Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vacxin viêm gan B tái tổ hợp

Chia sẻ: Nguyen Lan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:134

Thêm vào BST

Báo xấu

361
lượt xem 98
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Thay vì dùng huyết tương người, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã áp dụng công nghệ này để sản xuất vacxin viêm gan B tái tổ hợp và vacxin viêm gan A. Phương pháp này khắc phục được những khó khăn về nguồn nguyên liệu vì lượng huyết tương người đang ngày một thiếu hụt.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vacxin viêm gan B tái tổ hợp

Bé khoa häc vµ c«ng nghÖ bé y tÕ Ch−¬ng tr×nh khoa häc vµ c«ng nghÖ phôc vô ch¨m sãc vµ b¶o vÖ søc khoÎ céng ®ång B¸o c¸o tãm t¾t Dù ¸n s¶n xuÊt thö nghiÖm cÊp nhµ n−íc Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp M∙ sè KC.10-DA06 5971 10/8/2006 Hµ Néi-2004
Dù ¸n s¶n xuÊt thö nghiÖm cÊp nhµ n−íc KC.10-DA.06 __________________________________________________________________________________ Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp Cè vÊn khoa häc: GS.TSKH. NguyÔn Thu V©n Chñ nhiÖm dù ¸n: TS.Ng« Thïy Anh C¸c c¸n bé tham gia: KS. TrÞnh TuÊn ViÖt Cn. Vò V©n Quúnh Cn. Vò Hång Nga Cn. §inh Minh TuÊn Cn. Qu¸ch Minh Tu©n Ts. §ç Thñy Ng©n Ts. Vò Hång C−¬ng C¸c c¬ quan tham gia: - C«ng ty v¾cxin vµ sinh phÈm sè 1- ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ Trung −¬ng - Trung t©m Quèc gia KiÓm ®Þnh v¾cxin vµ c¸c chÕ phÈm sinh häc - Trung t©m y tÕ dù phßng - Thanh Hãa môc lôc
§Æt vÊn ®Ò...................................................................………………… 1 CH¦¥NG I: VËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p ..............................………….. 2 1. Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp.…………………………………………………………….. 2 2. X©y dùng tiªu chuÈn Quèc gia cho v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp s¶n xuÊt t¹i ViÖt Nam…………………………………………………. 3 2.1. An toµn chung ................................................................................. 3 2.2. KiÓm tra v« khuÈn ........................................................................... 3 2.3. X¸c ®Þnh hµm l−îng HBsAg ........................................................... 3 2.4. KiÓm tra chÊt g©y sèt ...................................................................... 4 2.5. KiÓm tra chÊt hÊp phô Al(OH)3 ....................................................... 4 2.6. KiÓm tra hµm l−îng Merthiolat ...................................................... 4 2.7. KiÓm tra hµm l−îng Formaldehyt .................................................... 4 2.8. KiÓm tra hµm l−îng protein toµn phÇn ............................................ 4 2.9. KiÓm tra c«ng hiÖu .......................................................................... 4 2.10. Thö nghiÖm nhËn d¹ng ................................................................. 5 3. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp trªn thùc ®Þa l©m sµng ………………. 5 3.1. §èi t−îng nghiªn cøu……………………………………………… 5 3.2. VËt liÖu nghiªn cøu………………………………………………… 5 3.3. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu…………………………………………… 5 CH¦¥NG II : KÕt qu¶ vµ bµn luËn .......................................…..….... 7 1. Hoµn thiÖn quy tr×nh s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp ........... 7 1.1. KÕt qu¶ kiÓm tra chñng s¶n xuÊt KM71-47-1.................................. 7 1.2. KÕt qu¶ kiÓm tra qu¸ tr×nh nh©n lªn cña tÕ bµo nÊm men................ 7 1.3. KÕt qu¶ kiÓm tra qu¸ tr×nh biÕn n¹p................................................. 7 1.4. KiÓm tra vì tÕ bµo............................................................................ 8
1.5. KiÓm tra qu¸ tr×nh tinh chÕ HBsAg.................................................. 8 1.6. Pha chÕ v¾cxin vµ ®ãng èng………………………………………. 12 2. X©y dùng tiªu chuÈn Quèc gia cho v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp s¶n xuÊt t¹i ViÖt Nam…………………………………………………. 12 2.1. X©y dùng tiªu chuÈn vÒ thµnh phÇn ho¸ häc……………………….. 12 2.2. X©y dùng vÒ c¸c chØ sè sinh häc……………………………………. 13 3. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp RecomBvax trªn thùc ®Þa l©m sµng ................ 14 3.1. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn……………………………………… 14 3.2. C¸c kÕt qu¶ ®¸nh gi¸ vÒ kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch sau khi tiªm v¾cxin theo ph¸c ®å th¸ng 0-1-2…………………….. 15 Ch−¬ng III. KÕt luËn.............................................................……........ 18 Tµi liÖu tham kh¶o ..................................................................……….. 21
môc lôc §Æt vÊn ®Ò...................................................................………………. 1 Ch−¬ng I: Tæng quan ..................................................................… 3 1. Nh÷ng hiÓu biÕt hiÖn nay vÒ virót viªm gan B.............................… 3 1.1. Th«ng tin ®¹i c−¬ng vÒ virót viªm gan B ........................................ 3 1.2. LÞch sö virót viªm gan B ................................................................. 3 1.3. CÊu tróc sinh häc ph©n tö cña virót B…………………………….. 4 1.4. BÖnh lý häc ...................................................................................... 12 1.5. DÞch tÔ häc virót viªm gan B ......................................................... 12 1.6. ChÈn ®o¸n viªm gan B .................................................................... 13 1.7. C¸c thÓ l©m sµng .............................................................................. 14 1.8. §iÒu trÞ .......................................................................................... 15 1.9. Dù phßng ....................................................................................... 16 1.10. ChiÕn l−îc lo¹i trõ l©y truyÒn viªm gan virót B ...............….......... 17 1.11. Phßng nhiÔm virót viªm gan B ...................................................... 18 1.12. Globulin miÔn dÞch phßng viªm gan B (HBIG).............................. 18 2. C¸c lo¹i v¾cxin viªm gan B vµ nh÷ng nghiªn cøu vÒ v¾cxin viªm gan B hiÖn nay………………………………………………… 18 2.1. C¸c lo¹i v¾cxin phßng viªm gan B vµ xu h−íng ph¸t triÓn………. 18 2.2. TÝnh an toµn cña v¾cxin viªm gan B……………………………… 20 2.3. TÝnh sinh miÔn dÞch cña v¾cxin viªm gan B……………………… 21 2.4. C¸c yÕu tè ¶nh h−ëng ®Õn tÝnh sinh miÔn dÞch cña v¾cxin phßng viªm gan B………………………………………… 23 3. Sö dông c«ng nghÖ t¸i tæ hîp ADN ®Ó biÓu thÞ kh¸ng nguyªn ....... 26 3.1. C¸c hÖ biÓu thÞ kh¸c nhau .............................................................. 26 3.2. BiÓu thÞ ë nÊm men ........................................................................ 26
3.3. BiÓu thÞ ë tÕ bµo ®éng vËt .............................................................. 27 3.4. HÖ biÓu thÞ ë Pichia pastoris .......................................................... 27 CH¦¥NG II: VËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p ..............................… 31 1. Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp.…………………………………………………………….. 31 1.1. Chñng s¶n xuÊt ................................................................................ 31 1.2. M«i tr−êng ………………………………………………………. 31 1.3. CÊy chñng ………………………………………………………… 33 1.4. Nh©n chñng ………………………………………………………. 33 1.5. BiÕn n¹p néi bµo …………………………………………………. 33 1.6. GÆt tÕ bµo………………………………………………………….. 34 1.7. T¸ch chiÕt HBsAg…………………………………………………. 34 1.8. Tinh chÕ HBsAg…………………………………………………… 34 1.9. BÊt ho¹t virót………………………………………………………. 35 1.10. Pha chÕ v¾cxin……………………………………………………. 35 1.11. So s¸nh qui tr×nh s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp ®· ®−îc hoµn thiÖn víi qui tr×nh s¶n xuÊt ë qui m« phßng thÝ nghiÖm …… 35 2. X©y dùng tiªu chuÈn Quèc gia cho v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp s¶n xuÊt t¹i ViÖt Nam…………………………………………………. 37 2.1. An toµn chung ................................................................................. 37 2.2. KiÓm tra v« khuÈn ........................................................................... 37 2.3. X¸c ®Þnh hµm l−îng HBsAg ........................................................... 38 2.4. KiÓm tra chÊt g©y sèt ...................................................................... 38 2.5. KiÓm tra chÊt hÊp phô Al(OH)3 ....................................................... 38 2.6. KiÓm tra hµm l−îng Merthiolat ...................................................... 39 2.7. KiÓm tra hµm l−îng Formaldehyt .................................................... 39 2.8. KiÓm tra hµm l−îng protein toµn phÇn ............................................ 40 2.9. KiÓm tra c«ng hiÖu .......................................................................... 40
2.10. Thö nghiÖm nhËn d¹ng ................................................................. 40 3. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp trªn thùc ®Þa l©m sµng ………………. 40 3.1. §èi t−îng nghiªn cøu……………………………………………… 40 3.2. VËt liÖu nghiªn cøu………………………………………………… 41 3.3. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu…………………………………………… 41 CH¦¥NG III: KÕT QU¶ Vµ bµn luËn ............................................ 46 1. Hoµn thiÖn quy tr×nh s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp ........... 46 1.1. KÕt qu¶ kiÓm tra chñng s¶n xuÊt KM71-47-1.................................. 46 1.2. KÕt qu¶ kiÓm tra qu¸ tr×nh nh©n lªn cña tÕ bµo nÊm men................ 46 1.3. KÕt qu¶ kiÓm tra qu¸ tr×nh biÕn n¹p................................................. 48 1.4. KiÓm tra vì tÕ bµo............................................................................ 50 1.5. KiÓm tra qu¸ tr×nh tinh chÕ HBsAg.................................................. 50 1.6. Pha chÕ v¾cxin vµ ®ãng èng………………………………………. 58 2. X©y dùng tiªu chuÈn Quèc gia cho v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp s¶n xuÊt t¹i ViÖt Nam…………………………………………………. 59 2.1. X©y dùng tiªu chuÈn vÒ thµnh phÇn ho¸ häc……………………….. 59 2.2. X©y dùng vÒ c¸c chØ sè sinh häc……………………………………. 64 3. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp RecomBvax trªn thùc ®Þa l©m sµng ................ 68 3.1. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn……………………………………… 68 3.2. C¸c kÕt qu¶ ®¸nh gi¸ vÒ kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch sau khi tiªm v¾cxin theo ph¸c ®å th¸ng 0-1-2…………………….. 74 Ch−¬ng IV. KÕt luËn....................................................................... 78 Tµi liÖu tham kh¶o ...................................................................... 81
c¸c ch÷ viÕt t¾t aa Amino acid (axÝt amin) ADN Desoxyribonucleic acid (axÝt desoxyribonucleic) ARN Ribonucleic acid (axÝt ribonucleic) AH Aluminium hydroxide (nh«m hydroxit) Anti-HBc Antibody against Hepatitis B core antigen (kh¸ng thÓ kh¸ng kh¸ng nguyªn lâi virót viªm gan B) Anti-HBe Antibody against Hepatitis B e antigen (kh¸ng thÓ kh¸ng kh¸ng nguyªn e virót viªm gan B) Anti-HBs Antibody against Hepatitis B surface antigen (kh¸ng thÓ kh¸ng kh¸ng nguyªn bÒ mÆt virót viªm gan B) Au Australia antigen (kh¸ng nguyªn Australia) CHO Chinese hamster ovary (tÕ bµo trøng chuét ®Êt vµng) CTTCMR Ch−¬ng Tr×nh Tiªm Chñng Më Réng CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung t©m kiÓm so¸t bÖnh tËt vµ dù phßng- Mü) D Dalton DR Double repeat (lÆp l¹i kÐp) §¦MD §¸p øng miÔn dÞch
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (thö nghiÖm miÔn dÞch g¾n enzym) FDA Food and Drug Administration (c¬ quan qu¶n lý thuèc vµ thùc phÈm) GMP Good manufacturing practice (thùc hµnh s¶n xuÊt tèt) GMT Geometric mean titer (hiÖu gi¸ trung b×nh nh©n) GP Glycoprotein (glycoprotein) HBV Hepatitis B virus (virót viªm gan B) HBcAg Hepatitis B core antigen (kh¸ng nguyªn lâi virót viªm gan B) HBeAg Hepatitis B e antigen (kh¸ng nguyªn e virót viªm gan B) HBsAg Hepatitis B surface antigen (kh¸ng nguyªn bÒ mÆt virót viªm gan B) HBx Hepatitis B x antigen (kh¸ng nguyªn x virót viªm gan B) HBIg Hepatitis B immunoglobulin (globulin miÔn dÞch phßng viªm gan B) HLKN Hµm l−îng kh¸ng nguyªn HT HuyÕt thanh HT1 (n) HuyÕt thanh lÊy lÇn thø nhÊt (hoÆc lÇn thø n) HLA kh¸ng nguyªn b¹ch cÇu ng−êi IU International unit (®¬n vÞ quèc tÕ)
IFNβ interferon-β IFNγ interferon-γ IFNα interferon-α kb kilobase (kil«baz¬) kD kilodalton (kil«dalton) KN Kh¸ng nguyªn KT Kh¸ng thÓ LD50 Lethal dose 50% (liÒu g©y chÕt 50%) LHBs Large hepatitis B surface antigen (kh¸ng nguyªn bÒ mÆt cña virót viªm gan B lo¹i lín) LH3E Lactalbumin hydrolysate Egle MHBs Medium hepatitis B surface antigen (kh¸ng nguyªn bÒ mÆt cña virót viªm gan B lo¹i trung b×nh) MLD Minimal lethal dose (liÒu g©y chÕt tèi thiÓu) MSV Master seed virus (Chñng gèc gièng) NMWL Nominal Molecular Weight Limit ( KÝch cì giíi h¹n träng l−îng ph©n tö ) OD Optical density (mËt ®é quang) ORF Open reading frame (khung ®äc më) P Protein PCR Polymerase chain reaction
(ph¶n øng chuçi polymeraza) ptl Ph©n tö l−îng SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (®iÖn di trªn gel polyacrylamid) SD Standard deviation (®é lÖch chuÈn) SHBs Small hepatitis B surface antigen (kh¸ng nguyªn bÒ mÆt cña virót viªm gan B lo¹i nhá) TCYTTG Tæ Chøc Y TÕ ThÕ Giíi TCVN Tiªu chuÈn ViÖt Nam VABIOTECH C«ng ty v¾cxin vµ sinh phÈm sè 1 v® võa ®ñ v/p vßng/phót VSDTT¦ VÖ Sinh DÞch TÔ Trung ¦¬ng WSV Working seed virus ( Chñng s¶n xuÊt)
®Æt vÊn ®Ò ViÖt Nam lµ mét trong nh÷ng n−íc cã tû lÖ ng−êi mang HBsAg cao trong céng ®ång, theo c¸c b¸o c¸o cña c¸c t¸c gi¶ kh¸c nhau cã thÓ giao ®éng tõ 11%- 26%. HBV vÉn chiÕm mét tû lÖ lín trong c¸c c¨n nguyªn g©y viªm gan ë c¸c bÖnh nh©n bÞ viªm gan, trªn 40% cã c¨n nguyªn g©y bÖnh lµ HBV. HBV còng chÞu tr¸ch nhiÖm tíi 90% c¸c tr−êng hîp ung th− gan nguyªn ph¸t, trong khi ë c¸c n−íc ®· tiÕn hµnh tiªm phßng v¾cxin viªm gan B cho céng ®ång tõ nh÷ng n¨m ®Çu thËp niªn 80 th× c¨n nguyªn chñ yÕu g©y ung th− gan nguyªn ph¸t hiÖn nay l¹i lµ virót viªm gan C, khi tû lÖ ng−êi mang HBsAg ®· gi¶m xuèng d−íi 1% do kÕt qu¶ tiªm phßng viªm gan B. Tû lÖ ng−êi mang ë phô n÷ cã thai lµ kho¶ng 12%, trong ®ã nÕu mÑ chØ bÞ HBsAg d−¬ng tÝnh kh«ng th«i th× kh¶ n¨ng truyÒn sang cho con trong thêi kú chu sinh lµ kho¶ng 40%, vµ nÕu mÑ mang c¶ HBsAg vµ HBeAg d−¬ng tÝnh th× kh¶ n¨ng truyÒn cho con sÏ lµ kho¶ng > 90%. Ng−êi mang HBV m¹n tÝnh cã nguy c¬ cao bÞ bÖnh gan trÇm träng khi tr−ëng thµnh, bao gåm ung th− gan vµ x¬ gan. Tö vong vµ bÖnh g©y ra bëi bÖnh gan m¹n tÝnh lµ rÊt phæ biÕn. Còng rÊt khã cã thÓ nãi ®−îc bÖnh nµo lµ do HBV g©y ra v× t×nh tr¹ng bÖnh th−êng kh«ng ®−îc b¸o c¸o ®Çy ®ñ. Tuy nhiªn râ rµng lµ nhiÔm HBV lµ mét vÊn ®Ò y tÕ céng ®ång quan träng vµ cã thÓ dù phßng ®−îc. N¨m 1991, nhãm Cè vÊn toµn cÇu cña Ch−¬ng tr×nh tiªm chñng më réng ®· kªu gäi tÊt c¶ c¸c n−íc ®−a thªm v¾cxin viªm gan B vµo Ch−¬ng tr×nh tiªm chñng quèc gia. ë ViÖt Nam, chÝnh phñ ®· cho phÐp ®−a v¾cxin viªm gan B vµo Ch−¬ng tr×nh tiªm chñng më réng ®Ó tiªm cho trÎ em d−íi 1 tuæi tõ th¸ng 8 n¨m 1997. Bªn c¹nh v¾cxin viªm gan B s¶n xuÊt tõ huyÕt t−¬ng ng−êi mang HBsAg cao, viÖc øng dông tiÕn bé khoa häc kü thuËt trong lÜnh vùc c«ng nghÖ sinh häc ®Ó cã ®−îc mét v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp ADN lµ hÕt søc cÇn thiÕt nh»m ®¸p øng nhu cÇu sö dông v¾cxin ngµy cµng lín trong nh©n d©n. Dùa trªn kÕt qu¶ ®¸ng khÝch lÖ cña ®Ò tµi KHCN-11-10A (1999) vµ KHCN-11-10B (2002): “Nghiªn cøu tiÕp thu chuyÓn nh−îng kü thuËt ®Ó x©y dùng qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A vµ v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp ADN”, v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp (RecomBvax) do C«ng ty V¾cxin vµ Sinh phÈm sè 1- ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ Trung −¬ng s¶n xuÊt cã kh¶ n¨ng phôc vô réng r·i cho nhu cÇu phßng bÖnh. ViÖc bæ sung trang thiÕt bÞ ®Ó më réng s¶n xuÊt, hoµn thiÖn qui tr×nh, ®µo t¹o c¸n bé KHCN n¾m v÷ng kiÕn thøc vµ kü thuËt ®Ó øng dông ®−îc c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin lµ hÕt søc cÇn thiÕt. Do ®ã, dù ¸n “Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp” cã môc tiªu nh− sau: - Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp. 1
- X©y dùng tiªu chuÈn Quèc gia cho v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp s¶n xuÊt t¹i ViÖt Nam. - ChuÈn bÞ n¨ng lùc khoa häc c«ng nghÖ ®Ó tiÕp thu dù ¸n vay vèn cña Hµn Quèc víi c«ng suÊt 20 triÖu liÒu/n¨m. Néi dung chÝnh cña dù ¸n lµ : - Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp. - X©y dùng tiªu chuÈn Quèc gia cho v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp s¶n xuÊt t¹i ViÖt Nam. - §¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp trªn thùc ®Þa ë giai ®o¹n 3, víi cì mÉu n=300. - §µo t¹o ®éi ngò c¸n bé khoa häc, c«ng nh©n kü thuËt lµnh nghÒ n¾m v÷ng kiÕn thøc vµ kü thuËt ®Ó cã thÓ tiÕp nhËn ®−îc c«ng nghÖ vµ sö dông trang thiÕt bÞ trong dù ¸n vay vèn cña Hµn Quèc. 2
Ch−¬ng I Tæng quan 1. Nh÷ng hiÓu biÕt hiÖn nay vÒ virót viªm gan B 1.1. Th«ng tin ®¹i c−¬ng vÒ virót viªm gan B Gen«m : ADN sîi kÐp mét phÇn. Hä : Hepadna. Thêi kú ñ bÖnh : 30-180 ngµy. §−êng l©y truyÒn : M¸u vµ dÞch tiÕt. TÊn c«ng cÊp tÝnh : NhÑ hoÆc d÷ déi. ChÈn ®o¸n huyÕt thanh : Anti-HBc, anti-HBs hoÆc HBsAg. §iÒu trÞ : TriÖu chøng. 1.2. LÞch sö virót viªm gan B Danh tõ viªm gan virót ®−îc hiÓu lµ mét nhiÔm trïng gan do mét trong nh÷ng virót viªm gan kh¸c nhau g©y ra. Danh tõ viªm gan B ®−îc MacCallum giíi thiÖu lÇn ®Çu tiªn vµo n¨m 1947 nh»m ph©n biÖt nhiÔm viªm gan (g©y thµnh dÞch) vµ viªm gan huyÕt thanh. Nh÷ng danh tõ nµy sau ®ã ®· ®−îc ñy ban Viªm gan virót cña TCYTTG sö dông. Tr−íc khi ph¸t hiÖn ra virót, sù l©y truyÒn viªm gan ®−îc ph©n biÖt dùa vµo quan s¸t theo dâi dÞch tÔ häc. KiÓu viªm gan B ®−îc coi nh− lµ l©y truyÒn qua ®−êng m¸u. Vµo n¨m 1963, khi nghiªn cøu tÝnh ®a d¹ng c¸c protein huyÕt thanh, Blumberg ®· kh¸m ph¸ ra mét protein ch−a tõng ®−îc biÕt tr−íc ®©y trong m¸u cña mét thæ d©n Australia. ¤ng gäi protein nµy lµ kh¸ng nguyªn Australia (Au). Sau nµy ng−êi ta thÊy kh¸ng nguyªn nµy cã liªn quan ®Õn kiÓu viªm gan B. §Õn n¨m 1968, c¸c nhµ nghiªn cøu kh¸c lµ Prince, Okochi vµ Murakami ®· x¸c ®Þnh ®−îc kh¸ng nguyªn Au (ngµy nay ng−êi ta gäi lµ kh¸ng nguyªn bÒ mÆt virót viªm gan B hoÆc HBsAg) vµ ®−îc t×m thÊy mét c¸ch ®Æc hiÖu trong huyÕt thanh bÖnh nh©n bÞ nhiÔm viªm gan kiÓu B. Vµo n¨m 1973, Dane ph¸t hiÖn ra c¸c h¹t kiÓu virót trong huyÕt thanh bÖnh nh©n bÞ nhiÔm viªm gan B. Nh÷ng h¹t nµy ®−îc gäi lµ virót viªm gan B (HBV). Nh÷ng virót kh«ng cã liªn quan kh¸c còng ®· ®−îc kh¸m ph¸ ra sau ®ã, song virót viªm gan B vÉn gi÷ tªn cña nã. B¶n chÊt virót cña c¸c h¹t nµy còng ®· ®−îc kh¼ng ®Þnh, Kaplan et al. ®· x¸c ®Þnh ®−îc ADN polymeraza néi gen phô thuéc ADN cïng víi lâi cña nã. ViÖc kh¸m ph¸ ra polymeraza nµy cho phÐp Robinson et al. x¸c ®Þnh vµ ®Æc tÝnh ho¸ ®−îc gen«m cña HBV. 3
Nh÷ng nghiªn cøu trªn toµn cÇu vÒ chu tr×nh nh©n lªn cña HBV víi quan t©m hµng ®Çu lµ sù kÕt dÝnh vµ x©m nhËp cña virót vµo tÕ bµo chñ. Nh÷ng nghiªn cøu l©m sµng còng ®ang ®−îc tiÕn hµnh nh»m t×m ra ®−îc c¸c ph−¬ng ph¸p ®iÒu trÞ bÖnh viªm gan B cÊp tÝnh hoÆc m¹n tÝnh. C¸c phßng thÝ nghiÖm kh¸c còng ®ang nghiªn cøu t×m kiÕm c¬ chÕ g©y ung th− cña HBV. 1.3. CÊu tróc sinh häc ph©n tö cña virót viªm gan B 1.3.1. Gen«m cña virót viªm gan B Gen«m cña virót viªm gan B ®−îc tr×nh bµy ë h×nh 1. KÝch th−íc gen«m giao ®éng gi÷a c¸c ph©n týp kh¸c nhau cña HBV, song tÊt c¶ ®Òu cã ®é dµi kho¶ng 3,2 Kb. ë viri«n cña HBV ng−êi ta t×m thÊy gen«m ë d¹ng sîi kÐp kh«ng hoµn chØnh. §iÒu nµy cã lÏ do tÝnh chÊt riªng trong chu tr×nh sèng cña HBV. HBV sö dông Transcriptaza phiªn m· ng−îc ®Ó phiªn m· toµn bé ®é dµi ARN sîi d−¬ng trong gen«m cña nã ng−îc trë l¹i thµnh ADN. Transcriptaza ng−îc nµy còng cã ho¹t tÝnh ADN polymeraza vµ nhê ®ã b¾t ®Çu mét qu¸ tr×nh sao chÐp mét ADN- sîi ©m míi ®−îc tæng hîp. Tuy nhiªn protein lâi capsid ho¸ Transcriptaza phiªn m· ng−îc/polymeraza tr−íc khi hoµn thµnh qu¸ tr×nh sao chÐp. Khi nµo vµ ë ®©u ADN sîi kÐp mét phÇn nµy cña gen«m ®−îc söa ch÷a thµnh ADN khÐp kÝn ®ång ho¸ trÞ vÉn cßn ch−a ®−îc biÕt. 1.3.2. Qu¸ tr×nh sao chÐp gen«m cña HBV Sù sao chÐp gen«m HBV x¶y ra bªn trong nh©n mét tÕ bµo bÞ nhiÔm. ARN polymeraza II phiªn m· ADN sîi trßn cña HBV thµnh mét sîi ARNm lín h¬n ®é dµi ®Çy ®ñ. Mét khi ®· ®−îc sao chÐp, ARN gen«m cã mÆt trong nh©n vµ x©m nhËp vµo bµo t−¬ng, ë ®ã ®−îc phiªn dÞch ®Ó t¸i sinh polymeraza, protein lâi vµ e cña HBV. Tõ tr¹ng th¸i tù do, tr−íc hÕt virót ph¶i kÕt dÝnh b¶n th©n nã vµo mµng mét tÕ bµo chñ ®Æc hiÖu. Qu¸ tr×nh kÕt dÝnh cña virót lµ mét trong nh÷ng b−íc quan träng ®Ó x¸c ®Þnh tÕ bµo chñ vµ tÝnh ®Æc hiÖu tÕ bµo. Tuy nhiªn hiÖn nay còng ch−a cã mét gißng tÕ bµo nµo ®Ó HBV cã thÓ g©y nhiÔm ®−îc in vitro. Mét vµi gißng tÕ bµo nh− HepG2 cã thÓ hç trî qu¸ tr×nh nh©n lªn cña virót chØ ë møc g©y nhiÔm ng¾n ngñi hoÆc sö dông æn ®Þnh HBV.ADN. Sau khi kÕt dÝnh, qu¸ tr×nh hoµ nhËp vá virót víi mµng tÕ bµo chñ ph¶i xÈy ra ®Ó cho phÐp protein lâi cña virót cã chøa gen«m vµ polymeraza x©m nhËp vµo tÕ bµo. Nh÷ng nghiªn cøu tr−íc ®©y cho thÊy qu¸ tr×nh axÝt ho¸ lµ cho phÐp ®èi víi sù x©m nhËp cña virót, song c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu hiÖn nay l¹i ng−îc l¹i. Còng kh«ng ®¸ng ng¹c nhiªn khi nh÷ng giai ®o¹n ®Çu tiªn cña qu¸ tr×nh nhiÔm trïng vÉn cßn nhiÒu tranh luËn. 4
Viri«n g©y nhiÔm, gäi mét c¸ch kh¸c lµ h¹t Dane cã ®−êng kÝnh kho¶ng 42nm. Nh− s¬ ®å trªn, cã chøa tÊt c¶ c¸c protein bÒ mÆt cña HBV còng nh− protein lâi, gen«m vµ polymeraza cña HBV. 1.3.4. Nh÷ng h¹t virót viªm gan B kh¸c Cã hai lo¹i h¹t kh¸c ®· ®−îc t×m thÊy trong huyÕt thanh cña ng−êi bÞ nhiÔm HBV vµ ®−îc gäi lµ h¹t viªm gan B h×nh cÇu vµ h¹t viªm gan B h×nh èng. C¶ hai lo¹i h¹t nµy ®Òu kh«ng cã chøa bÊt kú mét th«ng tin di truyÒn nµo chøng tá chóng g©y nhiÔm. C¶ hai lo¹i h¹t ®Òu cã ®−êng kÝnh 22 nm, tuy nhiªn h¹t viªm gan B h×nh èng cã ®é dµi thay ®æi. Mçi lo¹i h¹t ®−îc cÊu thµnh ®éc nhÊt tõ c¸c protein bÒ mÆt cña virót viªm gan B. H¹t h×nh cÇu tiÕt ra ®−îc cÊu t¹o chñ yÕu tõ protein bÒ mÆt cã kÝch th−íc nhá vµ trung b×nh trong khi h¹t h×nh èng tiÕt ra cã chøa c¶ protein bÒ mÆt virót viªm gan B träng l−îng ph©n tö lín. Cã thÓ t×m thÊy nh÷ng h¹t nµy víi hiÖu gi¸ cao trong m¸u nh÷ng ng−êi mang HBV. C¸c h¹t kh«ng g©y nhiÔm nµy cã hiÖu gi¸ cao cho thÊy virót ph¶i ®−îc h×nh thµnh ®Ó sö dông chóng theo mét kiÓu nµo ®Êy. Còng cã gi¶ thiÕt cho r»ng c¸c h¹t kh«ng g©y nhiÔm cã hµm l−îng cao trong huyÕt thanh cho phÐp c¸c h¹t virót g©y nhiÔm ch¹y ngang qua m¸u kh«ng x¸c ®Þnh ®−îc b»ng hÖ miÔn dÞch. Tuy nhiªn theo m« h×nh mÉu virót viªm gan B ë vÞt h×nh nh− cã sù t¨ng nhanh nhiÔm trïng khi virót ®−îc trén ë tû lÖ nµo ®ã víi c¸c h¹t kh«ng g©y nhiÔm. Sù b¸m dÝnh c¸c h¹t kh«ng g©y nhiÔm vµo tÕ bµo cã thÓ ®Ó ho¹t hãa tÕ bµo, chuÈn bÞ s½n sµng cho virót g©y nhiÔm. §iÒu nµy còng cã thÓ ®óng cho virót viªm gan B ë ng−êi, song vÉn ch−a ®−îc kÕt luËn. 1.3.5. Protein lâi virót viªm gan B (HBc) Protein lâi virót viªm gan B (HBc) ®−îc cÊu t¹o phÇn lín tõ axÝt amin −a n−íc vµ tÝch ®iÖn. Protein nµy kh«ng bao giê ®−îc glycosyl ho¸, còng nh− kh«ng cã liªn kÕt lipit nµo. Tuy nhiªn trong c¸c tÕ bµo eukayriot cã lÏ protein nµy ®−îc phosphoryl ho¸. Protein nµy ®−îc tæng hîp trong bµo t−¬ng vµ cã thÓ l¾p ghÐp víi nhau thµnh h¹t lâi cã chøa gen«m cña virót. BiÓu thÞ protein HBc ë vi khuÈn cho thÊy ARN l¾p r¸p theo mét kiÓu kh«ng ®Æc hiÖu. Kh¶ n¨ng l¾p r¸p h¹t c− tró trong vßng 149 axÝt amin ®Çu. Bèn côm Arginin trong vßng 36-38 axÝt amin cuèi cã lÏ tham gia vµo qu¸ tr×nh l¾p ghÐp c¸c axÝt nucleic. Qu¸ tr×nh phosphoryl ho¸ xÈy ra hoÆc ë Serin thø 170 hoÆc 172. C¸c axÝt amin nµy khu tró gi÷a côm Arginin 3 vµ 4. V× thÕ qu¸ tr×nh phosphoryl ho¸ c¸c ®iÓm Serin cã thÓ øc chÕ qu¸ tr×nh g¾n c¸c axÝt amin. Nh÷ng nghiªn cøu sö dông hÖ lai kÐp cïng víi kü thuËt quÐt peptit ®· x¸c ®Þnh ®−îc c¸c axÝt amin t−¬ng t¸c m¹nh (aa 78 vµ 117) cã thÓ t¹o thµnh mét phÇn bÒ mÆt tiÕp gi¸p dimer. Ng−îc l¹i, c¸c vÞ trÝ 113 vµ 143 cã lÏ tham gia vµo qu¸ tr×nh multimer ho¸ c¸c dimer. §ét biÕn ë hai vÞ trÝ nµy cã lÏ ®· t¸c ®éng ®Õn tÝnh æn ®Þnh cña capsit. 7
1.3.6. Protein e virót viªm gan B (HBe) Virót hepadna biÓu thÞ d¹ng tiÕt cña protein HBc. §iÒu nµy ®¹t ®−îc nhê qu¸ tr×nh phiªn dÞch tr×nh tù ®Çu 5’ vµo ORF cña HBc ®−îc gäi lµ tr×nh tù tiÒn-C. Tr×nh tù tiÒn-C cã chøa vÞ trÝ xuyªn mµng kþ n−íc/tÝn hiÖu tiÕt xuÊt dÉn ®Õn di chuyÓn protein HBe vµo trong lßng èng m« l−íi néi bµo (ER). Trong ER, vÞ trÝ 19 trong 29 vÞ trÝ vïng tiÒn -C ®−îc c¾t ra nhê mét tÝn hiÖu peptidaza trong khi 10 vÞ trÝ cßn l¹i ng¨n ngõa viÖc l¾p r¸p HBe vµo h¹t lâi. Mét vïng kh¸c sau nµy ®−îc c¾t ra b»ng mét proteaza Golgi ë vïng giµu Arginin. S¶n xuÊt c¸c thÓ tiÕt xuÊt nµy cña HBc cã thÓ b»ng c¸ch nµo ®Êy ®· ®µn ¸p sù ®µo th¶i miÔn dÞch cña tÕ bµo s¶n xuÊt - HBV. HBe ë hµm l−îng cao ®−îc t×m thÊy trong huyÕt thanh bÖnh nh©n nhiÔm HBV huyÕt cao víi Ýt triÖu chøng. §ång thêi, c¸o ®u«i chån sÏ kh«ng ph¶i chÞu ®ùng nhiÔm dai d¼ng virót viªm gan B, nÕu sö dông ph−¬ng ¸n HBe-©m cña virót. 1.3.7. H¹t lâi H¹t virion tinh khiÕt cã chøa protein HBc t¹o ra c¸c h¹t lâi bao bäc gen«m vµ polymeraza cña virót. ë virion tr−ëng thµnh, h¹t lâi nµy ®−îc t¹o vá bäc b»ng nhiÒu kh¸ng nguyªn bÒ mÆt kh¸c nhau cña HBV. H¬n n÷a cã thÓ mét protein- kinaza còng ®−îc bao vµo trong h¹t lâi. Cã lÏ mét nång ®é HBc nhÊt ®Þnh lµ cÇn thiÕt cho qu¸ tr×nh l¾p r¸p h¹t. C¸c dimer cña protein HBc b¾t ®Çu ®−îc h×nh thµnh, l¾p r¸p ë nång ®é 0,8 µM thµnh c¸c h¹t ®¼ng ®iÖn ®èi xøng kh«ng gian ba chiÒu (180 tiÓu ®¬n vÞ HBc t¹o thµnh mét h¹t lâi). C¸c h¹t lâi ®· l¾p ghÐp sau ®ã ®−îc lµm æn ®Þnh nhê c¸c cÇu nèi disulphid. HiÖn nay, ng−êi ta thÊy mét c¸ch râ rµng h¬n lµ vïng tiÒn -S1 vµ S cña protein vá bäc sÏ t−¬ng t¸c víi h¹t lâi. §iÒu nµy còng kh«ng cã g× ®¸ng ng¹c nhiªn v× h¹t lâi ph¶i ®−îc l¾p ghÐp mét c¸ch ®Æc hiÖu bëi mµng giµu protein bÒ mÆt cña HBV ®Ó cã thÓ s¶n sinh ra ®−îc c¸c viri«n tr−ëng thµnh. 1.3.8. Kh¸ng nguyªn bÒ mÆt virót viªm gan B S¬ ®å sau ®©y lµ c¸c kiÓu kh¸c nhau cña kh¸ng nguyªn bÒ mÆt virót viªm gan B. Trong gen«m cña HBV, vïng m· ho¸ kh¸ng nguyªn bÒ mÆt HBV gåm ba khung b¾t ®Çu tõ c¸c vÞ trÝ cã chung mét codon kÕt thóc. Bëi vËy, c¸c protein bÒ mÆt kh¸c nhau cña HBV ®Òu cã liªn quan ®Õn nhau bëi mét vïng chung nhau nh− ®· biÕt lµ vïng S. 1.3.8.1. Kh¸ng nguyªn bÒ mÆt virót viªm gan B lo¹i nhá (HBsAg hay lµ SHBsAg) Protein nµy lµ lo¹i protein nhá nhÊt trong sè c¸c protein bÒ mÆt virót viªm gan B vµ cã chøa ®éc nhÊt vïng-S. Trong lÞch sö nã còng ®−îc gäi lµ kh¸ng nguyªn Australia (kh¸ng nguyªn Au). Lµ kh¸ng nguyªn kþ n−íc chøa 4 vïng xuyªn mµng cã trËt tù. HBsAg chøa mét l−îng lín Cystein, tæng sè lµ 14 vµ tõng Cystein cã liªn kÕt chÐo víi mét Cystein kh¸c. HBsAg còng cã thÓ ®−îc glycosyl ho¸ ë Asp 146. Hai d¹ng protein nµy th−êng nh×n thÊy ®−îc trªn gel ch¹y ®iÖn di 8
víi h¹t HBsAg tinh khiÕt tõ huyÕt t−¬ng ng−êi mang. Protein nµy lµ ®o¹n khëi ®Çu lËp thµnh tÊt c¶ c¸c d¹ng h¹t cña HBV, v× vËy protein nµy ®−îc s¶n xuÊt víi mét l−îng lín ë virót. Nã còng chøa epitop cã tÝnh kh¸ng nguyªn cao. Ph©n tÝch epitop nµy cho phÐp x¸c ®Þnh ®−îc ph©n týp cña ng−êi mang HBV. Vi tÝnh ho¸ m« h×nh cho thÊy liªn quan ®Õn c¸c ®−êng xo¾n èc 3 vµ 4 lµ vïng xuyªn mµng ng¨n n¾p ®−îc gµi vµo mµng ER sau giai ®o¹n phiªn dÞch. Hai vßng xo¾n nµy ®−îc xem nh− lµ vÞ trÝ thùc hiÖn qu¸ tr×nh multimer ho¸. §iÒu nµy ®−îc cñng cè thªm nhê quan s¸t HBsAg bÞ xÐn bít vïng xo¾n èc nµy sÏ kh«ng cã kh¶ n¨ng t¹o thµnh c¸c h¹t vµ sÏ ë l¹i mµng ER. TÕ bµo bÞ nhiÔm ë giai ®o¹n sím s¶n sinh ra mét l−îng lín nhÊt protein. HiÖu gi¸ h¹t HBsAg kh«ng g©y nhiÔm t×m thÊy trong huyÕt thanh ng−êi mang cã thÓ cao tíi 200µg/ml. BiÓu thÞ HBsAg cã thÓ còng ®−îc c¶m øng nhê mét chÊn ®éng trong lßng èng l−íi néi bµo, ®iÓn h×nh lµ khi LHBsAg cã ë l−îng lín. MÆc dï nh÷ng h¹t nµy cã tÝnh kh¸ng nguyªn vµ tû lÖ m¾c cao, song hÖ miÔn dÞch h×nh nh− vÒ c¬ b¶n ®· quªn l·ng sù cã mÆt cña chóng. Nghiªn cøu c¸c yÕu tè hoµ tan ®iÒu chÕ tõ tÕ bµo lyph« T khi cã nhiÔm HBV cho thÊy HBsAg cã nguån gèc tõ tÕ bµo T cã lÏ ®· ng¨n chÆn sù s¶n sinh ra kh¸ng thÓ kh¸ng HBsAg trong c¸c tÕ bµo T kh¸c. Sù ng¨n chÆn nµy lµ ®Æc hiÖu ®èi víi HBsAg. Sù kiÒm chÕ miÔn dÞch cña c¸c kh¸ng thÓ kh¸ng c¸c thµnh phÇn kh¸c nhau cña HBV th−êng dai d¼ng ë ng−êi cã t×nh tr¹ng mang HBsAg m¹n tÝnh. Gen khëi ®éng S n»m trong vïng tiÒn-S. §ét biÕn ë vïng nµy sÏ dÉn ®Õn HBsAg ®−îc s¶n sinh ra víi møc thÊp. S¶n xuÊt HBsAg gi¶m ®i cã lÏ lµm cho virót ø ®äng trong néi bµo còng nh− mÊt kh¶ n¨ng l¾p r¸p c¸c h¹t virót. C¸c ph©n týp cña SHBsAg ®· ®−îc x¸c ®Þnh nguån gèc b»ng sù nhËn biÕt kh¸ng thÓ. Vïng kh¸ng nguyªn cã mÆt ë tÊt c¶ c¸c ph©n lËp HBs ®· biÕt ®−îc gäi lµ quyÕt ®Þnh kh¸ng nguyªn a. Bèn ph©n týp chñ yÕu kh¸c nhau lµ d hoÆc y vµ w hoÆc r. Hai bé nµy ®−îc cÆp ®«i theo kiÓu thµnh viªn cña mçi cÆp sÏ lo¹i trõ lÉn nhau. QuyÕt ®Þnh d cã Lysin ë vi trÝ 122, trong khi y cã Arginin. T−¬ng tù, quyÕt ®Þnh w cã Lysin ë vÞ trÝ 160 trong khi r cã Arginin. HiÖn nay ng−êi ta còng ®· t×m thÊy c¸c quyÕt ®Þnh kh¸c cã chøa c¸c epitop kh¸ng nguyªn kh«ng ®−îc nhËn biÕt bëi c¸c kh¸ng thÓ kh¸ng l¹i c¸c ph©n týp ®· ®−îc biÕt tr−íc ®©y. Víi c¸ch nhËn ®Þnh nh− vËy, mét sè kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu ph©n týp ®Æt vÊn ®Ò : liÖu v¾cxin sö dông h¹t HBs cã g©y ®−îc ®¸p øng miÔn dÞch b¶o vÖ ë ng−êi víi tÊt c¶ c¸c chñng HBV kh«ng ? C©u tr¶ lêi lµ “cã”. Tuy nhiªn còng vµo nh÷ng n¨m nµy kiÓu ®ét biÕn “ch¹y tho¸t” (escape) ®· ®−îc ph¸t hiÖn cho chóng ta thÊy r»ng cÇn ph¶i cã v¾cxin hoÆc ph−¬ng ph¸p ®iÒu trÞ hiÖn ®¹i h¬n. 1.3.8.2. Kh¸ng nguyªn bÒ mÆt virót viªm gan B lo¹i trung b×nh (MHBsAg) Protein bÒ mÆt virót viªm gan B lo¹i trung gian hoÆc kÝch th−íc trung b×nh nµy cã chøa thªm mét vïng 55 aa ®· ®−îc biÕt lµ tiÒn -S2. Vïng nµy −a n−íc vµ cã lÏ c− tró ë ngo¹i bµo. Vïng tiÒn-S2 còng cã mét vÞ trÝ glycosyl ho¸ bæ xung ë Asp 4. Cã thÓ vÞ trÝ nµy lu«n lu«n ®−îc glycosyl ho¸, song vÞ trÝ glycosyl ho¸ ë 9