zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Luận Văn - Báo Cáo

» Báo cáo khoa học

Giới thiệu một số phương pháp tách ADN từ máu toàn phần - Tạp chí nghiên cứu y học

Chia sẻ: Hồ Huyền Trang | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Báo xấu

335
lượt xem 35
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tách chiết ADN là khâu cơ bản và rất quan trọng trong kỹ thuật sinh học phần tử. Chúng tôi đã tiến hành kỹ thuật tách chiết ADN từ máu ngoại vi: kỹ thuật perchlorate sodium, kỹ thuật Acetate amonium. kỹ thuật QIA ampkit. Đồng thời so sánh các kỹ thuật đó với nhau dựa trên một số tiêu chuẩn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giới thiệu một số phương pháp tách ADN từ máu toàn phần - Tạp chí nghiên cứu y học

TCNCYH 23 (3) 2003 Giíi thiÖu mét sè ph−¬ng ph¸p t¸ch ADN tõ m¸u toµn phÇn Lª Hoµn, TrÇn Kh¸nh Chi, Ph¹m ThÞ NguyÖt H»ng, B¹ch Kh¸nh Hßa §¹i häc Y Hµ Néi T¸ch chiÕt ADN lµ kh©u c¬ b¶n vµ rÊt quan träng trong kü thuËt sinh häc ph©n tö. Chóng t«i ®· tiÕn hµnh mét sè kü thuËt t¸ch chiÕt ADN tõ m¸u ngo¹i vi: kü thuËt Perchlorate sodium, kü thuËt Acetate amonium, kü thuËt QIA ampkit. §ång thêi so s¸nh c¸c kü thuËt ®ã víi nhau dùa trªn mét sè tiªu chuÈn. KÕt qu¶ cho thÊy kü thuËt Perchlorate sodium cã nhiÒu −u ®iÓm nhÊt. Kü thuËt nµy ®ang ®−îc sö dông th−êng qui t¹i Labo Trung t©m Y sinh häc, §¹i häc Y Hµ Néi. I. §Æt vÊn ®Ò phÝ thùc hiÖn vµ møc ®é ®éc h¹i ®èi víi ng−êi thùc hiÖn. ADN (Acid Deoxyribose Nucleic) lµ mét II. §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p ®¹i ph©n tö ®−îc cÊu thµnh tõ c¸c ®¬n ph©n lµ nucleotid. Trong c¬ thÓ, tÊt c¶ c¸c tÕ bµo cã nghiªn cøu nh©n ®Òu chøa ph©n tö ADN. Ph©n tö nµy mang 1. §èi t−îng toµn bé th«ng tin di truyÒn cña c¸ thÓ. Nguån M¸u ngo¹i vi chèng ®«ng b»ng EDTA. th«ng tin di truyÒn ®ã ®−îc æn ®Þnh nhê ho¹t ®éng tù sao chÐp cña ADN theo nguyªn t¾c 2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu “b¸n b¶o tån". §ång thêi th«ng qua ho¹t ®éng Thùc hiÖn mét sè kü thuËt t¸ch ADN kh¸c cña c¸c bé m¸y tÕ bµo, nguån th«ng tin nµy nhau víi nguyªn lý c¬n b¶n gåm 4 b−íc: ®−îc chuyÓn sang c¸c ph©n tö ARN th«ng tin ra ngoµi bµo t−¬ng tæng hîp nªn ph©n tö • Ph¸ vì hång cÇu protein: • Ph¸ vì b¹ch cÇu ADN sao m· mARN dÞch m· Protein • Lo¹i bá protein Trªn c¬ së ®ã, sinh häc ph©n tö ®· ph¸t triÓn • Tña ADN c¸c kü thuËt di truyÒn trªn ADN vµo nghiªn cøu vµ chÈn ®o¸n mét sè bÖnh. §Ó thùc hiÖn kü 2.1. Kü thuËt t¸ch ADN b»ng Perchlorate thuËt nµy ®ßi hái ph¶i cã nguån nguyªn liÖu sodium ADN ®¶m b¶o c¶ vÒ chÊt vµ l−îng. V× vËy, t¸ch (Kü thuËt cña S.A. Miller, D.D. Dykes, H.F. chiÕt ADN lµ kh©u ®Çu tiªn, c¬ b¶n vµ rÊt quan Polesky - 1988) träng trong c¸c qui tr×nh thao t¸c trªn ADN. Víi tÇm quan träng ®ã, ®Ò tµi nµy tiÕn hµnh • Ho¸ chÊt: øng dông mét sè kü thuËt t¸ch ADN kh¸c nhau - Dung dÞch I (cho 1 lÝt): vµ so s¸nh chóng víi nhau. Sucrose 0,3M 102g Môc ®Ých cña ®Ò tµi lµ t×m ra mét kü thuËt phï hîp nhÊt víi c¸c tiªu chuÈn vÒ: chÊt l−îng Tris HCl 1M pH7.5 10mM 10ml ADN, hµm l−îng ADN, thêi gian tiÕn hµnh, chi 2
TCNCYH 23 (3) 2003 MgCl2 5mM 1g ➢ Tña ADN: Triton 100 1% 10ml - LÊy n−íc næi sang mét tube kh¸c. - Dung dÞch II (cho 500ml): - Thªm vµo 2,5 thÓ tÝch cån tuyÖt ®èi, l¾c nhÑ, ñ ë -300C qua ®ªm thu ®−îc tña ADN NaCl 0,0075M 2,19g d¹ng h×nh søa. EDTA 0,024M 4,46g - Röa tña b»ng cån 70%, ®Ó kh«, hoµ tña - SDS (Sodium Dodecyle Sunfate) 10% b»ng T.E. - Perchlorate sodium 5M 2.2. Kü thuËt t¸ch ADN b»ng acetate d'ammonium - NaCl 6M (Kü thuËt cña S.A.Miller, D.D.Dykes, - Cån tuyÖt ®èi H.F.Polesky - 1988) - Cån 70% • Ho¸ chÊt - T.E (cho 1lÝt) gåm: T.E 20-5: TrisHCl 20mM Tris HCl 1M pH8 10ml EDTA 5mM EDTA 0,5M pH8 2ml - Sarkosyl 20% • Qui tr×nh t¸ch: - Proteinase K 10mg/ ml ➢ Ph¸ vì hång cÇu: - Acetate d'ammonium - LÊy 10ml m¸u chèng ®«ng b»ng EDTA. - Cån tuyÖt ®èi - Thªm vµo ®ã dung dÞch I cho ®ñ 50ml. - Cån 70% 0 - Trén ®Òu, ly t©m 4200 vßng/ 10 phót/ 4 C. • Qui tr×nh t¸ch - Lo¹i bá n−íc næi, thu ®−îc cÆn tr¾ng (nÕu ➢ Ph¸ vì hång cÇu: cßn hång cÇu th× tiÕp tôc lo¹i bá hång cÇu b»ng dung dÞch I). - LÊy m¸u chèng ®«ng b»ng EDTA. ➢ Ph¸ vì b¹ch cÇu: - Trén ®Òu, ly t©m nhÑ 2000 vßng/ 15 phót. - Sau khi thu ®−îc cÆn tr¾ng cho thªm vµo: - LÊy phÇn huyÕt t−¬ng giµu b¹ch cÇu, ®Æt trong ®¸ 30 phót. 4,5ml dung dÞch II - Thªm vµo 15ml dung dÞch T.E 20-5, trén 125µl SDS 10% ®Òu, ly t©m 1500 vßng/ 10 phót. 1,1ml perchlorate sodium 5M - Lo¹i bá n−íc næi, thu cÆn tr¾ng. 10µl Proteinase K 10mg/ ml • Ph¸ vì b¹ch cÇu vµ lo¹i protein: - Trén ®Òu, ñ 420C/ 30 phót, l¾c nhÑ. - Sau khi thu ®−îc cÆn tr¾ng, thªm vµo: - Thªm 2ml NaCl 6M. 3,5ml T.E 20-5 - Trån ®Òu, ly t©m 3500 vßng/ 15 phót/ 40C. 3
TCNCYH 23 (3) 2003 175µl Sarkosyl 20% - Thªm 200µl cån tuyÖt ®èi, trén ®Òu b»ng m¸y Vortex. 75µl proteinase K - ChuyÓn sang cét QIAGEN, ly t©m 8000 - L¾c ®Òu, ñ 370C qua ®ªm. vßng/ 10 phót, sau ®ã chuyÓn cét QIAGEN vµo - Lo¹i bá protein tube 2ml s¹ch kh¸c. - Thªm 2ml acetate d'ammonium 7,5M. - Thªm 500µl Buffer AW1 vµo cét QIAGEN, ly t©m 8000 vßng/ 1 phót, ®Æt cét - Ly t©m 3500 vßng/ 15 phót/ 40C. QIAGEN vµo tube 2ml s¹ch kh¸c. • Tña ADN: - Thªm 500µl Buffer AW2, ly t©m 14000 - LÊy n−íc næi sang mét tube kh¸c. vßng/ 3 phót. - Thªm 15ml cån tuyÖt ®èi. - §Æt cét QIAGEN vµo tube ly t©m 1,5ml, thªm 200µl Buffer AE, ®Ó ë nhiÖt ®é phßng 1 - Trén ®Òu thu ®−îc tña ADN h×nh søa. phót, sau ®ã ly t©m 8000 vßng/ 1phót. - Röa tña b»ng cån 70%, ®Ó kh«, hoµ tan tña III. KÕt qu¶ b»ng T.E. 1. §o hµm l−îng vµ ®¸nh gi¸ ®é tinh 2.2.3. Kü thuËt t¸ch ADN b»ng QIA khiÕt cña ADN b»ng m¸y quang phæ kÕ ampkit (Microtechnique) - §o mËt ®é quang cña dung dÞch ADN ë • Nguyªn t¾c: Kü thuËt nµy t¸ch ADN tõ b−íc sãng 260nm vµ ë b−íc sãng 280nm. m¸u ngo¹i vi b»ng QIAamp minikit cã s½n. - Hµm l−îng ADN ®−îc x¸c ®Þnh theo c«ng • Qui tr×nh t¸ch: thøc: - Cho 20µl QIAGEN protease (hoÆc [ADN] µg/ml = OD260*HÖ sè pha lo·ng*50. proteinase K) vµo eppendorf 1,5ml. - §¸nh gi¸ ®é tinh khiÕt cña ADN qua tû sè - Thªm vµo ®ã 200µl Buffer AL, l¾c b»ng OD260/ OD280. ADN ®−îc coi lµ tinh khiÕt khi: m¸y khuÊy trén Vortex 15 gi©y. 1,6
TCNCYH 23 (3) 2003 Hai kü thuËt Perchlorate Sodium vµ Acetate 2. §iÖn di kiÓm tra ADN d'ammonium cã −u ®iÓm lµ dÔ tiÕn hµnh, thêi - B¶n gel ®iÖn di cã 6 giÕng, cho vµo mçi gian ng¾n vµ chi phÝ võa ph¶i mµ vÉn thu ®−îc giÕng mét thÓ tÝch ADN nh− nhau. ADN ®¶m b¶o c¶ vÒ chÊt vµ l−îng. H¬n n÷a, hai kü thuËt nµy ®i tõ mét l−îng m¸u kh¸ lín (10ml) nªn l−îng ADN thu ®−îc cã thÓ sö dông trong nh÷ng kü thuËt ®ßi hái mét l−îng ADN lín nh− ®Þnh nhãm kh¸ng nguyªn b¹ch cÇu, ®Þnh nhãm kh¸ng nguyªn tiÓu cÇu. ADN t¸ch tõ kü thuËt perchlorate sodium cã ®é tinh khiÕt cao h¬n ADN t¸ch tõ kü thuËt Acetate d'ammonium. V. KÕt luËn Qua qu¸ tr×nh tiÕn hµnh c¸c kü thuËt trªn cïng víi kÕt qu¶ thu ®−îc, chóng t«i nhËn thÊy H×nh 1: §iÖn di kiÓm tra ADN trªn gel r»ng kü thuËt Perchlorate Sodium lµ phï hîp agarose 0,8%, ®iÖn thÕ 100 V, thêi gian 20 nhÊt víi nh÷ng tiªu chuÈn ®· ®Æt ra. HiÖn nay, phót. kü thuËt nµy ®ang ®−îc sö dông th−êng qui t¹i - GiÕng sè 1, 2: ADN t¸ch tõ kü thuËt Perchlorate sodium - GiÕng sè 3, 4: ADN t¸ch tõ kü thuËt QIA ampkit Labo Trung t©m Y Sinh häc, §¹i häc Y Hµ Néi - GiÕng sè 5: ADN t¸ch tõ kü thuËt Acetate Ammonium ®Ó t¸ch ADN tõ m¸u ngo¹i vi. - GiÕng sè 6: ADN chuÈn n«ng ®é 12 µg/ml Tµi liÖu tham kh¶o - KÕt qu¶ cho thÊy c¸c b¨ng s¸ng hiÖn râ 1. Laboratoire d’immunologie plaquettaire: nÐt, gän vµ kh¸ ®Òu nhau. Fiches Techniques. 1998, Vol.2. IV. Bµn luËn 2. Biologie Moleculaire: Principes et Kü thuËt QIA amp cho ADN chÊt l−îng tèt techniques de base - Les techniques de PCR. dï chØ ®i tõ mét l−îng m¸u rÊt Ýt (200µl). Tuy 3. Lª §×nh L−¬ng : Nguyªn lÝ kü thuËt di nhiªn, chi phÝ cho kü thuËt nµy kh¸ cao nªn truyÒn . 2001. ch−a ®−îc ¸p dông réng r·i. Summary Application and comparison of some methods of extraction DNA from peripheral blood DNA extraction is a basic and importance step in molecular biology technical. DNA has been extracted from peripheral blood by some techniques as: Perchlorate sodium, Acetate amonium, QIA amp minikit. At the same time, the comparison of those techniques depend on some standard. The result indicated: Perchlorate sodium DNA extraction is the best technique among the techniques mentioned above. This technique is daily used to extract DNA from peripheral blood at the Bio - Medical Centre Laboratory, Hanoi Medical University. 5

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.11: Bộ Luận Văn Tốt Nghiệp Chuyên Ngành Tài Chính Ngân Hàng

172 tài liệu

837 lượt tải

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.