Khảo sát đặc điểm biểu hiện dấu ấn CD55 và CD59 trên quần thể hồng cầu và bạch cầu ở 30 người bình thường

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014<br /> <br /> KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM BIỂU HIỆN DẤU ẤN CD55 VÀ<br /> CD59 TRÊN QUẦN THỂ HỒNG CẦU VÀ<br /> BẠCH CẦU Ở 30 NGƯỜI BÌNH THƯỜNG<br /> Lê Xuân Hải*; Nguyễn Lĩnh Toàn**<br /> TÓM TẮT<br /> иi huyết sắc tố kịch phát ban đêm (Paroxymal Noctural Haemoglobinurea, PNH) là một<br /> bệnh hiếm gặp, đặc trưng bởi tình trạng thiếu máu. Nghiên cứu này tiến hành khảo sát dấu ấn<br /> CD55/CD59 của tế bào (TB) hồng cầu và bạch cầu của người khỏe mạnh bằng kỹ thuật đếm<br /> TB dòng chảy. Kết quả cho thấy biểu hiện CD55, CD59 mạnh và ổn định trên quần thể hồng cầu,<br /> bạch cầu hạt và bạch cầu mono, nhưng rất yếu và dao động trên quần thể bạch cầu lympho.<br /> Giá trị này có thể được sử dụng làm tham số tham chiếu cho những nghiên cứu tiếp theo.<br /> * Từ khóa: Đái huyết sắc tố kịch phát; Dấu ấn CD55 và CD59; Hồng cầu; Bạch cầu.<br /> <br /> Chracteristics of CD55, CD59 on Erythrocytes and White Blood Cells<br /> in Healthy Blood Donors<br /> Summary<br /> The paroxysmal nocturnal haemoglobinurea (PNH) is a rare type of acquired hemolytic<br /> anemia. In this study, we analyzed the CD55 and CD59 markers of erythrocyte and white blood<br /> cell in healthy blood donors by flow cytometry analysis. The results shown that strong and stable<br /> expression of CD55 and CD59 were observed on erythrocytes, monocytes, and neutrophils.<br /> In contract, weekly and unstable expression on lymphocytes of peripheral blood cells. These<br /> results may be used for the data reference for the further studies.<br /> * Key words: Paroxysmal nocturnal haemoglobinurea; CD55; CD59; Erythrocyte; White<br /> blood cell.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Đái huyết sắc tố kịch phát (ĐHSTKP)<br /> ban đêm là một bệnh hiếm gặp, đặc trưng<br /> bởi tình trạng thiếu máu, tan máu nội<br /> mạch, giảm sinh tủy, khuynh hướng d<br /> tắc mạch và nhi m tr ng 3 . Bệnh do đột<br /> biến ở TB gốc tạo máu, gây thiếu hụt<br /> <br /> hoặc mất các protein gắn màng như CD55,<br /> CD59… có nhiệm vụ ngăn cản bổ thể tấn<br /> công màng TB 6 . Do vậy, bổ thể d<br /> dàng tấn công làm tan hồng cầu. Bệnh có<br /> thể mắc ở mọi lứa tuổi, tỷ lệ nam và nữ<br /> như nhau [1, 3]. Tỷ lệ tử vong phụ thuộc<br /> <br /> * Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương<br /> ** Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Lê Xuân Hải (hailexuan@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 10/09/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 18/11/2014<br /> Ngµy bµi b¸o ®-îc ®¨ng: 27/11/2014<br /> <br /> 25<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014<br /> <br /> vào mức độ tan máu, giảm sinh tủy và<br /> biến chứng tắc mạch 1, 2, 3 . Hiện nay,<br /> phân tích CD55, CD59 hồng cầu bằng kỹ<br /> thuật TB dòng chảy là tiêu chuẩn vàng để<br /> chẩn đoán ĐHSTKP ban đêm 1, 6 . Các<br /> hướng d n đ u thống nhất ngư ng 5<br /> quần thể hồng cầu có thiếu hụt hoặc mất<br /> CD55 và/hoặc CD59 có giá trị trong chẩn<br /> đoán ĐHSTKP ban đêm 1, 2, 6 . Tuy nhiên,<br /> trong một số trường hợp như mới truy n<br /> máu, theo d i tiến triển bệnh sau gh p TB<br /> gốc tạo máu, phân tích CD55, CD59 hồng<br /> cầu không th c s tốt do đời sống hồng<br /> cầu khoảng 120 ngày nên kết quả có thể<br /> bị ảnh hưởng bởi hồng cầu truy n vào.<br /> ì vậy, nhi u tác giả đ phân tích CD55,<br /> CD59 bạch cầu để bổ trợ cho phân tích<br /> hồng cầu trong chẩn đoán và theo d i<br /> §HSTKP ban đêm 4, 5 . Tuy nhiên, việc<br /> sử dụng quần thể TB nào và ngư ng<br /> phát hiện thiếu hụt là bao nhiêu sẽ có giá<br /> trị chẩn đoán, đi u này các nghiên cứu<br /> chưa có s thống nhất. Để có thể áp<br /> dụng phân tích CD55/CD59 bạch cầu,<br /> chúng tôi d ng kỹ thuật TB dòng chảy<br /> phân tích CD55, CD59 trên b mặt hồng<br /> cầu và bạch cầu người khỏe mạnh bình<br /> thường với mục đích: tìm ra các quần thể<br /> TB có giá trị trong chẩn đoán ĐHSTKP<br /> ban đêm.<br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng nghiên cứu.<br /> 30 m u máu ngoại vi (2 ml mỗi m u,<br /> chống đông bằng EDTA) từ người hiến<br /> máu tình nguyện tại iện Huyết học - Truy n<br /> máu Trung ương trong tháng 6 - 2013.<br /> Loại trừ lấy m u từ những người không<br /> 26<br /> <br /> đủ tiêu chuẩn sức khỏe để hiến máu theo<br /> quy định của Bộ Y tế.<br /> * Hóa chất và trang thiết bị:<br /> - Các kháng thể đơn dòng CD45-PC5,<br /> CD55-PE, CD59-FITC (Beckman Coulter,<br /> Mỹ); nước muối sinh lý; dung dịch ly giải<br /> hồng cầu (Beckton Dickinson).<br /> - Máy đếm TB dòng chảy Navious<br /> (Beckman Coulter, Mỹ).<br /> 2. Phư ng ph p nghiên cứu.<br /> * ấy m u:<br /> Lấy 2 ml máu t nh mạch, chống đông<br /> bằng EDTA từ người khỏe mạnh tham gia<br /> hiến máu tình nguyện. Th c hiện x t nghiệm<br /> sớm trong 12 giờ sau khi lấy máu.<br /> * Khảo sát biểu hiện CD55, CD59 trên<br /> các quần thể TB hồng cầu và bạch cầu<br /> máu ngoại vi b ng<br /> thu t tế TB d ng<br /> chảy:<br /> - Phân tích CD55, CD59 hồng cầu:<br /> pha lo ng máu toàn phần 100 lần trong<br /> nước muối sinh lý. Ủ 100 ul máu pha<br /> lo ng với 20 µl anti CD55-PE và 20 µl antiCD59-FITC trong 20 phút ở nhiệt độ<br /> phòng, tránh ánh sáng. Sau ủ, thêm 1 ml<br /> dung dịch PBS và phân tích CD55, CD59<br /> hồng cầu trên máy đếm TB dòng chảy.<br /> - Phân tích CD55, CD59 bạch cầu:<br /> phân lập bạch cầu bằng phương pháp ly<br /> giải hồng cầu. Ly giải 100 µl máu toàn<br /> phần bằng 1 ml dung dịch ly giải hồng<br /> cầu. Sau ly giải, ly tâm loại bỏ dịch nổi<br /> (chứa tiểu cầu và xác hồng cầu), giữ và<br /> tái huy n dịch phần cặn bạch cầu trong<br /> 100 µl nước muối sinh lý. Ủ huy n dịch<br /> bạch cầu với 20 µl anti-CD55-PE, 20 µl<br /> anti-CD59-FITC và 20 µl anti-CD45-PC5<br /> trong 20 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh<br /> sáng. Sau ủ, rửa 2 lần bằng nước muối<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014<br /> <br /> sinh lý để loại bỏ kháng thể thừa, b 1 ml<br /> nước muối sinh lý, trộn đ u và đem phân<br /> tích CD55, CD59 bạch cầu trên máy đếm<br /> TB dòng chảy.<br /> - Xử lý số liệu bằng thuật toán thống<br /> kê y học với phần m m Excel 2007.<br /> <br /> sát trên 30 người bình thường, chúng tôi<br /> thấy không có trường hợp nào có mức<br /> thiếu hụt CD55, CD59 < 5 . ì vậy, chúng<br /> tôi cho rằng mức ngư ng 5 với hồng<br /> cầu là ph hợp.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu.<br /> * Đặc điểm về giới: nam: 13 BN (43,3%);<br /> nữ: 17 BN (56,7 ).<br /> * Đặc điểm về tuổi:<br /> Tuổi trung bình: 24,8; tuổi nhỏ nhất: 19;<br /> tuổi lớn nhất: 31.<br /> Nghiên cứu này sử dụng m u máu của<br /> 30 người hiến máu tình nguyện không<br /> phân biệt nam nữ, ở độ tuổi trẻ (19 - 31<br /> tuổi, trung bình 24,8 tuổi). ì vậy, số liệu<br /> thu được tương đối đại diện cho cả hai<br /> giới và ở lứa tuổi tương đối trẻ.<br /> <br /> CD55-PE<br /> <br /> 2. Đặc điểm biểu hiện CD5 và CD59<br /> trên c c quần thể TB m u ngoại vi<br /> người bình thường.<br /> Bảng 1: Đặc điểm biểu hiện CD55 và<br /> CD59 trên hồng cầu người bình thường<br /> (n = 30).<br /> CD59<br /> <br /> Trung bình SD Min - Max Trung bình SD Min - Max<br /> 97,65<br /> <br /> 1,52<br /> <br /> 95,4 - 100<br /> <br /> 97,34<br /> <br /> 1,30<br /> <br /> 95,1 - 100<br /> <br /> Khảo sát 30 m u máu bình thường<br /> thấy CD55 và CD59 luôn dương tính ở mức<br /> cao. CD55 ở mức 95,4 - 100 (trung bình<br /> 97,65 ), CD59 ở mức 95,1 - 100% (trung<br /> bình 97,34 ). Các hướng d n chẩn đoán<br /> ĐHSTKP ban đêm lấy mức<br /> 5 quần<br /> thể hồng cầu có thiếu hụt CD55/CD59<br /> làm tiêu chuẩn vàng cho chẩn đoán. Khảo<br /> <br /> 27<br /> <br /> CD59-FITC<br /> <br /> H nh : Biểu hiện CD55, CD59 trên các<br /> quần thể hồng cầu ở người bình thường,<br /> mức độ dương tính CD55 và CD59 đ u<br /> > 95%.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014<br /> <br /> Bảng : Đặc điểm biểu hiện CD55 và CD59 bạch cầu ở người bình thường<br /> (n = 30).<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> SD<br /> <br /> Min - Max<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> SD<br /> <br /> Min - Max<br /> <br /> Bạch cầu hạt<br /> <br /> 98,24<br /> <br /> 1,49<br /> <br /> 95,8 - 100<br /> <br /> 98,25<br /> <br /> 1,28<br /> <br /> 96,2 - 100<br /> <br /> Bạch cầu mono<br /> <br /> 96,24<br /> <br /> 2,99<br /> <br /> 91,2 - 99,8<br /> <br /> 97,16<br /> <br /> 2.81<br /> <br /> 90,8 - 99,6<br /> <br /> Bạch cầu lympho<br /> <br /> 32,84<br /> <br /> 11,00<br /> <br /> 17,5 - 52,7<br /> <br /> 32,77<br /> <br /> 11,92<br /> <br /> 20,8 - 56,7<br /> <br /> Biểu hiện CD55, CD59 trên bạch cầu<br /> <br /> quần thể bạch cầu mono, không thấy<br /> <br /> khác nhau giữa các quần thể bạch cầu<br /> <br /> trường hợp nào có biểu hiện thiếu hụt<br /> <br /> hạt trung tính, bạch cầu mono và bạch<br /> <br /> CD55 hoặc CD59<br /> <br /> cầu lympho. Biểu hiện CD55, CD59 mạnh<br /> <br /> thấp nhất 91,2 , CD59 thấp nhất 90,8%).<br /> <br /> và r<br /> <br /> Tuy nhiên, biểu hiện CD55, CD59 trên<br /> quần thể bạch cầu lympho người bình<br /> thường rất thay đổi, cả 30 người đ u<br /> có mức thiếu hụt CD55, CD59 thấp<br /> nhất 47,3 và 43,3 . Mức độ thiếu hụt<br /> CD55, CD59 có thể lên tới trên dưới<br /> 80 . Quần thể TB d ng để chẩn đoán<br /> và ngư ng thiếu hụt CD55, CD59 có<br /> ý ngh a chẩn đoán ĐHSTKP ban đêm<br /> khi phân tích CD55, CD59 bạch cầu<br /> chưa được thống nhất trong các hướng<br /> d n chẩn đoán ĐHSTKP ban đêm. ới<br /> nghiên cứu này, chúng tôi đ xuất khi<br /> phân tích CD55, CD59 bạch cầu chỉ nên<br /> phân tích ở quần thể bạch cầu hạt và<br /> bạch cầu mono, không d ng với quần<br /> thể bạch cầu lympho.<br /> ngư ng thiếu<br /> hụt, CD55, CD59 có ý ngh a trong chẩn<br /> đoán ĐHSTKP ban đêm, nghiên cứu<br /> này đ xuất là 5 với quần thể hồng<br /> cầu và bạch cầu hạt,<br /> 10 với quần<br /> thể bạch cầu mono.<br /> <br /> ràng trên các quần thể bạch cầu<br /> <br /> hạt trung tính (98,24<br /> <br /> 1,49<br /> <br /> và 98,25<br /> <br /> 1,28 ) và bạch cầu mono (96,24<br /> 2,99<br /> <br /> và 97,16<br /> <br /> 2,31 ), nhưng bộc<br /> <br /> lộ yếu hơn trên quần thể bạch cầu<br /> lympho (32,84<br /> <br /> 11,00<br /> <br /> và 32,77<br /> <br /> 11,92 ). Qua khảo sát trên 30 người<br /> bình thường khỏe mạnh chúng tôi thấy,<br /> mức độ biểu hiện CD55, CD59 ở quần<br /> thể bạch cầu hạt và bạch cầu mono khá<br /> cao và đồng nhất. Đối với quần thể<br /> bạch cầu hạt, không thấy trường hợp<br /> nào có biểu hiện thiếu hụt CD55 hoặc<br /> CD59<br /> <br /> 5<br /> <br /> (biểu hiện CD55 thấp nhất<br /> <br /> 95,8 , CD59 thấp nhất 96,2 ). Đối với<br /> 28<br /> <br /> 10<br /> <br /> (biểu hiện CD55<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014<br /> <br /> H nh : Biểu hiện CD55, CD59 trên các quần thể bạch cầu ở người bình thường.<br /> Trên 3 đồ thị chia 4 v ng, không có biểu hiện thiếu hụt CD55, CD59 trên quần thể<br /> bạch cầu hạt trung tính (đỏ) và bạch cầu mono (xanh lục), thiếu hụt r cả CD55 và<br /> CD59 trên quần thể bạch cầu lympho (xanh lam). Nếu có, quần thể thiếu hụt CD55<br /> nằm phía bên trái trục tung, quần thể thiếu hụt CD59 nằm bên dưới trục hoành của đồ<br /> thị 4 v ng.<br /> KẾT LUẬN<br /> Khảo sát biểu hiện CD55, CD59 trên<br /> 30 người hiến máu khỏe mạnh, chúng tôi<br /> thấy:<br /> - Biểu hiện CD55, CD59 mạnh và ổn<br /> định trên các quần thể hồng cầu, bạch<br /> cầu hạt và bạch cầu mono, nhưng rất<br /> 29<br /> <br /> yếu và dao động trên quần thể bạch cầu<br /> lympho.<br /> - Các quần thể TB thích hợp d ng<br /> phân tích thiếu hụt CD55, CD59 để<br /> chẩn đoán ĐHSTKP ban đêm là: hồng<br /> cầu, bạch cầu hạt và bạch cầu mono.<br /> Không d ng trên quần thể bạch cầu<br /> lympho.<br /> <br />