ng vi khu n Azotobacter. N i dung: - Phương pháp phân l p vi khu n Azotobacter. - Môi trư ng dinh dư ng ñ phân l p vi khu n Azotobacter. - ðánh giá ñ c tính sinh h c c a vi khu n Azotobacter. - B o qu n gi ng vi khu n Azotobacter. 1. Chu n b d ng c , nguyên v t li u và môi trư ng phân l p 1.1. D ng c , nguyên li u ðĩa Petri, c n 760, nư c vô trùng, bình tam giác ho c bình c u 100, 250, 500, 1000 ml. Bình tia, lam kính, ñèn c n, thu c nhu m, kính hi n vi. M u ñ t ñã sàng qua rây 2mm. Bình ch a 45 ho c 90 ml nư c vô trùng 1.2. Môi trư ng phân l p: s d ng môi trư ng Asby Glucô 10g K2HPO4 0,5g MgSO4 0,2g NaCl 0,2g K2SO4 0,1g CaCO3 5g Th ch 15 - 20g Nư c c t 1000ml Cân môi trư ng, ñun tan th ch cho vào bình thu tinh có nút mài, kh trùng 0,6 - 0,8 atm (105- 110 0C) trong 30 phút. ð m (50-60oC) phân vào ñĩa Petri 20-25 ml/ ñĩa (ñư ng kính 9 cm), công vi c này ñư c ti n hành hoàn toàn trong phòng vô trùng. 2. Các bư c phân l p vi khu n Azotobacter Cân 5g m u ñ t cho vào bình tam giác 100 ml ñã có s n 45 ml nư c vô trùng, cho lên máy l c trong 20 phút t c ñ 150 -200 l n/phút. Dùng que c y l y dung d ch l c ria c y lên môi trư ng th ch b ng. C y thành nhi u ñư ng th ng song song ho c c y ria 3 pha v i lư ng d ch gi m d n. Sau ñó ñem nuôi trong t ñ nh ôn 25 - 280C trong 2 - 3 ngày ñ i v i vi khu n m c nhanh. ð 5 - 7 ngày ñ i v i vi khu n m c ch m. Khu n l c Azotobacter có màu tr ng trong, l i nh y khi còn non, khi già có màu vàng l c ho c màu nâu s m, biên khu n l c ñ u. Vi khu n gram âm, không sinh bào t , di ñ ng nh tiên mao. Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………45
3. Xác ñ nh hình thái khu n l c, t bào và kh năng di ñ ng c a Azotobacter - Quan sát các khu n l c VSV ñã m c trong ñĩa petri. Nh n xét miêu t và v hình d ng các khu n l c ñ ng riêng r . Khi miêu t các khu n l c không m n p ñĩa petri. Ghi chép các ñ c ñi m c a khu n l c vào b ng theo m u sau: Khu n Hình ðư ng Màu B Nhìn Mép Cu Huỳnh Hình ð ð lc d ng kính, sáng, sc mt nghiêng trúc ch t quang v mm khu n ñ s trong lc - Làm tiêu b n gi t treo quan sát s di ñ ng c a Azotobacter. V d ng di chuy n. - Làm tiêu b n khô, nhu m Gram, quan sát hình thái c a vi khu n. V hình. ð phân l p ñư c gi ng Azotobacter thu n khi t, dùng phương pháp lo i d n tr c ti p trên ñĩa môi trư ng Asby. N u quan sát khu n l c không thu n ho c b nhi m t p ta lo i ngay. 4. Tuy n ch n ch ng gi ng Azotobacter Khi ñã phân l p ñư c ch ng gi ng Azotobacter thu n khi t r i, công vi c ti p theo bu c ph i ti n hành ñánh giá ñ c tính sinh h c c a ch ng gi ng m i ñư c phân l p. ðánh giá ñ c tính sinh h c b ng các ch tiêu sau: (trong bài th c hành v ñánh giá ñ c tính sinh h c c a VSV) - Th i gian m c - Kích thư c khu n l c - Kh năng m c môi trư ng pH r ng - Kh năng c nh tranh (Kháng kháng sinh) - Ho t tính c ñ nh nitơ phân t - Kh năng phát tri n trên môi trư ng t o các enzym………… 5. B o qu n ch ng gi ng Azotobacter Công tác b o qu n ch ng gi ng VSV là vi c làm r t c n thi t và di n ra thư ng xuyên. Khi ñã phân l p tuy n ch n ñư c ch ng gi ng VSV như ý mu n r i, thì vi c thu n hóa, b o qu n là r t quân tr ng. Ph i c y truy n và nuôi nh c l i r t nhi u l n ñ nh n ñư c gi ng ch ng thu n khi t. Sau ñó ph i th c hiên ñúng nguyên t c trong công tác b o qu n gi ng VSV t i phòng thí nghi m. (s gi i thi u trong bài th c hành v b o qu n và gi gi ng VSV) Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………46
* Câu h i ôn t p: Bài s 8 1. Trình bày các tiêu trí ñ phân l p, tuy n ch n ch ng gi ng Azotobacter trong ñ t? Môi trư ng nuôi c y? 2. Nêu ñ c tính sinh h c c a ch ng gi ng Azotobacte c n tuy n ch n? Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………47
Bài s 9 PHƯƠNG PHÁP L Y M U VÀ PHÂN L P TUY N CH N VI KHU N N T S N (VKNS) – RHIZOBIUM M c ñích: - Gi i thi u cho h c viên bi t phương pháp l y m u n t s n r cây h ñ u ñ phân l p ch ng gi ng vi khu n Rhizobium (vi khu n c ñ nh nitơ phân t c ng sinh) N i dung: - Hi u ñư c các bư c phân l p tuy n ch n vi khu n Rhizobium - Xác ñ nh ñư c ch ng gi ng vi khu n Rhizobium m i phân l p - ðánh giá ñ c tính sinh h c c a ch ng gi ng Rhizobium m i phân l p - B o qu n và s d ng ch ng gi ng Rhizobium m i phân l p 1. D ng c và nguyên v t liêu a. D ng c : Dao, kéo, k p s t, kéo, h p l ng, c n 760, 95 0 nư c vô trùng, bìng tam giác ho c bình c u 100, 250, 500, 1000ml, dung d ch HgCl2 0,1%. bình tia, lam kính, ñèn c n, thu c nhu m, kính hi n vi, b. Môi trư ng Pochon Manit hay glucô 10g K2HPO4 0.5g MgSO4 0,2g NaCl 0,2g Nư c men bia 100ml CaCO3 1g Côngô ñ 1% 10ml Th ch 15 - 20g Nư c c t 880ml Cân môi trư ng cho vào bình thu tinh có nút mài, kh trùng 0,6 - 0,8 át.m (105- 110 0C) qua 30 phút. ð m phân vào h p l ng 25- 30ml/ h p, công vi c này ñư c ti n hành hoàn toàn trong phòng vô trùng. 2. Phân l p vi khu n Rhizobium L y r cây ñ u ñ có n t s n to, nhi u k s c tr ng, màu h ng th i kỳ cây ra hoa, mang v phòng thí nghi m phân l p. Bên ngoài n t s n có nhi u t p khu n, ph i ti t trùng trư c khi phân l p. R a s ch n t s n, l y kéo c t n t s n ra kh i r . Chú ý không làm n t s n xây xát. Cho n t s n vào nư c trong r a th t s ch, cho vào c n 950 trong 3 phút, cho ti p vào dung d ch HgCl2 0,1% trong 5 phút, r a b ng nư c vô trùng 5 - 6 l n, m i l n 3 - 5 phút. Cho n t s n vào h p l ng có m t ít nư c vô trùng. Dùng k p s t bóp nát và làm thành dung d ch n t s n (có th dùng dao lam ñã kh trùng c t n t s n). Dùng que c y l y dung d ch n t s n c y lên môi trư ng th ch ph ng. C y thành nhi u ñư ng th ng song song v i lư ng d ch gi m d n. Sau ñó ñem nuôi t nuôi có 25 - 280C trong 2 - 3 ngày ñ i v i vi khu n m c nhanh. ð 5 - 7 ngày ñ i v i vi khu n m c ch m. Khu n l c n t s n có màu trong su t ho c 1/2 trong su t. Biên khu n l c ñ u. N u có côngô ñ hay Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………48